Summary
Ce protocole décrit l’utilisation d’aorte-gonades-celles cultivées pour les analyses d’expression, unités formant des colonies dans la culture et de la rate et la reconstitution à long terme pour déterminer l’effet des facteurs de régulation et les voies de signalisation sur souches hématopoïétiques développement des cellules. Cela a été démontré comme un système efficace pour l’étude de fonction et la biologie de cellules souches hématopoïétiques.
Abstract
La limitation de l’utilisation des embryons de souris pour les études de l’hématopoïèse est l’inconvénient supplémentaire dans les opérations, qui est en grande partie due au développement intra-utérin de l’embryon. Bien que les données génétiques de souris knockout (KO) sont convaincants, il n’est pas réaliste pour produire des souris KO pour tous les gènes selon les besoins. En outre, effectuer en vivo sauvetage expériences afin de consolider les données obtenues des souris KO n’est pas commode. Pour surmonter ces limites, la culture d’explants d’aorte-gonades-mésonéphros (AGM) a été développée comme un système approprié d’étudier le développement de cellules souches hématopoïétiques (CSH). Surtout pour des expériences de sauvetage, il peut être utilisé pour récupérer l’hématopoïèse altérée chez les souris KO. En ajoutant les produits chimiques appropriés dans le milieu, la signalisation ayant une déficience peut être réactivée ou voies de régulation peuvent être inhibées. Avec l’utilisation de cette méthode, beaucoup d’expériences peuvent être effectuées pour identifier les régulateurs critiques du développement HSC, y compris de HSC liées à l’expression des gènes à des niveaux d’ARNm et de protéines, la capacité de formation de colonie et capacité de reconstitution. Cette série d’expériences serait utile pour définir les mécanismes sous-jacents essentiels pour le développement de l’HSC chez les mammifères.
Introduction
Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont spécifiques des tissus de cellules souches adultes qui possèdent des cellules lymphoïdes et multilignée potentiel y compris érythroïdes, myéloïde, ainsi que la capacité à se renouveler. Des études récentes ont montré que les premiers autorenouveler provient d’une population endothéliale spécialisée, appelée endothélium hemogenic (HE), à travers l’endothélium de transition hématopoïétique (ISE) à la paroi ventrale de l’aorte dorsale1,2 ,3,4. Une fois formé dans la région aorte-gonades-mésonéphros (AGA) d’embryonnaire (E) 10,5 à E12.5 dans l’embryon de souris, GPX va migrer dans le foie fœtal pour l’expansion et finalement coloniser la moelle osseuse afin de maintenir l’hématopoïèse adulte tout au long de la vie d’un individu 5 , 6. bien que cela ait été étudiée pendant de nombreuses années, les mécanismes sous-jacents des HSC émergence et le développement restent incomplètement compris.
Contrairement à la fécondation in vitro et le développement de l’embryon de poisson zèbre, développement intra-utérin d’embryons de souris rend l’étude de l’hématopoïèse définitive au cours de l’embryogenèse beaucoup plus gênant. Bien que des expériences génétiques à l’aide de la souris knockout (KO) sont couramment utilisés, l’absence de certaines souris KO limite aussi leur utilisation dans le domaine de la recherche hématopoïétique. En outre, des expériences in vivo sauvetage ne sont pas facilement effectuées chez la souris KO. Depuis 1996, la culture d’explants d’AGA a été développée pour études hématopoïétiques par les pionniers dans la zone7. Avec l’aide de ce système de culture, tissus ventrales de la région d’AGA ont été identifiés pour promouvoir l’activité de l’HSC, tandis que les tissus dorsales exercent un autre effet8,9. Le système de culture des explants AGM a également été appliqué pour déterminer le rôle de la sérotonine, Mpl, SCF, BMP et HSC développement10,11,12,13, de signalisation Hedgehog 14. ce qui est important, c’est aussi une méthode populaire utilisée pour sauver des défauts hématopoïétiques en embryons mutants13,15.
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Protocol
toutes les procédures y compris les sujets animaux ont été approuvés par le Comité d’examen éthique de l’Institut de zoologie, Chinese Academy of Sciences, Beijing, Chine.
