Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Разработка электрохимических ДНК биосенсора для обнаружения пищевых патогенов

Published: June 3, 2018 doi: 10.3791/56585
Automatic Translation
1, 2,3, 1, 4
1Laboratory of Food Safety and Food Integrity, Institute of Tropical Agriculture and Food Security, Universiti Putra Malaysia, 2Laboratory of Functional Device, Institute of Advanced Technology, Universiti Putra Malaysia, 3Department of Chemistry, Faculty of Science, Universiti Putra Malaysia, 4La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University

Summary

Протокол для развития электрохимический биодатчик ДНК, состоящий из полимолочной кислоты стабилизированный, золото-модифицированных наночастиц, трафаретной печати углерода электрода для обнаружения Vibrio parahaemolyticus представлен.

Abstract

Parahaemolyticus вибрион (V. parahaemolyticus) является общей пищевого возбудителя, что способствует значительной части проблем общественного здравоохранения во всем мире, значительно влияет на интенсивность человеческой смертности и заболеваемости. Обычные методы для обнаружения V. parahaemolyticus такие методы на основе культуры, иммунологические анализы и молекулярные методы требуют сложных пробами и длительным, утомительным и дорогостоящим. Недавно биосенсоры доказали быть перспективным и всеобъемлющий метод обнаружения с преимуществами быстрого обнаружения, экономической эффективности и практичности. Это исследование фокусируется на развитии быстрый метод обнаружения V. parahaemolyticus с высокой селективностью и чувствительность, используя принципы ДНК гибридизации. В работе характеристик синтезированных полимолочной кислоты стабилизированный наночастиц золота (пла-AuNPs) была достигнута с помощью рентгеновской дифракции (XRD), УФ видимые спектроскопии (UV-Vis), передачи электронной микроскопии (ТЕА), полевой эмиссией Растровая электронная микроскопия (FESEM) и циклической вольтамперометрии (CV). Мы также провели дальнейшее тестирование стабильности, чувствительность и воспроизводимость пла-AuNPs. Мы обнаружили, что пла-AuNPs сформировал структуру звук стабилизации наночастиц в водном растворе. Мы также наблюдали, что чувствительность улучшилось в результате меньшее значение сопротивления (Rct) переноса заряда и увеличение активной площади поверхности (0.41 см2). Развитие нашей ДНК биосенсор была основана на модификации сериграфированного углерода электрода (ШПНО) с пла-AuNPs и с использованием метиленового синего (MB) в качестве индикатора окислительно-восстановительные. Мы оценили события иммобилизации и гибридизации, дифференциальная импульсно вольтамперометрии (DPV). Мы обнаружили, что взаимодополняющими, а не взаимодополняющими, и несоответствие олигонуклеотиды отличались специально сфабрикованы биодатчик. Он также показал надежно чувствительных обнаружения в перекрестной реактивности исследований против различных пищевых патогенов и идентификации V. parahaemolyticus в свежих мидий.

Introduction

Главной темой общественных и научных дискуссий в последние годы, пищевое отравление связано главным образом с 3 агентов: микроорганизмов1, химических веществ2и3паразитов. Загрязненной пищи может привести к серьезным последствиям для здоровья людей, особенно в группе риска выше тех, с ослабленной иммунной системой, престарелых, беременных женщин, младенцев и детей младшего возраста4. С более чем миллиона случаев острой диареи, ежегодно происходящих в детей до 5 лет в Африке, Азии и Латинской Америке пищевые отравления является основной глобальной болезни5,6 и Всемирная организация здравоохранения создала микроорганизмы как наиболее важным донором7. Выделяется среди наиболее широко признанным вирулентных штаммов Vibrio parahaemolyticus . Обычно встречается в прибрежных, устьевых и морских средах8, это грамотрицательные бактерии, который становится активным в средах с высокой соли и вызывает серьезные человеческие гастроэнтерит, когда едят в вареных, засланный или сырой морской 9товаров. Кроме того существующие медицинские условия в некоторые люди делают их подверженными раневые инфекции, септицемии или ухо инфекции, возникающие от V. parahaemolyticus10. Факторы вирулентности V. parahaemolyticus гемолизинов делятся на два типа, которые способствуют патогенеза заболевания: термостабильные прямой hemolysin (TDH) закодированного tdh генов и связанные с TDH hemolysin закодированного trh генов11. Вирулентность маркеры (tdh и trh генов) V. parahaemolyticus в основном находятся в клинических образцах, а не в экологических образцов.

V. parahaemolyticus обладает способностью выжить под широкий спектр условий, быстро реагировать на изменения окружающей среды12. Механизм его распространения перерастает свой потенциал опасности, как увеличивается его токсичность параллельно с массы клеток13. Хуже того изменение климата оказывает эти бактерии с достаточно условий для ускорения роста их клеток в населения14. Из-за его высокой частоты V. parahaemolyticus необходимо контролировать по пищевой цепи поставок, особенно в торговле и производстве морепродуктов, поскольку эти продукты являются, где они находятся в огромных количествах15,16 во всем мире. В настоящее время выявляются бактерии и изолированы с помощью целого ряда методов, включая биохимические тесты, обогащения и селективного СМИ17, сорбент иммуномагнитная, энзим соединенный assay (ELISA)18, пульс поле гель-электрофорез (PFGE) 19, латексной агглютинации тесты и полимеразной цепной реакции (ПЦР) тесты20. Эти методы обычно требуют квалифицированного персонала, сложных инструментов и кропотливой методы, которые не предоставляют информацию о загрязнении немедленно. Это серьезно ограничивает вероятность оперативно обнаружения вредного загрязнения и на месте приложения. Быстрое обнаружение средства остаются нерешенные задачи.

Biosensing формируется как перспективный вариант для выявления пищевых патогенов, потому что он предлагает экономии времени, экономически эффективных, практических и в реальном времени анализ метод21,,2223,24 . Однако несмотря на многие позитивные результаты обнаружения аналита в загрязненной образцами и стандартные решения, с помощью биодатчики, есть все еще отсутствие исследований, применительно к реальным образцов в водной смеси или органические экстракты25. Недавно электрохимических биодатчики, с помощью обнаружения прямого или косвенного дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) получили повышенное внимание среди ученых, из-за их конкретных обнаружения взаимодополняющие цели через гибридизацию событий26 , 27 , 28 , 29. Эти уникальные подходы являются более стабильным по сравнению с на основе ферментов биодатчики, таким образом предлагая перспективные технологии для миниатюризации и коммерциализации. Цель исследования сообщили, вот построить быстрый инструмент, который может обнаружить V. parahaemolyticus с высокой селективностью, чувствительность и практичности, основанный на специфике последовательности ДНК при гибридизации. Идентификация стратегии включают в себя сочетание полимолочной кислоты стабилизированный наночастиц золота (пла-AuNPs)30 и сериграфированного углеродных электродов (SPCEs) при наличии индикатора гибридизации, метиленовый синий (МБ). Потенциал развитых обнаружения построить дополнительно изучить, используя образцы lysate и свежие Кокл ДНК бактерий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: Все химические и биохимические реагенты для использования должен быть чда и использованы без дальнейшей очистки. Подготовьте все решения с использованием стерильных деионизированной водой. Автоклав все стекла до стерилизации.

Предупреждение: Пожалуйста, используйте все практики безопасности при выполнении лабораторных деятельности, включая использование инженерного управления (Зонта, бардачком) и средства индивидуальной защиты (очки, перчатки, лаборатории пальто, брюки полной длины, закрытых ног обувь).

1. Изготовление и характеристика изменения электрода, используя пла-AuNPs

  1. Подготовка и квалификация пла-AuNPs
    1. Быстро добавить 10 мл раствора натрия цитрат (38.8 мм) в 100 мл кипящей кислоты раствор водный Тетрахлороауратовая (1 мм) и охлаждения до температуры окружающей среды. Наблюдать изменения в цвете в приготовленный раствор AuNPs, который начинается как желтый, изменения черноватыми и наконец заканчивается как темно красный рубин.
    2. PLA окатышей в формы из нержавеющей стали для процесса плавки и разогреть их при температуре 190 ° C для 10 min. следовать с процедурой неотложных: положить их под давлением 2,2 МПа 1 мин в рамках подготовки листа PLA. PLA лист будет готов к использованию после охлаждения для около 3 часов.
    3. Энергично помешивая, Растворите 0,68 мг НОАК листов в 5 мл хлороформа при комнатной температуре. Смешать растворенного НОАК с 10 мл раствора ранее подготовленных AuNPs и равномерно перемешать его при комнатной температуре. Однородные смеси может быть обозначается как пла-AuNPs и характеризуется с помощью UV-Vis, XRD, ТЕА и FESEM с EDX.
  2. Подготовка и характеристика модифицированных сериграфированного углеродных электродов
    Примечание: ШПНО, используемые в данном исследовании включает систему тремя электродами: Счетчик электрода, углерода рабочих электродом и Ag/AgCl электродов ссылки.
    1. Быстро пипеткой 25 мкл однородный раствор пла-AuNPs на ШПНО и затем воздух сушить за 24 часа до использования.
    2. Электрохимически характеризуют изменение электродов, ШПНО/пла-AuNPs, в Ферро цианистый калий (K3[Fe(CN)6]3 -/4 -) для измерения активной площади поверхности, электрохимических импедансной спектроскопии, повторяемость, воспроизводимость и стабильности30.

