Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Entwicklung der eine elektrochemische DNA-Biosensor, einem Foodborne Krankheitserreger zu erkennen

Published: June 3, 2018 doi: 10.3791/56585
Automatic Translation
1, 2,3, 1, 4
1Laboratory of Food Safety and Food Integrity, Institute of Tropical Agriculture and Food Security, Universiti Putra Malaysia, 2Laboratory of Functional Device, Institute of Advanced Technology, Universiti Putra Malaysia, 3Department of Chemistry, Faculty of Science, Universiti Putra Malaysia, 4La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University

Summary

Ein Protokoll für die Entwicklung der eine elektrochemische DNA-Biosensor bestehend aus eine Polymilchsäure Säure stabilisiert, gold-Nanopartikeln modifiziert, Siebdruck kohlenstoffelektrode Vibrio Parahaemolyticus erkennen wird vorgestellt.

Abstract

Vibrio Parahaemolyticus (V. Parahaemolyticus) ist eine gemeinsame lebensmittelbedingten Erreger, die für einen Großteil der Probleme der öffentlichen Gesundheit Global gesehen trägt erheblich auf die Rate der menschlichen Sterblichkeit und Morbidität. Konventionelle Methoden für den Nachweis von V. Parahaemolyticus wie Kultur-basierte Methoden, immunologischen Assays und molekularen Methoden erfordern komplizierte Probenbehandlung und sind zeitraubend, mühsam und teuer. Vor kurzem, Biosensoren erwiesen sich eine viel versprechende und umfassende Methode mit den Vorteilen der schnellen Erkennung, Wirtschaftlichkeit und Zweckmäßigkeit. Diese Forschung konzentriert sich auf die Entwicklung einer schnelle Methode zum Nachweis V. Parahaemolyticus mit hoher Selektivität und Empfindlichkeit, die mit den Prinzipien der DNA-Hybridisierung. In der Arbeit gelang mittels Röntgendiffraktometrie (XRD), Ultraviolett-sichtbare Spektroskopie (UV-Vis), Transmission Electron Microscopy (TEM), Feldemission Charakterisierung von synthetisierten Polymilchsäure Säure stabilisiert gold-Nanopartikeln (PLA-AuNPs) Rasterelektronenmikroskopie (FESEM) und zyklischer Voltammetrie (CV). Wir führten auch weitere Tests an Stabilität, Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit von PLA-AuNPs. Wir fanden, dass die PLA-AuNPs eine Klangstruktur von stabilisierten Nanopartikeln in wässriger Lösung gebildet. Wir beobachten auch, dass die Empfindlichkeit durch die kleinere Ladung übertragungswert Widerstand (R-ct) und eine Zunahme der aktiven Fläche (0,41 cm2) verbessert. Die Entwicklung unserer DNA-Biosensor beruhte auf Änderung der Siebdruck kohlenstoffelektrode (tauglich) mit PLA-AuNPs und mit Methylenblau (MB) als Redox-Indikator. Wir bewertet die Immobilisierung und Hybridisierung Ereignisse durch differenzielle Puls Voltammetrie (DPV). Wir fanden, dass ergänzende, nicht-ergänzende und nicht übereinstimmende Oligonukleotide wurden speziell zeichnet sich durch die vorgefertigten Biosensor. Es zeigte auch zuverlässig empfindliche Detektion in Kreuzreaktivität Studien von verschiedenen lebensmittelbedingten Krankheitserregern und bei der Identifizierung von V. Parahaemolyticus in frische Herzmuscheln.

Introduction

Ein wichtiges Thema der öffentlichen und wissenschaftlichen Diskussion in den letzten Jahren, Lebensmittelvergiftung wird hauptsächlich mit 3 Agenten: Mikroorganismen1, Chemikalien2und Parasiten3. Kontaminierter Lebensmittel kann dazu führen, dass schwerwiegende gesundheitliche Folgen beim Menschen, vor allem in höheren Risikogruppe der Personen mit geschwächtem Immunsystem, ältere Menschen, Schwangere, Säuglinge und Kleinkinder4. Mit mehr als 1 Million Fälle von akuter Durchfall bei Kindern unter 5 Jahren in Afrika, Asien und Lateinamerika jährlich auftretenden Lebensmittelvergiftungen ist eine wichtige globale Krankheit5,6 und der World Health Organization gegründet Mikroorganismen als wichtigsten Faktor7. Vibrio Parahaemolyticus zeichnet sich unter den bekanntesten virulente Stämme. In der Regel in Küsten-, Flussmündungen und marine8gefunden, ist es ein gramnegatives Bakterium, wird im hohen Salz Umgebungen aktiv, und verursacht schwere menschliche Gastroenteritis beim Verzehr in ungenügend gekocht, fehlgeleitetes oder roh marine Produkte-9. Darüber hinaus machen Vorerkrankungen bei manchen Menschen sie anfällig für Infektionen, Septikämie oder Ohr-Infektion aus V. Parahaemolyticus10gewickelt. Die Virulenzfaktoren von V. Parahaemolyticus hämolysinen gliedern sich in zwei Arten, die an der Pathogenese der Erkrankung beitragen: thermostabile direkten hlya (TDH) von Tdh Gene codiert und TDH-bezogene hlya von Trh Gene11codiert. Die Virulenz-Marker (Tdh und Trh Gene) von V. Parahaemolyticus befinden sich meist in klinischen Proben nicht in Umweltproben.

V. Parahaemolyticus besitzt die Fähigkeit, unter den unterschiedlichsten Bedingungen überleben, reagiert schnell auf Veränderungen der Umwelt12. Seine Verbreitung Mechanismus eskaliert sein Gefahrenpotenzial, als seine Giftigkeit parallel zu Zelle Masse13erhöht. Noch schlimmer ist, stellt Klimawandel diese Bakterien mit reichlich Bedingungen ihre Zelle Bevölkerung Wachstum14zu beschleunigen. Aufgrund seiner hohen Frequenz muss V. Parahaemolyticus überwacht werden entlang der Food Supply Chain, insbesondere beim Handel und Produktion von Meeresfrüchten, da diese Produkte sind wo sie sich befinden, in enormen Mengen15,16 überall auf der Welt. Derzeit werden die Bakterien identifiziert und isoliert mit einer Reihe von Methoden, einschließlich biochemischen Tests, Bereicherung und selektivmedien17, Enzym-linked Immunomagnetic sorbent assay (ELISA)18, Puls-Bereich Gelelektrophorese (PFGE) 19, Latex Agglutination Prüfungen und Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Tests20. Diese Methoden erfordern in der Regel qualifiziertes Personal, ausgefeilte Instrumente und aufwendige Techniken, die Informationen über Verunreinigung nicht sofort angeben. Dies schränkt die Wahrscheinlichkeit schädlichen Verunreinigungen und vor-Ort-Anwendungen sofort zu erkennen. Schnellnachweis Werkzeuge bleiben eine hervorragende Herausforderung.

Biosensoren zeichnet sich als eine vielversprechende Option für den Nachweis von lebensmittelbedingten Krankheitserregern, denn es eine zeitsparende, kostengünstige, praktische und Echtzeit-Analyse-Methode21,22,23,24 bietet . Zwar gab es viele positive Ergebnisse der Analyten Erkennung dotierten Proben und Standardlösung mit Biosensoren, bleibt es jedoch ein Mangel an Forschung auf realen Proben in wässrigen Gemischen oder Bio-Extrakte25angewendet. Vor kurzem erhielten elektrochemische Biosensoren mit direkte und/oder indirekte Desoxyribonukleinsäure (DNA) Erkennung erhöhte Aufmerksamkeit unter den Wissenschaftlern, aufgrund ihrer spezifischen Nachweis der komplementären Ziel über eine Hybridisierung Event26 , 27 , 28 , 29. diese einzigartige Ansätze sind stabiler im Vergleich zu den Enzym-basierte Biosensoren, bietet somit eine viel versprechende Technologie für Miniaturisierung und Vermarktung. Das Ziel der Studie berichtet, soll hier ein schnelles Werkzeug zu konstruieren, die V. Parahaemolyticus mit hoher Selektivität, Sensibilität und Praktikabilität, basierend auf der DNA-Sequenz Spezifität bei Hybridisierung erkennen kann. Identifikation-Strategien beinhalten die Kombination aus Polymilchsäure Säure stabilisiert gold-Nanopartikeln (PLA-AuNPs)30 und Siebdruck Kohleelektroden (SPCEs) in Anwesenheit der Hybridisierung Indikator, Methylenblau (MB). Das Potenzial des Konstrukts entwickelten Erkennung ist weiter untersucht mit Bakterien DNA lysate und frische Herzmuscheln Proben.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hinweis: Die chemischen und biochemische Reagenzien verwendet werden sollte der analysenrein und ohne weitere Reinigung verwendet. Bereiten Sie alle Lösungen mit sterilen deionisiertes Wasser. Autoklav alle Gläser vor der Sterilisation.

Achtung: Bitte verwenden alle geeigneten Sicherheitsmaßnahmen beim Labortätigkeiten, einschließlich des Einsatzes von technischen Kontrollen (Abzugshaube, Handschuhfach) durchführen und persönliche Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, voller Länge Hose, geschlossene (Schuhe).

1. Herstellung und Charakterisierung von geändert Elektrode mit PLA-AuNPs

  1. Herstellung und Charakterisierung von PLA-AuNPs
    1. Schnell 100 mL kochendem wässrigen Chloroauric Säure (1 mM) 10 mL Natriumcitrat-Lösung (38,8 mM) hinzu und auf Raumtemperatur abkühlen. Beachten Sie die Änderungen in der Farbe in die vorbereiteten AuNPs-Lösung, die als gelb, schwärzlich Änderungen beginnt und endet schliesslich als Dunkles Rubinrot.
    2. Die PLA-Pellets in einem Edelstahl-Werkzeug für den Schmelzprozess legen und Heizen sie bei einer Temperatur von 190 ° C für 10 min. folgen mit den Pressvorgang: setzen Sie sie unter einem Druck von 2,2 MPa für 1 min als Teil der PLA-Blatt-Vorbereitung. Das PLA-Blatt wird nach dem Abkühlen für ca. 3 h einsatzbereit sein.
    3. Lösen Sie kräftig rühren auf, 0,68 mg der PLA Blätter in 5 mL Chloroform bei Raumtemperatur. Mischen Sie die gelöste PLA mit 10 mL der vorbereiteten AuNPs Lösung und homogen rühren bei Raumtemperatur. Die homogene Mischungen können dann als PLA-AuNPs bezeichnet und mit UV-Vis, XRD, TEM und FESEM mit EDX charakterisiert.
  2. Herstellung und Charakterisierung von modifizierten Siebdruck kohlenstoffelektrode
    Hinweis: Die Erholungsfläche in dieser Studie verwendeten besteht aus einem drei-Elektroden-System: eine Gegenelektrode eine kohlenstoffelektrode arbeiten und eine Ag/AgCl-Referenzelektrode.
    1. Schnell Pipette 25 µL der homogenen Lösung von PLA-AuNPs auf die Erholungsfläche und dann Luft trocknen es für 24 Stunden vor der Verwendung.
    2. Elektrochemisch charakterisieren die modifizierte Elektroden Erholungsfläche/PLA-AuNPs, in Ferro Zyankali (K3[Fe(CN)6]3-/4 -) zur Messung der aktiven Fläche, elektrochemische Impedanz Spektroskopie, Wiederholbarkeit, Reproduzierbarkeit und Stabilität30.