1. préparation de matériel
- stériliser le 0,65 µm filtres avec ultraviolet rayons produits sous l’ultraviolet ray lampe sur le banc propre pendant 4 h et retourner les filtres après la marque de 2 h.
Remarque : Lorsque vous travaillez avec la lumière UV, porter une protection appropriée. - Stériliser les mailles en acier inoxydable avec le stérilisateur autoclave à 121 ° C pendant 30 min.
Remarque : Une certaine hauteur de maille d’acier inoxydable est nécessaire pour supporter les filtres à l’interface air-liquide et ceci peut être réalisé avec le fil de la maille d’acier ( Figure 1 A). - Fluoxetine dilué à une concentration finale de 10 µM dans le 5300 à long terme de la culture moyenne et mélange uniformément.
NOTE : Pour une plaque de six puits, milieu de culture à long terme 2 mL Max 5300 est approprié pour chaque puits. Hydrocortisone à 10 -6 M peut être dilué de façon sélective dans le milieu. - Le milieu enrichi par la fluoxétine à 10 µM dans six puits assiettes ou plats de transfert et de mettre les mailles inox stérilisé dans le milieu.
- Laver les filtres à 0,65 µm avec de l’eau bouillante deux fois pendant 3 minutes chaque fois dans la boîte de Petri de cellule de verre pour la stérilisation. Après que chaque lavage, placez les filtres dans un tampon phosphate salin (PBS) pendant 2 minutes et place le mouillé des filtres sur l’acier inoxydable maillages se tenant à l’interface air-liquide, comme le montre la Figure 1 A [schématique dans le Centre].
Remarque : L’eau bouillante peut être généré avec le stérilisateur autoclave pour atteindre l’asepsie et l’équipement doit être retiré de stérilisateur autoclave en temps opportun pour éviter une baisse de température.
2. Culture d’explants AGA
- séparer soigneusement les régions AGA des embryons au E10.5 ou E11 avec une pince.
- Bande de l’utérus de souris enceintes avec des ciseaux de dissection et de séparer les embryons de l’utérus.
- Essuyer le sac vitellin, le cordon ombilical et viscères du corps de l’embryon.
- Retirer délicatement les tissus nerf dorsal et les tissus musculaires environnantes.
- Cut off les tissus avec la pince sur le site des membres antérieurs et postérieurs et séparer la région AGM du corps de l’embryon. les figures 1 B-C montrent la représentation schématique et la morphologie des AGM disséqué.
- Explantation l’AGM disséqués séparément sur les filtres à l’interface air-liquide ( Figure 1 A) et de la culture à 5 % de CO 2 à 37 ° C pendant 2-3 jours.
Remarque : Ne pas placer l’AGA disséqué sur le fil de la maille en acier et s’assurer que les filtres sont à l’interface air-liquide durant la culture. En plus de l’AGA, sac vitellin et le foie fœtal peuvent également être cultivées avec ce système 7.
3. Analyse de l’expression
- d’ARNm
- recueillir les assemblées générales annuelles cultivées dans 1 mL de PBS et centrifuger à 4 ° C, 310 x g pendant 6 min.
- Après avoir enlevé le surnageant, l’ARN total est extraite de l’AGM recueillies avec une solution de monophasique de phénol, selon le fabricant ' instructions de s.
- ARN total (2 µg) est alors inverse transcrit utilisant transcriptase inverse M-MLV afin d’obtenir des ADNc comme modèle. Les dosages quantitatifs de la PCR en temps réel sont effectuées avec SYBR Green et Gapdh est utilisée comme contrôle interne.
- Niveau de protéine
- recueillir l’AGA cultivé comme indiqué ci-dessus au point 3.1.1.
- Préparer la protéine de l’AGA cultivée avec le tampon de lyse cellulaire (10 mM Tris-HCl 10 mM NaCl et 0,5 % NP-40) contenant l’inhibiteur de la protéase et l’utilisation de western blot pour détecter le niveau de protéine comme précédemment décrit 13.
