Summary
本议定书描述使用培养的主动脉-性腺-肾的表达分析, 菌落形成单位在文化和脾脏, 并长期重建, 以确定影响的调节因子和信号通路的造血干细胞发育。这已被证明是一个有效的系统研究造血干细胞生物学和功能。
Abstract
使用小鼠胚胎进行造血研究的局限性是在手术中增加了不便, 这主要是由于胚胎的宫内发育。尽管来自击倒 (ko) 小鼠的基因数据令人信服, 但在需要时为所有基因生成高鼠并不现实。此外, 执行在体内抢救实验, 以巩固从 KO 小鼠获得的数据是不方便的。为了克服这些局限性, 主动脉-性腺-肾 (年会) 外植体培养作为研究造血干细胞 (HSC) 发育的适宜系统而发展起来。特别是在抢救实验中, 可用于恢复高鼠的造血损伤。通过在培养基中加入适当的化学物质, 可以重新激活受损的信号, 或抑制上调的通路。利用这种方法, 可以进行大量的实验, 以确定 hsc 发展的关键调控因子, 包括 hsc 相关基因在 mRNA 和蛋白质水平、菌落形成能力和重构能力上的表达。这一系列的实验将有助于确定哺乳动物 HSC 发育所必需的基本机制。
Introduction
造血干细胞 (干细胞) 是组织特异的成体干细胞, 具有多向的潜能, 包括红、髓细胞和淋巴细胞, 以及自我的能力。最近的研究表明, 最早的干细胞产生于一个专门的内皮细胞, 称为 hemogenic 内皮细胞 (他), 通过内皮到造血转移 (EHT) 在腹壁的背主动脉1,2 ,3,4。一旦从胚胎 (E) 10.5 到 E12.5 在小鼠胚胎中形成了主动脉-性腺-肾 (年会) 区域, 干细胞就会迁移到胎儿肝脏进行扩张, 最终在个体的生命中殖民骨髓以维持成人造血。5,6. 尽管这一研究已经进行了许多年, 但 HSC 产生和发展的基本机制仍未得到完全理解。
与体外不同的是, 斑马鱼胚胎的受精和发育, 小鼠胚胎的宫内发育使得在胚胎发生过程中的最终造血研究更不方便。虽然使用击倒 (ko) 小鼠的基因实验是常用的, 但某些高鼠的缺乏也限制了它们在造血研究领域的应用。此外,在体内抢救实验在 KO 小鼠中不易进行。自1996年以来, 在该领域的先驱在7中为造血研究开发了 "年度" 外植体培养。在这一文化体系的帮助下, 已经确定了股东大会区域的腹侧组织以促进 HSC 活动, 而背部组织则发挥相反的作用8,9。在 HSC 的发展中, 应用了 Mpl、蛋白、蛋白、BMP 和刺猬的信号, 确定了血清素、外植体培养系统的作用10、11、12、13、14. 重要的是, 它也是一种常用的方法来挽救突变体胚胎的造血缺损13,15。
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Protocol
包括动物学科在内的所有程序都已获得中国科学院动物研究所伦理审查委员会的批准.
1. 材料准备
- 对0.65 和 #181 进行消毒; m 过滤器在紫外线灯下产生紫外线, 在清洁的长凳上为4小时, 并且在 2 h 标记以后转动滤光器。 注意: 当使用 UV 光时, 请穿戴适当的保护.
- 121 和 #176 用高压灭菌器消毒不锈钢网格, 30 分钟.
注: 需要一定高度的不锈钢网格, 以支持气接口上的过滤器, 这可以用钢丝网 ( 图 1 A ) 实现. - 将氟西汀稀释到10和 #181 的最终浓度; M 进入 M5300 长期培养基, 均匀混合.
注: 对于一个六井板, 2 毫升 M5300 长期培养基是适当的每一个井。氢化可的松在 10 -6 M 可以被选择性地稀释到培养基中. - 将培养基与氟西汀加在10和 #181; M 成六孔板或碟, 并将灭菌不锈钢网放入介质中.