2. Entwicklung der elektrochemische DNA-Biosensor

  1. Vorbereitung der Sonde
    Hinweis: Die Sequenzen von SsDNA Sonde und komplementären DNA wurden basierend auf den Informationen vom National Center for Biotechnology Information (NCBI) Datenbank ausgewählt.
    1. Kaufen Sie synthetische Oligonukleotide (20-Mer SsDNA Sonde, 20-Mer komplementären DNA-20-Mer nicht übereinstimmende DNA und 21-Mer-komplementären DNA) als lyophilisierte Pulver aus kommerziellen Laboren, basierend auf die folgenden Sequenzen:
      Thiolated SsDNA Sonde: 5′ - / 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG - 3 '
      komplementäre DNA: 5′ - CAGTGCTTCTGCATAATCCG - 3 '
      One-Base nicht übereinstimmende DNA: 3 ' 5 ' - CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG -
      drei-Base nicht übereinstimmende DNA: 3 ' 5 ' - CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG -
      nicht-komplementären DNA: 5′ - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA - 3 '
    2. Bereiten Sie Stammlösungen alle Oligonukleotide (100 µM) mit einer sterilen TE-Lösung (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5), in Portionen aufgeteilt. Beachten Sie dies bei-4 ° C und dann machen Sie die entsprechenden Verdünnungen nur vor dem Gebrauch.
  2. Optimierung der Immobilisierung und Hybridisierung
    Hinweis: Eine Erholungsfläche modifiziert mit PLA-AuNPs, bezeichnet als Erholungsfläche/PLA-AuNPs, wurde für diese Studie verwendet und ein Drop-Gießverfahren diente für die DNA Immobilisierung und Hybridisierung.
    1. Erstens immobilisieren 25 µL Thiolated SsDNA Sonde auf der AuNPs/PLA-tauglich und Luft trocknen Sie es dann für 24 h bei Raumtemperatur, danach wird es schließlich als Erholungsfläche/PLA-AuNPs/SsDNA bezeichnet werden. Optimierung der Immobilisierung Bedingung mithilfe von drei Faktoren bestimmt: die Konzentration von SsDNA (von 0,2 bis 1,4 µM), Zeit (von 30 bis 210 min.) und Temperatur (von 25 bis 75 ° C).
    2. Pipette 25 µL der komplementären DNA auf die Oberfläche der Erholungsfläche/PLA-AuNPs/SsDNA zur Durchführung der Hybridisierung Veranstaltung, wonach es schließlich als Erholungsfläche/PLA-AuNPs/DsDNA bezeichnet werden kann. Optimierung der Hybridisierung Bedingung über die beiden Faktoren der Zeit (von 5 bis 30 min) und Temperatur (von 25 bis 75 ° C) zu bestimmen.
    3. Tauchen die immobilisierte und hybridisierte Elektroden in 20 µM MB für 30 min. unspezifisch adsorbierten DNA und überschüssige MB durch Waschen mit 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4,5) und dann Spülen mit entionisiertem Wasser. Maß der Spitzenstrom für MB-Reduzierung mit DPV-Technik. Die DPV-Messung mit 0,1 M PBS (pH 7) ausführen, enthält kein Indikator.
  3. Charakterisierung von vorgefertigten DNA-biosensor
    1. Tauchen die Erholungsfläche/PLA-AuNPs in 20 µM MB für 30 min, mit 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4,5) waschen und Spülen mit entionisiertem Wasser vor der Messung. Ein ähnliches Verfahren für alle Interaktionen mit der DNA-Sonde, komplementäre DNA nicht übereinstimmende DNA und nicht-komplementären DNA-Proben zu folgen.
    2. Die elektrochemische Reduktion zu messen.
      Hinweis: Wir haben DPV Schnittstellensoftware kommerziell hergestellten Autolab mit gemessen.
      Die DPV-Messungen der MB elektrochemische Reduktion durchgeführt auf einem Potential von -0,5 V bis 0,25 V, mit einem möglichen Schritt von 0,005 V, Amplitude Modulation von 0,05 V und einer Abtastrate von 7,73 mVs-1 mit 0,1 M-PBS-Puffer (pH 7), enthält kein Indikator. Die Selektivität, Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und Hitzestabilität von vorgefertigten DNA-Biosensor waren weiter untersucht. Berichteten Ergebnisse präsentierten sich als mittlere Wert Messungen in drei Wiederholungen.

(3) Validierung der vorgefertigten DNA-Biosensor mit realen Proben

  1. Vorbereitung von Bakterienstämmen
    1. Wählen Sie bakterielle Proben anhand ihrer erheblichen Verschmutzung der Meeresfrüchte31,32 .
      Hinweis: V. Parahaemolyticus Referenzstämme sowie 8 andere Bakterienstämme (Campylobacter Jejuni, Listeria Monocytogenes, Salmonella Typhimurium, Salmonellen Enteritis, Klebsiella Pneumonie, Escherichia coli O157: H7, Bacillus Cereusund Vibrio Alginolyticus) der gemeinsame lebensmittelbedingten Erreger waren für die elektrochemische DNA-Biosensor-Validierung in dieser Studie beschäftigt.
    2. Führen Sie eine Routine Subkultur von Bakterienstämmen auf ihre jeweiligen Agar alle zwei Wochen ihre Lebensfähigkeit zu erhalten, siehe Tabelle 1 für Kulturbedingungen.
    3. Pflegen Sie Langzeitarchivierung der Bakterienstämme in ihren jeweiligen wachsenden Brühen mit 20 % (V/V) Glycerin bei-80 ° C wie Glycerin schützt Bakterien verhindert die Bildung von Eiskristallen, die sie während des gefriervorgangs beschädigen können. Als nächstes impfen Sie eine Schleife der erhaltenen Bakterielle Zellkultur in Glycerin Aktien in der jeweiligen Brühen. Inkubieren Sie Brühen entsprechend ihrer jeweiligen Wachstumszeit und Temperatur, wenn benötigen, um die Bakterien wieder zu beleben.
    4. Bestimmen Sie die Menge von V. Parahaemolyticus Zellen unter Verwendung einer Ausbreitung Platte Technik33, ein Standard und eine bekannte Methode zum Auflisten von Mikroorganismen, die aus einer Reihe von Verdünnungen abgeleitet.
      1. Kultur V. Parahaemolyticus in Trypticase-Soja-Bouillon (TSB + 3 % NaCl) bei 37 ° C in einem 140 u/min schütteln Zustand. Übertragen Sie dann 1 mL Bakterienkultur Zelle in 9 mL TSB + 3 % NaCl, ein Verdünnungsfaktor 10-1 zu erhalten.
    5. Wiederholen Sie diesen Schritt neun Mal, um eine vollständige Reihe von bis zu 10-10 Verdünnungsfaktor zu bekommen. Als nächstes 0,1 mL jedes Verdünnungsfaktor (ab 10-1 bis 10-10) auf ein Vibrio selektive nährbodenplatte Kolonie zählen, bzw. verteilt. Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C für 24 h inkubiert.
    6. Verwenden Sie einen Kolonie Zähler zählen einzelne Kolonien und dann zurück-rechnen (Anzahl der KBE/pipettiert Betrag x Verdünnungsfaktor) um eine koloniebildenden Einheiten pro Milliliter Dichte (KBE mL-1) zu erhalten. Leiten Sie die Konzentration der koloniebildenden Einheiten (KBE) in der Bakterien-Zellsuspensionen vom Kalibrierung Grundstück KBE mL-1 gegen Extinktion ab.
  2. Vorbereitung des PCR-Assays
    1. Extrahieren Sie genomischen DNA nach einem modifizierten Lyse Verfahren34gekocht. Erste, Streifen, eine einzelne bakterielle Belastung auf Agar-Medien und in Brühe Medien, gefolgt von Bebrüten es seine relative Wachstum Zustand, ein 140 u/min schütteln Zustand zu impfen.
    2. Pipette eine 1 mL-Kultur der Brühe in eine Mikro Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie dies bei 4830 x g und 4 ° C für 1 min um Pellets zu erhalten. Verwenden Sie ca. 500 µL steriler TE-Puffer für Resuspension mit Pellets. Halten Sie die entstandene Suspension für 10 min bei 98 ± 2 ° C in einem Heizblock und chill es sofort bei-18 ° C für 10 min zur lyse der Zellen und die DNA freigeben.
    3. Zentrifugieren Sie die genomische DNA bei 4830 x g und 4 ° C für 3 min zu erhalten eine klare Suspension und halten den Überstand bei-20 ° C für die weitere Verwendung. Verwenden Sie eine Biophotometer-Messung mit UV-Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm (als Nukleinsäuren absorbierenden Wellenlänge des Lichts) und auch bei einer Wellenlänge von 280 nm (als die Proteine absorbierenden Wellenlänge des Lichts) zu bestimmen, die Konzentration und Reinheit der entnommenen genomische DNA und identifizieren Sie dann alle Stämme mit standard biochemischen Assays35 und von 16 s rRNA-Gen-Sequenzierung36zu überprüfen. Zu guter Letzt Denaturieren Sie die genomische DNA bei 92 ° C für 2 min und im Eiswasser vor Anwendung der Biosensor kühlen Sie schnell.
    4. Weiter bestätigen das Vorhandensein V. Parahaemolyticus mittels PCR ToxR gen Ziel. Führen Sie diese Schritte in einem Thermocycler mit einer Grundierung (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3' und 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3"). Optimieren Sie die PCR Verstärkung in eine gesamte Reaktionsvolumen von 25 µL bestehend aus sterilem Wasser (15,5 µL), Puffer (5 µL), Grundierung (1 µL, 10 µM), dNTP-Mix (1 µL), DNA-Vorlage (2 µL) und Taq-DNA-Polymerase (0,2 µL, 10 X).
    5. Vermischen Sie die Komponenten gut und ordnen Sie die PCR Verstärkung der Zielsequenz in einem Thermocycler programmiert für 30 Zyklen der Verstärkung. In unserer Studie jedem Zyklus bestand aus drei Schritten Reaktionen dh., erste Denaturierung (94 ° C, 3 min), gefolgt von 30 Zyklen der Denaturierung (94 ° C, 1 min), Glühen (63 ° C, 1,5 min) und Verlängerung (72 ° C, 1,5 min), gefolgt von letzte Verlängerung (72 ° C, 7 min).
    6. Bestimmen Sie die amplifizierten Produkte und deren Größen per Elektrophorese auf 1,5 % Agarosegel. Erfassen Sie die Gelbilder mit ein kommerziell hergestelltes Gel-Dokumentations-System.
  3. Vorbereitung der Herzmuschel-Proben
    1. Erhalten Sie frische Proben.
      Hinweis: Unsere frische Herzmuscheln (Anadara Granosa) wurden von der nassen Markt in Serdang Selangor, gewonnen und schnell an das Labor in einem Kühler Eisbox zur Analyse gebracht. Teilen Sie die Proben in 2 Gruppen, nämlich die behandelten und unbehandelten Gruppe davon aus, dass ums gleichmäßig aus den Beginn der Ernte geerntet wurden, bis ins Kühlhaus ablegen.
    2. Behandeln Sie Herzmuscheln in der behandelten Gruppe durch eine Aufbewahrung bei-20 ° C für 24 h, gefolgt durch die Einwirkung von UV-Licht bei 20 ° C für 4 h vor der DNA-Extraktion vor.
      Hinweis: Die Gefriertemperatur und UV-Exposition verwendet für die kontrollierte Gruppe tötet oder zumindest die natürlich anfallende V. Parahaemolyticus in ums beschränkt. Gelten Sie eine höhere Pasteurisierung Regime von 70 ° C nicht, wie der kontrollierten Zustand in dieser Studie die tatsächliche Situation der frische Herzmuscheln zu imitieren soll. Unterdessen analysieren Sie Proben direkt aus der unbehandelten Gruppe ohne jede Vorbehandlung, sobald sie im Labor ankommen.
    3. Subkultur einen Stamm von V. Parahaemolyticus ATCC 17802 TSB (3 % NaCl). Bestimmen Sie die entwicklungsfähigen Zellen in das Inokulum über Beschichtung von entsprechenden Verdünnungen der TSB (3 % NaCl) auf CA um ein Inokulum von 104 KBE mL-1 V. Parahaemolyticuszu erhalten. Waschen Sie jede Schale in destilliertem Wasser und Schrubben sie frei von Schmutz vor mit sterilen Pinzette in eine laminare Strömung Kabinett, um das Gewebe aus der Schale zu entfernen.
    4. Homogenisieren ca. 10 g Herzmuscheln Gewebeproben mit einem Homogenisator in 90 mL sterile TSB (3 % NaCl) für 60 s. hinzufügen eine bekannte Menge von V. Parahaemolyticus bis 9 mL der homogenisierten Probe Brühe für die Spikes Proben. Verwenden Sie die unspiked Beispiele als Negativkontrolle. Schätzen die Zellzahlen von V. Parahaemolyticus versetzt auf die Herzmuschel-Proben durch Ausplattieren 0,1 mL der Proben auf CA, und probieren Sie anschließend pipettieren 1 mL der Proben zu einem Microcentrifuge Schlauch für DNA Extraktion in der Biosensor und PCR-Assay verwendet werden.
    5. Extrahieren Sie die genomische DNA von der V. Parahaemolyticus der Spikes und unspiked Proben nach einem modifizierten gekocht Lyse Verfahren36. Schließlich bestimmen die DNA-Konzentration und Reinheit mit einer Bio-Photometer-Messung mit UV-Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm (als Nukleinsäuren absorbierenden Wellenlänge des Lichts) und auch bei einer Wellenlänge von 280 nm (als die Proteine, die Wellenlänge des Lichts absorbieren).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bildung von AuNPs zeigte sich durch die Veränderung der Farbe der wässrigen Lösung mit Natriumcitrat vorhanden. Dies verursacht die Farbe von hellgelb zu tief Rubinrot wechseln. Die Generation von PLA-AuNPs wurde aus den UV-Vis-Spektren (Abbildung 1), wo das Wachstum des Surface Plasmon Resonance (SPR) Peaks bei ca. 540 gefunden wurde, bestätigt nm. Die Entstehung und Existenz von PLA-AuNPs wurde auf 500-600 nm Wellenlänge reicht, je nach Partikel Größe37angegeben. Die XRD-Muster von AuNPs und PLA-AuNPs sind in Abbildung 2dargestellt. Alle Kristallit-Gipfel wurden bei den 2θ von 31,7, 38,2 44,4, 64,7 und 77,7 ° beobachtet. Sie wurden zugeschrieben (100) (111) (200) (220), und (311) kristallographische Ebenen der kubisch-FCC (kubisch flächenzentrierter) Gold (Metall)-Nanostrukturen (TERMTUD Datei Nr.-00-004-0783). Die PLA-AuNPs Kristallit Peak Intensitäten erhöht auch als eine breitere Beugung Peak bei 31,7 °, was bedeutet, dass die AuNPs in den Winkel des Leistungshebels eingebettet wurden und was die Bildung von polyphasisches gold Nanostrukturen38zentriert. Darüber hinaus hat alle AuNP Beugung Gipfel auf dem PLA-AuNPs gezeigt, dass die AuNPs eine stabile Struktur. Die mittlere Größe der PLA-AuNPs wurde mit Scherrer Gleichung errechnet (L = Kλ/βcosθ), durch die Bestimmung der Breite der (100) Bragg-Reflexion. Von der FWHM und d-Abstand (Tabelle 2), war die Kristallit-Größe von PLA-AuNPs berechnet als 27 nm.

