Summary
このプロトコルを記述する発現解析、文化と脾臓、および長期的な再構成のコロニー形成単位の培養大動脈生殖巣中腎を使用して造血幹に及ぼす制御因子、シグナル伝達経路を決定するには細胞の開発。これは、造血幹細胞生物学、機能を研究するための効果的なシステムとして実証されています。
Abstract
マウス胚を用いた造血研究の制限は、主に胚の子宮内開発のための操作で追加の不便です。ノックアウト (KO) マウスの遺伝データが説得力のある、すべて遺伝子 KO マウスを必要に応じて生成するは現実的ではありません。さらに、生体内で実行する KO マウスから得られたデータを統合するレスキュー実験不便です。これらの制限を克服するために、大動脈性腺発生 (AGM) 培養は、造血幹細胞 (HSC) の開発を検討する適切なシステムとして開発されました。特にレスキュー実験の KO マウスの造血の障害を回復に使えます。適切な化学物質をメディアに追加すると、障害信号を再開することができます。 または調整された細道を禁じることができます。このメソッドの使用は、多くの実験は HSC の開発の重要な調整装置を識別するために実行することができます、HSC など関連する遺伝子の発現 mRNA および蛋白質レベル、コロニー形成能力および再構成能力。この一連の実験は哺乳類における HSC 開発に欠かせない根本的なメカニズムを定義するのに役立つでしょう。
Introduction
造血幹細胞 (造血)、組織固有成体幹細胞多能性赤芽球、骨髄性を含むリンパ球様細胞と自己更新する能力を持っています。最近の研究は、初期の HSCs が背側大動脈1,2 の腹側の壁で造血転移 (EHT) 血管内皮を介して hemogenic 内皮 (彼) と呼ばれる特殊な血管内皮人口に生じた示されています。 ,3,4。マウス胚における E12.5 に胚 (E) 10.5 から大動脈生殖巣中の (AGM) 地域に結成され、一度 HSCs が拡張のため胎児の肝臓に移行、最終的に個人の生活の中で成人の造血を維持するために骨髄を植民地化5,6。 これは、長年にわたって研究されている、HSC の出現と発展の基になるメカニズムの不完全な理解まま。
体外受精やゼブラフィッシュ胚の開発と違ってマウス胚の子宮内開発研究を行う決定的な造血の胚形成の間にはるかに不便。ノックアウト (KO) マウスを用いた遺伝子実験が一般に利用が特定の KO マウスの不足はまた造血研究分野での使用を制限します。さらに、レスキューを実験する生体内では、KO マウスで簡単には実行されません。1996 年以来、AGM 培養は、フィールド7の開拓者によって造血研究開発されています。この文化システムの助けを借りて、AGM 部腹側の組織は、背側の組織は、反対の効果8,9を発揮しながら、HSC の活動を促進するために識別されています。AGM 植文化システムは、セロトニン、Mpl、SCF、BMP、および HSC 開発10、11,12,13,におけるヘッジホッグのロールを判断に適用されています。14します。 重要なことは、また変異胚13,15造血欠陥を救助するために使用人気のある方法です。
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Protocol
動物科目を含むすべてのプロシージャは、中国科学院動物研究所の北京、中国の倫理審査委員会によって承認されている
。1 材料準備
- 定置滅菌、0.65 μ m フィルター紫外線光線の紫外線の下で生産 4 h 用クリーン ベンチ内でランプをレイと 2 h マークの後にフィルターを裏返して。
。 注: UV ライトを使用して、適切な保護を着用します 。
- 滅菌オートクレーブ殺菌剤 30 分のための 121 ° c でステンレス メッシュします
。 注: 気液界面でフィルターをサポートするステンレス メッシュのある特定の高さが必要し、スチール メッシュ ( 図 1 A) にワイヤーとそれを実現すます 。
- 長期的な M5300 に 10 μ M の最終濃度に希釈フルオキセチン文化メディアとミックスに均等にします
。 注: 6 ウェル プレート 2 mL M5300 長期培養培地は各ウェルに適したです。10 -6 M でヒドロコルチゾンを媒体に選択的に希釈できる 。
- 6 ウェル プレートや料理に 10 μ M でフルオキセチンを添加した培地を転送し、媒体に滅菌のステンレス メッシュを入れて 。
- は、殺菌のためガラス細胞培養皿のたびに 2 回 3 分の沸騰水で 0.65 μ m フィルターを洗ってください。[スケマティック 図 1 A のように、それぞれの洗浄、入れフィルター リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 2 分とウェット フィルター ステンレスの上に場所をメッシュ気液界面に立ってを後センター] にします
。 注: 無菌状態を達成するためにオートクレーブ滅菌器で生成水を沸騰と温度低下を避けるために機器をタイムリーにオートクレーブ滅菌器から取り除いてください 。
2。AGM 外植体文化
- は慎重に鉗子で E10.5 または E11 で胚から AGM の領域を分離します。
- 解剖はさみで妊娠マウスから子宮を除去し、子宮の胚の区別します 。
- 卵黄嚢、臍帯、胎児の体から内臓をふき取りなさい 。
- 背側神経組織や周囲の筋肉組織を慎重に削除します 。
- カットは、前部と後部の肢のサイトで鉗子で組織をオフ、胚体から AGM 地域を区切ります。 図 1B C を示す模式図と解剖 AGM の形態 。
- 2 〜 3 日の 37 ° C で 5% CO 2 液体空気インターフェイス ( 図 1 A) 文化でフィルターに別々 に切り裂かれた議事録を外植体します
。 注: はないスチール メッシュのワイヤーに切り裂かれた AGM を配置し、フィルターは、気液界面培養中かどうかを確認します。AGM、以外にも卵黄嚢と胎仔肝することができますはまた培養するこのシステム 7 と 。
3。発現解析
- mRNA レベル
- 1 mL の PBS に培養された議事録を収集し 4 ° C、6 分 310 × g で遠心分離
- 上清を除去した後フェノールの単相性ソリューションで収集した定時から総 RNA を抽出、メーカーによると ' の指示 。
- 総 RNA (2 μ g) は、逆 M MLV 逆転写酵素を使用して、テンプレートとして cDNA を取得するを転写。定量的リアルタイム PCR の試金は SYBR グリーンで実行され、Gapdh は内部統制として使用されます 。
- 蛋白質のレベル
- 3.1.1 の手順で上記のように培養 AGM を収集します 。
- セル換散バッファーと培養の AGM から蛋白質の準備 (10 mM トリス塩酸、10 mM の NaCl、および 0.5% NP 40) 13 プロテアーゼ阻害剤と前述の蛋白質のレベルを検出する西部のしみのための使用を含む説明 。
4。文化 (CFU-C) アッセイでのコロニー形成単位
- 2-3 日培養後 1 mL リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と 4 ° C、6 分 310 × g で遠心分離機に AGM 地域を収集し、37 で 200 μ L コラゲナーゼ (PBS で 0.1%) との関連付けを解除° C
注: コラゲナーゼ単一細胞懸濁液を生成するために必要な時間は約 20 分です。AGM を格納筒を振るごとに 5 分は消化プロセスを加速できます。200 μ L 0.1% コラゲナーゼは各 AGM 用、200 μ L 10% 血清反応を停止するために使用します 。
- 文化 M3434 超低添付ファイル 24 ウェル プレート中の単一細胞を懸濁液します
。 注: 汚染を避けるためには、ペニシリン ・ ストレプトマイシン液選択追加できます媒体に。M3434 媒体は粘性、ため針なし 1.0 cc 注射器が細胞と培地を混合する使用されます 。
- 後 7 - 10 日間培養 5% CO 2 の 37 ° C でコロニー形成単位の赤芽球 (BFU E)、CFU granulo, 単球 (CFU-GM) と CFU-顆粒球、バーストを含む赤血球、巨核球 (CFU ジェム) マクロファージの種類ごとの数識別形態に基づいて、倒立顕微鏡 ( 図 2 C) を獲得します 。
5。生体内で移植アッセイ
植を培養、- コロニー形成単位脾臓 (CFU-S) 試金
- 後 2 - 3 日議事録を収集し、200 μ L コラゲナーゼ (PBS で 0.1%) 20 のと孵化によって単一細胞を懸濁液の準備分
- 男性 8 に 10 週齢の c57bl/6 マウスの致死照射 (x 線の 9 Gy) を行う細胞の注入の前に 4-5 h 。
- 照射マウスを入れてその活動を制限する落 。
- 静脈の血管拡張を促進するために 75% アルコールで綿棒を使って尾を拭く 。
- 0.5 の胚と同等 (ee) または 1 ee 単一セル中断 AGM の静脈内に注入照射マウスの尾静脈 1.0 cc 注射器です
。 注: セル PBS を中断している、受信者ごとの 0.5 mL PBS、適切な音量。25 ゲージまたはサイズ 26 ゲージの針は、1.0 cc 注射器で注入に使用されます。注射器に空気を導入することができます。出血を止めるため防腐剤綿棒と注射部位を押します 。
- 11 日ポスト移植を収集、ブアンで受信者のマウスの脾臓を修正 ' s ソリューション (1.22% ピクリン酸飽和溶液 15 mL、2 mL 40% メタノールと酢酸 1 mL) 1-2 日の別の 1 〜 2 日の 80% のアルコールで洗浄。肉眼的脾臓における目に見えるコロニーをカウントし、ee あたりのコロニーの数を決定します
。 注: ブアン ' s 定着剤、摩耗の適切な保護します 。
- 長期的な移植アッセイ
- 後 2-3 日培養外植体議事録を収集し、200 μ L コラゲナーゼ (PBS で 0.1%) 20 分と孵化によって単一細胞を懸濁液の準備
- 致命的な照射 (x 線の 9 Gy) 男性 8 に 10 週齢の c57bl/6 マウスの細胞の注入の前に 4-5 時間を実行します 。
- 照射マウスを入れてその活動を制限する落 。
- 静脈の血管拡張を促進するために 75% アルコールで綿棒を使って尾を拭く 。 < l私 > 0.5 胚と同等 (ee) を挿入または 1 ee 1.0 cc 注射器で照射マウスの尾静脈に静脈内 AGM のセル中断のシングルします。AGM は 2 × 10 5 骨髄細胞 (CD45.1 背景) と受信者ごと 1 ee の用量で注入される
。 注: 空気を導入していない注射器に。出血を止めるため防腐剤綿棒と注射部位を押します 。
- 4 ヶ月間は、移植後、受信者の骨髄を収集し、FACS による再構成の試金のためにそれを使用します。持つ受信者のみ ≥ 10% ドナー由来のキメリズムが成功した再構成を展示すると見なされます 。
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Representative Results
最近の出版物は、血管内皮細胞由来セロトニン AGM13pro のアポトーシスを阻害することによって造血の生存を促進する報告しました。HSC におけるセロトニンの促進効果を確認、フルオキセチンが含まれていた。選択的セロトニン再取り込み阻害剤 (SSRI)、としてフルオキセチンは、末梢組織16,17,18にセロトニンの再吸収を阻害する実証されています。文化システムの変化、AGM を使用して、上に示した手順に従って、フルオキセチンの HSC の開発に及ぼす影響を調べた。式解析それぞれ HSC 開発19、フルオキセチン治療 AGMs mRNA および蛋白質レベルでの極めて重要な遺伝子として定義されている Runx1 の発現増加を示した (図 2Aおよび2 b)。フルオキセチンも大幅 HSCs AGM では、BFU E、CFU-GM、CFU ジェム (図 2Cと図 2D) などでのコロニー形成能力を増やすことができます。さらに、生体内移植結果、フルオキセチン治療 AGM の HSCs が照射成人レシピエント (図 2E) における脾臓コロニーの数を増やすことができます。
図 1.AGM 構造と植の模式図は文化システムです。
(A) AGM 植文化システムを使用するためのフローチャートは HSCs 開発化学物質の影響を確認します。簡単に言えば、AGMs 胚から切除し、M5300 長期的な培地の希釈の化学物質とフィルターの気液界面培養します。2-3 日後、培養定時収集および造血関連遺伝子、コロニー形成能および再作成能力発現を調べるために使用します。AGM では、大動脈-生殖腺の発生;カルチャーの CFU C, コロニー形成単位CFU-S は、コロニー形成単位脾臓。(B) AGM の構造はこの図で示されています。背側大動脈;私は、間充織;G, 生殖腺;M、中。(C) AGM の形態。AGM は、E10.5 で周囲の間葉系細胞と胚体の尾側半分から分離されています。スケール バー = 1 mm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.AGM のアプリケーションは、フルオキセチンの HSC の開発に及ぼす影響を検出する培養系を外植体します。(A)投与 10 μ M はフルオキセチンと定時でRunx1の mRNA レベルが量的なリアルタイム PCR で検出されました。スチューデントのt検定: * *、P < 0.01。結果は、平均 ± SEM. (B)ウエスタンブロット分析をさらに確認 Runx1 議事録のタンパク質レベルでの発現の増加がフルオキセチンで治療として掲載されています。(C)代表的なイメージは、BFU E、CFU-GM、CFU ジェムの形態を示します。スケールバー = 100 μ m (D) CFU C 試験では, フルオキセチン治療がコロニーの種類ごとの数を増やすことができます。1 つの胚と同等 (ee) が使用されました。スチューデントのt検定: *、P < 0.05;* *、P < 0.01.The 結果 AGMs フルオキセチンが脾臓照射成人レシピエントにおけるコロニーの数を増やすことができます, フルオキセチン治療として平均 ± SEM. (E) CFU-S の試金が表示されます。スケール バー = 1.5 mm. 1 ee が使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
骨髄で成熟した造血が照射受信者の血システムを再作成することができますが知られています。異なり、これらの機能の HSCs マウス胚の AGM で新興の HSCs は熟女ではありません。直接移植結果このような私 (VE cad+ CD45- CD41+) と II 型 (VE cad+ CD45+) 前 HSCs が再構成能力20を所有していません。AGM 植文化システム、AGM 地域における初期の HSCs の利点を取って移植アッセイ4,20の受信者を再構築できます。さらに、マウス胚の子宮内開発により KO マウスの造血の障害者を救出する生体内で実験が実行する便利です。AGM 植文化は代替システム、中13,15に (成長因子とサイトカイン) の化学物質を加えることによって単にレスキュー実験に適しています。AGM、に加えてまた卵黄嚢と胎仔肝をこのシステム7で培養することができます。
この実験の先頭には、ステンレス メッシュ フィルターの厳密な滅菌は汚染を避けるためにとても重要です。もっと重要なは、文化の重要なステップは気液界面でフィルターに切り裂かれた AGM の培養をすることです。あまりにも多くの媒体の液体培養する AGM 原因となります、少なすぎる媒体は、AGM の乾燥を作る一方、虫歯かもしれない。培養中に細胞インキュベータの適切な湿度の維持も重要です培地の蒸発を防ぐために。
これの更なる向上は HSCs の体内における文化技術21の最近の進歩と開発を本当に模倣する培養系を外植体から造血研究への応用も大きく拡充HSC の自己複製、複数系統の分化と病のモデリングおよび薬剤の発見に HSC ニッチな相互作用。
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Disclosures
著者は金融利害の対立があります。
Acknowledgments
Suwei Gao は、図の準備のヘルプを感謝いたします。この作品は、国家自然科学基金、中国の (81530004、31425016) および科学省と中国の技術 (2016YFA0100500) からの助成金によって支えられました。J. l. が、実験を行い; 原稿を起草F. l. は、原稿を編集します。著者は両方とも読み、最終原稿を承認します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| durapore 0.65 µm filters | Millipore | R5BA63787 | AGM explant culture |
| M5300 long-term culture medium | Stem Cell Technologies | 5300 | AGM explant culture |
| Trizol | Tiangen | 5829 | RNA extration |
| M-MLV reverse transcriptase | Promega | 90694 | reverse transcription |
| SYBR Green | Qiagen | A6002 | quantatitive real-time PCR |
| protease inhibitor | Roche | 55622 | Protein extration |
| collagenase | Sigma | C2674 | digestion of AGM tissues |
| MethoCult GF M3434 medium | Stem Cell Technologies | 3434 | CFU-C assay |
| ultra-low attachment 24-well plates | Costar | 3473 | CFU-C assay |
| C57BL/6 CD45.2 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | CFU-S assay | |
| C57BL/6 CD45.1 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | Long-term transplantation | |
| phosphate buffered saline | Life Technologines | 8115284 | AGM Collection |
| Penicillin-Streptomycin solution | HyClone | SV30010 | AGM explant culture |
| anti-CD45.2-PE-CY7 | eBioscience | 25-0454-80 | Long-term transplantation |
| anti-CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | Long-term transplantation |
| UV lamp | Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD | 039-14402 | power: 30W |
| stainless steel mesh | AS ONE SHANGHAI Corporation | 2-9817-10 | aperture diameter: 2.5 mm |
| hydrocortisone | Sigma | H0396 | selectively diluted into M5300 medium |
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