- 洗涤0.65 和 #181; m 过滤器与煮沸的水二次为3分钟每次在玻璃细胞培养盘为绝育。每次洗涤后, 将过滤器放入磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 2 分钟, 并将湿过滤器放在气接口的不锈钢网格上, 如 图 1 A 所示 [示意图在中心].
注: 用蒸压灭菌器产生的开水可实现无菌, 设备应及时取出灭菌器, 避免温度降低.
2。大会外植体培养
- 在 E10.5 或 E11 的胚胎中小心地将股东大会区域与镊子分开。
- 用解剖剪刀将子宫从孕鼠中剥离出来, 并将胚胎从子宫中分离出来.
- 清除胚体中的卵黄囊、脐带和内脏.
- 小心移除背神经组织和周围肌肉组织.
- 用钳切断前、后肢部位的组织, 将其与胚体分离。 图 1 B-C 显示了解剖的周年大会的示意图表示和形态学.
- 将被解剖的公司分别放在气接口 ( 图 1 ) 上的滤镜上, 并在 5% CO 2 中的区域性中, 37 和 #176; C 为 2-3 天.
注意: 不要将被解剖的周年大会放在钢网的钢丝上, 并确保过滤器在文化气界面。除了周年大会, 蛋黄囊和胎儿肝脏也可以培养与此系统 7 .
3。表达式分析
- mRNA 级别
- 将培养的公司收集到1毫升 PBS 和离心机在4和 #176; C, 310 x g 为 6 min.
- 除去上清液后, 根据制造商和 #39 的指示, 从收集的公司中提取总 RNA, 并采用单相苯酚溶液.
- 总 RNA (2 和 #181; g) 然后用 m-MLV 反转录酶反向转录, 以获得 cDNA 为模板。定量 real-time PCR 方法是用 SYBR 绿和 Gapdh 作为内部控制进行的.
- 蛋白质级别
- 收集在步骤3.1.1 中如上所述的培养的年度股东大会。
- 用细胞裂解缓冲液 (10 毫米的三盐酸盐, 10 毫米氯化钠, 0.5% NP-40) 制备含有蛋白酶抑制剂的蛋白质, 并用于西方印迹检测先前描述的蛋白质水平 13 .
4。菌落形成单位在文化 (CFU-C) 化验中
- 在培养 2-3 天后, 收集1毫升磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 和离心机在4和 #176; C, 310 x g 为6分钟和离解与200和 #181; L 胶原酶 (0.1% 在 PBS) 在37#176; C.
注: 胶原酶产生单细胞悬浮液所需时间约20分钟。每5分钟摇晃一次含周年大会的管子可以加速消化过程。200和 #181; 0.1% 胶原酶用于每一个股东大会和200和 #181; l 10% 血清用于停止反应. - 在超低附着的 M3434 介质中培养单细胞悬浮 24-井板.
注意: 为避免污染, 青霉素-链霉素溶液可选择性添加到培养基中。由于 M3434 介质是粘性的, 所以使用1.0 毫升无针头的注射器来混合细胞和培养基. - 7-10 天后在37和 #176 培养; C 在 5% CO 2 中, 每种类型的菌落的数量, 包括爆裂形成单位-红 (BFU), CFU-granulo-单核细胞 (CFU-GM) 和 CFU-粒, 红细胞, 巨噬细胞, 巨 (CFU-GEMM)根据形态学进行区分, 并以倒置显微镜 ( 图 2 C ) 进行评分.
5。 在体内 移植试验
- 菌落形成单位-脾脏 (CFU S) 化验
- 2-3 天的外植体培养, 收集公司和准备单细胞悬浮通过孵化200和 #181; L 胶原酶 (0.1% 在 PBS) 为20最小
- 在细胞注射前, 对8至10周的老雄性 C57BL/6 小鼠进行致死性照射 (9 X 射线), 4-5 小时.
- 将辐照的鼠标放入抑制剂以限制其活动.
- 用75% 酒精浸泡的棉签擦拭尾部, 以促进静脉舒张.
- 注射0.5 胚当量 (ee) 或 1 ee 单细胞悬浮剂, 静脉注射到经照射的小鼠尾静脉, 用1.0 毫升注射器.
注: 细胞悬浮与 pbs 和0.5 毫升 pbs 每接收者是一个适当的容量。25口径或26口径的针用于注射 1.0 cc 注射器。没有空气可以被引入到注射器。用消毒棉签按压注射部位止血. - 十一天后移植, 收集并修复 Bouin 和 #39 中的受体小鼠的脾脏 (15 毫升1.22% 苦味酸酸饱和水溶液, 2 毫升40% 甲醇和1毫升乙酸) 1-2 天, 用80% 酒精清洗 1-2 天。从宏观上计算脾脏的可见菌落数, 并确定每个 ee 的菌落数量.
#8203; 注意: Bouin 和 #39 的固色剂, 穿戴适当的保护.
- 长期移植化验
- 2-3 #160;d 总是外植体培养, 收集公司, 并以200和 #181 孵化制备单细胞悬浮液; L 胶原酶 (0.1% 在 PBS) 为 20 min.
- 对8至10周的老雄性 C57BL/6 小鼠进行致死性照射 (9 x 射线), 在细胞注射前 4-5 小时.
- 将辐照的鼠标放入抑制剂以限制其活动.
- 用75% 酒精浸泡的棉签擦拭尾部, 以促进静脉舒张. 我注射0.5 胚当量 (ee) 或 1 ee 单细胞悬浮剂, 静脉注射到经辐照后的小鼠尾静脉, 用1.0 毫升注射器。每位获奖者注射 1 ee 2 和 #215; 10 5 骨髓细胞 (CD45.1 背景).
注: 注射器中不能引入空气。用消毒棉签按压注射部位止血. - 四月后, 收集接受者的骨髓并将其用于重构试验。只有与 #8805 的收件人; 10% 捐助者派生的嵌被认为是成功重组的表现.
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Representative Results
最近发表的一篇报道说, 内皮细胞衍生的血清素通过抑制干细胞的亡途径, 促进了其生存.13。为了证实血清素对 HSC 发育的促进作用, 氟西汀被列入。作为一种选择性血清素再抑制剂 (SSRI), 氟西汀已被证明抑制血清素吸收在周围组织16,17,18。采用上述方法对氟西汀对 HSC 培养的影响进行了研究。表达分析显示, Runx1 的表达增加, 这被定义为 HSC 发展的一个关键基因19, 在氟西汀治疗公司 mRNA 和蛋白质水平分别 (图 2a和2B)。氟西汀还能显著提高干细胞的群体形成能力, 包括 BFU、CFU 和 CFU-GEMM (图 2C和图 2D)。此外,在体内移植结果显示, 干细胞在使用氟西汀治疗时, 可以增加受照射成人的脾脏菌落数 (图 2E)。
图 1.组织结构和外植体培养体系的示意图。
(A)使用股东大会外植体培养的流程图 systemto 审查化学品对干细胞发展的影响。简要地, 公司从胚胎被解剖并且培养在过滤器在气接口与化学制品稀释在 M5300 长期文化媒介。2-3 天后, 培养的公司被收集并用于检测造血相关基因的表达、菌落形成能力和重新能力。年会, 主动脉-性腺-肾;CFU 文化中的群体形成单元;CFU, 菌落形成的单位-脾脏。(B)此图中显示了年度股东大会的结构。一, 背主动脉;我, 间;G, 性腺;我是肾(C) "年度股东大会" 的形态。在 E10.5, 与周围的骨髓间充质细胞一起从胚胎体的尾部半部分离。缩放条形图 = 1 mm请单击此处查看此图形的较大版本.