Die Abmessungen der PLA-AuNPs und seiner Morphologie wurden mittels TEM weiter untersucht. Von der Verteilungskurve TEM Partikel und Bilder von PLA-AuNPs wurde gesehen, dass gold-Nanopartikel fast kugelförmig (Abbildung 3 waren). Die Größe der Nanopartikel wurde im Bereich von ca. 37 nm, etwas größer als Scherrer Formel, was auf einer polykristallinen Natur der Nanopartikel als synthetisiert39entnommen. Kleinere Größe aus XRD im Gegensatz zu TEM ist auch beobachtet worden, in der bisherigen Forschung, wahrscheinlich, weil die Partikelstruktur polykristallinen in der Natur ist wegen der erheblichen Menge der Kristallite, die kleinere (Sub-Partikel)40 . Abbildung 4 zeigt das FESEM Bild von PLA-AuNPs als vorbereitet auf tauglich. Es ist offensichtlich aus dem FESEM Bilder und EDX-Spektren, dass Erholungsfläche/PLA-AuNPs der höchsten Gewichtsanteil von gold, größte Dichte und größte Oberfläche der Nanopartikel Berichterstattung hatte. Es kann, besonders hingewiesen werden, dass Abbildung 4(ein) das FESEM Bild der nackten Erholungsfläche zeigt. Das FESEM Bild in Abbildung 4(b) zeigt gut verteilten PLA-AuNPs. Um die chemischen Zusammensetzung der synthetisierten PLA-AuNPs behaupten, wurde EDX eingesetzt, um die chemische Zusammensetzung der als produziert PLA-AuNPs, gemäß Abbildung 4(ein)und 4(b) untersuchen. EDX-Spektrum bestätigt, dass die als produziert PLA-AuNPs aus Gold (Au) nur bestanden, und kein anderes Element mit Ausnahme der Spitze entsprechend Kohlenstoff (C) und Sauerstoff (O) angezeigt. Die Anwesenheit des C Peak war aufgrund der kohlenstoffelektrode, auf dem das Beispiel Drop Besetzung war.

Das EDX-Spektrum zeigte auch die Anwesenheit von O darauf hinweist, dass Sauerstoff an die kohlenstoffelektrode adsorbiert wurde, weil der Film der Luft ausgesetzt war. Dies bestätigt, dass Sauerstoff an Kohlenstoff-Nanoröhren adsorbiert ist, wenn sie Luft für eine lange Zeit41ausgesetzt sind. Es gibt, zwar verschiedene Gasmoleküle in Luft Sauerstoff glaubte man die wichtigsten adsorptiv an der Luft ausgesetzt Carbon Nanotubes42, möglicherweise aufgrund seiner schneller Adsorption im Vergleich mit anderen Molekülen43sei. Basis hierfür war auf der Suche nach, dass Sauerstoff die wichtigste adsorptiv an die kohlenstoffelektrode während der Nacht Luft Belichtung bei der Probenvorbereitung und die chemische Reinheit von PLA-AuNPs verstärkt. Das Verhältnis der anodischen und kathodischen Peak (ichPa/ipc) war fast 1, die ständige Peak Potenzial gegeben hat, wie der Scan rate erhöhte44. Darüber hinaus waren die anodische und kathodische Peak-Potenziale konsequent um verschiedene Scan Preise45 darauf hindeutet, dass die elektrochemische Reaktion reversibel anhand der Peak-Trennung (Abbildung 5 war). Die aktive Fläche der geänderten Elektrode wurde anhand der Randles-Sevick-Gleichung (ichpc = (2,69 × 105) n3/2 AD1/2 CV1/2. Von der Neigung des Grundstücks ichpc versus V1/2 in Abbildung 5(ein) und (b), die Fläche der Elektroden wurde als 0,26 cm2 und 0,41 cm2 berechnet für die nackten Erholungsfläche und PLA-AuNPs beziehungsweise. Dieses Ergebnis bestätigt, dass die Verbesserung durch die PLA-AuNPs auf der aktiven Fläche relativ höher im Vergleich mit nackten tauglich war. Das abgeleitete Ergebnis war vergleichbar mit dem Polymer eingebettet Gold-Nanopartikeln (β-CD-EDAS(N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylene-diamine Matrix gekapselt gold-Nanopartikel), die ergab, dass eine große aktive Oberfläche den Prozess der verbessert Elektronentransfer und daher führte zu besseren Empfindlichkeit46.

Die modifizierte Erholungsfläche elektrochemische Reaktion war in einem Prozess der kontrollierten Diffusion, dargestellt durch eine Verringerung der K3[Fe(CN)6]3 -/4 - Spitzenstrom, die wiederum stützte sich auf den aktuellen Scan-Rate-Quadratwurzel (V 1/2). Um einen besseren Blick auf die veränderten Elektrode Eigenschaften zu erhalten, wurde eine elektrochemische Impedanz Spektroskopie (EIS) Studie durchgeführt, um korrelieren mit der Leistung der modifizierten Elektrode in Bezug auf CV Messungen vorgestellt. Der Halbkreis Abschnitt gesehen bei hohen Frequenzen korreliert mit der begrenzende Prozess der Elektronentransfer in das EIS. Kostenlos Übergangswiderstand (R-ct) wurde direkt als der Durchmesser des Halbkreises gemessen. Dieses Ergebnis mit dem Wert von Rct von der bloßen Erholungsfläche, 1932 Ω war und wo die Änderung der Erholungsfläche/PLA-AuNPs sank auf 1444 Ω (Abbildung 6) ausgezählt. Der Rückgang des R-ct -Wert der Erholungsfläche/PLA-AuNPs kann von einem Rückgang der lokalen Dielektrizitätskonstante geführt haben und/oder eine Erhöhung der Dicke des elektrischen Double layer47, was darauf hindeutet, dass K-3[Fe(CN)6]3 - /4 - Funktion durch Adsorption an der Grenzfläche Metall/Lösung. Diese Ausgänge sind diejenigen abgeleitet aus den Messungen des CV (Abbildung 7) einzuhalten. Die Spitzenströme erhöht schrittweise mit der Änderung der SPCEs mit PLA-AuNPs, die zeigten, dass eine höhere Empfindlichkeit der Kehrwert der unteren Rct48war. Also, die Wertsteigerung des CV der modifizierten Elektroden und der Rückgang der R-ct -Werte können gewesen sein aufgrund der schrittweisen Ersatz von Wassermolekülen (das Volumen der Wassermoleküle ist 27.19 Å3) durch die Adsorption der K3 [Fe(CN)6] 3-/4 - auf der Metalloberfläche, verringert das Ausmaß der Auflösung Reaktion49.

