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Bioengineering

食品由来病原体を検出する電気化学的 DNA のバイオ センサーの開発

Published: June 3, 2018 doi: 10.3791/56585
Automatic Translation
1, 2,3, 1, 4
1Laboratory of Food Safety and Food Integrity, Institute of Tropical Agriculture and Food Security, Universiti Putra Malaysia, 2Laboratory of Functional Device, Institute of Advanced Technology, Universiti Putra Malaysia, 3Department of Chemistry, Faculty of Science, Universiti Putra Malaysia, 4La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University

Summary

腸炎ビブリオを検出するポリ酸安定、金ナノ粒子修飾、スクリーン印刷された炭素電極を構成する電気化学的 DNA センサーの開発のためのプロトコルが表示されます。

Abstract

(ビブリオ) 腸炎ビブリオ、人間の死亡率と罹患率に大きな影響を与える公衆衛生問題の大きい割合にグローバルに貢献する一般的な食中毒病原体であります。文化法、免疫アッセイと分子手法など腸炎ビブリオの検出のための従来の方法は、複雑なサンプル処理を必要し、時間がかかり、退屈な高価です。最近では、バイオ センサー高速検出、費用対効果、および実用性の利点を持つ有望な包括的な検出方法であると証明しました。この研究は、急速な高選択性と感度のハイブリダイゼーションの原則を使用して腸炎ビブリオ検出法の開発に焦点を当てます。仕事で合成したポリ酸安定の金ナノ粒子 (PLA によって金ナノ粒子) の評価は、x 線回折 (XRD)、紫外可視分光法 (紫外-可視)、透過型電子顕微鏡 (TEM)、電界放出を使用して達成されました。走査型電子顕微鏡 (FESEM) およびサイクリックボルタンメトリー (CV)。さらに、PLA 結果の再現性、感度、安定性のテストを行いました。わかった PLA によって金ナノ粒子が水溶液中で安定化されたナノ粒子の音構造を形成します。また電荷転送の抵抗 (Rct) 値を小さくと活性表面積 (0.41 cm2) の増加の結果として感度が改善したことが観測されました。私たちの DNA のバイオ センサーの開発は、PLA によって金ナノ粒子と酸化還元指示薬としてメチレン ブルー (MB) を使用してスクリーン印刷されたカーボン電極 (空間) の修正に基づいていた。差動パルス ・ ボルタンメトリー (DPV) による固定化と交配イベントを評価しました。相補、補完的、ことがわかったし、不一致のオリゴヌクレオチドは具体的に試作したバイオ センサーによって区別されていました。様々 な食品媒介病原体に対する交差反応性の研究、新鮮な貝で腸炎ビブリオの同定、また確実に高感度検出を分かった。

Introduction

近年公共および学術の議論の主要なトピック、食中毒は主に 3 のエージェントに関連付けられている: 微生物1化学2、および寄生虫3。汚染された食物は、人間、特に免疫力が弱い、高齢者、妊婦、赤ちゃん、幼児4とのそれらのより高いリスク グループの深刻な健康の結果を可能性があります。アフリカ、アジア、およびラテン アメリカの 5 歳未満の子供で毎年発生する急性下痢の以上 100 万の場合、食中毒は、世界の主要な疾患5,6と世界保健機関が確立最も重要な貢献者7として微生物。腸炎ビブリオは最も広く知られている病原性菌株の中で際立っています。通常、河口、沿岸及び海洋環境8で発見、それはグラム陰性菌では、高塩分環境でアクティブになりますし、不十分な調理、不適切または生の海洋の食べたとき深刻な人間の胃腸炎を引き起こす製品の9。さらに、何人かの人々 の既存の医療条件を作るそれら傷ビブリオ10から生じる感染症、敗血症や耳の感染症になりやすい。ヘモリジン腸炎ビブリオの病原因子が病気の発症に寄与する 2 つのタイプに分けられる: 耐熱性直接溶血毒 (TDH) tdh 遺伝子によってコード化された、TDH 関連溶血 trh 遺伝子11によってコード化されました。ビブリオの病原性マーカー (tdh と trh 遺伝子) は、環境試料ではなく臨床検体で大抵見つけられます。

腸炎ビブリオ12環境の変化に迅速に対応、条件の広い範囲の下で生き残るために能力を持っています。セル質量13と並行してその毒性が増加するにつれて、その増殖機構はその災害ポテンシャルをエスカレートします。さらに悪いことに、気候変動は、これらの細菌のセル人口成長14を加速する十分な条件を提供しています。腸炎ビブリオ高周波による、食品サプライ チェーン、貿易とそれらの製品は、膨大な量の15,の16の場所からは魚介類の生産で特に監視する必要世界。現在細菌が識別され、隔離された生化学的なテスト、濃縮培地17、酵素免疫吸着などの方法の範囲を使用してアッセイ (ELISA)18、パルス フィールド電気泳動 (PFGE)19、ラテックス凝集反応、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) テスト20。これらのメソッドは、有資格者、洗練された楽器と汚染に関する情報をすぐに提供していない骨の折れるテクニックに通常必要です。これは深刻な有害汚染物と敷地内のアプリケーションを速やかに検出の可能性を制限します。迅速な検出ツールのまま未解決の挑戦です。

バイオセンシング、食品由来の病原体の検出のための有望なオプションとして浮上して、時間を節約、コスト効果の高い、実用的なおよびリアルタイムの分析法21,22,23,24 を提供していますので.ただし、試料及びバイオ センサーを用いた標準液で検体検出の多くの肯定的な結果をされているが、まだある水溶液または有機抽出物25試料への応用研究の欠如。最近では、直接及び間接のデオキシリボ核酸 (DNA) の検出を用いた電気化学バイオ センサーの交配イベント26を介して相補的なターゲットの特異的検出のための科学者の間で注目を受けた,27,28,29. これらのユニークなアプローチは酵素を用いたバイオ センサー、小型化と実用化のための有望な技術をご提供と比較して安定しています。研究の対象は、高選択性、感度、交配時の DNA 配列の特異性に基づく実用性と腸炎ビブリオ検出することができます高速ツールを構築することですここで報告しました。識別方法は、交配インジケーター、メチレン ブルー (MB) の存在下でのポリ酸安定化金ナノ粒子 (PLA によって金ナノ粒子)30スクリーン印刷された炭素電極 (SPCEs) の組み合わせを含みます。開発の検出構成の可能性はさらに検討細菌 dna のライセートと新鮮なしわを使用します。

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Protocol

注: 使用するすべての化学・生化学的試薬分析グレードのはず、さらに精製することがなく使用します。滅菌の脱イオン水を使用してのすべてのソリューションを準備します。オートクレーブ滅菌前にすべてのガラス製品。