4. Les unités formant des colonies dans l’épreuve de Culture (CFU-C)
- après la mise en culture pendant 2-3 jours, recueillir les régions AGA dans une solution saline tamponnée au phosphate de 1 mL (PBS) et centrifuger à 4 ° C, 310 x g pendant 6 minutes et se dissocient avec 200 collagénase µL (0,1 % dans du PBS) à 37 ° C.
NOTE : Le temps nécessaire à la collagénase à générer des suspensions de cellules unique est environ 20 minutes. Agitation du tube contenant AGM toutes les 5 min peuvent accélérer le processus de digestion. Collagénase de 0,1 % 200 µL est utilisé pour chaque Assemblée générale annuelle et 200 µL de sérum de 10 % est utilisé pour arrêter la réaction. - Culture des suspensions de cellules unique dans le milieu de la M3434 en plaques 24 puits ultra faible attachement.
Remarque : Pour éviter toute contamination, solution de pénicilline-streptomycine peut être ajoutée sélectivement dans le milieu. Parce que le milieu M3434 est visqueux, une seringue cc 1,0 sans aiguille sert à mélanger les cellules et le milieu. - Après 7 - 10 jours de culture à 37 ° C à 5 % de CO 2, le nombre pour chaque type de colonies dont l’éclatement formant unité--érythroïdes BFU-E, CFU-granulo-monocyte (CFU-GM) et UFC-granulocyte, érythrocyte, macrophage, mégacaryocyte (CFU-GEMM) sont distingués basés sur la morphologie et a marqué avec un microscope inversé ( Figure 2 C).
5. In Vivo Dosage de transplantation
- formatrices unités-rate (CFU-S) dosage
- après 2 - 3 jours de culture d’explants, recueillir les assemblées générales annuelles et préparer des suspensions de cellules simples en incubant avec 200 collagénase µL (0,1 % dans du PBS) pour 20 min.
- Exécuter l’irradiation mortelle (9 Gy de rayons x) de 8 à 10 semaine souris C57BL/6 mâles 4-5 h avant l’injection de cellules.
- Mettre la souris irradiée dans une drisse de restreindre son activité.
- Essuyer la queue à l’aide d’un tampon de coton imprégné d’alcool à 75 % pour favoriser la vasodilatation de la veine.
- Injecter 0,5 embryon équivalent (ee) ou 1 ee seule cellule-suspensions AGA par voie intraveineuse dans la veine caudale des souris irradiée avec une seringue cc 1,0.
Remarque : Les cellules sont suspendues avec du PBS et 0,5 mL de PBS par bénéficiaire est un volume convenable. Une aiguille de calibre 25 ou 26 calibre est utilisée pour l’injection avec une seringue cc 1,0. Aucun flux d’air ne peut être introduit dans la seringue. Appuyez sur le site d’injection avec un tampon imbibé d’antiseptique pour arrêter le saignement. - Onze jours après la transplantation, recueillir et fixer la rate des souris bénéficiaires à Bouin ' solution s (solution aqueuse de l’acide picrique 1,22 % saturés 15 mL, 2 mL de méthanol 40 % et 1 mL d’acide acétique) pour 1 à 2 jours et laver avec de l’alcool à 80 % pour un autre 1-2 jours. Compter les colonies visibles dans la rate macroscopiquement et déterminer le nombre de colonies par ee.
Remarque : Bouin ' fixateur s, portez des protections appropriées.
- Essai à long terme de la transplantation
- après 2-3 jours explantation cultivant, recueillir les assemblées générales annuelles et préparer des suspensions de cellules simples en incubant avec 200 collagénase µL (0,1 % dans du PBS) pendant 20 min.
- Exécuter l’irradiation mortelle (9 Gy de rayons x) de 8 à 10 semaine souris C57BL/6 mâles 4-5 heures avant l’injection de cellules.
- Mettre la souris irradiée dans une drisse de restreindre son activité.
- Essuyer la queue à l’aide d’un tampon de coton imprégné d’alcool à 75 % pour favoriser la vasodilatation de la veine. < lJ’ai > injecter 0,5 embryon équivalent (ee) ou 1 ee simples des suspensions cellulaires de l’Assemblée générale annuelle par voie intraveineuse dans la veine de la queue d’une souris irradiée avec une seringue cc 1,0. AGM sont injectés à une dose de 1 ee par destinataire avec 2 × 10 5 cellules de moelle osseuse (fond CD45.1).