Tabelle 3 zeigt die relative Standardabweichung (RSD) der Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit der modifizierten Elektrode. Routinemäßige CV Aufnahme von K3[Fe(CN)6]3-/4 - für sechs aufeinander folgende Sätze zu untersuchen, die Wiederholbarkeit der modifizierten Elektroden gemacht wurde. Die RSD Erholungsfläche/PLA-AuNPs wurde als 4,26 % abgeleitet. Die Elektrode mit PLA-AuNPs Änderung gab bessere RSD nach mehreren Messungen. Darüber hinaus wurden mit dem gleichen Verfahren, sechs modifizierten Elektroden unabhängig hergestellt die gab RSD Werte von 4,05 % für tauglich/PLA-AuNPs, Angabe bessere Reproduzierbarkeit der Elektrode Fabrikation für PLA-AuNPs. Das modifizierte Substrat abhängig von PLA-AuNPs war bei 37 ° C über einen längeren Zeitraum gehalten. Es wurde auch für den Rekord von 20 Zyklen und einem Rückgang von 18 % Signalqualität genutzt. Zur Erreichung der maximalen Ausgang von der Biosensor, Immobilisierung Zeit, Temperatur, zusammen mit SsDNA Konzentration und Kriterien für die Hybridisierung untersucht. Diese Voraussetzungen optimiert werden, da sie den Spitzenstrom von DPV beeinflussen. Um die SsDNA-Konzentration zu optimieren, wurde Erholungsfläche/PLA-AuNPs mit unterschiedlicher Konzentration pipettiert (0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2 und 1,4 µM) von SsDNA für 60 min damit die optimale Konzentration von SsDNA bestimmt war. Anhand der Abbildung 8, erhöht der DPV Spitzenstrom wie höhere DNA-Konzentrationen verwendet wurden. Die Studie fand auch, dass die optimale Konzentration der DNA 1,2 µM SsDNA.

Um die Immobilisierung Periode mit einzelsträngiger DNA in Erholungsfläche/PLA-AuNPs zu optimieren, wurden 25 µL SsDNA (1,2 µM) in verschiedenen Zeiten getestet (30, 60, 90, 120, 150, 180 und 210 min.). In Abbildung 9zeigen die Ergebnisse eine Zunahme der Immobilisierung Periode die kontinuierliche Erhöhung des DPV Spitzenstrom. So wurde die optimale Ruhigstellung Tageszeit die SsDNA 180 min gewählt. Um die Immobilisierung Temperatur zu optimieren, wurde die Erholungsfläche/PLA-AuNPs mit SsDNA (1,2 µM) bei verschiedenen Temperaturen pipettiert (75, 65, 55, 45, 35 und 25 ° C) für 180 min. Wir fanden, dass wenn die Temperatur der Immobilisierung auf 55 ° C erhöht wurde, die DPV Spitzenstrom zunächst eskalierte gefolgt von einer nachfolgenden Abschreibungen (Abbildung 10). So wurde 55 ° C als die optimierte Immobilisierung Temperatur ausgewählt, um in späteren Experimenten verwendet werden. Trennung von SsDNA, die unbeweglich von Oberflächen die Elektrode und Hybridisierung Invalidität wurde durch erhöhte Temperaturen verursacht. Es wurden andere Berichte mit ähnlichen Ergebnissen50. Bei höheren Temperaturen51kam schneller Spaltung und Degeneration der DNA von den Oberflächen des Gold-Nanopartikel. Forschung kürzlich berichtet, dass die Bindung zwischen Gold und Thiol oxidiert verschlechtert sich schnell und einfach in eine Situation, die ambient, zum Beispiel wenn mit Wasser in Berührung, Luft und Licht52,53,54. Der Effekt der Hybridisierung Zeit wurde auch in dieser Studie untersucht.

Die vorgefertigten Erholungsfläche/PLA-AuNPs/SsDNA Drop-gegossen wurde mit einer Lösung aus Ziel DNA (0,2 µM) bei verschiedenen Hybridisierung Zeiten (5, 10, 15, 20, 25 und 30 min). Die Antwort der DPV stieg natürlich mit einem 5-min Anstieg Zeit der Inkubation (von 5 bis 10 min) (Abbildung 11). Sobald dieser Wert erreicht wurde, war ein 10 bis 30 min nach unten Muster zu beobachten, so dass die gewünschte Zeit für die Hybridisierung als 10 min gewählt wurde. Die Effizienz der Hybridisierung erhöht mit einem Anstieg der Temperatur von 25 ° C bis 35 ° C (Abbildung 12). Der hohe Strom galt, langsam zu verringern, bei einer Temperatur über 35 ° C. Der Grund dafür war Sandwich-Struktur Denaturierung reduzieren das Erkennungssignal zugeschrieben. Daher wurde die optimale Hybridisierung gewählte Temperatur 35 ° C. Der Prozess, den wir verwendet bei der Aufdeckung von V. Parahaemolyticus umfasst AuNPs um die aktive Fläche der Arbeitselektrode, PLA Oberflächenmodifizierung und komplexe, Redox vermitteln MB, zu verbessern, die es auf LB reduziert. Das Ergebnis dieser Oxidationsprozess war eine bessere Affinität zwischen SsDNA und MB55. Aktuelle DPV wurde durch die geringere Anzahl der beigefügten MB Moleküle während der Hybridisierung von SsDNA mit ihren komplementären Sequenz verringert.

Wir haben weitere Untersuchungen über die Leistung der entwickelten Biosensor durchgeführt. Die DPV Ergebnisse in Abbildung 13 zeigen, dass es selektiv DNA-Sonde, komplementäre DNA-eins-Basis nicht übereinstimmende DNA, drei-Base nicht übereinstimmende DNA und nicht-komplementären DNA in Anwesenheit von MB als die Erkennung Label56, unterscheiden konnte 57. der niedrigsten Spitzenstrom (0,73 µA) wurde durch komplementäre DNA, die langsam durch eine Basis nicht übereinstimmende DNA erhöht ausgestellt (0.94 µA), drei Basen übereinstimmende DNA (1,05 µA), nicht-komplementären DNA (3,25 µA) und Sonde DNA (4,79 µA). Die aktuelle Ziel-DNA war das kleinste von den Strömungen der Oligonukleotid-Sequenzen, so dass unsere Biosensor zu unterscheiden zwischen den Oligonukleotid-Sequenzen sensitiv und spezifisch. MB gebunden stark mit SsDNA immobilisierte Sonden-DNA eine große DPV Spitzenstrom produzieren. Erholungsfläche/PLA-AuNPs/nicht-komplementären DNA reduziert die immobilisierten Sonde DNA aktuelle um fast die Hälfte als nur eine kleine Menge von MB auf der Oberfläche der Erholungsfläche/PLA-AuNPs/DsDNA montiert. Dies ist vermutlich nicht zugegriffen werden Wechselwirkungen zwischen MB und Guanin Basen zu. Die Interaktionsmodi von DNA und MB sind stark abhängig von den experimentellen Bedingungen wie pH-Wert, Temperatur, DNA-Konzentration, Ionenstärke und Art der Puffer58,59. MB verbindet häufig mit DsDNA durch Nut und intercalative Modi, was MB Ansammlung auf DsDNA Oberfläche60. Die Exposition von unserer Capture-Sonden-DNA an One-Base nicht übereinstimmende DNA und drei-Base nicht übereinstimmende DNA konsequent reduziert DPV Spitzenströme und komplementären Ziel-DNA dieser Trend fortgesetzt. Tabelle 4 zeigt den Prozentsatz der Selektivität Rate für MB-Peak. Unsere allgemeine Feststellung war, dass Hybridisierung von der konstruierten DNA-Biosensor hochselektiven über immobilisierte Sonde DNA auf die Erholungsfläche/PLA-AuNPs Oberfläche.

Die Empfindlichkeit der entwickelten DNA-Biosensor wurde mit verschiedenen Konzentrationen von komplementären Ziel Oligonukleotid untersucht. Abbildung 14 zeigt die allmähliche Erschöpfung der DPV Spitzenstrom von MB auf die Erholungsfläche/PLA-AuNPs als die komplementären DNA-Konzentration erhöht. Abbildung 15 zeigt eine lineare Regression Koeffizient 0.96 der zwischen das Protokoll des reduzierten Spitzenstrom MB und das Protokoll von mehreren Konzentration der Ziel DNA (12:02 bis 0,02 mM) generiert wurde. Ein Diagramm der aktuellen Veränderungen der Gipfel (ΔP) wurde aufgetragen, mit Hilfe der Formel 3σ/m (σ wird die Standardabweichung der leere Projektmappe und m ist die Steigung der linearen Kurve)61,62,63. Die Nachweisgrenze der vorgefertigten DNA-Biosensor errechnete um 16:43, die tatsächlich größer als unsere kleinste war Probe gemessen. Dieses Ergebnis wurde im Einvernehmen mit der Tatsache, dass ΔP für 12:02 und 14:00 (2,65 × 10-6 A und 2,81 × 10-6 A) mit einer Standardabweichung von 1.19 × 10-7 A und 1,06 × 10-7 A, bzw. überschnitten.

Um die LOQ für die fabrizierten DNA-Biosensor zu berechnen, verwendet wir die 10σ/m-Formel in dem (σ ist die leere Projektmappe Standardabweichung und m ist die Steigung der linearen Kurve) und fand das Ergebnis zu einem Gewinn von 14:08. Wiederholte Denaturierung der komplementären DNA wurde durchgeführt, um die DNA-Biosensor in Bezug auf seine Regenerationsvermögen beurteilen. Wir haben dies durch Inkubation 0,2 µM komplementären DNA-modifizierte Elektrode in heißem Wasser bei 86 ° C 8 min um die doppelsträngige DNA, gefolgt durch rasches Abkühlen im Eisbad weiterhin die denaturierten einzelsträngigen DNA-64zu denaturieren.

Die Hybridisierung Aktivität blieb mit 91 % von ihrer ersten Reaktion nach 8 Bemühungen der Regeneration (n = 5, RSD = 4,05 %). Der DNA-Biosensor basierend auf SAM-Methode für DNA-Sonde Immobilisierung an Erholungsfläche/PLA-AuNPs war sehr stabil, erreichen eine gute Resonanz bei der Aufdeckung von komplementären DNA nach wiederholten Denaturierung Prozesse. Die Stabilität unserer DNA-Biosensor bezüglich Hitze wurde weiter erforscht. Zu diesem Zweck gespeichert wir die PLA-AuNPs/Erholungsfläche/SsDNA Elektrode bei einer Temperatur von 4 ° C, 25 ° C und 45 ° C in einem versiegelten Alu-Beutel mit Silica-Gels. Am Ende der 6 Monate wir die komplementäre DNA und schätzt den Prozentsatz der Wiederaufnahme der Produktion Signal. Abbildung 16 zeigt, dass die Sonde Erholungsfläche/PLA-AuNPs/SsDNA hochstabile mit mehr als 80 % seiner ursprünglichen Signal noch erstattungsfähig nach 6 Monaten Lagerung. Die starke Reaktion zwischen PLA-AuNPs und SsDNA zeigte sich langfristigen Stabilität bei Temperaturen unter 45 ° C.