2. Разработка биосенсора электрохимических ДНК

  1. Подготовка зонда
    Примечание: Последовательности ssDNA зонд и комплементарной ДНК были выбраны на основе информации из национального центра биотехнологий информации (NCBI) базы данных.
    1. Купить синтетические олигонуклеотиды (20-mer ssDNA зонд, 20-mer комплементарной ДНК, ДНК 20-mer несоответствие и 21-mer не комплементарной ДНК) как лиофилизированный порошок из коммерческих лабораторий, основанный на следующих последовательностей:
      thiolated ssDNA зонд: 5 ′ - / 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG - 3 '
      комплементарная ДНК: 5 ' - CAGTGCTTCTGCATAATCCG - 3′
      один база несоответствие ДНК: 5 ' - CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG - 3′
      три база несоответствие ДНК: 5 ' - CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG - 3′
      не комплементарной ДНК: 5 ' - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA - 3′
    2. Подготовка запасов решения всех олигонуклеотиды (100 мкм) с помощью TE раствор стерильный (10 мм трис-HCl, 1 ЭДТА, pH 7.5), разделен на аналитической части. Оставлять это на 4 ° C, а затем сделать соответствующие разведений просто перед использованием.
  2. Оптимизация иммобилизации и гибридизации
    Примечание: ШПНО изменен с пла-AuNPs, обозначается ШПНО/пла-AuNPs, был использован для этого исследования, и метод литья drop был использован для иммобилизации ДНК и гибридизации.
    1. Во-первых, иммобилизации 25 мкл thiolated ssDNA зонда на ШПНО/пла-AuNPs и затем высушите на воздухе он за 24 ч при комнатной температуре, после чего он будет окончательно обозначается как ШПНО/пла-AuNPs/ssDNA. Определить оптимизации состояния иммобилизация с помощью трех факторов: концентрация ssDNA (от 0,2 до 1,4 мкм), времени (от 30 до 210 мин) и температуры (от 25 до 75 ° C).
    2. Пипетка 25 мкл комплементарной ДНК на поверхности ШПНО/пла-AuNPs/ssDNA осуществлять гибридизации событие, после которого он может быть окончательно обозначается ШПНО/пла-AuNPs/dsDNA. Определите оптимизации гибридизации состояния через два фактора времени (от 5 до 30 мин) и температуры (от 25 до 75 ° C).
    3. Погружать иммобилизованных и гибридизированные электродов в 20 мкм МБ на 30 мин удалить неспецифически адсорбированных ДНК и избыток MB промывкой 0,5 М ABS/20 мм NaCl (pH 4.5) и затем полоскания с деионизированной водой. Мера пиковый ток сокращения MB, используя технику DPV. Выполнение измерения DPV, используя 0,1 М PBS (рН 7) содержащий не показатель.
  3. Характеристика сфабрикованные биосенсор ДНК
    1. Погружать ШПНО/пла-AuNPs в 20 мкм МБ за 30 мин, мыть с 0.5 М ABS/20 мм NaCl (pH 4.5) и затем промойте деионизованной воды до измерения. Выполните аналогичную процедуру для всех взаимодействий, включая зонд ДНК, комплементарная ДНК, несоответствие ДНК и не дополнительные образцы ДНК.
    2. Измерьте электрохимических сокращения.
      Примечание: Мы измерили DPV, используя коммерчески выпускаемой Autolab с интерфейса программного обеспечения.
      DPV измерения электрохимических сокращения MB, выступал на потенциал, от -0,5 V до 0,25 V, с шагом потенциальных 0.005 V, амплитуда модуляции 0,05 V и скорость сканирования 7.73 mVs-1 в 0,1 М PBS (рН 7), содержащих не показатель. Избирательность, чувствительность, воспроизводимость и термической стабильности готовых биосенсора ДНК были дополнительно изучить. Полученные результаты были представлены как среднее значение измерения в трех реплицирует.

3. Проверка сфабрикованы ДНК биосенсора с использованием реальных образцов

  1. Подготовка бактериальных штаммов
    1. Выберите бактериальные образцы, основанный на их значительное загрязнение морской31,32 .
      Примечание: V. parahaemolyticus как эталонных штаммов и 8 других бактериальных штаммов (Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Salmonella энтерит, клебсиелла пневмонии, Кишечной палочки O157: H7, Bacillus cereusи alginolyticus вибрион) общего пищевого проверки электрохимический биодатчик ДНК в этом исследовании были заняты патогена.
    2. Проведение обычных суб-культуры бактериальных штаммов на их соответствующих агар каждые две недели для поддержания их жизнеспособности, обратитесь в таблице 1 для условий культуры.
    3. Поддерживать долгосрочное сохранение штаммов бактерий в их соответствующих растущих бульоны, содержащие глицерола 20% (v/v)-80 ° c, как глицерин защищает бактерии, предотвращая образование кристаллов льда, которые могут повредить их во время процесса замораживания. Далее прививать цикла культуры сохранились бактериальных клеток в глицерин запасов в соответствующих бульоны. Инкубируйте отваров согласно их соответствующим ростом времени и температуры, когда нуждающиеся возродить бактерий.
    4. Определите количество V. parahaemolyticus клеток с помощью распространения пластины техника33, стандарт и известный метод для перечисления микроорганизмов, полученных от серию разведений.
      1. Культура V. parahaemolyticus в Trypticase соевый бульон (ЦБ + 3% NaCl) при 37 ° C в условиях тряски 140 об/мин. Затем, перевести 1 мл культуры клеток бактерий на 9 мл ЦБ + 3% NaCl получить коэффициент разбавления 10-1 .
    5. Повторите этот шаг девять раз, чтобы получить полную серию коэффициент разбавления до 10-10 . Далее распространение 0,1 мл каждого разведения фактора (начиная с 10-1 до 10-10) на Vibrio селективного агар пластина для колонии, подсчета, соответственно. Инкубируйте пластины инкубируют при 37 ° C в течение 24 ч.
    6. Используйте колонии счетчик для подсчета отдельных колоний, а затем обратно рассчитать (подсчет суммы CFU/накапаны x коэффициент разрежения) чтобы получить единицу, образуя колонии, в миллилитр плотность (CFU мл-1). Производные концентрация колонии, образуя единиц (CFUs) в суспензий клеток бактерий от калибровки участок CFU мл-1 против поглощения.
  2. Подготовка анализа ПЦР
    1. Экстракт геномной ДНК после изменение вареной лизис процедура34. Во-первых, полоска индивидуальных бактериальных нагрузку на агаре СМИ и инокуляции в бульон СМИ, следуют инкубации на ее состоянии относительного роста, 140 об/мин, пожимая условие.
    2. Пипетка 1 мл культуры бульон в микро пластиковых пробирок. Центрифуга это на 4830 x g и 4 ° C в течение 1 мин для получения гранул. Используйте около 500 мкл стерильных TE буфера для ре подвеска с Пелле. Держите результате подвеска для 10 мин на 98 ± 2 ° C в блоке Отопление и немедленно охладить его при-18 ° C 10 мин Лизируйте клетки и освободить ДНК.
    3. Центрифуга геномной ДНК на 4830 x g и 4 ° C на 3 мин для получения четких подвеска и держать супернатант при-20 ° C для дальнейшего использования. Используйте biophotometer измерений с УФ поглощение на длине волны 260 Нм (как нуклеиновые кислоты поглощать волны света) и также на длине волны 280 Нм (как белки поглощать волны света) для определения концентрации и чистоту извлеченные Геномная ДНК и затем определить все штаммы с использованием стандартных биохимических анализов35 и проверка их 16S рРНК гена последовательности36. Наконец денатурировать геномной ДНК на 92 ° C на 2 мин и остывание в ледяной воде до приложения биодатчик.
    4. Далее подтвердить присутствие V. parahaemolyticus с использованием ПЦР целевого гена toxR. Выполните эту процедуру в Термоциклер с помощью пары праймера (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3 и 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3'). Оптимизируйте амплификации PCR в томе Общая реакция 25 мкл, состоящий из стерильной воды (15,5 мкл), буфер (5 мкл), грунт (1 мкл, 10 мкм), dNTP смесь (1 мкл), ДНК шаблона (2 мкл) и полимеразы дна Taq (0.2 мкл, 10 x).
    5. Хорошо перемешайте компоненты и организовать амплификации PCR последовательности целевых объектов в Термоциклер, запланированных на 30 циклов амплификации. В нашем исследовании, каждый цикл состоял из трехступенчатой реакции т.е., первоначальный денатурация (94 ° C, 3 мин) следуют 30 циклов денатурация (94 ° C, 1 мин), отжиг (63 ° C, 1.5 мин) и расширения (72 ° C, 1.5 мин), а затем окончательное расширение (72 ° C, 7 мин).
    6. Определите, усиленные продукты и их размеры через электрофорез на 1,5% агарозном геле. Захват изображения гель с системой коммерчески производимых гель документации.
  3. Подготовка образцов Кокл
    1. Получите свежие образцы.
      Примечание: Наши свежие моллюски (анадары granosa) были получены от мокрого рынка в Серданг, Селангор и быстро принес в лабораторию в ледяной кулер поле для анализа. Образцы делят на 2 группы, а именно обработанных и необработанных группы, предполагая, что моллюски были собраны равномерно с самого начала сбора урожая до их ввода в холодильных.
    2. До лечения мидий в группе обработанные, сохраняя их в-20 ° C в течение 24 ч, затем под воздействием УФ-излучения при 20 ° C за 4 ч до экстракции ДНК.
      Примечание: Температура замерзания и УФ-облучения, используемые для управляемой группы убивает или по крайней мере ограничивает естественно накопления V. parahaemolyticus в мидий. Не применять выше режим пастеризации 70 ° c, как контролируемые условия в этом исследовании призвана имитировать фактическое положение свежие моллюски. Тем временем анализировать образцы непосредственно из необработанной группы без предварительной обработки, как только они прибывают в лаборатории.
    3. Субкультура штамм V. parahaemolyticus ATCC 17802 в БСЭ (3% NaCl). Определить уровень жизнеспособных клеток в посевные через покрытие соответствующих разведений БСЭ (3% NaCl) на CA для того чтобы получить посевным материалом 104 CFU мл-1 о V. parahaemolyticus. Мыть каждый Кокл в дистиллированной воде и кустарников его свободной от грязи перед использованием стерильный пинцет в поток Ламинарный шкаф для удаления тканей из оболочки.
    4. Однородный около 10 g Кокл образцов ткани с гомогенизатор в 90 мл стерильного БСЭ (3% NaCl) для 60 s. Добавить известно количество V. parahaemolyticus до 9 мл бульона гомогенизированных образцов для загрязненной образцами. Используйте unspiked образцы как отрицательный контроль. Оценить подсчет клеток V. parahaemolyticus шипами на образцы Кокл на покрытие 0,1 мл образцов на CA, и впоследствии, закупорить 1 мл образцов в пробки microcentrifuge ДНК образца добычу, чтобы использоваться в биосенсор и ПЦР-анализа.
    5. Экстракт геномной ДНК V. parahaemolyticus с шипами и unspiked образцы после изменение вареной лизис процедура36. Наконец, определите концентрации ДНК и чистоты, используя измерения фотометр био с УФ поглощение на длине волны 260 Нм (как нуклеиновые кислоты поглощать волны света) и также на длине волны 280 Нм (как белки поглощать волны света).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Формирование AuNPs было обнаружено через изменение цвета водный раствор с натрия цитрата настоящего. Это вызвало изменения от светло-желтого к глубокий рубиново-красный цвет. Поколение пла-AuNPs было подтверждено от UV-vis спектры (рис. 1), где рост пик поверхностного плазмон резонанс (СРП) был найден на около 540 Нм. Формирование и существование пла-AuNPs было указано на 500-600 Нм длины волны колеблется, в зависимости от размера частиц37. XRD моделей AuNPs и пла-AuNPs показано на рисунке 2. Все кристаллитов пики были замечены на 2θ 31,7, 38,2%, 44,4, 64,7 и 77,7 °. Они были приписаны (100) (111) (200) (220), и (311) кристаллографических плоскостей кубической FCC (лицо центру кубический) золота (металл) наноструктур (JCPDS файл №-00-004-0783). ПЛА-AuNPs кристаллитов пика интенсивности также возросло как широкой дифракции пик сосредоточены на 31.7°, подразумевая, что AuNPs были внедрены в Ноа и предлагая формирования полифазный золото наноструктур38. Кроме того все пики дифракции AuNP, показан на пла-AuNPs отметили, что стабильной структуры AuNPs. Средний размер пла-AuNPs была рассчитана с использованием Шеррер уравнение (L = kλ/βcosθ), путем определения ширины отражения Брэгг (100). FWHM и d интервал (Таблица 2), был рассчитан размер кристаллитов пла-AuNPs как 27 Нм.