Remarque : Aucun flux d’air ne peut être introduit dans la seringue. Appuyez sur le site d’injection avec un tampon imbibé d’antiseptique pour arrêter le saignement. - Quatre mois après transplantation, recueillir la moelle osseuse du receveur et l’utiliser pour l’essai de reconstitution de FACS. Uniquement les destinataires avec ≥ 10 % dérivé donneur chimérisme sont considérés comme pièce reconstitution réussie.
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Representative Results
Une publication récente a rapporté sérotonine de culture cellulaire endothéliale favorise la survie des CSH en inhibant la voie de pro-apoptotic dans l' Assemblée générale annuelle13. Pour confirmer l’effet promoteur de la sérotonine sur le développement de l’HSC, fluoxétine a été inclus. Comme un inhibiteur de recapture de la sérotonine (ISRS), la fluoxétine a été démontrée inhibe la réabsorption de la sérotonine dans les tissus périphériques16,17,18. À l’aide de l’AGA explantation système de culture, a examiné l’effet de la fluoxétine sur le développement de l’HSC en suivant la procédure présentée ci-dessus. Les analyses d’expression ont montré une expression accrue de Runx1, qui se définit comme un gène essentiel pour le développement HSC19, en AGM Fluoxetine traités à des niveaux d’ARNm et de protéines, respectivement (Figure 2A et 2 b). Fluoxetine peut augmenter considérablement la capacité de formation de colonie de CSH dans l’Assemblée générale annuelle, y compris les BFU-E, CFU-GM et CFU-GEMM (Figure 2C etDde la Figure 2). En outre, in vivo les résultats de la transplantation ont montré que CSH dans l’AGA traités par la fluoxétine peut augmenter le nombre de colonies de la rate chez les receveurs adultes irradiés (Figure 2E).
Figure 1 . Représentation schématique de la structure de l’AGA et explant culture système.
(A) l’organigramme à l’aide de l’AGM explant culture systemto examiner l’effet des produits chimiques sur le développement de CSH. Brièvement, AGM sont disséqués provenant d’embryons et cultivés sur des filtres à l’interface air-liquide avec des produits chimiques dilués dans le milieu de culture à long terme de 5300. 2 - 3 jours plus tard, les assemblées générales annuelles cultivées sont recueillies et utilisées pour étudier l’expression des gènes apparentés hématopoïétiques, capacité de formation de colonie et capacité de repeuplement. AGM, aorte-gonades-mésonéphros ; Unités d’UFC-C, formant des colonies dans la culture ; CFU-S, formant des colonies unités-rate. ()B) la structure de l’AGM est représentée dans ce diagramme. A, aorte dorsale ; Moi, mésenchyme ; G, gonades ; M, mésonéphros. ()C) la morphologie de l’AGM. L’AGA est séparée de la moitié caudale du corps embryonnaire avec les cellules mésenchymateuses environnantes à E10.5. Barreaux de l’échelle = 1 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Demande de l’Assemblée générale annuelle explantation système de culture pour détecter l’effet de la fluoxétine sur le développement de HSC. (A) le niveau de l’ARNm de Runx1 dans les assemblées générales annuelles, traités par la fluoxétine à 10 µM a été détecté par PCR en temps réel quantitative. Test t de Student : **, P < 0,01. Les résultats sont présentés en moyenne ± SEM. (B) Western blotting analyse a confirmé que l’augmentation de l’expression de Runx1 au niveau de la protéine dans les assemblées générales annuelles traités par la fluoxétine. (C) les images représentatives montrent la morphologie des BFU-E, CFU-GM et CFU-GEMM. Barres d’échelle = 100 µm. (D) UFC-dosage C ont montré que la Fluoxetine traitement peut augmenter le nombre de chaque type de colonie. Un embryon équivalent (ee) a été utilisé. Test t de Student : *, P < 0,05 ; **, P < 0.01.The résultats sont présentent comme moyenne ± SEM. (E) CFU-S dosage AGMs traités par la fluoxétine ont montré que Fluoxetine peut augmenter le nombre de colonies dans la rate des bénéficiaires adultes irradiés. Barreaux de l’échelle = 1,5 mm. 1 ee a été utilisé. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Il est bien connu que CSH matures dans la moelle osseuse peut repeupler l’approvisionnement en sang des receveurs irradiés. Contrairement à ces autorenouveler fonctionnelle, le CSH émergentes dans l’Assemblée générale annuelle des embryons de souris est immatures. Transplantation directe est ressorti ce type j’ai (VE-cad+ CD45– CD41+) et type II (VE-cad+ CD45+) pre-CSH posséder aucune reconstitution capacité20. Profitant du système de culture d’explants AGM, le CSH naissant dans la région de l’AGA peut reconstituer les destinataires dans la transplantation dosage4,20. En outre, en raison du développement intra-utérin de l’embryon de souris, des expériences in vivo pour sauver l’hématopoïèse altérée chez les souris KO sont gênantes à effectuer. La culture d’explants d’AGA est un système alternatif, qui est bien adapté pour des expériences de sauvetage, simplement en ajoutant les produits chimiques (facteurs de croissance et cytokines) dans les moyennes de13,15. En plus de l’AGA, le sac vitellin et le foie fœtal peuvent également être cultivées avec ce système7.
Au début de cette expérience, la stérilisation stricte des filtres et des mailles en acier inoxydable est très importante éviter la contamination. Plus important encore, l’étape critique dans la culture est de faire l’AGA disséqué cultivées sur les filtres à l’interface air-liquide. Trop moyen provoquera l’AGA à être mis en culture dans le liquide et il peut être décomposée, considérant que trop peu de moyen rendra l’AGA sec. Au cours de la mise en culture, maintenir l’humidité adéquate de l’incubateur de cellule est également important pour éviter l’évaporation du milieu.
Nouvelle amélioration de cette explantation système de culture pour vraiment imiter le développement du CSH in vivo, ainsi que des avancées récentes en organoïde culture techniques21, élargira considérablement son application dans des études de l’hématopoïèse, de Différenciation de l’auto-renouvellement, lignée multiples HSC et l’interaction HSC-niche pour maladie modélisation et découverte de médicaments.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun intérêt financier contradictoires.
Acknowledgments
Nous remercions Suwei Gao d’aide dans la préparation de la figure. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale sciences naturelles de Chine (81530004, 31425016) et le ministère des sciences et technologie de la Chine (2016YFA0100500). J.L. effectué les expériences et rédigé le manuscrit ; F.L. édition le manuscrit. Les deux auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| durapore 0.65 µm filters | Millipore | R5BA63787 | AGM explant culture |
| M5300 long-term culture medium | Stem Cell Technologies | 5300 | AGM explant culture |
| Trizol | Tiangen | 5829 | RNA extration |
| M-MLV reverse transcriptase | Promega | 90694 | reverse transcription |
| SYBR Green | Qiagen | A6002 | quantatitive real-time PCR |
| protease inhibitor | Roche | 55622 | Protein extration |
| collagenase | Sigma | C2674 | digestion of AGM tissues |
| MethoCult GF M3434 medium | Stem Cell Technologies | 3434 | CFU-C assay |
| ultra-low attachment 24-well plates | Costar | 3473 | CFU-C assay |
| C57BL/6 CD45.2 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | CFU-S assay | |
| C57BL/6 CD45.1 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | Long-term transplantation | |
| phosphate buffered saline | Life Technologines | 8115284 | AGM Collection |
| Penicillin-Streptomycin solution | HyClone | SV30010 | AGM explant culture |
| anti-CD45.2-PE-CY7 | eBioscience | 25-0454-80 | Long-term transplantation |
| anti-CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | Long-term transplantation |
| UV lamp | Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD | 039-14402 | power: 30W |
| stainless steel mesh | AS ONE SHANGHAI Corporation | 2-9817-10 | aperture diameter: 2.5 mm |
| hydrocortisone | Sigma | H0396 | selectively diluted into M5300 medium |
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