Neun verschiedene Arten von Bakterien (B. Cereus, L. Monocytogenes, C. Jejuni, E. Coli O157: H7, V. Alginolyticus, S. Typhimurium, S. Enteritis, K. Lungenentzündung und V. Parahaemolyticus) liefen durch PCR-Nachweis. Die PCR-Verstärkung-Produkte für die Spezies-spezifische Erkennung von V. Parahaemolyticus aus der Bakterienkultur sind in Abbildung 17dargestellt. Das ToxR gen von V. Parahaemolyticus wurde als PCR-Primer für V. Parahaemolyticus Identifikation durch seine Präsenz in pathogenen Isolate eingesetzt. Von der PCR-Analyse V. Parahaemolyticus zeigten positive Ergebnisse aufgrund der Spezifität der PCR-Primer des Gens ToxR gegenüber V. Parahaemolyticus. Keine PCR-Produkte von anderen Bakterienstämme wurden erkannt. Der DPV Spitzenstrom geholt, nachdem eine Kreuzreaktivität Bewertung sehr klare Erkennung von V. Parahaemolyticus im Vergleich zu anderen Bakterienarten, zeigte, wie in Abbildung 18dargestellt. Die DPV-Signal stieg die Zahl der Basenpaare sank aufgrund der größeren Menge an MB-Moleküle gebunden, die Sonden. V. Parahaemolyticus konnten deutlich von den anderen lebensmittelbedingten Krankheitserregern diskriminiert werden, die die Umwelt die schnupperprobe nachgeahmt.

Herzmuscheln wurden als realen Proben für die DNA-Biosensor-Validierung in dieser Studie ausgewählt, da sind beliebte Zutaten in mehrere Arten von lokalen Lebensmitteln. Es ist bekannt, dass rohe Herzmuscheln oft pathogene V tragen. Parahaemolyticus und können diese Bakterien auf den Menschen übertragen, vor allem, wenn sie während der Lagerung nach der Ernte65unzureichend gekühlt werden. Die behandelte Gruppe von Herzmuschel Proben wurde bei-20 ° C für 24 h gespeichert und UV-Licht bei 20 ° C für 4 h vor der Extraktion der DNA während der Vorbehandlung Schritt ausgesetzt. Abbildung 19 zeigt, dass die PCR-Analyse V. Parahaemolyticus in den behandelten und unbehandelten (Spike) Proben gefunden. Das zeigt Lane 7, 8, 9, 10, 11 und 12 korrelieren mit der Kolonie in der bisherigen Diskussion zählen. Keine V. Parahaemolyticus wird in den behandelten und unbehandelten (unspiked) Proben, wie in Bahn 1, 2, 3, 4, 5 und 6 in der PCR-Ergebnisse angezeigt, obwohl die Anzahl der Kolonie seine Präsenz in den Proben angegeben habe. Ein möglicher Grund dafür ist das Vorhandensein einer Kontaminierung Metaboliten wie Protein in der extrahierten DNA-66.

Abbildung 20 fasst die Ergebnisse der Erkennung mit Hilfe der entwickelten DNA-Biosensor, die erfolgreich das Vorhandensein von V. Parahaemolyticus in der behandelten Gruppe bestehend aus Spikes und unspiked Proben bestimmt. Diese Ergebnisse korrelieren positiv mit den zuvor besprochenen PCR-Ergebnisse. Jede Probe der PCR, die positive Ergebnisse zeigten entdeckt wurde, mit der PLA-stabilisierten elektrochemische Biosensor-Technik, die AuNP-basiert ist, und die DPV Peakfläche eindeutig korrespondierte mit den daraus resultierenden PCR Intensität Bands (Abbildung 19 und Abbildung 20). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die vorgeschlagenen Nanopartikel basierende elektrochemische Sensor in dieser Studie V. Parahaemolyticus erfolgreich in die realen Proben, was beweist, dass es besser als PCR ohne Auswirkung auf die Authentizität der Ergebnisse erkannt.

Figure 1
Abbildung 1 : Absorption von PLA-AuNPs Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : X-ray Diffraction Spektrum von PLA-AuNPs. Adaptiert mit Erlaubnis von Ref [30]. Copyright (2016) Sociedade Brasileira de Química. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Durchmesser Häufigkeitsverteilung TEM und Bilder von PLA-AuNPs bei einer Messung skaliert von 50 nm. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Ref [30]. Copyright (2016) Sociedade Brasileira de Química. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : EDX-Spektren und FESEM Bilder von (a) nackten Erholungsfläche und (b) tauglich/PLA-AuNPs. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Ref [30]. Copyright (2016) Sociedade Brasileira de Química. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Die Handlung der Spitze aktueller Oxidation gegen die Scan-Rate Quadratwurzel und zyklischen Voltammograms: (a) Kahl Erholungsfläche und (b) tauglich/PLA-AuNPs in 1,0 Mmol L-1 K3[Fe(CN)6] (pH 7). Die Scan-Preise waren 300, 250, 200, 150, 100 und 50 mV s−1. Adaptiert mit Erlaubnis von Ref [30]. Copyright (2016) Sociedade Brasileira de Química. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 : Impedanz Spektren von modifizierten Elektroden in 1,0 Mmol L-1 K 3 [Fe(CN)6] (pH 7). Amplitude: 5 mV und Frequenzbereich: 0,1-105 Hz. Adapted mit freundlicher Genehmigung von Ref [22]. Copyright (2016) Elsevier. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7 : Anodische Spitzenstrom von geändert Elektroden in 1,0 Mmol L-1 K 3 [Fe(CN)6] (pH 7) mit einer Scanrate von 0,1 V s -1 zyklischer Voltammetrie Messen Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 8
Abbildung 8 : Zusammenschluß für SsDNA Immobilisierung auf Erholungsfläche/PLA-AuNPs in 0,1 Mol L-1 PBS (pH 7) bei Abtastraten von 0,1 V s -1 nach 30 min Inkubation bei 20 µM mit differential Pulsmessung Voltammetrie MB Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 9
Abbildung 9 : Wirkung von SsDNA Immobilisierung Zeit auf Erholungsfläche/PLA-AuNPs in 0,1 Mol L -1 PBS (pH 7) mit einer Scanrate von 0,1 V s -1 nach 30 min Inkubation bei 20 µM mit differential Pulsmessung Voltammetrie MB Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 10
Abbildung 10 : Einfluss der SsDNA Immobilisierung Temperatur auf Erholungsfläche/PLA-AuNPs mit einer Scanrate von 0,1 V s -1 0,1 mol L -1 PBS (pH 7) nach einer Inkubationszeit von 30 min in 20 µM MB mit differential Voltammetrie Pulsmessung Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 11
Abbildung 11 : Auswirkung der Hybridisierung Zeit auf Erholungsfläche/PLA-AuNPs/SsDNA in 0,1 Mol L -1 PBS (pH 7) mit einer Scanrate von 0,1 V s -1 nach 30 min Inkubation bei 20 µM mit differential Pulsmessung Voltammetrie MB Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 12
Abbildung 12 : Einfluss der Hybridisierung Temperatur auf Erholungsfläche/PLA-AuNPs/SsDNA in 0,1 Mol L -1 PBS (pH 7) mit einer Scanrate von 0,1 V s -1 nach 30 min Inkubation bei 20 µM MB mit differential Pulsmessung Voltammetrie. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Ref [22]. Copyright (2016) Elsevier. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 13
Abbildung 13 : Histogramm der MB Reduktion Spitzenstrom mit verschiedenen Arten von DNA in 0,1 Mol L –1 PBS (pH 7) mit einer Scanrate von 0,1 V s -1 nach 30 min Inkubation bei 20 µM MB. Der Inset zeigt differenzierte Puls Voltammograms unter den gleichen Bedingungen. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Ref [22]. Copyright (2016) Elsevier. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 14
Abbildung 14 : Histogramm der MB Reduktion Spitzenstrom mit verschiedenen DNA-Konzentration in 0,1 Mol L –1 PBS (pH 7) mit einer Scanrate von 0,1 V s -1 nach 30 min Inkubation bei 20 µM MB mit differential Pulsmessung Voltammetrie. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Ref [22]. Copyright (2016) Elsevier. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 15
Abbildung 15 : Eine lineare Handlung der Reduzierung peak aktuelle MB gegen das Protokoll von verschiedenen DNA-Konzentration 0,1 mol L -1 PBS (pH 7) mit einer Scanrate von 0,1 V s -1 nach 30 min Inkubation bei 20 µM MB mit differential Pulsmessung Voltammetrie. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Ref [22]. Copyright (2016) Elsevier. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 16
Abbildung 16 : Wirkung von verschiedenen Hybridisierung Temperaturen auf Erholungsfläche/PLA-AuNPs/SsDNA nach 6 Monaten Lagerung Intervall (n = 3). Messungen wurden in 0,1 Mol L-1 PBS (pH 7) mit einer Scanrate von 0,1 V s-1 nach 30 min Inkubation bei 20 µM MB mit differential Pulsmessung Voltammetrie. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Ref [22]. Copyright (2016) Elsevier. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 17
Abbildung 17 : Agarose Gelelektrophorese-PCR-Amplifikation mit 16 s rRNA gen Sequenzierungsprodukte von ausgewählten Bakterien aus Bakterienkultur. Lane M: 1kb DNA-Leiter, Lane C−: negative Kontrolle (sterilem destilliertem Wasser), Lane c +: Positivkontrolle (DNA extrahiert aus E. Coli dient als Vorlage), Lane EG: E. Coli O157: H7, Lane CJ: C. Jejuni , Lane BC: B. Cereus, Lane KP: K. Lungenentzündung, Lane ST: S. Typhimurium, Lane LM: L. Monocytogenes, Lane SE: S. Enteritis, Lane VP: V. Parahaemolyticus und Lane VV: V. Alginolyticus Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 18
Abbildung 18 : Histogramm der MB Reduktion Spitzenstrom für Kreuzreaktivität Studie von der DNA-Biosensor gegen verschiedene lebensmittelbedingten Krankheitserregern in 0,1 Mol L -1 PBS (pH 7) mit einer Scanrate von 0,1 V s -1 nach 30 min Inkubation bei 20 µM MB mit differential Pulsmessung Voltammetrie. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Ref [23]. Copyright (2017) Springer. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 19
Abbildung 19 : Agarose-Gel-Elektrophorese-PCR Verstärkung Produkte von V. Parahaemolyticus aus frischen Herzmuschel Proben. Lane M: 2ul von 100 bp DNA-Leiter, Lane 1-3: unbehandelt unspiked Proben, Bahn 4-6: behandelt unspiked Proben, Bahn 7-9: unbehandelt dotierten Proben, Gasse 10-12: Spike Proben, Lane c + behandelt: Positivkontrolle (V. Parahaemolyticus ATCC 17802), Lane c-: negative Kontrolle (sterilem destilliertem Wasser). Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Ref [23]. Copyright (2017) Springer. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 20
Abbildung 20 : Histogramm der MB Reduktion Spitzenstrom für die Erkennung von V. Parahaemolyticus in frische Herzmuscheln Proben mit Hilfe der DNA-Biosensor in 0,1 Mol L-1 PBS (pH 7) mit einer Scanrate von 0,1 V s-1 nach 30 min Inkubation bei 20 µM MB mit differential Pulsmessung Voltammetrie. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Ref [23]. Copyright (2017) Springer. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Elektrode Zusammensetzung Inkubationszeit (h) Temperatur (° C) Wachstumsmedium
Campylobacter jejuni 48 42 BA / BB
Listeria monocytogenes 48 30 TSA / TSB
Salmonella typhimurium 24 37 TSA / TSB
Salmonella enteritidis 24 37 TSA / TSB
Klebsiella Pneumonie 24 37 EMBA / TSB
Escherichia coli O157: H7 24 37 MA / TSB
Bacillus cereus 24 37 MYPA / TSB
Vibrio alginolyticus 24 37 TSA + 3 % NaCl/TSB+3% NaCl
Vibrio parahaemolyticus 24 37 CA/TSA+3% NaCl/TSB+3% NaCl

Tabelle 1: Bedingungen des ausgewählten Bakterien Kultur.