Размеры пла-AuNPs и его морфология далее были исследованы с помощью ТЕА. Кривая распределения частиц ТЕА и образы пла-AuNPs было замечено, что наночастиц золота были почти сферическую форму (рис. 3). Размер наночастиц был в диапазоне около 37 Нм, немного больше, чем полученные от Шеррер формула, предлагая поликристаллического характер наночастицы синтезированы как39. Меньший размер результате XRD в отличие от ТЕА также было отмечено в предыдущих исследованиях, скорее всего, потому что структура частиц поликристаллического в природе из-за значительного количества кристаллитов, которые меньше (суб частицы)40 . Рисунок 4 показывает FESEM изображение как подготовленные НОАК-AuNPs на ШПНО. Это видно из FESEM изображения и спектры EDX, что высокий процент веса золота, наибольшей плотности и крупнейшим поверхности наночастиц покрытия ШПНО/пла-AuNPs. Можно также отметить, в частности, что Рисунок 4() показывает изображение FESEM голые ШПНО. FESEM изображения в Рисунок 4(b) показывает хорошо распределенных пла-AuNPs. Подтвердить химический состав синтезированных пла-AuNPs', EDX использовалась для изучения химического состава как производства пла-AuNPs, в соответствии с рис. 4()и 4(b). Спектр EDX подтвердил, что как производства пла-AuNPs состояли из золота (Au) только и отображается другой элемент, за исключением пика, соответствующего углерода (C) и кислорода (O). Присутствие C пик обусловлен углерода электрода, на которую образец было падение в ролях.

Спектр EDX, также показало наличие O указанием, что кислород был адсорбированные на электроде углерода, потому, что фильм был разоблачен в воздух. Это подтверждает, что кислород является адсорбированные на углеродных нанотрубок, если они подвергаются воздействию воздуха для долгое время41. Хотя есть различные молекулы газа в воздухе, кислорода считается основным адсорбата на воздух облученных углеродных нанотрубок42, возможно из-за его быстрее адсорбции, по сравнению с другими молекулами43. Это было основано на поиске кислорода был основным адсорбата на электроде углерода во время ночного воздуха экспозиции в пробоподготовки и усилены химическая чистота пла-AuNPs. Отношение пик анодной и катодной (яПА/iийpc) был почти 1, который дал постоянной пик потенциал как сканирования Оценить увеличение44. Кроме того анодной и катодной пик потенциалов согласуются в различные проверки ставок45 предполагая, что электрохимической реакции было обратимым основан на пик разделения (рис. 5). Активную площадь поверхности модифицированных электрода была рассчитана с помощью уравнения Randles-Sevick (яpc = (2.69 × 105) n3/2 объявление1/2 Cv1/2. Со склона сюжет яpc против v1/2 в Рисунок 5() и (b), площадь поверхности электродов была рассчитана как 0.26 см2 и 0,41 см2 для голой ШПНО и пла-AuNPs соответственно. Этот результат подтвердил, что улучшения предоставляемой пла-AuNPs на активную площадь поверхности была сравнительно выше по сравнению с голыми ШПНО. Производный результат был сопоставим с размером полимер встроенный золота наночастиц (β-CD-EDAS(N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylene-diamine матрица инкапсулированные наночастиц золота), которое показало активизировать процесс высокой активной поверхности Перенос электрона и поэтому приводит к лучше чувствительность46.

Изменение ШПНО электрохимической реакции в процессе контролируемого диффузии, показано сокращение K3[Fe(CN)6]3 -/4 - пиковый ток, который в свою очередь опирается на текущем сканирования стоимость квадратного корня (v 1/2). Чтобы получить лучшее представление о модифицированных электродные свойства, было проведено исследование спектроскопии (EIS) электрохимических импеданс соотнести с исполнением модифицированных электрода, представлены в виде резюме измерений. В разделе полукруг, видели на высоких частотах коррелирует с ограничивающим процесс переноса электрона в EIS. Сопротивление теплопередаче заряда (ctR) измерялась непосредственно как диаметр полукруга. Этот результат совпадали с значением Rct голые ШПНО, который был 1932 Ω и где модификации ШПНО/пла-AuNPs снизилась до 1444 Ω (рис. 6). Уменьшение значения Rct ШПНО/пла-AuNPs может быть результатом уменьшение местных диэлектрическая проницаемость и/или увеличение толщины двойного электрического слоя47, предполагая, что K3[Fe(CN)6]3 - /4 - функции путем адсорбции на интерфейсе металла/решения. Эти выходы выполнил те производный от измерения CV (рис. 7). На пике токи увеличивалось с изменением с помощью пла-AuNPs, который показал, что более высокая чувствительность обратное нижнейctR48SPCEs. Таким образом увеличение стоимости CV модифицированных электродов и уменьшение значения Rct могло быть из-за постепенную замену молекул воды (объем молекул воды является 27.19 Å3) путем адсорбции K3 [Fe(CN)6] 3/4 - на поверхности металла, снижения степени реакции распада49.

Таблица 3 указывает относительный стандартное отклонение (RSD) повторяемости и воспроизводимости модифицированных электрода. Рутинной CV запись K3[Fe(CN)6]3-4 - было сделано шесть последовательных наборов расследовать повторяемость модифицированных электродов. RSD ШПНО/пла-AuNPs была получена как 4,26%. Электрод с пла-AuNPs модификации дал лучше RSD после нескольких измерений. Кроме того используя ту же процедуру, шесть модифицированных электродов были независимо сфабрикованы, который дал RSD значения 4.05% для ШПНО/пла-AuNPs, указывающий лучшей воспроизводимости изготовления электрода для пла-AuNPs. Изменение подложки в зависимости от пла-AuNPs хранился при 37 ° C для расширенной продолжительности. Он также использовался для записи 20 циклов и уменьшение 18% качество сигнала. Для того, чтобы достичь максимального выхода из биосенсор, периода иммобилизации, температура, вместе с были рассмотрены ssDNA концентрации и критерии для гибридизации. Эти условия необходимо оптимизировать, как они влияют на пиковый ток DPV. Чтобы оптимизировать ssDNA концентрации, ШПНО/пла-AuNPs был накапаны с различными концентрации (0,2, 0,4, 0.6, 0.8, 1.0, 1,2 и 1,4 мкм) из ssDNA 60 мин так, что оптимальной концентрации ssDNA был определен. Основываясь на рисунке 8, DPV пиковый ток увеличился, поскольку более высокие концентрации ДНК были использованы. Исследование также показало, что 1,2 мкм ssDNA оптимизированной концентрации ДНК.