注意: コントロール (ヒューム フード、グローブ ボックス) をエンジニア リングの使用など研究室の活動を実行するときすべての適切な安全対策を使用してくださいと個人用保護具 (保護メガネ、手袋、白衣、フルの長さのズボン、閉じてつま先靴)。

1. 作製と PLA によって金ナノ粒子を使用して修飾した電極のキャラクタリゼーション

  1. PLA によって金ナノ粒子の調製とキャラクタリゼーション
    1. すばやく沸騰水性塩化金酸溶液 (1 mM) の 100 mL にクエン酸ナトリウム溶液 (38.8 mM) 10 mL を追加し、周囲温度まで冷却します。黄色、黒への変更として開始し、最終的に暗いルビーとして終了する調製した金ナノ粒子溶液の色の変化を観察します。
    2. 溶融プロセスのステンレス鋼の金型の PLA ペレットを置き、それらを押す手順で 10 分以下の 190 ° C の温度で予熱: PLA シート準備の一部として 1 分 2.2 MPa の圧力の下でそれらを置きます。PLA シートは、約 3 時間冷却した後使用できるようになります。
    3. 活発にかき混ぜながら、室温でクロロホルム 5 mL に PLA シートの 0.68 mg 溶解します。事前に準備された金ナノ粒子溶液 10 mL で溶存の PLA を混合し、均一室温で攪拌します。均質な混合物は PLA によって金ナノ粒子と呼ばれますことができます、EDX を用いた紫外可視、x 線回折、電子顕微鏡、FESEM 特徴付けられます。
  2. 変更されたスクリーン印刷されたカーボン電極の作製と評価
    注: この研究で使用される空間構成 3 電極システム: 銀/塩化銀参照電極、カーボン電極、対向電極。
    1. すぐに空間とし、空気に PLA によって金ナノ粒子の均質なソリューションのピペット 25 μ L は 24 h 使用する前にそれを乾燥します。
    2. 、電極の電気化学的特性空間/PLA-, カリウム鉄シアン化物の (K3[Fe(CN)6]3 -/4 -) 活性表面積、電気化学インピー ダンス分光法、再現性を測定するには再現性、および安定性30。

2. 電気化学的 DNA バイオ センサーの開発

  1. プローブの準備
    注: 一本鎖 Dna プローブと相補的な DNA のシーケンスは、国立生物工学情報 (NCBI) のデータベース センターからの情報に基づいて選ばれました。
    1. 次のシーケンスに基づく商業所から凍結乾燥粉末として総合的なオリゴヌクレオチド (20 mer ssDNA プローブ、20 mer の相補的な DNA、20 mer 一致しない DNA、21 mer 非相補的な DNA) を購入します。
      チオール ssDNA プローブ: 5 '-5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG -/3 '
      相補的な DNA: 3 '5' - CAGTGCTTCTGCATAATCCG -
      1 つベースが一致しない DNA: 3 '5' - CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG -
      3 拠点が一致しない DNA: 3 '5' - CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG -
      非相補的な DNA: 3 '5' - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA -
    2. 分析に分けて滅菌テ ソリューション (10 mM トリス-HCl は、1 ミリメートルの EDTA、pH 7.5) を使用してすべてのオリゴヌクレオチド (100 μ M) の溶液を準備します。-4 ° C でこれを維持し、適切な希釈液を使用する直前。
  2. 固定および交配の最適化
    注: PLA 結果、空間/PLA-結果として示されると変更、スペースはこの研究のため使用され、ドロップ キャスト法は DNA の固定化および交配のために使用されました。
    1. まず、チオール ssDNA プローブ空間/PLA - 結果の 25 μ L を固定し、空気乾燥して、室温で 24 時間後、最後に示されます空間/PLA-金ナノ粒子/ssDNA として。3 つの要因を使用して固定化条件の最適化を決定する: ssDNA (0.2 から 1.4 μ M まで)、(210 分 30 からまで)、時間および温度 (25 から 75 ° C まで) の濃度。
    2. その後それ表すことができます最後にスペース/PLA-金ナノ粒子/dsDNA として交配イベントを行うスペース/PLA によって金ナノ粒子/ssDNA の表面に相補的な DNA の 25 μ L をピペットします。(30 分 5 に至るまで) 時間と温度 (25 から 75 ° C まで) の 2 つの要因によって交配条件の最適化を決定します。
    3. 固定化を浸すと 20 μ m MB 30 分ハイブリッド電極が 0.5 M ABS で洗浄することにより非具体的に吸着した DNA と過剰な MB を削除/20 mM 塩化ナトリウム (pH 4.5) とで洗浄し、脱イオン水。DPV を用いたメガバイトの削減のピーク電流を測定します。0.1 M PBS (pH 7) を使用する DPV 測定を実行インジケーターが含まれていません。
  3. 作製した DNA のバイオ センサーの特性評価
    1. 結果、30 分の 20 μ m MB スペース/PLA を浸す、0.5 M abs/20 mM 塩化ナトリウム (pH 4.5) を洗浄し、測定前に脱イオン水で洗い流し。プローブ DNA、相補的な DNA、dna 塩基のミスマッチ、および非相補的な DNA のサンプルを含むすべての相互作用のと同様の手順に従います。
    2. 電気化学的還元を測定します。
      メモ: インターフェイス ソフトウェアを商業的に製造された Autolab を使用して DPV を測定しました。
      MB の電気化学的還元に至る-0.5 V 0.005 V、0.05 V、変調振幅と 7.73 mVs-1 0.1 M PBS (pH 7) でのスキャン速度の潜在的なステップで 0.25 V、潜在的な公演の DPV 測定にはインジケーターが含まれていません。選択性、感度、再現性、および DNA の作製バイオ センサーの熱安定性をさらに検討しました。報告された結果は、3 つの複製で、平均値測定を発表されました。