Probe POS. [° 2Th.] FWHM [° 2TH.] d-Abstand [Å] Kristallit Größe (nm)
PLA-AuNPs 31.682 0.3149 2.8243 27

Tabelle 2: Die Größe der Kristallite PLA-AuNP. Angepasst mit freundlicher Genehmigung von Ref [30]. Copyright (2016) Sociedade Brasileira de Química.

Modifizierte Elektrode % RSD (n = 6) Signal-Reduktion (%) (n = 20)
Wiederholgenauigkeit Reproduzierbarkeit
Erholungsfläche/PLA-AuNPs 4.26 4.05 18

Tabelle 3: Eigenschaften von modifizierten Elektroden über AuNPs und PLA-AuNPs Änderung in K 3 [Fe(CN)6] mit 1,0 Mmol L -1 Konzentration auf eine Scan-Rate von 0,1 V s -1 . Adaptiert mit Erlaubnis von Ref [30]. Copyright (2016) Sociedade Brasileira de Química.

Elektrode Zusammensetzung IchPa (µA) E-pa Selektivität (in%)
(n = 3) (V)
Erholungsfläche/PLA-AuNP/Sonden-DNA 4,79 ± 0,10 -0.46 -
Erholungsfläche/PLA-AuNP/nicht-komplementären DNA 3.25 ± 0.12 -0.44 67,85
Nicht übereinstimmende DNA Erholungsfläche/PLA-AuNP/3-Grundlagen 1.05 ± 0,11 -0.45 21,92
Nicht übereinstimmende DNA Erholungsfläche/PLA-AuNP/1-Basis 0.94 ± 0.12 -0.46 19,62
Erholungsfläche/PLA-AuNP/ergänzende DNA 0,73 ± 0,10 -0.45 15,24

Tabelle 4: DPV Selektivität der MB Spitzenstrom in 0,1 Mol L -1 PBS (pH 7) mit einer Scanrate von 0,1 V s -1 nach 30 min Inkubation bei 20 µM MB

Zusammensetzung der Elektroden Nachweisverfahren Linearen Bereich (M) Nachweisgrenze (M) Referenzen
3D AuNPs DPV 1.5 × 10-6 - 7,0 × 10-9 2.0 × 10-10 69
(+) AuNPs DPV 1.0 × 10-9 - 1,5 × 10-12 2.6 × 10-12 70
AuNPs/GR DPV 1.3 × 10-9 - 2,5 × 10-11 8.3 × 10-12 71
AuNPs-ADH-GSs DPV 5.0 × 10-8 - 3.0 × 10-13  3.0 × 10-13 72
AuNPs-MPT DPV 5.0 × 10-9 - 1.0 × 10-11  5.0 × 10-11 73
AuNPs-GO DPV 1.0 × 10-9 - 1.0 × 10-14 3.5 × 10-15 74
CoS / AuNPs DPV 1.0 × 10-9 - 1.0 × 10-12 7.0 × 10-13 75
PLA-AuNPs DPV 2.0 × 10-8 - 2.0 × 10-13 5.3 × 10-12 Diese Arbeit

Tabelle 5: Vergleich von einigen der neu entwickelten elektrochemischen DNA Nanosensoren. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Ref [22]. Copyright (2016) Elsevier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Die entscheidenden Schritte in einen Rahmen für die erfolgreiche Entwicklung dieser Art von elektrochemische Biosensor sind Auswahl der geeigneten biologischen erkennungselemente für den Wandler (Nukleinsäure oder DNA hier); chemischen Ansatz für den Bau der Fernerkundungen Schicht des Wandlers; Transduktion Material; Optimierung der DNA Immobilisierung und Hybridisierung; und Validierung der entwickelten Biosensor mit realen Proben.

Für die erfolgreiche Entwicklung der empfindliche und selektive elektrochemische DNA-Biosensor-Core, ist die Optimierung der Immobilisierung und Hybridisierung. In dieser Arbeit verwendeten wir MB als komplexe Redox. Es gibt verschiedene Prinzipien der MB-DNA-Wechselwirkungen: (i) durch elektrostatische Wechselwirkung der MB kationische Ladung mit Phosphat Rückgrat anionischen Ladung SsDNA und DsDNA; (Ii) von MB Interkalation durch erfolgreiche Einfügen von MB zwischen G-C Basenpaare in der DsDNA abwechselnd; (Iii) durch kovalente Bindung an das Ende der Ziel-SsDNA erzeugt, die eine niedrige Beschriftungsdichte (ein oder zwei MB Moleküle pro DNA-Strang); und (iv) von MB Interaktionen mit einem ungebundenen Guanin in SsDNA Basis. Das vierte Prinzip, das exakt V. Parahaemolyticus vom Kreuz Reaktivität von Bakterien und in frische Herzmuscheln identifiziert haben wir angewendet. Nach Oxidation von besonderem Interesse gab es eine stärkere Affinität zwischen MB und SsDNA. Hybridisierung von SsDNA mit ihren komplementären Sequenz ersetzt die verklebten MB-Moleküle und reduziert somit das Signal.

Die Reihe der oben dargestellten Versuchsergebnisse konzentriert sich auf die Entwicklung einer schnellen Methode zur Erkennung von V. Parahaemolyticus mit hoher Selektivität und Empfindlichkeit, die mit den Prinzipien der DNA-Hybridisierung. Der erste Schritt ist die Synthese und Charakterisierung von Polymilchsäure Säure stabilisiert gold-Nanopartikeln (PLA-AuNPs) für die Änderung der Elektrode (Abbildungen 1-6 und Tabelle 2). Die Qualität von gold-Nanopartikeln wurde bewertet mit Ultraviolett-sichtbare Spektroskopie (UV-Vis), Röntgendiffraktometrie (XRD), Feld-Emission Scanning Electron Microscopy (FESEM), Transmission Electron Microscopy (TEM), zyklische Voltammetrie (CV) und Impedanz-Analyse. Der zweite Teil der Entwicklung beteiligten eine elektrochemische Charakterisierung der modifizierten Elektrode (Abbildungen 7-12 und Tabelle 3-4) bestimmt die erfolgreiche Erweiterung der modifizierten Elektrode bezogen auf die nackte Elektrode in Bedingungen die Hybridisierung Veranstaltung zu erkennen.

Der dritte Schritt der DNA-basierten Biosensor Entwicklung stützte sich auf die Optimierung der Versuchsbedingungen der Hybridisierung Veranstaltung und die Anwendung der entwickelten Biosensor auf den Nachweis der tatsächlichen Erreger (Abbildungen 13-20). Die Hybridisierung-Ereignis, das den Erfolg der Nachweis des Erregers bestimmt wurde anhand differenzielle Puls Voltammetrie (DPV). Die positive Existenz des gezielten Erregers wurde durch Reduzierung der aktuellen angegeben. Die Empfindlichkeit des entwickelten Biosensor wurde durch den Bau einer Kalibrierung Handlung und die Berechnung der LOD (Abbildung 15) bewertet. Die vorgefertigten Biosensor konnte speziell V. Parahaemolyticus von anderen Krankheitserregern, basierend auf den verschiedenen Ebenen der Stromabsenkung (Abbildungen 17 und 18) zu unterscheiden. Die Bewertung der Machbarkeit der entwickelten Biosensor zur Erkennung von V. Parahaemolyticus in tatsächlichen schnupperprobe ist in Figuren 19 und 20 und die positive Existenz des gezielten Erregers wird durch Reduktion des Stroms . Die erfolgreiche Entwicklung von DNA-basierten Biosensoren ist stark abhängig von der DNA-Sonde Auswahl, Verbesserung der modifizierten Elektroden sowie die Optimierung der Versuchsbedingungen. Die DNA-Sonde hier wurde aus der bisherigen Arbeit von Nakano67angepasst. Verbesserung der modifizierten Elektroden erfolgte mithilfe von gold-Nanopartikeln mit Polymilchsäure stabilisiert, um die Standardisierung der Nanosize zu ermöglichen. Die gold-Nanopartikel-Funktion als Electro katalytischen Material68 und handeln, um die Übertragungsrate des Elektrons zu steigern und bieten auch eine Oberfläche, auf der die DNA-Sonde zu verankern. Die Versuchsparameter waren in Bezug auf Temperatur und Inkubationszeit optimiert, die für DNA duplex Formulars entscheidend. Die Hybridisierung Temperatur beeinflusst der Trennung zwischen der unspezifischen Adsorption und diese erhöht sich die Selektivität des Sensors. Inkubationszeit von der Hybridisierung erhöht die Chancen der duplex Bildung. Die Immobilisierung Verfahren muss optimiert werden, um sicherzustellen, dass die DNA-Sonde in geeignete Orientierung für die duplex Bildung zu bilden werden.

Tabelle 5 vergleicht eine Probe des kürzlich entwickelten elektrochemische DNA Biosensoren69,70,71,72,73,74,75 ,. DNA-basierte Biosensoren ist eine vielversprechende Methode für molekulare Basis Techniken zu ersetzen, zwar gibt es ein paar Einschränkungen, die angegangen werden müssen, bevor die Methode handlich genug für den Einsatz vor Ort sein kann. Die Haupteinschränkung besteht Probe Verarbeitung DNA-Extraktion als die Reinheit und der Menge an DNA extrahiert vor Ort dürfte nicht so gut wie die von der standard-Lab-basierte Methode extrahiert werden. Es ist jedoch eine vielversprechende Alternative, wenn die PCR und Gel-Elektrophorese mit Vorbehandlung Beispielsystem wie mikrofluidischen ersetzt werden kann.

DNA-basierte Biosensoren sind möglicherweise nützlich für viele Anwendungen einschließlich medizinische Diagnostik, Umweltüberwachung und Lebensmittel-monitoring. Diese Technik ermöglicht es Online-Überwachung von Verfahren zur Qualitätskontrolle sowie Point-of-Care monitoring des Patienten. Die Übertragbarkeit der ganze Sensorik wird die Dezentralisierung von Diagnoseverfahren ermöglichen, wo der Verbraucher das Erkennungssystem im Komfort ihres Hauses nutzen können.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren möchten die Unterstützung der Universiti Putra Malaysia bestätigen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Merck 100056
Chloroform Merck 102445
Diaminoethane tetraacetic acid Promega E5134
Dibasic sodium phosphate  Sigma-Aldrich S9763
Disodium hydrogen phosphate Sigma-Aldrich 255793
Ethanol  Sigma-Aldrich 16368
Gold (III) chloride trihydrate Sigma-Aldrich 520918
Hydrochloric acid Merck 100317
Methylene blue Sigma-Aldrich M44907
Monobasic sodium phosphate, monohydrate Sigma-Aldrich S3522
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich P5119
Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D NatureWorks 4042D
Potassium chloride R&M Chemicals 59435
Potassium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich P9791
Potassium hexacyanoferrate III R&M Chemicals 208019
Sodium acetate anhydrous salt Sigma-Aldrich S2889
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888
Trisodium citrate Sigma-Aldrich S1804
Tris(hydroxymethyl) aminomethane Fisher Scientific T395-100
Tris-Base Fisher Scientific BP152-500
2X PCR Master Mix with Dual-Dye Norgen Biotek 28240
Agarose gel Merck 101236
Bolton Agar Merck 100079
Bolton Broth Merck 100079
CHROMagar Vibrio CHROMagar VB910
dNTPs Promega U1511
Nuclease-free water Thermo Scientific R0581
Eosin methylene blue agar  Merck 101347
GelRed Biotium 41001
Glycerol Merck 104092
Go Taq Buffer Promega M7911
Loading dye 100 bp DNA ladder Promega G2101
Loading dye 1kb DNA ladder Promega G5711
Magnesium chloride Promega 91176
Mannitol egg yolk polymyxin agar Merck 105267
McConkey Agar Merck 105465
Nutrient Broth Merck 105443
Taq polymerase Merck 71003
Trypticase Soy Broth Merck 105459
Trypticase Soy Agar Merck 105458

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gould, L. H., Rosenblum, I., Nicholas, D., Phan, Q., Jones, T. F. Contributing factors in restaurant-associated foodborne disease outbreaks, FoodNet sites, 2006 and 2007. Journal of Food Protection. 76, 1824-1828 (2013).
  2. Arvanitoyannis, I. S., Kotsanopoulos, K. V., Papadopoulou, A. Rapid detection of chemical hazards (toxins, dioxins, and PCBs) in seafood. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 54, 1473-1528 (2014).
  3. Robertson, L. J., Sprong, H., Ortega, Y. R., van der Giessen, J. W. B., Fayer, R. Impacts of globalisation on foodborne parasites. Trends in Parasitology. 30, 37-52 (2014).
  4. Sandilands, E. A., Bateman, D. N. The epidemiology of poisoning. Medicine. 44, 76-79 (2016).
  5. Boschi-Pinto, C., Velebit, L., Shibuya, K. Estimating child mortality due to diarrhoea in developing countries. Bulletin of the World Health Organization. 86, 710-717 (2008).
  6. Farthing, M. J. G. Diarrhoea: A Significant Worldwide Problem. International Journal of Antimicrobial Agents. 14, 65-69 (2000).
  7. World Health Organization. WHO estimates of the global burden of foodborne diseases: foodborne disease burden epidemiology reference group 2007-2015. , 1-255 (2015).
  8. Yeung, M., Boor, K. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathogens and Disease. 1, 74-88 (2004).
  9. Sakazaki, R. Foodborne Diseases. Cliver, D. O., Riemann, H. P. , Academic Press. 127-136 (2002).
  10. Grochowsky, J., Odom, S. R., Akuthota, P., Stead, W. Primary Septicemia and Abdominal Compartment Syndrome From Vibrio parahaemolyticus Infection in a 40-Year-Old Patient With No Known Immunocompromise. Infectious Disease in Clinical Practice. 22, (2013).
  11. Raghunath, P. Roles of thermostable direct hemolysin (TDH) and TDH-related hemolysin (TRH) in Vibrio parahaemolyticus. Frontiers in Microbiology. 5, 805 (2014).
  12. Kalburge, S. S., Whitaker, W. B., Boyd, E. F. High-Salt Preadaptation of Vibrio parahaemolyticus Enhances Survival in Response to Lethal Environmental Stresses. Journal of Food Protection. 77, 246-253 (2014).
  13. Esteves, K., Hervio-Heath, D., Mosser, T., Rodier, C., Tournoud, M. G., Jumas-Bilak, E., Colwell, R. R., Monfort, P. Rapid proliferation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, and Vibrio cholerae during freshwater flash floods in French Mediterranean Coastal lagoons. Applied and Environmental Microbiology. 81, 7600-7609 (2015).
  14. Khandeparker, L., Anil, A. C., Naik, S. D., Gaonkar, C. C. Daily variations in pathogenic bacterial populations in a monsoon influenced tropical environment. Marine Pollution Bulletin. 96, 337-343 (2015).
  15. Caburlotto, G., Suffredini, E., Toson, M., Fasolato, L., Antonetti, P., Zambon, M., Manfrin, A. Occurrence and molecular characterization of Vibrio parahaemolyticus in crustaceans commercialised in Venice area, Italy. International Journal of Food Microbiology. 220, 39-49 (2016).
  16. Wong, H. C., Chen, M. C., Liu, S. H., Liu, D. P. Incidence of highly genetically diversified Vibrio parahaemolyticus in seafood imported from Asian countries. International Journal of Food Microbiology. 52, 181-188 (1999).
  17. Rosec, J. P., Causse, V., Cruz, B., Rauzier, J., Carnat, L. The international standard ISO/TS 21872-1 to study the occurence of total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae in seafood: ITS improvement by use of a chromogenic medium and PCR. International Journal of Food Microbiology. 157, 189-194 (2012).
  18. Maniyankode, R. A., Kingston, J. J., Murali, H. S., Batra, H. V. Specific identification of vibrio parahaemolyticus employing monoclonal antibody based immunoassay. International Journal of Pharmacy and Biological Sciences. 4 (2), B156-B164 (2013).
  19. Suffredini, E., Lopez-Joven, C., Maddalena, L., Croci, L., Roque, A. Pulsed-field gel electrophoresis and PCR characterization of environmental Vibrio parahaemolyticus strains of different origins. Applied and Environmental Microbiology. 77, 6301-6304 (2011).
  20. Bhattacharyya, N., Hou, A. A pentaplex PCR assay for detection and characterization of Vibrio vulnificus and Vibrio parahaemolyticus isolates. Letters in Applied Microbiology. 57, 233-240 (2013).
  21. da Silva, E. T. S. G., et al. Electrochemical Biosensors in Point-of-Care Devices: Recent Advances and Future Trends. ChemElectroChem. 4 (4), 778-794 (2017).
  22. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hushiarian, R. Sensitive detection of multiple pathogens using a single DNA probe. Biosensors and Bioelectronics. 86, 398-405 (2016).
  23. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hushiarian, R. A simple, portable, electrochemical biosensor to screen shellfish for Vibrio parahaemolyticus. AMB Express. 7 (1), 41 (2017).
  24. Zhang, J., Li, Z., Zhang, H., Wang, J., Liu, Y., Chen, G. Rapid detection of several foodborne pathogens by F0F1-ATPase molecular motor biosensor. Journal of Microbiological Methods. 93, 37-41 (2013).
  25. Barsan, M. M., Ghica, E. M., Brett, C. M. A. Portable biosensing of food toxicants and environmental pollutants. Nikolelis, D. P., Varzakas , T., Erdem, A., Nikoleli, G. P. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Boca Raton. 33-69 (2014).
  26. Kwun, J., Yun, S., Park, L., Lee, J. H. Development of 1,1'-oxalyldiimidazole chemiluminescent biosensor using the combination of graphene oxide and hairpin aptamer and its application. Talanta. 119, 262-267 (2014).
  27. Thavanathan, J., Huang, N. M., Thong, K. L. Colorimetric biosensing of targeted gene sequence using dual nanoparticle platforms. International Journal of Nanomedicine. 10, 2711-2722 (2015).
  28. Hushiarian, R., Yusof, N. A., Abdullah, A. H., Ahmad, S. A. A., Dutse, S. W. Facilitating the indirect detection of genomic DNA in an electrochemical DNA biosensor using magnetic nanoparticles and DNA ligase. Analytical Chemistry Research. 6, 17-25 (2015).
  29. Dutse, S. W., Yusof, N. A., Ahmad, H., Hussein, M. Z., Zainal, Z., Hushiarian, R., Hajian, R. An Electrochemical Biosensor for the Determination of Ganoderma boninense Pathogen Based on a Novel Modified Gold Nanocomposite Film Electrode. Analytical Letters. 47 (5), 819-832 (2014).
  30. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hajian, R. Characterization of Polylactide-Stabilized Gold Nanoparticles and Its Application in the Fabrication of Electrochemical DNA Biosensors. Journal of the Brazilian Chemical Society. 27 (9), 1679-1686 (2016).
  31. Vongkamjan, K., Wang, S., Moreno Switt, A. I. Rapid detection of foodborne bacterial pathogens in seafood. Handbook of Seafood: Quality and Safety Maintenance and Applications. , 247-257 (2016).
  32. Wang, F., Jiang, L., Yang, Q., Han, F., Chen, S., Pu, S., Vance, A., Ge, B. Prevalence and antimicrobial susceptibility of major foodborne pathogens in imported seafood. Journal of Food Protection. 74 (9), 1451-1461 (2011).
  33. Szermer-Olearnik, B., Sochocka, M., Zwolinska, K., Ciekot, J., Czarny, A., Szydzik, J., Kowalski, K., Boratynski, J. Comparison of microbiological and physicochemical methods for enumeration of microorganisms. Postepy Higieny i Medycyny Doswiadczalnej. 68, 1392-1396 (2014).
  34. Ivanov, I. G., Bachvarov, D. R. Determination of plasmid copy number by the "boiling" method. Analytical Biochemistry. 165 (1), 137-141 (1987).
  35. Gopireddy, V. R. Biochemical tests for the identification of bacteria. International Journal of Pharmacy and Technology. 3 (4), 1536-1555 (2011).
  36. Böhme, K., Fernández-No, I. C., Pazos, M., Gallardo, J. M., Barros-Velázquez, J., Cañas, B., Calo-Mata, P. Identification and classification of seafood-borne pathogenic and spoilage bacteria: 16S rRNA sequencing versus MALDI-TOF MS fingerprinting. Electrophoresis. 34 (6), 877-887 (2013).
  37. Seoudi, R., Fouda, A. A., Elmenshawy, D. A. Synthesis, characterization and vibrational spectroscopic studies of different particle size of gold nanoparticle capped with polyvinylpyrrolidone. Physica B: Condensed Matter. 405, 906-911 (2010).
  38. Mishra, A., Harper, S., Yun, S. I. Interaction of biosynthesized gold nanoparticles with genomic DNA isolated from E. coli and S. aureus. Nanotechnology (IEEE-NANO). , 1745-1750 (2011).
  39. Sugimoto, T. Formation of modoispersed nano- and micro-particles controlled in size, shape, and internal structure. Chemical Engineering and Technology. 26, 313-321 (2003).
  40. Rath, C., Sahu, K. K., Kulkarni, S. D., Anand, S., Date, S. K., Das, R. P., Mishra, N. C. Microstructure-dependent coercivity in monodispersed hematite particles. Applied Physics Letters. 75, 4171-4173 (1999).
  41. Abbas, M., Wu, Z. Y., Zhong, J., Ibrahim, K., Fiori, A., Orlanducci, S., Sessa, V., Terranova, M. L., Davoli, I. X-ray absorption and photoelectron spectroscopy studies on graphite and single-walled carbon nanotubes: Oxygen effect. Applied Physics Letters. 87 (5), 051923 (2005).
  42. Lim, S. C., Choi, Y. C., Jeong, H. J., Shin, Y. M., An, K. H., Bae, D. J., Lee, Y. H., Lee, N. S., Kim, J. M. Effect of gas exposure on field emission properties of carbon nanotubes arrays. Advanced Materials. 13, 1563-1567 (2001).
  43. Kim, B. H., Kim, B. R., Seo, Y. G. A study on adsorption equilibrium for oxygen and nitrogen into carbon nanotubes. Adsorption. 11, 207-212 (2005).
  44. Bard, A. J., Faulkner, L. R. Electrochemical methods: Fundamentals and applications. , John Wiley & Sons Inc. (2000).
  45. Tan, Q., Wang, L., Ma, L., Yu, H., Ding, J., Liu, Q., Xiao, A., Ren, G. Study on anion electrochemical recognition based on a novel ferrocenyl compound with multiple binding sites. Journal of Physical Chemistry B. 112, 11171-11176 (2008).
  46. Manivannan, S., Ramaraj, R. Polymer-embedded gold and gold/silver nanoparticle-modified electrodes and their applications in catalysis and sensors. Pure and Applied Chemistry. 83, 2041-2053 (2011).
  47. Benali, O., Larabi, L., Traisnel, M., Gengembre, L., Hareka, Y. Electrochemical, theoretical and XPS studies of 2-mercapto-1-methylimidazole adsorption on carbon steel in 1 M HClO4. Applied Surface Science. 253, 6130-6139 (2007).
  48. Shi, Y., Wen, L., Li, F., Cheng, H. M. Nanosized Li4Ti5O12/graphene hybrid materials with low polarization for high rate lithium ion batteries. Journal of Power Sources. 196, 8610-8617 (2011).
  49. Bentiss, F., Traisnel, M., Lagrenee, M. The substituted 1,3,4-oxadiazoles: a new class of corrosion inhibitors of mild steel in acidic media. Corrosion Science. 42, 127-146 (2000).
  50. Wang, M., Gong, W., Meng, Q., Zhang, Y. Electrochemical DNA impedance biosensor for the detection of DNA hybridization with polymeric film, single walled carbon nanotubes modified glassy carbon electrode. Russian Journal of Electrochemistry. 47, 1368-1373 (2011).
  51. Herdt, A. R., Drawz, S. M., Kang, Y., Taton, T. A. DNA dissociation and degradation at gold nanoparticle surfaces. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 51 (2), 130-139 (2006).
  52. Bhatt, N., Huang, P. J. J., Dave, N., Liu, J. Dissociation and degradation of thiol-modified DNA on gold nanoparticles in aqueous and organic solvents. Langmuir. 27, 6132-6137 (2011).
  53. Liu, X., Jang, C. H., Zheng, F., Jürgensen, A., Denlinger, J. D., Dickson, K. A., Raines, R. T., Abbott, N. L., Himpsel, F. J. Characterization of protein immobilisation at silver surfaces by near edge X-ray absorption fine structure spectroscopy. Langmuir. 22, 7719-7725 (2006).
  54. Willey, T. M., Andrew, L., Vance, T., Buuren, V., Bostedt, C., Terminello, L. J., Fadley, C. S. Rapid degradation of alkanethiol-based self-assembled monolayers on gold in ambient laboratory conditions. Surface Science. 576 (1), 188-196 (2005).
  55. Farjami, E., Clima, L., Gothelf, K., Ferapontova, E. E. DNA interactions with a Methylene Blue redox indicator depend on the DNA length and are sequence specific. Analyst. 135, 1443-1448 (2010).
  56. Lin, X., Ni, Y., Kokot, S. An electrochemical DNA-sensor developed with the use of methylene blue as a redox indicator for the detection of DNA damage induced by endocrine-disrupting compounds. Analytica Chimica Acta. 867, 29-37 (2015).
  57. Zhang, F. T., Nie, J., Zhang, D. W., Chen, J. T., Zhou, Y. L., Zhang, X. X. Methylene Blue as a G-Quadruplex Binding Probe for Label-Free Homogeneous Electrochemical Biosensing. Analytical Chemistry. 86, 9489-9495 (2014).
  58. Ning, L., Li, X., Yang, D., Miao, P., Ye, Z., Li, G. Measurement of Intracellular pH Changes Based on DNA-Templated Capsid Protein Nanotubes. Analytical Chemistry. 86, 8042-8047 (2014).
  59. Sani, N. D. M., Heng, L. Y., Surif, S., Lazim, A. M., et al. AIP Conference Proceedings. Murad, A., et al. 1571, 636-640 (2013).
  60. Xu, P., Wang, J., Xu, Y., Chu, H., Shen, H., Zhang, D., Zhao, M., Liu, J., Li, G. Binding modes and interaction mechanism between different base pairs and methylene blue trihydrate: a quantum mechanics study. Advances in Experimental Medicine and Biology. 827, 187-203 (2015).
  61. Guo, Y., Chen, J., Chen, G. A label-free electrochemical biosensor for detection of HIV related gene based on interaction between DNA and protein. Sensors & Actuators, B: Chemical. 184, 113-117 (2013).
  62. Huang, K. J., Liu, Y. J., Wang, H. B., Wang, Y. Y., Liu, Y. M. Sub-femtomolar DNA detection based on layered molybdenum disulfide/multi-walled carbon nanotube composites, au nanoparticle and enzyme multiple signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 55, 195-202 (2014).
  63. Kong, R. M., Song, Z. L., Meng, H. M., Zhang, X. B., Shen, G. L., Yu, R. Q. A label-free electrochemical biosensor for highly sensitive and selective detection of DNA via a dual-amplified strategy. Biosensors and Bioelectronics. 54, 442-447 (2014).
  64. Rashid, J. I. A., Yusof, N. A., Abdullah, J., Hashim, U., Hajian, R. Novel Disposable Biosensor Based on SiNWs/AuNPs Modified-Screen Printed Electrode for Dengue Virus DNA Oligomer Detection. IEEE Sensors Journal. 15, 4420-4421 (2015).
  65. Yingkajorn, M., Sermwitayawong, N., Palittapongarnpimp, P., Nishibuchi, M., Robins, W. P., Mekalanos, J. J., Vuddhakul, V. Vibrio parahaemolyticus and its specific bacteriophages as an indicator in cockles (Anadara granosa) for the risk of V. parahaemolyticus infection in Southern Thailand. Microbial Ecology. 67, 849-856 (2014).
  66. Ahmad Ganaie, H., Ali, M. N. Short term protocol for the isolation and purification of DNA for molecular analysis. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research. 24, 266-270 (2014).
  67. Nakano, K., Kimura, T., Kitamura, Y., Ihara, T., Ishimatsu, R., Imato, T. Potentiometric DNA sensing platform using redox-active DNA probe pair for sandwich-type dual hybridization at indicator electrode surface. Journal of Electroanalytical Chemistry. 720-721, 71-75 (2014).
  68. Yang, J., Jim Yang, L., Heng-Phon, T., Gan-Moog, C. Inhibition of DNA hybridization by small metal nanoparticles. Biophysical Chemistry. 120, 87-95 (2006).
  69. Niu, L. M., Liu, F., Wang, W., Lian, K. Q., Ma, L., Shi, H. M., Kang, W. J. Electrochemical Behavior of Paraquat on a Highly Ordered Biosensor Based on an Unmodified DNA-3D Gold Nanoparticle Composite and Its Application. Electrochimica Acta. 153, 190-199 (2015).
  70. Li, Z., Miao, X., Xing, K., Zhu, A., Ling, L. Enhanced electrochemical recognition of double-stranded DNA by using hybridization chain reaction and positively charged gold nanoparticles. Biosensors and Bioelectronics. 74, 687-690 (2015).
  71. Niu, S., Sun, J., Nan, C., Lin, J. Sensitive DNA biosensor improved by 1,10-phenanthroline cobalt complex as indicator based on the electrode modified by gold nanoparticles and graphene. Sensors and Actuators B: Chemical. 176, 58-63 (2013).
  72. Yi, H., Xu, W., Yuan, Y., Bai, L., Wu, Y., Chai, Y., Yuan, R. A pseudo triple-enzyme cascade amplified aptasensor for thrombin detection based on hemin/G-quadruplex as signal label. Biosensors and Bioelectronics. 54, 415-420 (2014).
  73. Das, R., Sharma, M. K., Rao, V. K., Bhattacharya, B. K., Garg, I., Venkatesh, V., Upadhyay, S. An electrochemical genosensor for Salmonella typhi on gold nanoparticles-mercaptosilane modified screen printed electrode. Journal of Biotechnology. 188, 9-16 (2014).
  74. Han, X., Fang, X., Shi, A., Wang, J., Zhang, Y. An electrochemical DNA biosensor based on gold nanorods decorated graphene oxide sheets for sensing platform. Analytical Biochemistry. 443 (2), 117-123 (2013).
  75. Huang, K. J., Liu, Y. J., Zhang, J. Z., Cao, J. T., Liu, Y. M. Aptamer/Au nanoparticles/cobalt sulfide nanosheets biosensor for 17β-estradiol detection using a guanine-rich complementary DNA sequence for signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 67, 184-191 (2015).

Tags

Biotechnik Ausgabe 136 Polymilchsäure Säure stabilisiert gold-Nanopartikeln Siebdruck kohlenstoffelektrode DNA-Biosensor Vibrio Parahaemolyticus elektrochemischer Sensor DNA-Hybridisierung
Entwicklung der eine elektrochemische DNA-Biosensor, einem Foodborne Krankheitserreger zu erkennen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nordin, N., Yusof, N. A., Radu, S.,… More

Nordin, N., Yusof, N. A., Radu, S., Hushiarian, R. Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen. J. Vis. Exp. (136), e56585, doi:10.3791/56585 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter