Summary

Application du système de Culture aorte-gonades-mésonéphros Explant dans l’hématopoïèse perfectionnement

Published: November 03, 2017
doi:

Summary

Ce protocole décrit l’utilisation d’aorte-gonades-celles cultivées pour les analyses d’expression, unités formant des colonies dans la culture et de la rate et la reconstitution à long terme pour déterminer l’effet des facteurs de régulation et les voies de signalisation sur souches hématopoïétiques développement des cellules. Cela a été démontré comme un système efficace pour l’étude de fonction et la biologie de cellules souches hématopoïétiques.

Abstract

La limitation de l’utilisation des embryons de souris pour les études de l’hématopoïèse est l’inconvénient supplémentaire dans les opérations, qui est en grande partie due au développement intra-utérin de l’embryon. Bien que les données génétiques de souris knockout (KO) sont convaincants, il n’est pas réaliste pour produire des souris KO pour tous les gènes selon les besoins. En outre, effectuer en vivo sauvetage expériences afin de consolider les données obtenues des souris KO n’est pas commode. Pour surmonter ces limites, la culture d’explants d’aorte-gonades-mésonéphros (AGM) a été développée comme un système approprié d’étudier le développement de cellules souches hématopoïétiques (CSH). Surtout pour des expériences de sauvetage, il peut être utilisé pour récupérer l’hématopoïèse altérée chez les souris KO. En ajoutant les produits chimiques appropriés dans le milieu, la signalisation ayant une déficience peut être réactivée ou voies de régulation peuvent être inhibées. Avec l’utilisation de cette méthode, beaucoup d’expériences peuvent être effectuées pour identifier les régulateurs critiques du développement HSC, y compris de HSC liées à l’expression des gènes à des niveaux d’ARNm et de protéines, la capacité de formation de colonie et capacité de reconstitution. Cette série d’expériences serait utile pour définir les mécanismes sous-jacents essentiels pour le développement de l’HSC chez les mammifères.

Introduction

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont spécifiques des tissus de cellules souches adultes qui possèdent des cellules lymphoïdes et multilignée potentiel y compris érythroïdes, myéloïde, ainsi que la capacité à se renouveler. Des études récentes ont montré que les premiers autorenouveler provient d’une population endothéliale spécialisée, appelée endothélium hemogenic (HE), à travers l’endothélium de transition hématopoïétique (ISE) à la paroi ventrale de l’aorte dorsale1,2 ,3,4. Une fois formé dans la région aorte-gonades-mésonéphros (AGA) d’embryonnaire (E) 10,5 à E12.5 dans l’embryon de souris, GPX va migrer dans le foie fœtal pour l’expansion et finalement coloniser la moelle osseuse afin de maintenir l’hématopoïèse adulte tout au long de la vie d’un individu 5 , 6. bien que cela ait été étudiée pendant de nombreuses années, les mécanismes sous-jacents des HSC émergence et le développement restent incomplètement compris.

Contrairement à la fécondation in vitro et le développement de l’embryon de poisson zèbre, développement intra-utérin d’embryons de souris rend l’étude de l’hématopoïèse définitive au cours de l’embryogenèse beaucoup plus gênant. Bien que des expériences génétiques à l’aide de la souris knockout (KO) sont couramment utilisés, l’absence de certaines souris KO limite aussi leur utilisation dans le domaine de la recherche hématopoïétique. En outre, des expériences in vivo sauvetage ne sont pas facilement effectuées chez la souris KO. Depuis 1996, la culture d’explants d’AGA a été développée pour études hématopoïétiques par les pionniers dans la zone7. Avec l’aide de ce système de culture, tissus ventrales de la région d’AGA ont été identifiés pour promouvoir l’activité de l’HSC, tandis que les tissus dorsales exercent un autre effet8,9. Le système de culture des explants AGM a également été appliqué pour déterminer le rôle de la sérotonine, Mpl, SCF, BMP et HSC développement10,11,12,13, de signalisation Hedgehog 14. ce qui est important, c’est aussi une méthode populaire utilisée pour sauver des défauts hématopoïétiques en embryons mutants13,15.

Protocol

toutes les procédures y compris les sujets animaux ont été approuvés par le Comité d’examen éthique de l’Institut de zoologie, Chinese Academy of Sciences, Beijing, Chine. 1. préparation de matériel stériliser le 0,65 µm filtres avec ultraviolet rayons produits sous l’ultraviolet ray lampe sur le banc propre pendant 4 h et retourner les filtres après la marque de 2 h. Remarque : Lorsque vous travaillez avec la lumière UV, porter une protection appropriée….

Representative Results

Une publication récente a rapporté sérotonine de culture cellulaire endothéliale favorise la survie des CSH en inhibant la voie de pro-apoptotic dans l’ Assemblée générale annuelle13. Pour confirmer l’effet promoteur de la sérotonine sur le développement de l’HSC, fluoxétine a été inclus. Comme un inhibiteur de recapture de la sérotonine (ISRS), la fluoxétine a été démontrée inhibe la réabsorption de la sérotonine dans les tissus périphéri…

Discussion

Il est bien connu que CSH matures dans la moelle osseuse peut repeupler l’approvisionnement en sang des receveurs irradiés. Contrairement à ces autorenouveler fonctionnelle, le CSH émergentes dans l’Assemblée générale annuelle des embryons de souris est immatures. Transplantation directe est ressorti ce type j’ai (VE-cad+ CD45 CD41+) et type II (VE-cad+ CD45+) pre-CSH posséder aucune reconstitution capacité20. Profitant du sys…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Suwei Gao d’aide dans la préparation de la figure. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale sciences naturelles de Chine (81530004, 31425016) et le ministère des sciences et technologie de la Chine (2016YFA0100500). J.L. effectué les expériences et rédigé le manuscrit ; F.L. édition le manuscrit. Les deux auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Materials

durapore 0.65 µm filters Millipore R5BA63787 AGM explant culture
M5300 long-term culture medium Stem Cell Technologies 5300 AGM explant culture
Trizol  Tiangen 5829 RNA extration
M-MLV reverse transcriptase Promega 90694 reverse transcription
SYBR Green Qiagen A6002 quantatitive real-time PCR
protease inhibitor Roche 55622 Protein extration
collagenase Sigma C2674 digestion of AGM tissues
MethoCult GF M3434 medium Stem Cell Technologies 3434 CFU-C assay
ultra-low attachment 24-well plates Costar 3473 CFU-C assay
C57BL/6 CD45.2 mice Beijing HFK Bioscience Co. Ltd CFU-S assay
C57BL/6 CD45.1 mice Beijing HFK Bioscience Co. Ltd Long-term transplantation
phosphate buffered saline Life Technologines 8115284 AGM Collection
Penicillin-Streptomycin solution HyClone SV30010 AGM explant culture
anti-CD45.2-PE-CY7 eBioscience 25-0454-80 Long-term transplantation
anti-CD45-FITC eBioscience 11-0451-81 Long-term transplantation
UV lamp Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD 039-14402 power: 30W
stainless steel mesh AS ONE SHANGHAI Corporation 2-9817-10  aperture diameter: 2.5 mm
hydrocortisone Sigma H0396 selectively diluted into M5300 medium

References

  1. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
  2. Boisset, J. C., Robin, C. Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta. Cell cycle. 9, 2489-2490 (2010).
  3. Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
  4. Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3, 625-636 (2008).
  5. Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129, 4891-4899 (2002).
  6. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
  7. Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86, 897-906 (1996).
  8. Peeters, M., et al. Ventral embryonic tissues and Hedgehog proteins induce early AGM hematopoietic stem cell development. Development. 136, 2613-2621 (2009).
  9. Taoudi, S., Medvinsky, A. Functional identification of the hematopoietic stem cell niche in the ventral domain of the embryonic dorsal aorta. PNAS. 104, 9399-9403 (2007).
  10. Crisan, M., et al. BMP and Hedgehog Regulate Distinct AGM Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo. Stem Cell Reports. 6, 383-395 (2016).
  11. Durand, C., et al. Embryonic stromal clones reveal developmental regulators of definitive hematopoietic stem cells. PNAS. 104, 20838-20843 (2007).
  12. Fleury, M., Petit-Cocault, L., Clay, D., Souyri, M. Mpl receptor defect leads to earlier appearance of hematopoietic cells/hematopoietic stem cells in the Aorta-Gonad-Mesonephros region, with increased apoptosis. Int J Dev Biol. 54, 1067-1074 (2010).
  13. Lv, J., Wang, L., Gao, Y., Ding, Y. Q., Liu, F. 5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival. J Exp Med. 214, 529-545 (2017).
  14. Souilhol, C., et al. Inductive interactions mediated by interplay of asymmetric signalling underlie development of adult haematopoietic stem cells. Nature communications. 7, 10784 (2016).
  15. Fitch, S. R., et al. Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis. Cell Stem Cell. 11, 554-566 (2012).
  16. Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato, E., Crespi, F. Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes. Exp Brain Res. 143, 191-197 (2002).
  17. Ortiz, J., Artigas, F. Effects of monoamine uptake inhibitors on extracellular and platelet 5-hydroxytryptamine in rat blood: different effects of clomipramine and fluoxetine. Br J Pharmacol. 105, 941-946 (1992).
  18. Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine. Life sciences. 15, 471-479 (1974).
  19. Chen, M. J., Yokomizo, T., Zeigler, B. M., Dzierzak, E., Speck, N. A. Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter. Nature. 457, 887-891 (2009).
  20. Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).
  21. Muthuswamy, S. K. Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead. Development. 144, 963-967 (2017).

Play Video

Cite This Article
Lv, J., Liu, F. Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis. J. Vis. Exp. (129), e56557, doi:10.3791/56557 (2017).

View Video