3. 実際のサンプルを使用して作製した DNA のバイオ センサーの検証

  1. 菌株の調製
    1. 魚介類31,32の重要な汚染に基づいて細菌のサンプルを選択します。
      注:ビブリオ参照株と他の 8 の細菌株 (カンピロバクターリステリア菌、サルモネラ菌、腸炎サルモネラ、クレブシエラ肺炎として性大腸菌 o157: h7、ビブリオ菌セレウス菌、) 一般的な食中毒の病原体は、本研究では電気化学的 DNA バイオ センサーの検証のため採用されました。
    2. 彼らの生存率を維持、培養条件、表 1を参照してください彼らのそれぞれの寒天培地に細菌の日常的サブカルチャー 2 週間ごとを実施します。
    3. グリセリン凍結のプロセス中にそれらを損傷することができます氷結晶の形成を防ぐことによって細菌を保護すると、-80 ° c 20% (v/v) グリセロールを含む、それぞれ成長の流体培養基の細菌の緊張の長期保全を維持します。次に、それぞれの流体培養基にグリセロールで保存された細菌の細胞培養のループを接種します。細菌を復活させるために必要があるときは、それぞれの成長の時間と温度の流体培養基を孵化させなさい。
    4. 希釈のシリーズから派生した微生物を列挙する拡散板法33、標準およびよく知られている方法を用いた腸炎ビブリオ細胞の量を決定します。
      1. 腸炎ビブリオトリプチ醤油スープの文化 (TSB + 3 %nacl) 140 rpm 振動状態で 37 ° C で。その後、TSB + 3% の 9 mL に 1 mL の細菌培養を転送 10-1希釈倍率を取得するための食塩。
    5. 全シリーズの最大 10-10希釈倍率を取得する 9 回この手順を繰り返します。次に、腸炎ビブリオの選択寒天培地カウント、それぞれの植民地に (10-1010-1から始まって) 各希釈倍率を 0.1 mL を広がってください。24 h の 37 ° C で培養したプレートを孵化させなさい。
    6. コロニー カウンターを使用して、個々 のコロニーをカウントし、(カウント CFU/戻量希釈倍率 ×) の背中をコロニー形成単位ミリリットル密度 (CFU mL-1) を取得する計算に。CFU mL-1吸光度に対する校正のプロットから細菌細胞懸濁液の単位 (CFUs) を形作っているコロニーの濃度を派生します。
  2. PCR 法の準備
    1. 煮沸溶解手順34次の変更されたゲノム DNA を抽出します。最初、ストリーク個々 の細菌の寒天にひずみし、スープ メディア、その相対成長の条件、条件を振って 140 rpm のインキュベーション後に接種します。
    2. マイクロ遠心チューブに液の 1 mL 文化をピペットします。4830 x g とペレットを取得に 1 分間、4 ° C でこれを遠心します。ペレットの再懸濁液に約 500 μ L の滅菌の TE バッファーを使用します。98 ± 2 ° C 加熱ブロックで 10 分結果の懸濁液を保持し、すぐに細胞を溶解し、DNA をリリース 10 分-18 ° C で冷やします。
    3. 4830 x g と明確なサスペンションを取得し、さらに使用するための-20 ° C で上澄みを維持に 3 分間、4 ° C でゲノム DNA を遠心します。260 の波長に紫外線吸収をもつ biophotometer 測定を使用して nm (核酸は光の波長を吸収) と同時に、波長 280 nm (光の波長を吸収するタンパク質) に濃度と抽出の純度を決定するにはゲノム DNA し、標準的な生化学的アッセイ35を使用しておよび 16S rRNA 遺伝子配列36によってそれらを確認するすべての系統を識別します。最後に、92 ° C 2 分でゲノム DNA を変性し、バイオ センサーへの応用の前に氷の水で急速に冷やします。
    4. さらに腸炎ビブリオの存在を確認 toxR 遺伝子を対象とする PCR を使用します。たちのプライマー (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3' と 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3') を使用してこの手順を実行します。25 μ l の滅菌水 (15.5 μ L)、バッファー (5 μ L)、(1 μ、10 μ M) のプライマー、dNTP ミックス (1 μ L)、DNA テンプレート (2 μ L)、Taq DNA ポリメラーゼ (0.2 μ L, 10 x) から成る全反応量の PCR 増幅を最適化します。
    5. コンポーネントをよく混ぜ、増幅の 30 サイクル プログラムたちでターゲット シーケンスの PCR 増幅を手配します。私たちの研究では、各サイクルから成って 3 段階反応すなわち。、30 サイクルの変性 (94 ° C 1 分)、(63 ° C、1.5 分) をアニーリングをおよび拡張 (72 ° C、1.5 分)、最終的な拡張 (72 ° C, 7 分) 続いて続いて初期変性 (94 ° C、3 分)。
    6. 増幅産物と 1.5% の agarose のゲルの電気泳動でそのサイズを決定します。市販ゲル ドキュメンテーション システムでゲル画像をキャプチャします。
  3. コックル試料の調製
    1. 新鮮なサンプルを取得します。
      注: 私たちの新鮮な貝 (Anadara において) に serdang、セランゴール州、ウェット マーケットから得られ、分析用氷クーラー ボックスで研究室にすぐに持って来られます。サンプルを 2 つのグループ、すなわち処理と未処理グループ、こと、貝収穫された均一に収穫の開始から低温貯蔵にそれらを配置することまで想定して分割します。
    2. 事前治療群で 20 ° C の DNA の抽出の前に 4 時間で紫外線の暴露に続いて、24 時間-20 ° C で保存して貝を扱います。
      注: 凍結温度と制御に使用される紫外線暴露グループを殺すか、または少なくとも、当然のことながら蓄積腸炎ビブリオ貝の制限します。本研究では制御された条件の目的は、新鮮な貝の実際の状況を模倣する、70 ° C のより高い殺菌政権は適用されません。一方、彼らは研究室に到着するとすぐに前治療なし未処理のグループから直接サンプルを分析します。
    3. 腸炎ビブリオATCC 17802 TSB でのひずみのサブカルチャー (3 %nacl)。TSB の適切な希釈液のめっきによる菌の生菌のレベルを決定する (3 %nacl) 104 CFU mL-1 腸炎ビブリオの菌を取得するためにカリフォルニア州に。各コックル蒸留水で洗うし、スクラブのシェルから組織を削除する層流のキャビネットで無菌の鉗子を使用する前に汚れの自由。
    4. コックル組織サンプル約 10 g を 90 ml の滅菌 TSB のホモジナイザーを用いた均質化 (3 %nacl) 60 s の追加 9 mL、試料の均質化サンプル スープに腸炎ビブリオの既知の量です。ネガティブ コントロールとしてハワイプ サンプルを使用します。腸炎ビブリオca で、サンプルの 0.1 mL をメッキすることによってしわサンプルにスパイクの細胞数の推定し、抽出、バイオ センサーと PCR の試金で使用されるサンプル DNA の微量遠心チューブに試料 1 mL を分注後。
    5. 煮沸溶解手順36次の改良は、スパイクとハワイプ サンプルから、腸炎ビブリオのゲノム DNA を抽出します。DNA 濃度・純度バイオ光度測定を用いた UV 吸収波長 260 を最後に、決定 nm (核酸は光の波長を吸収) と同時に、波長 280 nm (光の波長を吸収するタンパク質) に。