Чтобы оптимизировать периода иммобилизации, с участием одноцепочечной ДНК в ШПНО/пла-AuNPs, 25 мкл ssDNA (1,2 мкм) были протестированы в разное время (30, 60, 90, 120, 150, 180-210/мин). На рисунке 9результаты показывают увеличение периода иммобилизации, что привело к непрерывное увеличение DPV пиковый ток. Таким образом оптимальная иммобилизации время ssDNA был выбран в качестве 180 мин. Для оптимизации температуры иммобилизации, ШПНО/пла-AuNPs был накапаны с ssDNA (1,2 мкм) в широком диапазоне температур (75, 65, 55, 45, 35 и 25 ° C) для 180 мин. Мы обнаружили, что когда температура иммобилизации было увеличено до 55 ° C, пиковый ток DPV первоначально обострилась после последующей амортизации (рис. 10); Таким образом 55 ° C был выбран в качестве оптимизированного иммобилизации температуры для использования в последующих экспериментов. Разделение ssDNA, неподвижной поверхности электрода и гибридизации инвалидности была вызвана повышенных температур. Там были другие доклады с аналогичные результаты50. Быстрее расщепления и дегенерации ДНК от поверхности наночастиц золота произошел на более высоких температурах51. Исследования, проведенные недавно сообщили что связь между золотом и тиоловых окисляет быстро деградирует и просто в ситуации, эмбиент, например при контакте с водой, воздуха и света52,,5354. В этом исследовании было также изучено влияние времени гибридизации.

Сфабрикованы ШПНО/пла-AuNPs/ssDNA было падение литой с раствором ДНАО цели (0,2 мкм) в различных гибридизации раз (5, 10, 15, 20, 25 и 30 мин). Ответ DPV Роза очевидно, с 5-мин, увеличение времени инкубации (от 5 до 10 минут) (Рисунок 11). Как только было получено это значение, шаблон вниз 10 до 30 мин наблюдалось так необходимое время для гибридизации был выбран в качестве 10 мин. Повысить эффективность гибридизации с увеличением температуры от 25 ° C до 35 ° C (рис. 12). Сильный ток был замечен медленно снижаться при температуре выше 35 ° C. Причина для этого была приписана сэндвич структуры денатурации сокращения обнаружения сигнала. Следовательно температура оптимальной гибридизации выбран был 35 ° C. Процесс, который мы использовали в обнаружения, V. parahaemolyticus включает AuNPs для повышения активной площади поверхности рабочих электродом, PLA посредником модификации поверхности и окислительно-восстановительного комплекса, MB, чтобы сократить его к LB. Итоги этого процесса окисления был лучше сродство между ssDNA и55МБ. DPV текущего уменьшилось из-за меньшее количество вложенных MB молекул при гибридизации ssDNA с его дополнительные последовательности.

Мы провели дальнейшие расследования в исполнении развитых биодатчик. DPV результаты на рисунке 13 показывают, что он был в состоянии различать выборочно зонд ДНК, комплементарной ДНК, один база несоответствие ДНК, три база несоответствие ДНК и не комплементарной ДНК присутствии MB как обнаружения метки56, 57. низкие пиковый ток (0,73 МКА) была выставлена на комплементарной ДНК, которая медленно увеличилось на несоответствие ДНК одной базы (0,94 МКА), три баз несоответствие ДНК (1.05 МКА), не комплементарной ДНК (3.25 МКА) и зонд ДНК (4.79 МКА). Текущий целевой ДНК был самый маленький из всех течений последовательности олигонуклеотида, позволяя нашей биосенсора для различения последовательности олигонуклеотида чутко и конкретно. MB сильно связаны с ssDNA иммобилизованных зонда ДНК, производить большой DPV пиковый ток. ШПНО/пла-AuNPs/не комплементарной ДНК сократился почти вдвое только небольшое количество МБ, собрал на поверхности ШПНО/пла-AuNPs/dsDNA иммобилизованных зонд ДНК текущего. Это может быть из-за недоступных взаимодействия между MB и гуанина баз. Взаимодействие видов ДНК и МБ сильно зависит от таких экспериментальных условиях как рН, температуры, концентрации ДНК, ионной силы и тип буфера58,59. МБ обычно ссылки dsDNA паза и intercalative режимы, обусловило накопление MB на dsDNA поверхности60. Экспозиции нашего захвата зонд ДНК один база несоответствие ДНК и три база несоответствие ДНК последовательно сокращены DPV пик течений и взаимодополняющие цели ДНК продолжение этой тенденции. Таблица 4 показывает процент избирательности курс на пик MB текущей. Наш общий вывод был высокоселективных через иммобилизованных зонд ДНК на поверхности ШПНО/пла-AuNPs гибридизации сконструированный биосенсора ДНК.

Чувствительность развитых биосенсор ДНК было дальнейшее расследование с различных концентраций олигонуклеотида взаимодополняющие цели. Рисунок 14 изображает постепенное истощение DPV пиковый ток МБ на ШПНО/пла-AuNPs как взаимодополняющие концентрации ДНК увеличилось. Рисунок 15 экспонатов линейной регрессии коэффициент 0,96, который был создан между журнал снижение MB пиковый ток и в журнал нескольких концентрации целевых ДНК (0.2 вечера до 0,02 мм). Граф пик текущие изменения (ΔP) был построены с использованием формулы 3σ/m (σ, будучи стандартное отклонение пустое решение и быть наклон линейной кривой m)61,,6263. Предела обнаружения готовых биосенсора ДНК была рассчитана, в 4:43 вечера который был больше, чем наш маленький фактически измеренное образца. Этот результат согласуется тот факт что ΔP 0: 2 вечера и 2 вечера (2,65 × 10-6 A и 2.81 × 10-6 А) со стандартным отклонением 1.19 × 10-7 A и 1.06 × 10-7 A, соответственно, перекрываются.

Чтобы вычислить LOQ для готовых биосенсор ДНК, мы использовали формулу 10σ/m в котором (σ — стандартное отклонение пустое решение и m является наклон линейной кривой) и результат, чтобы получить 14: 8 вечера. Неоднократные денатурации комплементарной ДНК была выполнена для оценки биосенсор ДНК с точки зрения его способности регенерации. Мы сделали это путем инкубации 0.2 мкм взаимодополняющих ДНК модифицированные электрода в горячей воде на 86 ° C 8 мин чтобы денатурировать двуцепочечной ДНК, а затем быстрое охлаждение в ледяной ванне для поддержания денатурированной ДНК одноцепочечной64.

Гибридизация активность поддерживалась на 91% от его первоначального ответа после 8 усилия регенерации (n = 5, RSD = 4.05%). Биосенсор ДНК, на основе метода Сэм для иммобилизации зонд ДНК на ШПНО/пла-AuNPs был весьма стабильным, достижения хороший отклик в выявлении комплементарной ДНК после неоднократных денатурации процессов. Стабильность наших ДНК биосенсор относительно тепла дополнительно изучить. Чтобы сделать это, мы хранится пла-AuNPs/ШПНО/ssDNA электрода при температуре 4 ° C, 25 ° C и 45 ° C в герметичных алюминиевых мешочек, содержащие силикагелей. В конце 6 месяцев мы оценили комплементарной ДНК и процент восстановления сигнала производства. На рисунке 16 показано, что зонд ШПНО/пла-AuNPs/ssDNA было весьма стабильным, с более чем 80% своего первоначального сигнала до сих пор для восстановления после 6 месяцев хранения. Сильная реакция между пла-AuNPs и ssDNA было установлено долгосрочной стабильности при температуре ниже 45 ° C.

Девять различных видов бактерий (B. cereus, L. monocytogenes, C. jejuni, кишечной палочки O157: H7, V. alginolyticus, S. typhimurium, S. энтерит, K. пневмония и V. parahaemolyticus) были экранированы ПЦР обнаружение. Продукты амплификации PCR для вегетационных обнаружения V. parahaemolyticus от культуры бактерий показаны на рисунке 17. Ген toxR V. parahaemolyticus , была использована как PCR праймер для V. parahaemolyticus идентификации из-за своего присутствия патогенных изолятов. Из анализа ПЦР V. parahaemolyticus показали положительные результаты из-за специфики праймера PCR toxR гена к V. parahaemolyticus. Нет продуктов ПЦР из других бактериальных штаммов были обнаружены. Текущий DPV пик, полученные после перекрестной реактивности оценки показали очень четкое определение V. parahaemolyticus по сравнению с другими видами бактерий, как показано на рисунке 18. DPV сигнала, возросло как количество пар оснований сократилась, из-за большего количества молекул MB, обязан зондов. V. parahaemolyticus смогли четко подвергаться от других пищевых патогенов, которые передразнил окружающей среды продовольственной образца.

Моллюски были выбраны в качестве реальных образцов для проверки биосенсор ДНК в этом исследовании, так как они являются Популярные ингредиенты в нескольких типах местных продуктов питания. Хорошо известно, что сырье Коклс часто несут патогенных V. parahaemolyticus и может передавать эти бактерии для людей, особенно если они являются недостаточно охлажденный во время хранения после сбора урожая65. Группе обработанных образцов Кокл температуре-20 ° C в течение 24 ч и воздействию УФ-излучения при 20 ° C за 4 ч до экстракции ДНК нашей на этапе предварительной обработки. На рисунке 19 показано, что ПЦР-анализа по направлению V. parahaemolyticus (шипами) образцы обработанных и необработанных. Это показано в переулок 7, 8, 9, 10, 11 и 12, соотнося с колонии рассчитывать в ходе предыдущей дискуссии. Не V. parahaemolyticus появляется в обработанных и необработанных образцов (unspiked), как показано в переулок 1, 2, 3, 4, 5 и 6 в результаты ПЦР, хотя число колонии указали свое присутствие в образцах. Возможной причиной для этого является наличие загрязнять метаболитов например белка в извлечения ДНК66.

Рисунок 20 обобщаются результаты обнаружения с помощью развитых биосенсор ДНК, которая успешно установлено присутствие V. parahaemolyticus в группе обработанные, состоящий из образцов шипами и unspiked. Эти результаты положительно коррелируют с ранее обсуждались результаты ПЦР. Каждый образец PCR, показали положительные результаты был открыт с помощью метода пла стабилизированный электрохимический биодатчик, который основан на AuNP, и площади пика DPV четко соответствовали Результирующие диапазоны интенсивности PCR (Рисунок 19 и Рисунок 20). Эти результаты показывают, что предлагается на основе наночастиц Электрохимический датчик в этом исследовании обнаружено V. parahaemolyticus успешно в реальных образцах, доказав тем самым, что она превосходит ПЦР с не влияет на достоверность результатов.

Figure 1
Рисунок 1 : Absorbance пла AuNPs Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Спектр рентгеновской дифракции в пла-AuNPs. Адаптирована с разрешения ссылка [30]. Авторское право (2016) Sociedade Brasileira de одной. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : ТЕА частоты Диаметр распределения и изображения пла-AuNPs на измерение масштаба 50 Нм. Перепечатано с разрешения ссылка [30]. Авторское право (2016) Sociedade Brasileira de одной. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : EDX спектры и FESEM изображения () голые ШПНО и (b) ШПНО/пла-AuNPs. Перепечатано с разрешения ссылка [30]. Авторское право (2016) Sociedade Brasileira de одной. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 : Сюжет пик текущего окисления против сканирования стоимость квадратного корня и циклических voltammograms: (a) голые ШПНО и (b) ШПНО/пла-AuNPs в 1,0 ммоль L-1 K3[Fe(CN)6] (рН 7). Сканирования ставки были 300, 250, 200, 150, 100 и 50 мВ с−1. Адаптирована с разрешения ссылка [30]. Авторское право (2016) Sociedade Brasileira de одной. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6 : Спектров импеданса модифицированных электродов в 1,0 ммоль L-1 K 3 [Fe(CN)6] (рН 7). Амплитуда: 5 МВ и диапазон частоты: 0,1-105 Гц. адаптированный с разрешения ссылка [22]. Авторское право Elsevier (2016). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7 : Тока анодного пик изменение электродов в 1,0 ммоль L-1 K 3 [Fe(CN)6] (рН 7) со скоростью сканирования 0,1 s V -1 с помощью циклической вольтамперометрии измерения Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8 : Эффект концентрации для иммобилизации ssDNA на ШПНО/пла-AuNPs в 0,1 mol L-1 PBS (рН 7) скоростью сканирования 0,1 s V -1 после 30 минут инкубации в 20 мкм MB используя дифференциальная импульсно вольтамперометрии измерения Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 9
Рисунок 9 : Эффект ssDNA иммобилизации времени на ШПНО/пла-AuNPs в 0,1 mol L -1 PBS (рН 7) со скоростью сканирования 0,1 s V -1 после 30 минут инкубации в 20 мкм MB используя дифференциальная импульсно вольтамперометрии измерения Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 10
Рисунок 10 : Влияние температуры ssDNA иммобилизации на ШПНО/пла-AuNPs со скоростью сканирования 0,1 s V -1 на 0,1 mol L -1 PBS (рН 7) после инкубационного периода 30 мин в 20 мкм MB используя дифференциальная импульсно вольтамперометрии измерения Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 11
Рисунок 11 : Эффект гибридизации времени на ШПНО/пла-AuNPs/ssDNA в 0,1 mol L -1 PBS (рН 7) со скоростью сканирования 0,1 s V -1 после 30 минут инкубации в 20 мкм MB используя дифференциальная импульсно вольтамперометрии измерения Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 12
Рисунок 12 : Влияние температуры гибридизации на ШПНО/пла-AuNPs/ssDNA в 0,1 mol L -1 PBS (рН 7) со скоростью сканирования 0,1 s V -1 после 30 минут инкубации в 20 мкм MB используя дифференциальная импульсно вольтамперометрии измерения. Перепечатано с разрешения ссылка [22]. Авторское право Elsevier (2016). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 13
Рисунок 13 : Гистограмма MB снижение пиковый ток, с использованием различных типов ДНК в 0,1 mol L –1 PBS (рН 7) со скоростью сканирования 0,1 s V -1 после 30 минут инкубации в 20 мкм МБ. Врезные иллюстрирует дифференциальная импульсно voltammograms на тех же условиях. Перепечатано с разрешения ссылка [22]. Авторское право Elsevier (2016). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 14
Рисунок 14 : Гистограмма MB снижение пиковый ток, используя различные концентрации ДНК в 0,1 mol L –1 PBS (рН 7) со скоростью сканирования 0,1 s V -1 после 30 минут инкубации в 20 мкм MB используя дифференциальная импульсно вольтамперометрии измерения. Перепечатано с разрешения ссылка [22]. Авторское право Elsevier (2016). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 15
Рисунок 15 : Линейный участок сокращения пиковый ток MB против журнале разные концентрации ДНК в 0,1 mol L -1 PBS (рН 7) со скоростью сканирования 0,1 s V -1 после 30 минут инкубации в 20 мкм MB используя дифференциальная импульсно вольтамперометрии измерения. Перепечатано с разрешения ссылка [22]. Авторское право Elsevier (2016). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 16
Рисунок 16 : Влияние различных гибридизации температур на ШПНО/пла-AuNPs/ssDNA на 6 месяцев хранения интервала (n = 3). Измерения были сделаны в 0,1 mol L-1 PBS (рН 7) со скоростью сканирования 0,1 s V-1 после 30 минут инкубации в 20 мкм MB используя дифференциальная импульсно вольтамперометрии измерения. Перепечатано с разрешения ссылка [22]. Авторское право Elsevier (2016). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 17
Рисунок 17 : Электрофорез ПЦР-амплификации гель агарозы, используя продукты последовательности гена 16S рРНК отдельных бактерий от культуры бактерий. Лейн M: 1kb ДНК лестница, Лейн C−: отрицательный контроль (стерильной дистиллированной воды), Лейн c +: положительный контроль (ДНК извлеченные из E. coli используется в качестве шаблона), Лейн EC: E. coli O157: H7, Лейн CJ: C. jejuni , Лейн до н.э.: B. cereus, Лейн КП: пневмонии K., Лейн ST: S. typhimurium, Лейн LM: л моноцитогенес, Лейн SE: S. энтерит, Лейн VP: V. parahaemolyticus и Лейн VV: V. alginolyticus пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 18
Рисунок 18 : Гистограмма MB снижение пика тока для перекрестной реактивности исследования ДНК биосенсора против различных пищевых патогенов в 0,1 mol L -1 PBS (рН 7) со скоростью сканирования 0,1 s V -1 после 30 минут инкубации в 20 мкм MB используя дифференциальная импульсно вольтамперометрии измерения. Перепечатано с разрешения ссылка [23]. Авторское право (2017) Springer. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 19
Рисунок 19 : Гель агарозы электрофореза PCR амплификация продуктов V. parahaemolyticus из свежего Кокл образцов. Лейн M: 2ul 100 bp ДНК лестницы, пер 1-3: лечить unspiked образцы, переулок 4-6: лечение unspiked образцы, переулок 7-9: лечить шипами образцы, Лейн 10-12: лечение шипами образцы, Лейн c +: положительный контроль (V. parahaemolyticus ATCC 17802), Лейн C-: отрицательный контроль (стерильной дистиллированной воды). Перепечатано с разрешения ссылка [23]. Авторское право (2017) Springer. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 20
Рисунок 20 : Гистограмма MB снижение пиковый ток для обнаружения V. parahaemolyticus в образцах свежих Кокл с помощью биосенсора ДНК в 0,1 mol L-1 PBS (рН 7) со скоростью сканирования 0,1 s V-1 после 30 минут инкубации в 20 мкм MB используя дифференциальная импульсно вольтамперометрии измерения. Перепечатано с разрешения ссылка [23]. Авторское право (2017) Springer. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Состав электрода Время инкубации (h) Температура (° C) Средства роста
Campylobacter jejuni 48 42 BA / BB
Листерий 48 30 TSA / БСЭ
Сальмонеллы typhimurium 24 37 TSA / БСЭ
Сальмонеллы enteritidis 24 37 TSA / БСЭ
Клебсиелла пневмонии 24 37 EMBA / БСЭ
Кишечной палочки O157: H7 24 37 МА / БСЭ
Bacillus cereus 24 37 МЮПА / БСЭ
Alginolyticus холерный 24 37 TSA + 3% NaCl NaCl/TSB+3%
Parahaemolyticus холерный 24 37 CA/TSA+3% NaCl/TSB+3% NaCl

Таблица 1: Культура условий отдельных бактерий.

Пример Поз [° 2.] FWHM [° 2.] d расстояние [Е] Размер кристаллитов (Нм)
ПЛА AuNPs 31.682 0.3149 2.8243 27

Таблица 2: Размер кристаллитов пла-AuNP. Адаптированный с разрешения ссылка [30]. Авторское право (2016) Sociedade Brasileira de одной.

Изменение электрод % RSD (n = 6) Снижение сигнала (%) (n = 20)
Повторяемость Воспроизводимость
ШПНО/пла AuNPs 4.26 4.05 18

Таблица 3: свойства модифицированных электродов, связанных с AuNPs и пла-AuNPs модификации в K 3 [Fe(CN)6] с 1.0 ммоль L -1 концентрация со скоростью сканирования 0,1 s V -1 . Адаптирована с разрешения ссылка [30]. Авторское право (2016) Sociedade Brasileira de одной.

Состав электрода яПА (МКА) EПА Избирательность ставка (%)
(n = 3) (V)
ШПНО/пла-AuNP/зонд ДНК 4.79 ± 0.10 -0.46 -
ШПНО/пла-AuNP/не комплементарной ДНК 3.25 ± 0,12 -0.44 67.85
Несоответствие ДНК ШПНО/пла-AuNP/3-баз 1,05 ± 0,11 -0.45 21.92
Несоответствие ДНК ШПНО/пла-AuNP/1-base 0.94 ± 0,12 -0.46 19.62
ШПНО/пла-AuNP/комплементарной ДНК 0,73 ± 0.10 -0.45 15.24

Таблица 4: DPV избирательность MB пиковый ток в 0,1 mol L -1 PBS (рН 7) со скоростью сканирования 0,1 s V -1 после инкубации 30 мин в 20 мкм MB

Состав электродов Метод обнаружения Линейный диапазон (М) Предел обнаружения (М) Ссылки
3D AuNPs DPV 1,5 х 10-6 - 7.0 × 10-9 2.0 × 10-10 69
(+) AuNPs DPV 1.0 × 10-9 - 1,5 × 10-12 2.6 × 10-12 70
AuNPs/GR DPV 1.3 × 10-9 - 2,5 × 10-11 8.3 × 10-12 71
AuNPs ЗП СОБ DPV 5,0 × 10-8 - 3.0 × 10-13  3.0 х 10-13 72
AuNPs-MPTS DPV 5,0 × 10-9 - 1.0 × 10-11  5,0 × 10-11 73
AuNPs го DPV 1.0 × 10-9 - 1.0 × 10-14 3,5 × 10-15 74
CoS / AuNPs DPV 1.0 × 10-9 - 1.0 × 10-12 7.0 × 10-13 75
ПЛА AuNPs DPV 2.0 × 10-8 - 2.0 × 10-13 5.3 × 10-12 Эта работа

Таблица 5: Сравнение некоторых недавно разработанных электрохимических Наносенсоры ДНК. Перепечатано с разрешения ссылка [22]. Авторское право (2016) Elsevier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Важнейшие шаги в рамки для успешного развития этого типа электрохимический биодатчик являются подбор соответствующих биологических распознавания элементов для преобразователя (нуклеиновые кислоты или ДНК здесь); химический подход для построения зондирования слой преобразователя; трансдукция материал; Оптимизация ДНК иммобилизации и гибридизации; и проверка развитых биосенсора с использованием реальных образцов.

Основной вклад в успешное развитие чувствительных и селективного электрохимического ДНК биосенсор, является оптимизация состояние иммобилизации и гибридизации. В этой работе мы использовали MB как окислительно-восстановительного комплекса. Существуют различные принципы взаимодействия MB-ДНК: (i), электростатического взаимодействия MB катионного заряда с костяк фосфата анионные заряд ssDNA и dsDNA; (ii) путем интеркаляции MB через успешное включение MB между чередование пар оснований G-C в dsDNA; (iii) путем ковалентной связи до конца целевого ssDNA, который производит метка низкой плотности (MB одного или двух молекул в ДНК); и (iv) MB взаимодействиями с несвязанных гуанина в ssDNA. Мы применили четвертый принцип, который точно идентифицирует V. parahaemolyticus от перекрестная реактивность бактерий и свежие моллюски. После окисления особый интерес был сильнее сходство между MB и ssDNA. Гибридизация ssDNA с его дополнительные последовательности заменяет кабального молекул MB и таким образом уменьшает сигнал.

Серии экспериментальных результатов, представленных выше фокусируется на разработку метода быстрого обнаружения V. parahaemolyticus с высокой селективностью и чувствительность, используя принципы ДНК гибридизации. Первым шагом является синтез и характеристика полимолочной кислоты стабилизированный наночастиц золота (пла-AuNPs) для модификации электрода (рисунки 1-6 и Таблица 2). Качество наночастиц золота оценивалась с использованием УФ видимые спектроскопии (UV-Vis), рентгеновская дифрактометрия (XRD), Автоэмиссионные сканирование электронной микроскопии (FESEM), передачи электронной микроскопии (ТЕА), циклической вольтамперометрии (CV) и Анализ импеданса. Второй частью развития участвует электрохимические характеристики модифицированных электрода (7-12 цифр и Таблица 3-4), который определяет Успешное повышение модифицированных электрода относительно голый электрод в условия обнаружения событий гибридизации.

Третий этап развития биосенсор на основе ДНК была основана на оптимизации экспериментальных условий событий гибридизации и применение развитых биосенсора для обнаружения фактических возбудителя (цифры 13-20). Гибридизация событие, которое определяет успех обнаружения возбудителя была оценена с помощью дифференциальная импульсно вольтамперометрии (DPV). Положительные существование целенаправленных возбудителя было указано через снижение тока. Чувствительность развитых биосенсор оценивалась путем строительства участка калибровки и расчет Лод (Рисунок 15). Сфабрикованы биосенсор был в состоянии различать специально V. parahaemolyticus от других патогенов, основанные на различных уровнях текущего сокращения (цифры 17 и 18). Оценки целесообразности развитых биосенсора для обнаружения V. parahaemolyticus в пример фактического питания представлена в цифры 19 и 20 и позитивные существование целенаправленных возбудителя обозначается уменьшения тока . Успешное развитие на основе ДНК биодатчики сильно зависит от выбора зонд ДНК, повышение модифицированных электрода, а также оптимизации экспериментальных условий. ДНК-зонд здесь был адаптирован от предыдущей работы Накано67. Повышение модифицированных электродов была выполнена с помощью наночастиц золота, стабилизировалось с polylactic кислотой для включения стандартизации наноразмерные. Функцию наночастиц золота как электро каталитических материалов68 и закон, чтобы увеличить скорость передачи электрона, а также обеспечить поверхность, на которой якорь ДНК-зонд. Экспериментальные параметры были оптимизированы с точки зрения температуры и инкубации время, которое имеет решающее значение для ДНК для дуплексной форме. Гибридизация Температура влияет на разделение между неспецифической адсорбционной и это повышает избирательность датчика. Время инкубации гибридизации увеличивает шансы дуплекс формирования. Иммобилизация процедура должна быть оптимизирована для того, чтобы убедиться, что ДНК-зонд будет в подходящую ориентацию дуплекс формирования форму.

Таблица 5 сравнить в пример недавно разработали электрохимических ДНК биодатчики69,70,,7172,73,74,75 ,. На основе ДНК biosensing является перспективным методом для замены методы молекулярной основе, хотя есть несколько ограничений, которые должны быть рассмотрены, прежде чем этот метод может быть достаточно портативный для использования на месте. Основным ограничением является пример обработки экстракции ДНК как чистоту и количество ДНК, извлеченные на сайте не может быть так хорошо, как, добытых стандартного лабораторного метода. Это, однако, является перспективной альтернативой если ПЦР и гель электрофореза может быть заменен с предварительной выборки системы например microfluidic.

Биосенсоры на основе ДНК потенциально полезны для многих приложений, включая медицинской диагностики, мониторинга окружающей среды и контроля продуктов питания. Этот метод позволит онлайн мониторинг процессов контроля качества, а также мониторинг точки обслуживания пациентов. Переносимость вся датчик системы позволит Децентрализация диагностических процессов, где потребитель может использовать системы обнаружения в комфорте их дома.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы отметить поддержку Universiti Путра Малайзия.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Merck 100056
Chloroform Merck 102445
Diaminoethane tetraacetic acid Promega E5134
Dibasic sodium phosphate  Sigma-Aldrich S9763
Disodium hydrogen phosphate Sigma-Aldrich 255793
Ethanol  Sigma-Aldrich 16368
Gold (III) chloride trihydrate Sigma-Aldrich 520918
Hydrochloric acid Merck 100317
Methylene blue Sigma-Aldrich M44907
Monobasic sodium phosphate, monohydrate Sigma-Aldrich S3522
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich P5119
Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D NatureWorks 4042D
Potassium chloride R&M Chemicals 59435
Potassium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich P9791
Potassium hexacyanoferrate III R&M Chemicals 208019
Sodium acetate anhydrous salt Sigma-Aldrich S2889
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888
Trisodium citrate Sigma-Aldrich S1804
Tris(hydroxymethyl) aminomethane Fisher Scientific T395-100
Tris-Base Fisher Scientific BP152-500
2X PCR Master Mix with Dual-Dye Norgen Biotek 28240
Agarose gel Merck 101236
Bolton Agar Merck 100079
Bolton Broth Merck 100079
CHROMagar Vibrio CHROMagar VB910
dNTPs Promega U1511
Nuclease-free water Thermo Scientific R0581
Eosin methylene blue agar  Merck 101347
GelRed Biotium 41001
Glycerol Merck 104092
Go Taq Buffer Promega M7911
Loading dye 100 bp DNA ladder Promega G2101
Loading dye 1kb DNA ladder Promega G5711
Magnesium chloride Promega 91176
Mannitol egg yolk polymyxin agar Merck 105267
McConkey Agar Merck 105465
Nutrient Broth Merck 105443
Taq polymerase Merck 71003
Trypticase Soy Broth Merck 105459
Trypticase Soy Agar Merck 105458

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gould, L. H., Rosenblum, I., Nicholas, D., Phan, Q., Jones, T. F. Contributing factors in restaurant-associated foodborne disease outbreaks, FoodNet sites, 2006 and 2007. Journal of Food Protection. 76, 1824-1828 (2013).
  2. Arvanitoyannis, I. S., Kotsanopoulos, K. V., Papadopoulou, A. Rapid detection of chemical hazards (toxins, dioxins, and PCBs) in seafood. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 54, 1473-1528 (2014).
  3. Robertson, L. J., Sprong, H., Ortega, Y. R., van der Giessen, J. W. B., Fayer, R. Impacts of globalisation on foodborne parasites. Trends in Parasitology. 30, 37-52 (2014).
  4. Sandilands, E. A., Bateman, D. N. The epidemiology of poisoning. Medicine. 44, 76-79 (2016).
  5. Boschi-Pinto, C., Velebit, L., Shibuya, K. Estimating child mortality due to diarrhoea in developing countries. Bulletin of the World Health Organization. 86, 710-717 (2008).
  6. Farthing, M. J. G. Diarrhoea: A Significant Worldwide Problem. International Journal of Antimicrobial Agents. 14, 65-69 (2000).
  7. World Health Organization. WHO estimates of the global burden of foodborne diseases: foodborne disease burden epidemiology reference group 2007-2015. , 1-255 (2015).
  8. Yeung, M., Boor, K. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathogens and Disease. 1, 74-88 (2004).
  9. Sakazaki, R. Foodborne Diseases. Cliver, D. O., Riemann, H. P. , Academic Press. 127-136 (2002).
  10. Grochowsky, J., Odom, S. R., Akuthota, P., Stead, W. Primary Septicemia and Abdominal Compartment Syndrome From Vibrio parahaemolyticus Infection in a 40-Year-Old Patient With No Known Immunocompromise. Infectious Disease in Clinical Practice. 22, (2013).
  11. Raghunath, P. Roles of thermostable direct hemolysin (TDH) and TDH-related hemolysin (TRH) in Vibrio parahaemolyticus. Frontiers in Microbiology. 5, 805 (2014).
  12. Kalburge, S. S., Whitaker, W. B., Boyd, E. F. High-Salt Preadaptation of Vibrio parahaemolyticus Enhances Survival in Response to Lethal Environmental Stresses. Journal of Food Protection. 77, 246-253 (2014).
  13. Esteves, K., Hervio-Heath, D., Mosser, T., Rodier, C., Tournoud, M. G., Jumas-Bilak, E., Colwell, R. R., Monfort, P. Rapid proliferation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, and Vibrio cholerae during freshwater flash floods in French Mediterranean Coastal lagoons. Applied and Environmental Microbiology. 81, 7600-7609 (2015).
  14. Khandeparker, L., Anil, A. C., Naik, S. D., Gaonkar, C. C. Daily variations in pathogenic bacterial populations in a monsoon influenced tropical environment. Marine Pollution Bulletin. 96, 337-343 (2015).
  15. Caburlotto, G., Suffredini, E., Toson, M., Fasolato, L., Antonetti, P., Zambon, M., Manfrin, A. Occurrence and molecular characterization of Vibrio parahaemolyticus in crustaceans commercialised in Venice area, Italy. International Journal of Food Microbiology. 220, 39-49 (2016).
  16. Wong, H. C., Chen, M. C., Liu, S. H., Liu, D. P. Incidence of highly genetically diversified Vibrio parahaemolyticus in seafood imported from Asian countries. International Journal of Food Microbiology. 52, 181-188 (1999).
  17. Rosec, J. P., Causse, V., Cruz, B., Rauzier, J., Carnat, L. The international standard ISO/TS 21872-1 to study the occurence of total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae in seafood: ITS improvement by use of a chromogenic medium and PCR. International Journal of Food Microbiology. 157, 189-194 (2012).
  18. Maniyankode, R. A., Kingston, J. J., Murali, H. S., Batra, H. V. Specific identification of vibrio parahaemolyticus employing monoclonal antibody based immunoassay. International Journal of Pharmacy and Biological Sciences. 4 (2), B156-B164 (2013).
  19. Suffredini, E., Lopez-Joven, C., Maddalena, L., Croci, L., Roque, A. Pulsed-field gel electrophoresis and PCR characterization of environmental Vibrio parahaemolyticus strains of different origins. Applied and Environmental Microbiology. 77, 6301-6304 (2011).
  20. Bhattacharyya, N., Hou, A. A pentaplex PCR assay for detection and characterization of Vibrio vulnificus and Vibrio parahaemolyticus isolates. Letters in Applied Microbiology. 57, 233-240 (2013).
  21. da Silva, E. T. S. G., et al. Electrochemical Biosensors in Point-of-Care Devices: Recent Advances and Future Trends. ChemElectroChem. 4 (4), 778-794 (2017).
  22. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hushiarian, R. Sensitive detection of multiple pathogens using a single DNA probe. Biosensors and Bioelectronics. 86, 398-405 (2016).
  23. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hushiarian, R. A simple, portable, electrochemical biosensor to screen shellfish for Vibrio parahaemolyticus. AMB Express. 7 (1), 41 (2017).
  24. Zhang, J., Li, Z., Zhang, H., Wang, J., Liu, Y., Chen, G. Rapid detection of several foodborne pathogens by F0F1-ATPase molecular motor biosensor. Journal of Microbiological Methods. 93, 37-41 (2013).
  25. Barsan, M. M., Ghica, E. M., Brett, C. M. A. Portable biosensing of food toxicants and environmental pollutants. Nikolelis, D. P., Varzakas , T., Erdem, A., Nikoleli, G. P. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Boca Raton. 33-69 (2014).
  26. Kwun, J., Yun, S., Park, L., Lee, J. H. Development of 1,1'-oxalyldiimidazole chemiluminescent biosensor using the combination of graphene oxide and hairpin aptamer and its application. Talanta. 119, 262-267 (2014).
  27. Thavanathan, J., Huang, N. M., Thong, K. L. Colorimetric biosensing of targeted gene sequence using dual nanoparticle platforms. International Journal of Nanomedicine. 10, 2711-2722 (2015).
  28. Hushiarian, R., Yusof, N. A., Abdullah, A. H., Ahmad, S. A. A., Dutse, S. W. Facilitating the indirect detection of genomic DNA in an electrochemical DNA biosensor using magnetic nanoparticles and DNA ligase. Analytical Chemistry Research. 6, 17-25 (2015).
  29. Dutse, S. W., Yusof, N. A., Ahmad, H., Hussein, M. Z., Zainal, Z., Hushiarian, R., Hajian, R. An Electrochemical Biosensor for the Determination of Ganoderma boninense Pathogen Based on a Novel Modified Gold Nanocomposite Film Electrode. Analytical Letters. 47 (5), 819-832 (2014).
  30. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hajian, R. Characterization of Polylactide-Stabilized Gold Nanoparticles and Its Application in the Fabrication of Electrochemical DNA Biosensors. Journal of the Brazilian Chemical Society. 27 (9), 1679-1686 (2016).
  31. Vongkamjan, K., Wang, S., Moreno Switt, A. I. Rapid detection of foodborne bacterial pathogens in seafood. Handbook of Seafood: Quality and Safety Maintenance and Applications. , 247-257 (2016).
  32. Wang, F., Jiang, L., Yang, Q., Han, F., Chen, S., Pu, S., Vance, A., Ge, B. Prevalence and antimicrobial susceptibility of major foodborne pathogens in imported seafood. Journal of Food Protection. 74 (9), 1451-1461 (2011).
  33. Szermer-Olearnik, B., Sochocka, M., Zwolinska, K., Ciekot, J., Czarny, A., Szydzik, J., Kowalski, K., Boratynski, J. Comparison of microbiological and physicochemical methods for enumeration of microorganisms. Postepy Higieny i Medycyny Doswiadczalnej. 68, 1392-1396 (2014).
  34. Ivanov, I. G., Bachvarov, D. R. Determination of plasmid copy number by the "boiling" method. Analytical Biochemistry. 165 (1), 137-141 (1987).
  35. Gopireddy, V. R. Biochemical tests for the identification of bacteria. International Journal of Pharmacy and Technology. 3 (4), 1536-1555 (2011).
  36. Böhme, K., Fernández-No, I. C., Pazos, M., Gallardo, J. M., Barros-Velázquez, J., Cañas, B., Calo-Mata, P. Identification and classification of seafood-borne pathogenic and spoilage bacteria: 16S rRNA sequencing versus MALDI-TOF MS fingerprinting. Electrophoresis. 34 (6), 877-887 (2013).
  37. Seoudi, R., Fouda, A. A., Elmenshawy, D. A. Synthesis, characterization and vibrational spectroscopic studies of different particle size of gold nanoparticle capped with polyvinylpyrrolidone. Physica B: Condensed Matter. 405, 906-911 (2010).
  38. Mishra, A., Harper, S., Yun, S. I. Interaction of biosynthesized gold nanoparticles with genomic DNA isolated from E. coli and S. aureus. Nanotechnology (IEEE-NANO). , 1745-1750 (2011).
  39. Sugimoto, T. Formation of modoispersed nano- and micro-particles controlled in size, shape, and internal structure. Chemical Engineering and Technology. 26, 313-321 (2003).
  40. Rath, C., Sahu, K. K., Kulkarni, S. D., Anand, S., Date, S. K., Das, R. P., Mishra, N. C. Microstructure-dependent coercivity in monodispersed hematite particles. Applied Physics Letters. 75, 4171-4173 (1999).