图 2.应用周年大会外植体培养系统检测氟西汀对 HSC 发育的影响.(A)用定量 real-time PCR 检测10µM 公司治疗氟西汀时的Runx1的 mRNA 水平。学生的t测试: **, P 和 #60; 0.01。结果显示为平均± SEM. (B)西方印迹分析进一步证实了氟西汀治疗公司 Runx1 蛋白在蛋白质水平上的表达增加。(C)代表图像显示 BFU、CFU 和 CFU-GEMM 的形态学。缩放条形图 = 100 µm. (D) CFU 试验表明, 氟西汀治疗可增加每种菌落的数量。一个胚胎当量 (ee) 被使用。学生的t测试: *、P 和 #60; 0.05;**、P 和 #60; 0.01.The 结果以平均± SEM 显示. (E)用氟西汀公司治疗的 CFU S 测定表明, 氟西汀可以增加受照射的成年患者脾脏的菌落数量。使用了刻度线 = 1.5 毫米 1 ee。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
众所周知, 成熟的干细胞在骨髓中可以重新填充受照射的接受者的血液系统。与这些功能干细胞不同的是, 在小鼠胚胎的周年大会上出现的干细胞是不成熟的。直接移植结果表明, I 型 (ve cad+ CD45- CD41+) 和类型 II (ve cad+ CD45+) 前干细胞具有没有重构能力20。利用股东大会的外植体培养体系, 在干细胞的新生中, 可以在移植试验中重建受体4,20。此外, 由于小鼠胚胎的宫内发育,在体内进行的在活体中抢救高损伤的造血的实验是不方便的。股东大会的外植体文化是一个可供选择的系统, 它很好地适用于抢救实验, 只需将化学物质 (生长因子和细胞因子) 加入到培养基13,15中。除了周年大会, 蛋黄囊和胎儿肝脏也可以培养与此系统7。
在本试验开始时, 过滤器和不锈钢网格的严格灭菌是避免污染的重要因素。更重要的是, 文化中的关键步骤是在气界面的过滤器上培养被解剖的周年大会。过多的培养基会使股东在液体中被培养, 它可能会腐烂, 而太少的培养基会使股东大会变得枯燥。在培养过程中, 保持细胞孵化器的适当湿度对防止培养基的蒸发也很重要。
进一步改进这种外植体培养系统, 以真正模仿干细胞的发展在体内, 连同最近在化文化技术的进步21, 将大大扩大其在造血研究中的应用, 从hsc 自我更新, 多分化, 和 hsc-利基互动的疾病建模和药物发现。
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Disclosures
作者没有相互矛盾的财务利益。
Acknowledgments
我们感谢普华永在图准备方面的帮助。这项工作得到了中国国家自然科学基金 (81530004、31425016) 和中国科学技术部 (2016YFA0100500) 的资助。. 进行了实验并草拟了手稿;--编辑了手稿。两位作者阅读并批准了最后的手稿。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| durapore 0.65 µm filters | Millipore | R5BA63787 | AGM explant culture |
| M5300 long-term culture medium | Stem Cell Technologies | 5300 | AGM explant culture |
| Trizol | Tiangen | 5829 | RNA extration |
| M-MLV reverse transcriptase | Promega | 90694 | reverse transcription |
| SYBR Green | Qiagen | A6002 | quantatitive real-time PCR |
| protease inhibitor | Roche | 55622 | Protein extration |
| collagenase | Sigma | C2674 | digestion of AGM tissues |
| MethoCult GF M3434 medium | Stem Cell Technologies | 3434 | CFU-C assay |
| ultra-low attachment 24-well plates | Costar | 3473 | CFU-C assay |
| C57BL/6 CD45.2 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | CFU-S assay | |
| C57BL/6 CD45.1 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | Long-term transplantation | |
| phosphate buffered saline | Life Technologines | 8115284 | AGM Collection |
| Penicillin-Streptomycin solution | HyClone | SV30010 | AGM explant culture |
| anti-CD45.2-PE-CY7 | eBioscience | 25-0454-80 | Long-term transplantation |
| anti-CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | Long-term transplantation |
| UV lamp | Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD | 039-14402 | power: 30W |
| stainless steel mesh | AS ONE SHANGHAI Corporation | 2-9817-10 | aperture diameter: 2.5 mm |
| hydrocortisone | Sigma | H0396 | selectively diluted into M5300 medium |
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