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Representative Results

金ナノ粒子の形成は、現在クエン酸ナトリウムを用いた水溶液の色の変化によって明らかにされました。これは深いルビー色の赤に黄色の光から変更する色を発生します。表面プラズモン共鳴 (SPR) ピークの成長が約 540 で見つかりました紫外-可視スペクトル (図 1) から PLA によって金ナノ粒子の生成が確認された nm。形成と PLA によって金ナノ粒子の存在粒子サイズ37に応じて、500-600 nm の波長範囲で示されました。金ナノ粒子と PLA によって金ナノ粒子の x 線回折パターンは、図 2のとおりです。すべての結晶のピークは、77.7 °、64.7、44.4 38.2 31.7 2 θ で観測しました。彼らは (100) (111) (200) (220) に帰因した立方 FCC (面心立方) 金 (311) 結晶面 (金属) (JCPDS ファイル号-00-004-0783) ナノ構造とします。PLA によって金ナノ粒子結晶のピーク強度 31.7 °、PLA で、金ナノ粒子が埋め込まれたことを意味し、38相性金ナノ構造体の形成を中心とした広範な回折ピークも増加しました。さらに、PLA, にすべての AuNP 回折のピークは、金ナノ粒子が安定した構造を持っていたことを示した。PLA によって金ナノ粒子の平均サイズは、シェラーの式を使って計算された (L = kλ/βcosθ)、(100) ブラッグ反射の幅を決定することによって。半値幅から d 間隔 (表 2)、PLA によって金ナノ粒子の結晶子サイズは 27 として算出した nm。

PLA, およびその形態の寸法は、TEM を使用してさらに検討しました。TEM 粒子分布曲線 PLA によって金ナノ粒子のイメージから、金ナノ粒子がほとんど球形形 (図 3) で見られました。ナノ粒子のサイズは、約 37 の範囲 nm、39として合成したナノ粒子の多結晶の性質を示唆、シェラーの式から得られるよりもわずかに大きい。TEM とは対照的 x 線回折から生じるより小さいサイズは、前の研究、粒子構造小さい (サブ粒子)40結晶のかなりの量のための自然結晶が理由で観察されています。.図 4は、空間に準備として PLA, FESEM イメージを示します。FESEM 画像や EDX スペクトル空間/PLA, 金、最大密度の重量の割合が最も高いとナノ粒子の適用範囲の最も大きい表面があったことから明らかです。それも明記する、特に、FESEM 裸空間像を図 4(、) に示します。図 4(b) FESEM イメージは、よく分散 PLA 結果を示しています。合成 PLA 結果の化学組成を断言するには、EDX は、生産として PLA-結果、図 4(、)と 4(b) に従っての化学成分を調査するため採用されました。EDX スペクトルは生産として PLA, 金 (Au) だけで構成されていたことを確認してから、炭素 (C) と酸素 (O) に対応するピークを除くその他の要素は表示されません。C ピークの存在はこれにサンプルされたドロップ キャスト カーボン電極によるものだった

EDX スペクトルはまた O を示すフィルムが空気にさらされたためには、炭素電極の酸素が吸着されたの存在を示した。これは、彼らは長い時間41の空気にさらされている場合、単層カーボンナノ チューブに酸素を吸着することを確認します。空気で様々 な気体分子がありますが、主な表面に吸着した大気暴露した炭素ナノチューブ42、43他の分子と比較してより高速な吸着に起因する酸素が考えられていた。これは酸素が試料で一晩空気露出の間に、主要な表面に吸着した炭素電極をだったし、強化 PLA によって金ナノ粒子の化学純度を見つけることに基づいていた。陽極および陰極のピーク比 (私pa/ipc) ほぼ 1、スキャン レート増加44として一定のピーク電位を与えたのだった。また、陽極および陰極ピーク電位は電気化学反応は、ピーク分離 (図 5) に基づく可逆だった示唆している別のスキャン率45で安定していた。ランドルズ Sevick 方程式を用いたアクティブ修飾電極の表面積を求めた (私の pc = (2.69 × 105) n3/2広告1/2 Cv1/2。プロットの傾きから私pc v1/2 図 5(、) とと(b)、電極の表面積が 0.26 cm2と 0.41 cm2として算出しました。裸の空間と、PLA, それぞれ。この結果は、裸スペースに比べ比較的高い活性表面積の PLA によって金ナノ粒子によってもたらされる改善を確認しました。派生の結果だったに匹敵する高分子埋め込まれた金のナノ粒子 (β-CD-EDAS(N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylene-diamine マトリックスは、金ナノ粒子をカプセル化)、高活性表面積強化のプロセスであることを明らかにしました。電子伝達とその結果より良い感度46。

変更されたスペースの電気化学反応は、K3[Fe(CN)6]3 -還元による表示制御の拡散のプロセス/4 -ピーク電流、順番が現在に頼ってスキャン率の平方根 (vの1/2)。電極特性の方のビューを取得するには、CV 測定の観点から発表された電極の性能に関連する電気化学インピー ダンス分光法 (EIS) に関する研究を行った。EIS の電子転送の律速過程と相関が高頻度で見られる半円断面。半円の直径として直接電荷移動抵抗 (Rct) を測定しました。この結果は、裸のスペース、だった 1932年 Ω と空間/PLA によって金ナノ粒子の改質が 1444 Ω (図 6) に減少の R のct値で集計。空間/PLA によって金ナノ粒子の R のct値の低下起因するかもしれない局所誘電の減少および/または電気の二重の厚さの増加層47、その K3[Fe(CN)6] を示唆している3-/4-金属/溶液界面で吸着機能します。これらの出力は、CV (図 7) の測定から派生したものに従った。ピーク電流は、PLA の結果より高い感度が低い Rct48の逆関数であることを示したを使用して SPCEs の変更と徐々 に増加しました。したがって、電極の CV の値の増加と R のct値低下可能性がありますされている水分 (水の分子の体積は 27.19 Å3) の段階的な交換のため K3の吸着による[6Fe(CN)]3 -/4 -溶解反応49の範囲の減少、金属の表面に。

表 3は、再現性と修飾電極の再現性の相対標準偏差 (RSD) を示します。ルーチンの CV 記録 K3[Fe(CN)6]3 -/4 -電極の再現性を調査するための六つの連続したセットのため作られました。4.26%、RSD の空間/PLA-結果を導いた。PLA によって金ナノ粒子修飾電極は、複数回の測定後良い RSD を与えた。さらに、同じ手順を使用して、六つの電極個別作製したない、PLA によって金ナノ粒子用電極作製の良い再現性を示す空間/PLA-結果の 4.05% の RSD 値与えた。PLA 結果によって変更された基板は 37 ° C で長時間にわたって保たれました。それはまた 20 サイクルの記録および信号品質の 18% の減少のため利用されました。一緒にバイオ センサー、固定期間、温度、出力最大値を達成するために ssDNA 濃度との交配のための条件を調べた.DPV のピーク電流に影響を与えるこれらの条件を最適化する必要。SsDNA 濃度を最適化するため空間/PLA によって金ナノ粒子は異なる濃度で戻 (0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0、1.2、1.4 μ M) 60 分 ssDNA の ssDNA の最適濃度を測定しました。図 8に基づき、DPV ピーク電流は増加 DNA 濃度が高いが使用されたようです。最適化された DNA 濃度が 1.2 μ M ssDNA をだったことも分かった。

空間/PLA によって金ナノ粒子の単一座礁させた DNA を含む固定期間を最適化する時代、ssDNA (1.2 μ M) の 25 μ L を調べた (30、60、90、120、150、180 〜 210 分)。図 9では、調査結果は DPV ピーク電流の継続的な増加に終って固定期間の増加を示す.従って、ssDNA の最適な固定時間は、180 分として選ばれました。種々 の温度で (1.2 μ M) と戻いたスペース/PLA, 固定温度を最適化する (75、65、55、45、35、および 25 ° C) 180 分。我々 は以降減価償却 (図 10) に続いて固定化の温度が 55 ° C に増加、DPV ピーク電流最初エスカレートを発見します。従って、55 ° C は、その後の実験で使用される最適化された固定温度として選ばれました。電極および交配の無力の表面からモバイルは ssDNA の分離は、温度の上昇によって引き起こされました。他のレポートと同様の結果50とされています。高速分割と金のナノ粒子の表面から DNA の変性がより高い温度51で発生しました。調査は最近報告されたすぐに金とチオールの間の結合が酸化低下し、単にアンビエントであるような状況でたとえば水にさらされると、空気し光52,53,54。本研究では交配時の効果を調べた。

捏造の空間/PLA-金ナノ粒子/ssDNA はドロップ キャスト ターゲット DNA の解決 (0.2 μ M) (5、10、15、20、25、および 30 分) 回異なる交配で。DPV の応答は (5 分) から孵化の時間が 5 分増加と明らかに、上がった (図 11)。この値は、一度 10 分として交配のため希望の時間を選択したので 10 〜 30 分下降パターンが観察されました。交配の効率は 25 ° C から 35 ° C (図 12) への温度の増加と増加しました。高電流が 35 ° C 以上の高温で徐々 に減少を見られました。この理由は、検出信号を減らすサンドイッチ構造変性に起因しました。したがって、選択交配最適温度は 35 ° c.我々 は腸炎ビブリオ構成に作用電極、表面改質と複雑な酸化還元を仲介する PLA MB のアクティブな表面領域を強化する金ナノ粒子の検出に使用されるプロセスは、ポンドに減少しました。この酸化プロセスの結果は ssDNA と MB55良い相性だった現在の DPV は相補的な配列を持つ一本鎖 Dna の交配時添付 MB 分子数が低いため減少しました。

さらに先進のバイオ センサーの性能の調査を行った。DPV 結果を図 13で示す検出ラベル56,として MB 存在下で非相補的な DNA、dna 塩基のミスマッチで 3 拠点、1 ベースが一致しない DNA 相補的な DNA プローブ DNA を選択的に区別することができた57。 最も低いピーク電流 (0.73 μ a) として展示された 1 つベースが一致しない DNA によって徐々 に増加する相補的な DNA (0.94 μ a) 3 拠点に DNA が一致していない (1.05 μ a) 非相補的な DNA (3.25 μ a) と DNA をプローブ (4.79 μ a)。現在のターゲット DNA を区別するオリゴヌクレオチドのシーケンス敏感に、具体的に私たちのバイオ センサーを許可するオリゴヌクレオチド シーケンスのすべての流れの中で最小でした。MB は、固定化したプローブ大きな DPV ピーク電流を作り出す DNA の一本鎖 Dna と強くバインド。空間/PLA-金ナノ粒子/非-相補的な DNA は、MB スペース/PLA-金ナノ粒子/dsDNA の表面に組み立て量が少ないとして約半分に現在固定されたプローブ DNA を減少しました。これは拠点 MB とグアニン間アクセスできない相互作用に起因する可能性があります。DNA と MB の対話モードは、pH、温度、DNA 濃度、イオン強度、およびバッファー58,59の種類などの実験条件に強く依存します。MB 一般的リンク dsDNA 溝と intercalative モードは、dsDNA 表面60MB 蓄積します。私たちキャプチャ プローブ DNA の 1 つベースが一致しない DNA と 3 拠点が一致しない DNA への暴露は一貫して DPV ピーク電流を減少し、相補的なターゲット DNA がこの傾向を継続します。表 4は、現在 MB ピークの選択率のパーセンテージを示します。私達の全体的な見つけることは、構築された DNA のバイオ センサーの交配が、空間/PLA-金ナノ粒子の表面に固定化したプローブ DNA によって選択性の高いことだった。

開発した DNA のバイオ センサーの感度は相補的なターゲットのオリゴヌクレオチドの濃度さらに調べた。図 14は、相補的な DNA 濃度の上昇として空間/PLA 結果 MB の DPV ピーク電流の段階的な減少を示しています。図 15は、0.96 減少 MB ピーク電流のログとログ ターゲット DNA (12:02 0.02 mm) のいくつかの濃度の間に生成された線形回帰係数を展示します。3 σ/m 式 (されて空のソリューション、線形曲線の傾き m の標準偏差 σ) を使用して現在のピークが変更 (ΔP) のグラフをプロットした61,62,63。16:43 だった実際に私達の最も小さくより大きい測定サンプル作製した DNA のバイオ センサーの検出限界を求めた.この結果は、事実と一致してその ΔP 12:02 と 14 (2.65 × 10-6 A および 2.81 × 10-6 A) 1.19 × 10 の標準偏差と-7 A と 1.06 × 10-7 A がそれぞれ、オーバー ラップします。

作製した DNA バイオ LOQ を計算するための 10σ/m 式を使用 (σ は標準偏差を空のソリューションと m は直線カーブの傾斜) 14:08 の利得にする結果を発見し、。再生容量の点で DNA のバイオ センサーを評価するために相補的な DNA の繰り返しの変性を行った。我々 は変性の単一座礁させた DNA64を維持するために氷水で急速冷却に続いて、二本鎖 DNA を変性する 0.2 μ M 8 分 86 ° C のお湯で相補的な DNA 修飾電極をインキュベート、これをしました。

交配活性が再生の 8 の努力の後に初期レスポンスの 91% で保持される (n = 5、RSD = 4.05%)。サム空間/PLA によって金ナノ粒子に DNA プローブの固定化法を用いた DNA センサーは非常に安定した、繰り返し変性プロセス後の相補的な DNA を検出するに良い反応を達成します。熱に関する私たちの DNA のバイオ センサーの安定性はさらに探検されました。これを行うには、シリカゲルを含んでいる密封されたアルミ袋に 4 ° C、25 ° C、および 45 ° C の温度で PLA-金ナノ粒子/スペース/ssDNA 電極を格納しました。6 ヶ月の終わりには、相補的な DNA と推定信号の生産の回復の割合。図 16は、6 ヶ月保管後、プローブの空間/PLA-金ナノ粒子/ssDNA がまだ回復可能な最初の信号の 80% 以上で安定性の高いことを示します。45 ° C 以下の温度で長期的な安定性を持っている PLA によって金ナノ粒子と一本鎖 Dna との間の強い反応が見つかりました

9 種菌 (セレウス菌、リステリア菌、C. jejuni、 E. 大腸菌 o157: h7、 V. 菌、サルモネラ菌、 S. 腸炎、 k. 肺炎とV。腸炎ビブリオ) PCR 検出による上映します。細菌文化から腸炎ビブリオの種特異的検出のための PCR 増幅の製品は、図 17に示します。腸炎ビブリオの toxR 遺伝子は識別ビブリオ病原性菌株でのプレゼンスのための PCR プライマーとして利用されました。PCR 解析から腸炎ビブリオ腸炎ビブリオに対する toxR 遺伝子の PCR プライマーの特異性のための肯定的な結果を示した。他の菌株からの PCR の製品は検出されませんでした。DPV ピーク電流図 18に示されている、交差反応性評価の結果、他の種の細菌と比較して腸炎ビブリオの非常に明確な検出後に得られます。MB 分子プローブにバインドの大きい量のため、塩基対の数として増加 DPV 信号が減少しました。腸炎ビブリオ明らかに食品サンプルの環境を模倣する他の食品由来病原体から差別されることができました。

貝は、以来、彼らは、地元の食品のいくつかの種類の人気のある成分本研究で DNA のバイオ センサーの検証の実試料として選択されました。生の貝がしばしば病原性 V を運ぶことが知られている. 腸炎ビブリオと彼らに65を収穫後の保管中に冷凍不十分な場合は特に、人間にこれらの細菌を送信できます。コックル サンプルの扱われたグループは、24 時間-20 ° C で保存され、私たちの前処理のステップの間に DNA の抽出の前に 4 h 20 ° C で紫外線にさらされています。図 19は、処理と未処理 (スパイク) サンプル内ビブリオPCR 解析で見つかったことを示しています。これは、「レーン 7 8 9 10 11、および 12 の植民地との相関は、上記説明でカウント。ない V. 腸炎ビブリオ処理と未処理の (ハワイプ) 試料中のようにレーン 1、2、3、4、5、6 PCR の結果でコロニー カウントはサンプルでのプレゼンスを示すものでした。これの可能な理由は、抽出した DNA66でタンパク質などの代謝産物の汚染存在です。

図 20は、スパイクとハワイプ サンプルから成る群の腸炎ビブリオの存在を正常に確認するまで開発した DNA バイオ センサーを用いた検出結果をまとめたものです。これらの結果は肯定的に前述の PCR の結果と相関します。肯定的な結果を示した PCR のすべてのサンプルは、AuNP ベース、PLA 安定化電気化学バイオ センサーの技術を使用して発見され、DPV のピーク面積は明確に結果として得られる PCR 強度バンド (図 19とと対応図 20)。本研究で提案されたナノ粒子を用いた電気化学センサー検出することビブリオ正常にこのようにそれが結果の信頼性に影響しないと PCR に優れている証明見本と実物が示唆されました。

Figure 1
図 1: PLA によって金ナノ粒子の吸光度この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: PLA によって金ナノ粒子の x 線回折スペクトル。Ref. [30] から許可を適応します。著作権 (2016) Sociedade ブラジレイラ ・ デ ・ Química.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: TEM 周波数径分布と測定で PLA によって金ナノ粒子の画像のスケールで 50 nm。[30] 文献より許可を得て転載。著作権 (2016) Sociedade ブラジレイラ ・ デ ・ Química.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: EDX スペクトルと FESEM (a) 裸のスペースと (b) スペース/PLA-結果の画像です。[30] 文献より許可を得て転載。著作権 (2016) Sociedade ブラジレイラ ・ デ ・ Química.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 5
図 5: スキャン率の平方根とサイクリックボルタモ ピーク現在酸化のプロット: (a) 裸の空間とで 1.0 モル L-1 (b) スペース/PLA-, K3[Fe(CN)6] (pH 7)。スキャン レートが 300、250、200、150、100、50 mV s−1。Ref. [30] から許可を適応します。著作権 (2016) Sociedade ブラジレイラ ・ デ ・ Química.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 6
図 6: 1.0 モル L-1で電極のインピー ダンス スペクトルK3[Fe(CN)6] (pH 7)。振幅: 5 mV、および周波数範囲: 0.1-105 hz 適合 ref. [22] の許可を得て。著作権 (2016) エルゼビア。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 7
図 7: 陽極酸化ピーク電流の変更 1.0 モル L-1で電極K3[Fe(CN)6] (pH 7) 0.1 V s のスキャン レートで-1サイクリックボルタンメトリー測定を使用してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 8
図 8: SsDNA 固定スペース/PLA - 結果 0.1 mol L-1濃度の効果0.1 V s のスキャン レートで PBS (pH 7)-120 μ M で 30 分インキュベート後差分パルス ・ ボルタンメトリー測定を使用して MBこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 9
図 9: 空間/PLA - 結果 0.1 mol L 一本鎖 Dna 固定化時間の影響-10.1 V s のスキャン レートで PBS (pH 7)-120 μ M で 30 分インキュベート後差分パルス ・ ボルタンメトリー測定を使用して MBこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 10
図 10: 空間/PLA-, 0.1 V s のスキャン速度で一本鎖 Dna 固定化温度の影響-10.1 mol L で-1PBS (pH 7) 差動パルス ・ ボルタンメトリー測定を使用して MB の 20 μ M で 30 分の潜伏期間の後この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 11
図 11: 0.1 mol L スペース/PLA によって金ナノ粒子/ssDNA 交配時期の影響-10.1 V s のスキャン レートで PBS (pH 7)-120 μ M で 30 分インキュベート後差分パルス ・ ボルタンメトリー測定を使用して MBこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 12
図 12: 0.1 mol L スペース/PLA によって金ナノ粒子/ssDNA ハイブリダイゼーション温度の影響-10.1 V s のスキャン レートで PBS (pH 7)-120 μ M で 30 分インキュベート後差分パルス ・ ボルタンメトリー測定を使用して MB。Ref. [22] から許可を得て転載。著作権 (2016) エルゼビア。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 13
図 13: ヒストグラム MB 削減ピーク電流 0.1 mol L DNA の種類を使用しての -10.1 V s のスキャン レートで PBS (pH 7)-120 μ m MB 30 分後。挿入図は、同じ条件で差動パルス電位を示しています。Ref. [22] から許可を得て転載。著作権 (2016) エルゼビア。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 14
図 14: ヒストグラム MB 削減ピーク電流 0.1 mol L DNA 濃度の異なるを使用しての -10.1 V s のスキャン レートで PBS (pH 7)-120 μ M で 30 分インキュベート後差分パルス ・ ボルタンメトリー測定を使用して MB。Ref. [22] から許可を得て転載。著作権 (2016) エルゼビア。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 15
図 15: 削減の線形プロット ピーク電流の 0.1 mol L DNA 濃度の異なるログに対して MB-10.1 V s のスキャン レートで PBS (pH 7)-120 μ M で 30 分インキュベート後差分パルス ・ ボルタンメトリー測定を使用して MB。Ref. [22] から許可を得て転載。著作権 (2016) エルゼビア。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 16
図 16: ストレージ間隔 6 ヶ月でスペース/PLA によって金ナノ粒子/ssDNA に及ぼす異なる交配温度(n = 3)。0.1 mol L で行った-1 0.1 V s のスキャン レートで PBS (pH 7)-1 20 μ M で 30 分インキュベート後差分パルス ・ ボルタンメトリー測定を使用して MB。Ref. [22] から許可を得て転載。著作権 (2016) エルゼビア。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 17
図 17: Agarose ゲル電気泳動 PCR 増幅 16S rRNA の遺伝子は、細菌文化から選択した細菌の製品のシーケンスを使用します。レーン m: 1 kb の DNA の梯子、レーン C−: 負の制御 (滅菌蒸留水) レーン c/mfc: 肯定的な制御 (DNA 抽出から大腸菌テンプレートとして使用)、レーン EC: 大腸菌 o157: h7、レーン CJ: c、レーン BC:セレウス、レーン KP: k. 肺炎、車線 ST: s、レーン LM: 菌、リステリア菌、レーン SE: s. 腸炎、レーン VP: V。腸炎ビブリオおよび車線 VV: 菌対この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 18
図 18: ヒストグラム MB 削減ピーク電流 0.1 mol L 様々 な食中毒細菌に対する DNA のバイオ センサーの交差反応性の研究のための-10.1 V s のスキャン レートで PBS (pH 7)-120 μ M で 30 分インキュベート後差分パルス ・ ボルタンメトリー測定を使用して MB。Ref. [23] から許可を得て転載。著作権 (2017) スプリンガー 。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 19
図 19: Agarose ゲル電気泳動 PCR 増幅産物の腸炎ビブリオ新鮮なコックル サンプルから。100 bp の DNA の梯子、レーン 1-3 の車線 m: 2ul: ハワイプ サンプル、4-6 の車線の放置: ハワイプ サンプル、レーン 7-9 を扱われる: 未処理試料、レーン 10 12: 試料、レーン c/mfc を扱われる: 肯定的な制御 (ビブリオ ATCC 17802)、レーン C-: 負の制御 (滅菌蒸留水)。Ref. [23] から許可を得て転載。著作権 (2017) スプリンガー 。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 20
図 20: ヒストグラム MB 削減ピーク電流の検出のための腸炎ビブリオ 0.1 mol L DNA バイオ センサーを用いた新鮮なコックル サンプル-1 0.1 V s のスキャン レートで PBS (pH 7)-1 20 μ M で 30 分インキュベート後差分パルス ・ ボルタンメトリー測定を使用して MB。Ref. [23] から許可を得て転載。著作権 (2017) スプリンガー 。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

電極組成物 潜伏時間 (h) 温度 (° C) 成長媒体
カンピロバクター 48 42 BA/BB
リステリア菌 48 30 TSA/TSB
サルモネラ 24 37 TSA/TSB
サルモネラ腸炎でも 24 37 TSA/TSB
クレブシエラ肺炎 24 37 エンバ/TSB
性大腸菌 o157: h7 24 37 MA/TSB
セレウス菌 24 37 MYPA/TSB
ビブリオ菌 24 37 TSA + 3% NaCl/TSB+3% NaCl
腸炎ビブリオ 24 37 CA/TSA+3% NaCl/TSB+3% NaCl

表 1:文化選択した細菌の条件。

サンプル 順位 [° 日.] 半値幅 [° 日.] d 間隔 [Å] 結晶子サイズ (nm)
PLA によって金ナノ粒子 31.682 0.3149 2.8243 27

表 2:PLA AuNP 微結晶のサイズ。Ref. [30] の許可を得て適合。著作権 (2016) Sociedade ブラジレイラ ・ デ ・ Química.

修飾電極 RSD % (n = 6) 信号抑圧 (%)(n = 20)
再現性 再現性
空間/PLA によって金ナノ粒子 4.26 4.05 18

テーブル 3: 電極 K 金ナノ粒子と PLA によって金ナノ粒子修飾に関連のプロパティ3[Fe(CN)6] 1.0 モル L と-1濃度 0.1 V 秒のスキャン レート-1.Ref. [30] から許可を適応します。著作権 (2016) Sociedade ブラジレイラ ・ デ ・ Química.

電極組成物 私pa (μ A) Epa 選択率 (%)
(n = 3) (V)
空間/PLA-AuNP/プローブ DNA 4.79 ± 0.10 -0.46 -
空間/PLA-AuNP/非-相補的な DNA 3.25 ± 0.12 -0.44 67.85
空間/PLA-AuNP/3-塩基不一致 DNA 1.05 ± 0.11 -0.45 21.92
空間/PLA-AuNP/1-ベースが一致しない DNA 0.94 ± 0.12 -0.46 19.62
空間/PLA AuNP/補足 DNA 0.73 ± 0.10 -0.45 15.24

表 4: DPV MB ピーク電流 0.1 mol L 性-10.1 V s のスキャン レートで PBS (pH 7)-120 μ m MB 30 分後

電極の組成 検出法 線形範囲 (M) 検出限界 (M) 参照
3 D 結果 DPV 1.5 × 10-6 - 7.0 × 10-9 2.0 × 10-10 69
(+)金ナノ粒子 DPV 1.0 × 10-9 - 1.5 × 10-12 2.6 × 10-12 70
金ナノ粒子/GR DPV 1.3 × 10-9 - 2.5 × 10-11 8.3 × 10-12 71
ADH GSs DPV 5.0 × 10-8 - 3.0 × 10-13  3.0 × 10-13 72
結果 MPTS DPV 5.0 × 10-9 - 1.0 × 10-11  5.0 × 10-11 73
金ナノ粒子-行く DPV 1.0 × 10-9 - 1.0 × 10-14 3.5 × 10-15 74
CoS/結果 DPV 1.0 × 10-9 - 1.0 × 10-12 7.0 × 10-13 75
PLA によって金ナノ粒子 DPV 2.0 × 10-8 - 2.0 × 10-13 5.3 × 10-12 この仕事

表 5: 最近開発された電気化学的 DNA ナノセンサーのいくつかの比較。Ref. [22] から許可を得て転載。著作権 (2016) Elsevier。

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Discussion

このタイプの電気化学バイオ センサーの開発に成功するためのフレームワークの重要な手順です。 (核酸またはここの DNA) の探触子に対して適切な生物的認識の要素の選択探触子; の検知層を構築するための化学的アプローチ生体材料;DNA の固定化および交配; の最適化実際のサンプルを使用して開発されたバイオ センサーの検証。

固定および交配条件の最適化は、コアの高感度電気化学的 DNA センサーの開発に成功します。この作品では、複雑な酸化還元に MB を使用しました。MB DNA の相互作用の様々 な原則がある: (i) MB カチオン ssDNA の dsDNA; リン酸バックボーン アニオン電荷との静電的相互作用(ii) MB の C (G) 塩基 dsDNA; で交互になる間に挿入成功を通じて MB インターカレーションによる(低ラベル密度 (1 つまたは 2 MB の分子 dna あたり) を生成する iii) によって共有結合ターゲット ssDNA の最後に、(iv) MB 非連結のグアニン ssDNA の基本相互作用によって。第 4 の原則としては、交差反応性が新鮮な貝、細菌のビブリオから正確に識別を適用されます。特別な関心の酸化後、MB と ssDNA の強い親和性があった。相補的な配列を持つ一本鎖 Dna の交配は保税 MB 分子を置き換え、信号を削減します。

上で示した実験結果のシリーズは、急速な高選択性と感度のハイブリダイゼーションの原則を使用して腸炎ビブリオ検出法の開発に焦点を当てください。最初のステップは、合成とポリ酸安定化金ナノ粒子のキャラクタリゼーション (PLA,) (図 1-6および表 2) 電極の修飾のためです。金ナノ粒子の品質は、紫外可視分光法 (紫外-可視)、x 線回折 (XRD)、電界放射走査型電子顕微鏡 (FESEM)、透過型電子顕微鏡 (TEM)、サイクリック ・ ボルタンメトリー (CV) を使用して評価されたとインピー ダンス解析。第 2 開発部関係で裸の電極を基準にして変更された電極の強化に成功を決定修飾電極 (図 7-12および表 3-4) の電気化学特性評価交配イベント検出の条件。

DNA によって基づくバイオ センサー開発の 3 番目のステップは、交配イベントの実験条件の最適化や先進のバイオ センサーの実際の病原体 (図 13-20) の検出への応用に基づいていた。病原体の検出の成功を決定する交配イベントは、微分パルスボルタンメトリー (DPV) を使用して評価されました。対象となる病原体の肯定的な存在は、現在の削減を通じて示されました。先進のバイオ センサーの感度を校正プロットの構築と LOD (図 15) の計算を行った。具体的には腸炎ビブリオ電流を低減 (図 17 と 18) のさまざまなレベルに基づく他の病原体から区別するために試作したバイオ センサーができた。図 19 と 20で実際の食品サンプルで腸炎ビブリオの検出のための先進バイオ センサーの実現可能性の評価を提示し、対象となる病原体の肯定的な存在は、電流の低減効果によって示される.DNA を用いたバイオ センサーの開発に成功、DNA プローブの選択、修飾電極の強化だけでなく、実験条件の最適化に大きく依存します。DNA プローブをここでは、中野67の前の仕事から適応されています。ナノサイズの標準化を可能にするポリ乳酸で安定した金ナノ粒子を用いた電極の強化を行った。電気触媒材料68と電子の転送速度が向上、また DNA プローブを固定するために表面を提供する行為として金ナノ粒子の機能。実験パラメーターは、フォームの両面に DNA のため不可欠である温度、培養時間の面で最適化しました。ハイブリダイゼーション温度は非特異吸着とこの増加の分離にセンサーの選択性を影響します。交配のインキュベーション時間は、二重形成のチャンスを高めます。固定化の手順は、フォームに二重形成のため向き不向きある DNA プローブを確認するために最適化されなければなりません。

表 5比較のサンプルを最近開発した電気化学的 DNA バイオ センサー69,70,71,72,73,74,75,.DNA を用いたバイオセンシングは、メソッドは十分なオンサイトの使用のために携帯することができます前に対処する必要があります、いくつかの制限がありますが、分子のベースの技術を交換するための有望な方法です。主な制限は、サンプル処理 DNA 抽出純度として、サイトに抽出された DNA の量はほど良く標準演習方式によって抽出する可能性がありますありません。それは、しかし、有望な代替手段場合は PCR およびゲルの電気泳動マイクロ流体などのサンプル前処理システムと置き換えることができます。

DNA を用いたバイオ センサーは潜在的医療診断、環境モニタリング、食品監視を含む多くのアプリケーションに適しています。この手法は、ポイント ・ オブ ・ ケア患者の監視し同様、品質管理プロセスのオンライン監視に有効になります。全体のセンサー システムの移植性には、消費者が彼らの家の快適さで検出システムを使用することができます診断プロセスの分散が可能になります。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

著者は、マレーシア ・ プトラのサポートを確認したいと思います。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Merck 100056
Chloroform Merck 102445
Diaminoethane tetraacetic acid Promega E5134
Dibasic sodium phosphate  Sigma-Aldrich S9763
Disodium hydrogen phosphate Sigma-Aldrich 255793
Ethanol  Sigma-Aldrich 16368
Gold (III) chloride trihydrate Sigma-Aldrich 520918
Hydrochloric acid Merck 100317
Methylene blue Sigma-Aldrich M44907
Monobasic sodium phosphate, monohydrate Sigma-Aldrich S3522
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich P5119
Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D NatureWorks 4042D
Potassium chloride R&M Chemicals 59435
Potassium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich P9791
Potassium hexacyanoferrate III R&M Chemicals 208019
Sodium acetate anhydrous salt Sigma-Aldrich S2889
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888
Trisodium citrate Sigma-Aldrich S1804
Tris(hydroxymethyl) aminomethane Fisher Scientific T395-100
Tris-Base Fisher Scientific BP152-500
2X PCR Master Mix with Dual-Dye Norgen Biotek 28240
Agarose gel Merck 101236
Bolton Agar Merck 100079
Bolton Broth Merck 100079
CHROMagar Vibrio CHROMagar VB910
dNTPs Promega U1511
Nuclease-free water Thermo Scientific R0581
Eosin methylene blue agar  Merck 101347
GelRed Biotium 41001
Glycerol Merck 104092
Go Taq Buffer Promega M7911
Loading dye 100 bp DNA ladder Promega G2101
Loading dye 1kb DNA ladder Promega G5711
Magnesium chloride Promega 91176
Mannitol egg yolk polymyxin agar Merck 105267
McConkey Agar Merck 105465
Nutrient Broth Merck 105443
Taq polymerase Merck 71003
Trypticase Soy Broth Merck 105459
Trypticase Soy Agar Merck 105458

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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食品由来病原体を検出する電気化学的 DNA のバイオ センサーの開発
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Nordin, N., Yusof, N. A., Radu, S., Hushiarian, R. Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen. J. Vis. Exp. (136), e56585, doi:10.3791/56585 (2018).

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