  41. Abbas, M., Wu, Z. Y., Zhong, J., Ibrahim, K., Fiori, A., Orlanducci, S., Sessa, V., Terranova, M. L., Davoli, I. X-ray absorption and photoelectron spectroscopy studies on graphite and single-walled carbon nanotubes: Oxygen effect. Applied Physics Letters. 87 (5), 051923 (2005).
  42. Lim, S. C., Choi, Y. C., Jeong, H. J., Shin, Y. M., An, K. H., Bae, D. J., Lee, Y. H., Lee, N. S., Kim, J. M. Effect of gas exposure on field emission properties of carbon nanotubes arrays. Advanced Materials. 13, 1563-1567 (2001).
  43. Kim, B. H., Kim, B. R., Seo, Y. G. A study on adsorption equilibrium for oxygen and nitrogen into carbon nanotubes. Adsorption. 11, 207-212 (2005).
  44. Bard, A. J., Faulkner, L. R. Electrochemical methods: Fundamentals and applications. , John Wiley & Sons Inc. (2000).
  45. Tan, Q., Wang, L., Ma, L., Yu, H., Ding, J., Liu, Q., Xiao, A., Ren, G. Study on anion electrochemical recognition based on a novel ferrocenyl compound with multiple binding sites. Journal of Physical Chemistry B. 112, 11171-11176 (2008).
  46. Manivannan, S., Ramaraj, R. Polymer-embedded gold and gold/silver nanoparticle-modified electrodes and their applications in catalysis and sensors. Pure and Applied Chemistry. 83, 2041-2053 (2011).
  47. Benali, O., Larabi, L., Traisnel, M., Gengembre, L., Hareka, Y. Electrochemical, theoretical and XPS studies of 2-mercapto-1-methylimidazole adsorption on carbon steel in 1 M HClO4. Applied Surface Science. 253, 6130-6139 (2007).
  48. Shi, Y., Wen, L., Li, F., Cheng, H. M. Nanosized Li4Ti5O12/graphene hybrid materials with low polarization for high rate lithium ion batteries. Journal of Power Sources. 196, 8610-8617 (2011).
  49. Bentiss, F., Traisnel, M., Lagrenee, M. The substituted 1,3,4-oxadiazoles: a new class of corrosion inhibitors of mild steel in acidic media. Corrosion Science. 42, 127-146 (2000).
  50. Wang, M., Gong, W., Meng, Q., Zhang, Y. Electrochemical DNA impedance biosensor for the detection of DNA hybridization with polymeric film, single walled carbon nanotubes modified glassy carbon electrode. Russian Journal of Electrochemistry. 47, 1368-1373 (2011).
  51. Herdt, A. R., Drawz, S. M., Kang, Y., Taton, T. A. DNA dissociation and degradation at gold nanoparticle surfaces. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 51 (2), 130-139 (2006).
  52. Bhatt, N., Huang, P. J. J., Dave, N., Liu, J. Dissociation and degradation of thiol-modified DNA on gold nanoparticles in aqueous and organic solvents. Langmuir. 27, 6132-6137 (2011).
  53. Liu, X., Jang, C. H., Zheng, F., Jürgensen, A., Denlinger, J. D., Dickson, K. A., Raines, R. T., Abbott, N. L., Himpsel, F. J. Characterization of protein immobilisation at silver surfaces by near edge X-ray absorption fine structure spectroscopy. Langmuir. 22, 7719-7725 (2006).
  54. Willey, T. M., Andrew, L., Vance, T., Buuren, V., Bostedt, C., Terminello, L. J., Fadley, C. S. Rapid degradation of alkanethiol-based self-assembled monolayers on gold in ambient laboratory conditions. Surface Science. 576 (1), 188-196 (2005).
  55. Farjami, E., Clima, L., Gothelf, K., Ferapontova, E. E. DNA interactions with a Methylene Blue redox indicator depend on the DNA length and are sequence specific. Analyst. 135, 1443-1448 (2010).
  56. Lin, X., Ni, Y., Kokot, S. An electrochemical DNA-sensor developed with the use of methylene blue as a redox indicator for the detection of DNA damage induced by endocrine-disrupting compounds. Analytica Chimica Acta. 867, 29-37 (2015).
  57. Zhang, F. T., Nie, J., Zhang, D. W., Chen, J. T., Zhou, Y. L., Zhang, X. X. Methylene Blue as a G-Quadruplex Binding Probe for Label-Free Homogeneous Electrochemical Biosensing. Analytical Chemistry. 86, 9489-9495 (2014).
  58. Ning, L., Li, X., Yang, D., Miao, P., Ye, Z., Li, G. Measurement of Intracellular pH Changes Based on DNA-Templated Capsid Protein Nanotubes. Analytical Chemistry. 86, 8042-8047 (2014).
  59. Sani, N. D. M., Heng, L. Y., Surif, S., Lazim, A. M., et al. AIP Conference Proceedings. Murad, A., et al. 1571, 636-640 (2013).
  60. Xu, P., Wang, J., Xu, Y., Chu, H., Shen, H., Zhang, D., Zhao, M., Liu, J., Li, G. Binding modes and interaction mechanism between different base pairs and methylene blue trihydrate: a quantum mechanics study. Advances in Experimental Medicine and Biology. 827, 187-203 (2015).
  61. Guo, Y., Chen, J., Chen, G. A label-free electrochemical biosensor for detection of HIV related gene based on interaction between DNA and protein. Sensors & Actuators, B: Chemical. 184, 113-117 (2013).
  62. Huang, K. J., Liu, Y. J., Wang, H. B., Wang, Y. Y., Liu, Y. M. Sub-femtomolar DNA detection based on layered molybdenum disulfide/multi-walled carbon nanotube composites, au nanoparticle and enzyme multiple signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 55, 195-202 (2014).
  63. Kong, R. M., Song, Z. L., Meng, H. M., Zhang, X. B., Shen, G. L., Yu, R. Q. A label-free electrochemical biosensor for highly sensitive and selective detection of DNA via a dual-amplified strategy. Biosensors and Bioelectronics. 54, 442-447 (2014).
  64. Rashid, J. I. A., Yusof, N. A., Abdullah, J., Hashim, U., Hajian, R. Novel Disposable Biosensor Based on SiNWs/AuNPs Modified-Screen Printed Electrode for Dengue Virus DNA Oligomer Detection. IEEE Sensors Journal. 15, 4420-4421 (2015).
  65. Yingkajorn, M., Sermwitayawong, N., Palittapongarnpimp, P., Nishibuchi, M., Robins, W. P., Mekalanos, J. J., Vuddhakul, V. Vibrio parahaemolyticus and its specific bacteriophages as an indicator in cockles (Anadara granosa) for the risk of V. parahaemolyticus infection in Southern Thailand. Microbial Ecology. 67, 849-856 (2014).
  66. Ahmad Ganaie, H., Ali, M. N. Short term protocol for the isolation and purification of DNA for molecular analysis. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research. 24, 266-270 (2014).
  67. Nakano, K., Kimura, T., Kitamura, Y., Ihara, T., Ishimatsu, R., Imato, T. Potentiometric DNA sensing platform using redox-active DNA probe pair for sandwich-type dual hybridization at indicator electrode surface. Journal of Electroanalytical Chemistry. 720-721, 71-75 (2014).
  68. Yang, J., Jim Yang, L., Heng-Phon, T., Gan-Moog, C. Inhibition of DNA hybridization by small metal nanoparticles. Biophysical Chemistry. 120, 87-95 (2006).
  69. Niu, L. M., Liu, F., Wang, W., Lian, K. Q., Ma, L., Shi, H. M., Kang, W. J. Electrochemical Behavior of Paraquat on a Highly Ordered Biosensor Based on an Unmodified DNA-3D Gold Nanoparticle Composite and Its Application. Electrochimica Acta. 153, 190-199 (2015).
  70. Li, Z., Miao, X., Xing, K., Zhu, A., Ling, L. Enhanced electrochemical recognition of double-stranded DNA by using hybridization chain reaction and positively charged gold nanoparticles. Biosensors and Bioelectronics. 74, 687-690 (2015).
  71. Niu, S., Sun, J., Nan, C., Lin, J. Sensitive DNA biosensor improved by 1,10-phenanthroline cobalt complex as indicator based on the electrode modified by gold nanoparticles and graphene. Sensors and Actuators B: Chemical. 176, 58-63 (2013).
  72. Yi, H., Xu, W., Yuan, Y., Bai, L., Wu, Y., Chai, Y., Yuan, R. A pseudo triple-enzyme cascade amplified aptasensor for thrombin detection based on hemin/G-quadruplex as signal label. Biosensors and Bioelectronics. 54, 415-420 (2014).
  73. Das, R., Sharma, M. K., Rao, V. K., Bhattacharya, B. K., Garg, I., Venkatesh, V., Upadhyay, S. An electrochemical genosensor for Salmonella typhi on gold nanoparticles-mercaptosilane modified screen printed electrode. Journal of Biotechnology. 188, 9-16 (2014).
  74. Han, X., Fang, X., Shi, A., Wang, J., Zhang, Y. An electrochemical DNA biosensor based on gold nanorods decorated graphene oxide sheets for sensing platform. Analytical Biochemistry. 443 (2), 117-123 (2013).
  75. Huang, K. J., Liu, Y. J., Zhang, J. Z., Cao, J. T., Liu, Y. M. Aptamer/Au nanoparticles/cobalt sulfide nanosheets biosensor for 17β-estradiol detection using a guanine-rich complementary DNA sequence for signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 67, 184-191 (2015).

Tags

Биоинженерии выпуск 136 полимолочной кислоты стабилизированный наночастиц золота сериграфированного углеродных электродов биосенсор ДНК Vibrio parahaemolyticus Электрохимический датчик гибридизация ДНК
Разработка электрохимических ДНК биосенсора для обнаружения пищевых патогенов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nordin, N., Yusof, N. A., Radu, S.,… More

Nordin, N., Yusof, N. A., Radu, S., Hushiarian, R. Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen. J. Vis. Exp. (136), e56585, doi:10.3791/56585 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter