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Bioengineering

Foodborne 병원 체를 검출 하는 전기 화학 DNA 바이오 센서의 개발

Published: June 3, 2018 doi: 10.3791/56585
Automatic Translation
1, 2,3, 1, 4
1Laboratory of Food Safety and Food Integrity, Institute of Tropical Agriculture and Food Security, Universiti Putra Malaysia, 2Laboratory of Functional Device, Institute of Advanced Technology, Universiti Putra Malaysia, 3Department of Chemistry, Faculty of Science, Universiti Putra Malaysia, 4La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University

Summary

브리 parahaemolyticus 감지 polylactic 산 안정, 금 나노 입자 수정, 모티브로 탄소 전극으로 구성 된 전기 화학 DNA 바이오 센서의 개발에 대 한 프로토콜 제공 됩니다.

Abstract

(대 parahaemolyticus) 브리 parahaemolyticus 크게 인간의 사망률과 질병 률의 속도 영향을 미치는 보건 문제의 큰 비율에 세계적으로, 기여 일반적인 foodborne 병원 체 이다. 문화 기반 방법, 면역학 분석 실험, 분자 기반 방법 등 parahaemolyticus 대 의 검출을 위한 일반적인 방법 복잡 한 샘플 처리를 요구 하 고, 지루한, 시간과 비용이 많이 드는 있습니다. 최근, 바이오 센서는 빠른 검색, 비용 효율성, 실용성의 장점으로 유망 하 고 포괄적인 탐지 방법으로 입증 했습니다. 이 연구는 높은 선택도 및 DNA 교 잡의 원리를 사용 하 여 감도 parahaemolyticus 대 감지 하는 빠른 방법 개발에 중점을 둡니다. 작업, 합성된 polylactic 산 안정 금 나노 입자 (PLA-AuNPs)의 x 선 회절 (XRD), 자외선 보이는 분광학 (UV-Vi), 전송 전자 현미경 (TEM), 필드-방출을 사용 하 여 달성 되었다 스캐닝 전자 현미경 검사 법 (FESEM), 그리고 주기적 Voltammetry (CV). 우리는 또한 추가 안정성, 감도, 및 PLA AuNPs의 재현성의 테스트 실시. 우리는 PLA AuNPs 수성 해결책에서 안정 된 나노 입자의 소리 구조 형성을 발견. 우리는 또한 감도 작은 충전 전송 저항 (Rct) 값과 활성 표면적 (0.41 c m2)의 증가 결과로 향상 된 관찰. 우리의 DNA 바이오 센서의 개발은 PLA AuNPs와 redox 표시기로 메 틸 렌 블루 (MB)를 사용 하 여 모티브로 탄소 전극 (SPCE)의 수정에 근거 했다. 우리는 차동 펄스 voltammetry (DPV)에 의해 동원 정지 및 교 잡 이벤트를 평가. 보완, 보완, 우리 그를 발견 하 고 일치 하지 않는 oligonucleotides 특별히 조작된 바이오 센서에 의해 수훈이 있었다. 그것은 또한 다양 한 식품을 매개로 병원 체에 대 한 분 연구 하 고 신선한 cockles parahaemolyticus 대 의 식별에 안정적으로 민감한 탐지를 보여주었다.

Introduction

최근 몇 년 동안에서 공공 및 과학적인 논쟁의 주요 주제, 식중독은 주로 3 에이전트와 관련 된: 미생물1, 화학2및 기생충3. 오염 된 음식 인간, 약한 면역 체계, 노인, 임신 여성, 아기, 그리고 어린 아이4에 그들의 더 높은 위험 그룹에서 특히 심각한 건강 결과 일으킬 수 있습니다. 아프리카, 아시아 및 라틴 아메리카에서 5 세 미만의 어린이에서 매년 발생 하는 급성 설사의 경우에 이상 백만, 식중독 주요 글로벌 질병5,6 와 세계 보건 기구 설립 7가장 중요 한 기여자 서의 미생물 비 브리 오 parahaemolyticus 가장 널리 인정 된 악성 종자 들 눈에 띈다. 그램 음성 박테리아는 높은 소금 환경에서 활성화 되 고 부적당 하 게 요리, 분실 또는 원시 해양에 먹을 때 심각한 인간의 위장염은 일반적으로 해안, 강어귀, 및 해양 환경8에서 발견, 제품9. 또한, 기존의 의료 조건을 어떤 사람들 그들을 상처 감염, 패 혈 증 또는 귀 감염 parahaemolyticus 대10에서 발생 하는 경향이 확인. Parahaemolyticus 대 hemolysins의 독성 요인 질병 병 인에 기여 하는 2 가지의 유형으로 분할 된다: 내 직접 hemolysin (TDH) tdh 유전자에 의해 코딩 및 TDH 관련 hemolysin trh 유전자11에 의해. V. parahaemolyticus 의 독성 마커 (tdh와 trh 유전자)는 주로 환경 표본 보다 임상 표본에서 발견 됩니다.

Parahaemolyticus 대 보유 하 고 광범위 한 조건에서 살아남을 수 신속 하 게 환경 변화12응답. 그것의 확산 메커니즘의 독성 세포 대량13와 병렬로 증가 위험 잠재력을 에스컬레이션 합니다. 심지어 최악의 경우, 기후 변화 이러한 박테리아 그들의 세포 인구 성장14를 가속 화 하기 위해 충분 한 조건을 제공 합니다. 그것의 높은 주파수로 인해 parahaemolyticus 대 감시 될 필요가 식품 공급망의 무역 및 해산물 제품 이기 때문에 그들은 거 대 한 수량15,16 에서 발견의 생산에서 특히 따라 통해 세계. 현재 박테리아 식별 및 생화학 테스트, 농축 및 선택적 미디어17, 매 효소 연결 된 immunomagnetic를 포함 하 여 방법의 범위를 사용 하 여 절연 시험 (ELISA)18, 펄스 분야 젤 전기 이동 법 (PFGE) 19, 라텍스 교착 테스트, 그리고 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 시험20. 이러한 메서드는 일반적으로 자격 갖춘된 직원, 정교한 계기 및 힘 드는 기법을 즉시에 오염에 대 한 정보를 제공 하지 않습니다 필요 합니다. 이 심각 하 게 유해한 오염 및 현장 응용 프로그램을 신속 하 게 감지 가능성을 제한 합니다. 빠른 검색 도구는 뛰어난 도전 남아 있습니다.

시간 절약, 비용 효과적인, 실용적인, 그리고 실시간 분석 방법21,,2223,24 제공 하기 때문에 바이오 센 싱은 foodborne 병원 체의 검출을 위한 유망 옵션으로 나오고 . 그러나, 비록 아군된 샘플 및 바이오 센서를 사용 하 여 표준 솔루션 분석 탐지의 많은 긍정적인 결과 왔다, 있다 아직 수성 혼합물 또는 유기농 추출 물25실제 샘플에 적용 하는 연구의 부족. 최근에, 직접 및 간접 deoxyribonucleic 산 (DNA) 탐지를 사용 하 여 전기 화학 바이오 센서 교 잡 이벤트26 를 통해 보완 대상의 그들의 특정 탐지 때문에 과학자 들 사이에서 증가 관심 받은 , 27 , 28 , 29. 이러한 독특한 접근은 소형화 및 상용화 유망 기술에 따라서 제공 하 고, 효소 기반 바이오 센서에 비해 더 안정. 연구의 대상 보고 여기 parahaemolyticus 대 높은 선택도, 민감도, 실용성, 교 잡 동안 DNA 순서 특이성에 따라 검색할 수 있는 빠른 도구를 생성 하는. 식별 전략 교 잡 표시기, 메 틸 렌 블루 (MB)의 존재 polylactic 산 안정 금 나노 입자 (PLA-AuNPs)30 및 모티브로 탄소 전극 (SPCEs)의 조합을 포함 한다. 개발 된 탐지 구성의 잠재력 추가 박테리아 DNA lysate와 신선한 코 클 샘플을 사용 하 여 탐구 된다.

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Protocol

참고: 모든는 화학과 생 화 확 적인 시 약 사용 될 분석 등급의 고 추가 정화 없이 사용. 살 균 이온된 수를 사용 하 여 모든 솔루션을 준비 합니다. 오토 클레이 브 살 균 전에 모든 유리.

주의: 사용 하십시오 모든 적절 한 안전 관행 공학적 통제 (연기 후드, 글러브)의 사용을 포함 하 여 실험실 활동을 수행할 때 및 개인 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 실험실 외 투, 전체 길이 바지, 폐쇄 발가락 신발)입니다.

1. 제조 및 특성의 수정 전극 PLA AuNPs를 사용 하 여

  1. 준비 및 PLA AuNPs의 특성화
    1. 빨리 끓는 수성 chloroauric 산 성 솔루션 (1 mM) 100 mL를 나트륨 구 연산 염 해결책 (38.8 m m)의 10 mL를 추가 하 고 주위 온도 아래로 냉각. 준비 된 AuNPs 솔루션는 노란색, 거 무스 름 한 변경으로 시작 되 고 마지막으로 어두운 루비 빨간색으로 끝나는 색상의 변화를 관찰 합니다.
    2. PLA 펠 릿 용 해 공정에 대 한 스테인레스 스틸 몰드에 놓고 10 분 따라 눌러 절차와 190 ° C의 온도에 그들을 예 열: PLA 시트 준비의 일환으로 1 분에 대 한 2.2 MPa의 압력에서 그들을 넣어. PLA 시트는 약 3 시간 냉각 후 사용 하기 위해 준비가 될 것입니다.
    3. 적극적으로 교 반, 실 온에서 클로 프롬의 5 mL에 PLA 시트의 0.68 mg 분해. 이전 준비 AuNPs 솔루션의 10 mL와 함께 녹아 PLA를 혼합 하 고 균질 실내 온도에 그것을 저 어. 균질 혼합물 다음 PLA AuNPs로 표시 될 수 있습니다 하 고 UV-마주, XRD, TEM, 및 FESEM EDX에 사용 특징.
  2. 준비 및 수정된 모티브로 탄소 전극의 특성
    참고:이 연구에 사용 된 SPCE 구성 3 전극 시스템: 카운터 전극, 탄소 작업 전극과 Ag/AgCl 기준 전극.
    1. 빠르게 SPCE 그리고 공기에 PLA AuNPs의 동질적인 솔루션의 피 펫 25 µ L 24 h 사용 전에 건조.
    2. 수정 된 전극의 화학적 특성 SPCE/PLA-AuNPs, 칼륨 페로 시안 화물에 (K3[Fe(CN)6]3/4-) 활성 표면적, 전기 화학 임피던스 분광학, 반복성, 측정 하 재현성, 고 안정성30.

2입니다. 전기 화학 DNA 바이오 센서의 개발

  1. 조사 준비
    참고: ssDNA 프로브 및 보완 DNA 시퀀스는 생물 공학 정보 (NCBI) 데이터베이스에 대 한 국립 센터에서 정보에 따라 선정 됐다.
    1. 다음 시퀀스에 따라 상업 실험실에서 동결 건조 된 분말 합성 oligonucleotides (20-메 르 ssDNA 프로브, 20-메 르 보완 DNA, 20-메 르 일치 하지 않는 DNA와 21-메 르 비 보완 DNA)를 구입:
      thiolated ssDNA 프로브: 5 '-/ 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG-3
      보완 DNA: 5 '-CAGTGCTTCTGCATAATCCG-3
      한 기반 일치 하지 않는 DNA: 5-CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG-' 3 '
      3 자료 일치 하지 않는 DNA: 5-CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG-' 3 '
      비 보완 DNA: 5 '-CGCACAAGGCTCGACGGCTGA-3
    2. 솔루션을 사용 하는 살 균 테 (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5), 분석 부분으로 나누어 모든 oligonucleotides (100 µ M)의 재고 솔루션을 준비 합니다. -4 ° C에 보관 한 다음 적절 한 희석 그냥 사용 하기 전에.
  2. 동원 정지 및 교 잡의 최적화
    참고:는 SPCE PLA AuNPs, SPCE/PLA-AuNPs로 표시로이 연구를 위해 사용 되었다 고 드롭 주조 방법은 DNA 동원 정지 및 교 잡에 대 한 사용 되었다.
    1. 첫째, SPCE/PLA-AuNPs에 thiolated ssDNA 조사의 25 µ L를 무력화 하 고 공기 건조 실 온에서 24 h 이후 그것은 것입니다 수 마지막으로로 표시 SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA. 세 가지 요소를 사용 하 여 동원 정지 조건의 최적화를 결정: ssDNA (0.2에서 1.4 µ M에 배열 되는), (에서 30 210 분), 시간 및 온도 (25에서 75 ° C에 배열 되는)의 농도.
    2. SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA 후 그것은 수 수 마지막으로로 표시 SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA 교 잡 이벤트 수행의 표면에 보완 DNA의 25 µ L 플라스틱 (5에서 30 분에 배열 되는) 시간 및 온도 (25에서 75 ° C에 배열 되는)의 두 요소를 통해 교 잡 조건의 최적화를 결정 합니다.
    3. 담가 고정 30 분에 대 한 20 µ M MB에에서 교배 전극을 제거 0.5 m ABS 세척 하 여 비 특히 흡착된 DNA와 초과 MB/20 mM NaCl (pH 4.5)과 다음으로 rinsing 저온. 측정 피크 전류 DPV 기술을 사용 하 여 MB 감소 합니다. DPV 측정 0.1 M PBS (pH 7)를 사용 하 여 실행 없음 표시기를 포함 하.
  3. 조작된 DNA 바이오 센서의 특성
    1. 30 분 동안 20 µ M MB에에서 SPCE/PLA AuNPs를 담가, 0.5 M ABS/20 m m NaCl (pH 4.5), 세척 하 고 이전에 측정 이온을 제거 된 물으로 씻어. 프로브 DNA, 보완 DNA, 일치 하지 않는 DNA 및 비 보완 DNA 샘플을 포함 하 여 모든 상호 작용에 대 한 비슷한 절차를 따릅니다.
    2. 전기 화학 감소를 측정 합니다.
      참고: DPV 인터페이스 소프트웨어와 상업적으로 제조 된 Autolab를 사용 하 여 측정 했습니다.
      0.005 V, 0.05 V의 진폭을 변조 하 고 0.1 M PBS (pH 7)에서 7.73 mVs-1 의 스캔 속도의 잠재적인 단계 V, 0.25-0.5 V에서에서 배열 하는 잠재력에서 MB 전기 화학 감소의 DPV 측정 없음 표시기 포함. 선택도, 감도, 재현성, 및 조작된 DNA 바이오 센서의 열 안정성 더 공부 했다. 보고 결과 3 개의 복제에으로 평균 값 측정을 제시 했다.

3. 실제 샘플을 사용 하 여 조작된 DNA 바이오 센서의 유효성 검사

  1. 세균성 긴장의 준비
    1. 해산물31,32 의 그들의 중요 한 오염에 따라 세균 샘플을 선택 합니다.
      참고: parahaemolyticus V. 참조 긴장 및 다른 8 세균성 긴장 (Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, 살 모 넬 라 typhimurium, 살 모 넬 라 장 염, Klebsiella 폐 렴으로 병원 성 대장균 O157:H7, 균 cereus및 비 브리 오 alginolyticus) 일반적인 식중독의 병원 체는이 연구에서 전기 화학 DNA 바이오 센서 유효성 검사에 대 한 고용 했다.
    2. 문화 조건에 대 한 표 1 을 참조 하십시오 그들의 생존을 유지 그들의 각각 agar에 세균성 긴장의 일상적인 하위 문화 2 주마다를 수행 합니다.
    3. 글리세롤 동결 과정에서 그들을 손상 시킬 수 있는 얼음 결정의 형성을 방지 하 여 박테리아를 보호-80 ° C에서 20% (v/v) 글리세롤에 포함 된 그들의 각각 성장 broths에 세균성 긴장의 장기 보존을 유지 합니다. 다음으로, 각각 broths로 글리세롤 주식에 보존 된 세균성 세포 배양의 루프를 예방. 박테리아를 부활 해야 하는 때 그들의 각각 성장 시간과 온도 따라 broths을 품 어.
    4. 희석의 시리즈에서 파생 된 미생물을 열거 하기 위한 확산 플레이트 기술33, 표준 및 잘 알려진 방법을 사용 하 여 parahaemolyticus 대 셀의 수량을 결정 합니다.
      1. Parahaemolyticus V. Trypticase 간장 국물에 문화 (TSB + 3 %NaCl) 140 rpm 진동 상태에서 37 ° C에서. 다음, TSB + 3%의 9 mL에 박테리아 세포 배양의 1ml를 전송 NaCl 10-1 희석 비율을 얻을.
    5. 9 번 10-10 희석 비율의 전체 시리즈를이 단계를 반복 합니다. 다음으로, 식민지 세 고, 각각에 대 한 브리의 선택적 천 배지에 0.1 mL (10-1 에서 10-10에 시작 되는) 각 희석 비율의 확산. 24 h에 대 한 37 ° C에서 incubated 접시를 품 어.
    6. 식민지 카운터를 사용 하 여 개별 식민지를 계산 하 고 다음 다시-수를 계산 (CFU/pipetted 양 희석 요인 x) 밀리 밀도 (CFU mL-1) 당 콜로 니 형성 단위를 얻을 수 있습니다. CFU mL-1 흡 광도 대 한 교정 줄거리에서 박테리아 세포 정지에서 단위 (CFUs)를 형성 하는 식민지의 농도 파생 시킵니다.
  2. PCR 분석 실험의 준비
    1. 삶은 세포 절차34다음 변경 된 게놈 DNA 추출 합니다. 첫 번째, 행진 개별 박테리아 스트레인 agar 미디어에 고 국물 미디어, 그것의 상대 성장 상태, 상태를 떨고 140 rpm에서 잠복기 뒤에 접종
    2. 마이크로 원심 튜브로 국물의 1 mL 문화를 플라스틱. 4830 x g와 펠 릿을 얻기 위해 1 분에 4 ° C에서 원심이. 무 균 테 버퍼의 약 500 µ L를 사용 하 여 펠 릿으로 다시 중단. 98 ± 2 ° C가 열 블록에서에 10 분에 대 한 결과 정지를 누른 즉시 lyse 세포와 DNA를 풀어 10 분-18 ° C에서 그것을 진정.
    3. 4830 x g와 명확한 정지는 상쾌한 추가 사용 하기 위해-20 ° C에서 유지 하는 3 분 4 ° C에서 게놈 DNA를 원심. Biophotometer 측정을 사용 하 여 260의 파장에서 자외선 흡수와 (빛의 파장을 흡수 하는 핵 산)으로 nm 및 280의 파장에 또한 nm (단백질 흡수 하는 빛의 파장)으로 농도 추출의 순도 결정 하 게놈 DNA 다음 표준 생 화 확 적인 분석 실험35 를 사용 하 여 그리고 16S rRNA 유전자 시퀀싱36여 확인 모든 긴장을 식별. 마지막으로 2 분 동안 92 ° C에서 게놈 DNA를 변성 하 고는 바이오 센서에 응용 프로그램 전에 얼음 물에 급속 하 게 냉각.
    4. 더 parahaemolyticus 대 존재 확인 toxR 유전자를 타겟으로 PCR를 사용 하 여. Thermocycler 뇌관 쌍 (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3'와 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3')를 사용 하 여이 절차를 수행 합니다. 메 마른 물 (15.5 µ L), 버퍼 (5 µ L), 뇌관 (1 µ L, 10 µ M), dNTP 믹스 (1 µ L), DNA 템플렛 (2 µ L), 및 Taq DNA 중 합 효소 (0.2 µ L, 10 x)으로 구성 된 25 µ L 양의 총 반응에서 PCR 증폭을 최적화 합니다.
    5. 구성 요소를 잘 믹스 하 고 증폭의 30 주기 위한 프로그램 thermocycler에 대상 시퀀스의 PCR 증폭을 정렬. 우리의 연구에서 각 주기 구성 3 단계 반응 , 즉., 변성 (94 ° C, 1 분), 어 닐 링 (63 ° C, 1.5 분) 및 확장 (72 ° C, 1.5 분), 최종 확장 (72 ° C, 7 분) 뒤의 30 사이클 이어서 초기 변성 (94 ° C, 3 분).
    6. 증폭된 제품 및 그들의 크기에 1.5 %agarose 젤 전기 이동 법을 통해 확인 합니다. 상업적으로 생산된 젤-문서 시스템 젤 이미지를 캡처하십시오.
  3. 코 클 샘플의 준비
    1. 신선한 샘플을 얻습니다.
      참고: 우리의 신선한 새 조개 (Anadara granosa) Serdang, Selangor, 젖은 시장에서 얻은 고 신속 하 게 분석을 위한 아이스 쿨러 상자에 실험실에 가져온. 2 그룹, 즉 치료 및 치료 그룹을 cockles 수확 했다 균일 하 게 추수의 시작에서 냉장으로 배치까지 가정으로 샘플을 나눕니다.
    2. 사전-20 ° C 24 h, 20 ° C 4 h 이전 DNA 추출에서 UV 빛에 노출에 의해 뒤에서 그들을 저장 하 여 대우 그룹 cockles 취급.
      참고: 동결 온도 자외선 노출을 사용 하는 제어에 대 한 그룹 죽이기 또는 적어도 자연스럽 게 축적 parahaemolyticus 대 cockles에 제한. 이 연구에서 제어 상태의 목표 신선한 새 조개의 실제 상황을 모방 하는 70 ° C의 높은 저온 살 균 법 체제를 적용 되지 않습니다. 한편, 그들은 실험실에 도착 하자마자 사전 치료 없이 치료 그룹에서 직접 샘플을 분석 합니다.
    3. Subculture parahaemolyticus 대 17802 TSB에 ATCC의 변형 (3 %NaCl). TSB의 적절 한 희석의 도금을 통해 inoculum 가능한 셀의 수준을 결정 (3 %NaCl) 104 CFU mL-1 parahaemolyticus 대의 inoculum을 얻으려면 CA에. 증류수에 각 코 클 워시와 껍질에서 조직 제거를 층 류 캐비닛에 소독 집게를 사용 하기 전에 흙의 무료 잡 목.
    4. 살 균 TSB의 90 mL에 균질 화기와 약 10 g 코 클 조직 샘플의 균질 (3 %NaCl) 60에 대 한 s. 추가 아군된 샘플에 대 한 무 균된 샘플 국물의 9 ml parahaemolyticus 대 의 알려진된 금액. Unspiked 샘플을 사용 하 여 부정적인 컨트롤. Parahaemolyticus 대 CA에 샘플의 0.1 mL를 도금 하 여 코 클 샘플에 아군의 셀 개수를 추정 고 이후, microcentrifuge 튜브에 dna 샘플의 1 mL를 pipetting 추출, 바이오 센서 및 PCR 분석 실험에 사용할 수 있습니다.
    5. 변경 된 다음 아군 및 unspiked 샘플에서는 parahaemolyticus 대 의 게놈 DNA 추출 삶은 세포 절차36. DNA 농도 및 순도 바이오 광도 측정을 사용 하 여 260의 파장에서 자외선 흡수와 마지막으로, 결정 (빛의 파장을 흡수 하는 핵 산)으로 nm 및 280의 파장에 또한 nm (단백질 흡수 하는 빛의 파장)으로.

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Representative Results

AuNPs의 형성 나트륨 시트르산 존재와 용액의 색깔에서 변화를 통해 밝혀졌다. 이 깊은 루비 레드 빛 노란색에서 변경 하려면 색상을 발생 합니다. PLA AuNPs의 세대 표면 플라스몬 공명 (SPR) 피크의 성장 약 540에서 발견 됐다 대 한 UV 스펙트럼 (그림 1)에서 확인 되었다 nm. 형성 및 PLA AuNPs의 존재는 입자 크기37에 따라 500-600 nm 파장 범위에 표시 했다. AuNPs 및 PLA AuNPs의 XRD 패턴은 그림 2에 표시 됩니다. 모든 crystallite 봉우리 31.7, 38.2, 44.4, 64.7, 77.7 °의 2θ에서 관찰 되었다. 그들은 (100) (111) (200) (220)에 기인 했다 입방 FCC (얼굴 중심 입방) 금 (311) 결정학 비행기 (금속) nanostructures (JCPDS 파일 번호-00-004-0783). PLA AuNPs crystallite 피크 농도 또한 광범위 한 회절 피크 31.7 °, PLA에는 AuNPs 포함 했다 암시 및 polyphasic 골드 nanostructures38의 형성을 제안 중심으로 증가. 또한, PLA AuNPs에 표시 된 모든 AuNP 회절 봉우리 표시는 AuNPs 안정적인 구조 했다. PLA AuNPs의 평균 크기 Scherrer의 방정식을 사용 하 여 계산 되었다 (L = kλ/βcosθ), (100) 브래그의 반사의 너비를 결정 하 여. FWHM d-간격 (표 2)에서 PLA AuNPs의 crystallite 크기는 27로 계산 했다 nm.

PLA AuNPs의 형태학의 크기 또한 가장을 사용 하 여 조사 되었다. 가장 입자 분포 곡선 PLA AuNPs의 이미지에서 그것 금 나노 입자 모양 (그림 3)에 거의 구형 했다 보였다. 나노 입자의 크기는 약 37의 범위에서 nm, Scherrer의 공식, 제안으로 합성 나노39의 다 자연에서에서 얻은 것 보다 약간 더 큰. 작은 크기에서 가장 달리 XRD 결과 또한 이전 연구에서, 가장 가능성이 있기 때문에 입자 구조 자연에 다는 작은 (하위 입자)40 정자의 중요 한 양 때문에 관찰 되었습니다. . 그림 4 SPCE에 준비로 PLA AuNPs의 FESEM 이미지를 보여준다. FESEM 이미지와 EDX 스펙트럼 SPCE/PLA-AuNPs 했다 금, 최고의 밀도, 높은 무게 비율 및 나노 범위의 최대 표면에서 분명 하다. 그것은 또한 기재, 특히, 그림 4(a) 벌 거 벗은 SPCE의 FESEM 이미지가 표시 됩니다. 그림 4(b) FESEM 이미지 잘 분산된 PLA AuNPs를 보여줍니다. 단언 하기 위해 합성된 PLA AuNPs의 화학 성분, EDX는 생산으로 PLA-AuNPs, 그림 4(a)와 4(b)에 의하여의 화학 성분 조사를 고용 했다. EDX 스펙트럼으로 생산 PLA-AuNPs 금 (Au),의 구성 했다 탄소 (C) 및 산소 (O)에 해당 하는 피크를 제외 하 고 다른 요소 표시 확인. C 피크의 존재에 있는 샘플은 드롭 캐스트 탄소 전극 때문 이었다.

EDX 스펙트럼은 또한 O 영화 공기에 노출 되는 때문에 산소는 탄소 전극에 흡착 되었다 나타내는의 존재를 보여주었다. 이 오랜 시간41에 대 한 공기에 노출 되는 경우 탄소 나노튜브에 산소 흡착 확인 합니다. 공기에 다양 한 가스 분자 들이 있더라도, 산소는 공기에 노출 된 탄소 나노튜브42,43다른 분자 비교 된 그것의 더 빠른 흡착으로 인해 주요 흡착 수 믿어. 이 산소 탄소 전극에 주요 흡착 샘플 준비에서 하룻밤 공기 노출 시 고 강화 PLA AuNPs의 화학 순수성을 찾는 것에 근거 했다. 양극 및 음극 피크의 비율 (내가펜 실바 니 아/ipc)는 거의 1, 스캔 속도 증가44로 지속적인 피크 잠재력을 준. 또한, 양극 및 음극 피크 잠재력 다른 스캔 속도45 전기 화학 반응 했다 가역 피크 분리 (그림 5)에 따라 제안에 일관 했다. 수정 된 전극의 활성 표면적 Randles Sevick 방정식을 사용 하 여 계산 되었다 (내가pc = (2.69 × 105) n3/2 광고1/2 Cv1/2. 작의의 사면에서 나 그림 5(a)에서 v1/2 대pc (b), 전극의 표면적 0.26 cm2 0.41 c m2 으로 계산 했다 벌 거 벗은 SPCE 및 PLA-AuNPs, 각각. 이 결과 확인 개선 PLA-AuNPs 활성 표면적에 의해 여유 맨 SPCE 비해 상대적으로 높은 했다. 파생 된 결과 폴리머 임베디드 골드의 비교는 나노 입자 (β-CD-EDAS(N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylene-diamine 매트릭스 캡슐 골드 나노 입자), 높은 활성 표면적의 과정 강화 밝혀 전자 전송 그리고에 따라서 결과 더 나은 감도46.

수정된 SPCE 전기 화학 반응에는 K3[Fe(CN)6]3-감소 표시 제어 확산의 과정에 /4- 피크 전류, 차례는 전류에 의존 스캔 속도 제곱근 (v 의 1/2)입니다. 수정된 전극 속성의 더 나은 보기를 얻으려면 전기 화학 임피던스 분광학 (EIS) 연구와 CV 측정의 관점에서 제시 하는 수정 된 전극의 성능 상관 관계를 수행 되었다. 높은 주파수에서 본 반원 섹션의 EIS에서 전자 전송 제한 프로세스와 상관 된다. 책임 이동 저항 R (ct)는 반원의 직경으로 직접 측정 했다. 이 결과 벌 거 벗은 SPCE, 이었던 1932 Ω와 SPCE/PLA-AuNPs의 수정 1444 Ω (그림 6)에 감소의 Rct 의 가치와 청산. 로컬 유전율 감소에서 결과 수 있습니다 SPCE/PLA-AuNPs Rct 값의 감소 및 전기 더블의 두께 증가 레이어47, 제안 하는 그 K3[Fe(CN)6]3- /4- 금속/솔루션 인터페이스에 흡착 하 여 기능. 이러한 출력 CV (그림 7)의 측정에서 파생 된 것 들과 준수. 피크 전류는 PLA-AuNPs, 높은 감도 낮은 Rct48의 역을 했다를 사용 하 여 SPCEs의 수정으로 점차적으로 증가 했다. 따라서, 수정 된 전극의 이력서의 가치에 있는 증가 및 Rct 값에서 감소 되었을 수도 있습니다 (물 분자의 볼륨은 27.19 Å3) 물 분자의 점진적 교체로 인해 K3 의 흡착에 의해 [Fe(CN)6] 3/4- 금속 표면에, 해체 반응을49의 범위를 감소.

표 3 수정 된 전극의 재현성 및 반복성의 상대 표준 편차 (RSD)를 나타냅니다. 일상적인 이력서 녹음의 K3[Fe(CN)6]3-4- 6 연속 세트 수정된 전극의 반복성을 조사를 위해 만든 /. RSD의 SPCE/PLA-AuNPs 4.26%로 파생 되었다. PLA AuNPs 수정 전극 여러 측정 후 더 나은 RSD를 했다. 또한, 동일한 절차를 사용 하 여, 6 수정 된 전극은 독립적으로 조작 하지, SPCE/PLA-AuNPs 위한 PLA AuNPs의 전극 제조의 더 나은 재현성을 나타내는 4.05 %RSD 값 준. PLA AuNPs 따라 수정된 기판은 연장된 기간에 대 한 37 ° C에서 유지 되었다. 그것은 또한 20 사이클의 기록 및 신호 품질에 18%의 감소를 위해 이용 되었다. 와 함께 바이오 센서, 동원 정지 기간, 온도, 출력 최대를 달성 하기 위하여 ssDNA 농도 및 교 잡에 대 한 기준 시험 되었다. DPV의 피크 전류 영향으로 이러한 조건을 최적화 될 필요 합니다. SsDNA 농도 최적화, SPCE/PLA-AuNPs 다른 농도와 pipetted는 (0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2와 1.4 µ M) 60 분 동안 ssDNA의 ssDNA의 최적 농도 결정 했다 그래야. 그림 8을 기반으로, DPV 피크 전류 증가 높은 DNA 농도 사용 되었다. 연구는 또한 DNA의 최적화 된 농도 1.2 µ M ssDNA 했다 발견.

최적화 하려면 SPCE/PLA-AuNPs의 단일 가닥 DNA를 포함 하는 동원 정지 기간, 25 µ L ssDNA (1.2 µ M)의 서로 다른 시간에 시험 되었다 (30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 분). 그림 9에서 발견 동원 정지 기간 DPV 피크 전류를 지속적으로 증가 결과로 증가 보여줍니다. 따라서,는 ssDNA의 최적의 동원 정지 시간 180 분으로 선정 됐다. 동원 정지 온도 최적화 하려면 SPCE/PLA-AuNPs는 다양 한 온도에서 ssDNA (1.2 µ M)와 pipetted (75, 65, 55, 45, 35, 및 25 ° C) 180 분. 우리는 발견 그 때 동원 정지의 온도 55 ° C에 증가 되었다, DPV 피크 전류 처음 에스컬레이션 뒤 후속 감가 상각 (그림 10); 따라서, 55 ° C 후속 실험에 사용 되는 최적화 된 동원 정지 온도으로 선정 됐다. 전극과 교 잡 비활성화의 표면에서 모바일은 ssDNA의 분리는 증가 온도 의해 발생 했다. 비슷한 결과50다른 보고 되었습니다. 빨리 분할 및 금 나노 입자의 표면에서 DNA의 변성 높은 온도51에서 발생 했습니다. 연구 실시 최근 보고 신속 하 게 저하 금과 thiol 사이 유대 산화 하 고 단순히 주위 상황에 예 물에 드러낼 때, 공기, 빛52,,5354. 교 잡의 효과 또한이 연구에서 조사 되었다.

조작된 SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA 드롭-캐스트는 표적 DNA의 솔루션 (0.2 µ M) (5, 10, 15, 20, 25, 그리고 30 분) 시간 다른 교 잡에서. DPV의 응답 (5-10 분)에서 보육 시간에 5 분 증가 함께 명백 하 게, 상승 (그림 11). 일단이 값을 가져온, 그래서 교 잡에 대 한 원하는 시간 10 분으로 선정 되었다 10 ~ 30 분 하향 패턴 관찰 되었다. 온도 25 ° C에서 35 ° C (그림 12)의 증가와 교 잡의 효율성 증가. 높은 전류는 35 ° c. 보다 높은 온도에서 천천히 감소를 보였다 이것을 위한 이유는 샌드위치 구조 변성 감지 신호를 감소에 기인 했다. 따라서, 선택 하는 최적의 교 잡 온도 35 ° c. 우리 parahaemolyticus 대 구성 작업 전극, PLA 표면 수정 및 복잡 한, redox 중재 MB의 활성 표면적을 향상 시키기 위해 AuNPs 감지에 사용 되는 프로세스 파운드 감소. 이 산화 과정의 결과가 이었다 ssDNA MB55사이 더 나은 선호도. DPV 현재 ssDNA 보완 시퀀스와의 교 잡 하는 동안 연결 된 MB 분자의 낮은 수 감소 했다.

우리는 추가 개발 된 바이오 센서의 성능에 대 한 조사를 실시. 그림 13 에서 DPV 결과 표시는 그것이 선택적으로 검색 레이블56, 으로 프로브 DNA, 보완 DNA, 한 기반 일치 하지 않는 DNA, 3 기반 일치 하지 않는 DNA와 MB의 비 보완 DNA를 구별할 수 57. 낮은 피크 전류 (0.73 µ A) 천천히 증가 한 기반 일치 하지 않는 DNA 보완 DNA에 의해 전시 (0.94 µ A), 3-기초 DNA 불일치 (1.05 µ A), 비 보완 DNA (3.25 µ A), DNA 프로브와 (4.79 µ A). 현재 대상 DNA 이었다 우리의 바이오 센서 과민 하 게 그리고 특히 oligonucleotide의 시퀀스 사이 차별을 허용 하는 oligonucleotide 시퀀스의 모든 흐름의 작은. MB는 고정된 프로브 큰 DPV 피크 전류를 생산 하는 DNA의 ssDNA와 강력 하 게 바인딩됩니다. SPCE/PLA-AuNPs/비-무료 DNA SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA의 표면에 조립 하는 MB의 단지 작은 금액으로 거의 절반에 의해 현재 고정된 프로브 DNA를 감소. 이 기지 MB와 구 아닌 사이 액세스할 수 상호 작용 때문일 것입니다. DNA와 MB의 상호 작용 모드는 강력 하 게 pH, 온도, DNA 농도, 이온 강도 및 버퍼58,59의 유형으로 같은 실험 조건에 따라 다릅니다. MB은 일반적으로 dsDNA 표면60MB 축적 결과 홈 및 intercalative 모드, 여 dsDNA를 링크 합니다. 한 기반 일치 하지 않는 DNA 및 3 기반 일치 하지 않는 DNA에 DNA 조사의 우리의 캡처 노출 일관 DPV 피크 전류를 감소 하 고 보완 대상 DNA는이 추세를 지속. 표 4 현재 MB 피크에 대 한 선택도 속도의 비율을 보여줍니다. 우리의 전반적인 찾는 생성 된 DNA 바이오 센서의 교 잡 고정된 프로브는 SPCE/PLA-AuNPs의 표면에 DNA를 통해 매우 선택적 이었다.

개발 된 DNA 바이오 센서의 감도 더 보완 대상 oligonucleotide의 다양 한 농도로 조사 되었다. 그림 14 보완 DNA 농도 증가의 DPV 피크 전류 SPCE/PLA-AuNPs에 MB의 점진적 고갈 묘사. 그림 15 선형 회귀 계수 감소 MB 피크 전류의 로그와 로그 대상 DNA (0. 오후 2 0.02 m m)의 여러 농도의 사이 생성 했다 0.96의 전시. 피크 전류 변화 (ΔP)의 그래프는 3σ/m 수식 (되 고 빈 솔루션 및 m 되는 선형 곡선의 기울기의 표준 편차 σ)를 사용 하 여 플롯은61,,6263. 조작된 DNA 바이오 센서의 검출 한계 샘플 측정 43 오후 4 실제로 우리의 작은 보다 컸다는 것을 계산 했다. 이 결과 사실 동의 그 ΔP 오후 0 2 및 오후 2 (2.65 × 10-6 A, 2.81 × 10-6 A) 1.19 × 10의 표준 편차와-7 A, 1.06 × 10-7 , 각각, 겹쳐.

LOQ 조작된 DNA 바이오 센서에 대 한 계산, 우리는 10σ/m 수식 사용 (σ는 빈 솔루션 표준 편차가 고 m은 선형 곡선의 기울기) 오후 14 시 8 분의 이득 될 결과 발견. 상호 보완적인 DNA의 반복된 변성 재생 용량 측면에서 DNA 바이오 센서를 평가 하기 위해 수행 되었다. 우리가 이런 짓을 하 여 변성 변성된 단일 가닥 DNA64유지 하는 얼음 목욕에서 급속 한 냉각에 의해 다음 이중 가닥 DNA를 8 분 동안 86 ° C에 온수에 0.2 µ M 보완 DNA 수정 전극 잠복기.

교 잡 활동 중생의 8 노력 후 초기 응답의 91%에서 유지 되었다 (n = 5, RSD = 4.05%). 샘 SPCE/PLA-AuNPs에 DNA 프로브 동원 정지에 대 한 방법에 따라 DNA 바이오 센서 매우 안정적인, 반복된 변성 프로세스 후 보완 DNA 검출에 좋은 응답을 달성 했다. 열에 대 한 우리의 DNA 바이오 센서의 안정성 더 탐험 했다. 이렇게 하려면, 우리는 실리 카 젤을 포함 하는 밀봉 된 알루미늄 주머니에 4 ° C, 25 ° C, 그리고 45 ° C의 온도에서 PLA-AuNPs/SPCE/ssDNA 전극을 저장. 6 개월의 끝에, 우리는 보완적인 DNA를 평가 하 고 신호 생산의 회복의 비율을 추정. 그림 16 6 개월 저장 후 프로브 SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA는 여전히 복구할 수 그것의 초기 신호의 80% 이상으로 매우 안정 된 보여 줍니다. PLA AuNPs ssDNA 사이 강한 반응 45 ° c 온도에 장기 안정성을 발견

박테리아의 9 종 (B. cereus, L. monocytogenes, C. jejuni, E. 콜라가 O157:H7, alginolyticus 대, S. typhimurium, S. 장 염, K. 폐 렴 및 V. parahaemolyticus) PCR 검출 검사를 실시 했다. 박테리아 문화에서 parahaemolyticus 대 의 종의 검출을 위한 PCR 증폭 제품 그림 17에 나와 있습니다. Parahaemolyticus 대 의 toxR 유전자는 병원 성 격리에 있는 그것의 존재로 인해 parahaemolyticus 대 식별을 위한 PCR 뇌관으로 이용 되었다. PCR 분석에서 parahaemolyticus 대 parahaemolyticus 대향해 toxR 유전자의 PCR 뇌관의 특이성으로 인해 긍정적인 결과 나타났다. 다른 세균성 긴장에서 PCR 제품 감지 했다. DPV 피크 전류 그림 18에서처럼 분 평가 보여준 다른 박테리아 종에 비해 parahaemolyticus 대 의 매우 명확한 검출 후 얻은. 기본적인 쌍의 수로 증가 DPV 신호 감소, MB 분자 프로브에 바인딩된의 큰 금액. Parahaemolyticus V. 명확 하 게 다른 foodborne 병원 체는 유사 식품 샘플의 환경에서 차별 될 수 있었다.

이후 그들은 로컬 푸드의 여러 종류에 인기 있는 재료 cockles이이 연구에서 DNA 바이오 센서 유효성 검사에 대 한 실제 샘플으로 선정 됐다. 그것은 잘 알려진 원시 cockles 종종 병원 성 V를 수행. parahaemolyticus 그리고 그들은 inadequately65수확 후 저장 동안 냉장 하는 경우에 특히 인 간에 게 이러한 박테리아를 전송할 수 있습니다. 코 클 샘플의 대우 그룹 24 h,-20 ° C에서 저장 되었고 이전 우리의 사전 처리 단계 동안 DNA 추출 4 h 20 ° C에서 자외선에 노출. 그림 19 는 PCR 분석 있는 parahaemolyticus 대 모두 치료 및 치료 (아군된) 샘플을 보여 줍니다. 이 레인 7, 8, 9, 10, 11 및 12 식민지과 이전 설명의 계산을 표시 됩니다. 아니 V. parahaemolyticus 식민지 수 샘플에서 입지를 표시 않았다 비록 차선 1, 2, 3, 4, 5 및 PCR 결과에 6에서에서와 같이 치료 및 치료 (unspiked) 샘플에 나타납니다. 이 대 한 가능한 이유 오염66추출 된 DNA 단백질 등의 대사 산물의 존재 이다.

그림 20 은 성공적으로 아군 및 unspiked 샘플 구성 된 대우 그룹에서 parahaemolyticus 대 의 존재를 결정 개발된 DNA 바이오 센서를 사용 하 여 검색 결과 요약 합니다. 이러한 결과 앞에서 설명한 PCR 결과 긍정적으로 상관. 긍정적인 결과 보였다는 PCR의 모든 샘플 인 AuNP 기반 전기 화학 바이오 센서 PLA 안정화 기술를 사용 하 여 발견 되었다 그리고 DPV 피크 지역 (그림 19 와 결과 PCR 강도 밴드와 함께 명확 하 게 대응 그림 20). 이러한 결과 본이 연구에서 제안 된 나노 기반 전기 화학 센서 감지 parahaemolyticus 대 성공적으로 실제 샘플, 따라서 그것은 결과의 신뢰성에 아무런 영향 PCR에 우수한 증명에 나타냅니다.

Figure 1
그림 1 : PLA AuNPs의 흡 광도 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : PLA AuNPs의 x 선 회절 스펙트럼. 참고 [30] 허가 적응. 저작권 (2016) 하 고 있다 Brasileira 드 Química. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 가장 주파수 직경 분포 및 측정에서 PLA AuNPs의 이미지 규모 50 nm. 참고 [30]에서 허가로 증 쇄. 저작권 (2016) 하 고 있다 Brasileira 드 Química. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : EDX 스펙트럼 및 (a) 벌 거 벗은 SPCE 및 (b) SPCE/PLA-AuNPs의 FESEM 이미지. 참고 [30]에서 허가로 증 쇄. 저작권 (2016) 하 고 있다 Brasileira 드 Química. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 : 스캔 속도 제곱근 및 순환 voltammograms에 대 한 피크 전류 산화의 줄거리: (a) 벌 거 벗은 SPCE 및 (b) SPCE/PLA-AuNPs 1.0 m m o l L-1 K3[Fe(CN)6] (pH 7). 스캔 속도 300, 250, 200, 150, 100, 그리고 50 mV s 됐다−1. 참고 [30] 허가 적응. 저작권 (2016) 하 고 있다 Brasileira 드 Química. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6 : 1.0 m m o l L-1 에서 수정 된 전극의 임피던스 스펙트럼 K 3 [Fe(CN)6] (pH 7). 진폭: 5 mV, 및 주파수 범위: 0.1-105 Hz. 적응 허가 참고 [22]. 저작권 (2016) Elsevier. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7 :의 고 피크 전류 1.0 m m o l L-1 에서 전극 수정 K 3 [Fe(CN)6] (pH 7) 0.1 V s의 스캔 속도로 -1 주기적 voltammetry 측정을 사용 하 여 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 8
그림 8 : SsDNA immobilization SPCE/PLA-AuNPs에 0.1 mol L-1 에 대 한 농도의 효과 0.1 V s의 스캔 속도로 PBS (pH 7) -1 20 µ M에서 30 분 부 화 후 MB 차동 펄스 voltammetry 측정을 사용 하 여 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 9
그림 9 : SPCE/PLA-AuNPs 0.1 몰 L에 ssDNA 동원 정지 시간의 영향 -1 0.1 V s의 스캔 속도로 PBS (pH 7) -1 20 µ M에서 30 분 부 화 후 MB 차동 펄스 voltammetry 측정을 사용 하 여 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 10
그림 10 : SPCE/PLA-AuNPs 0.1 V s의 스캔 속도로 ssDNA immobilization 온도 효과 -1 0.1 몰 L에서 -1 차동 펄스 voltammetry 측정을 사용 하 여 MB의 20 µ M에서 30 분의 잠복기 후 PBS (pH 7) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 11
그림 11 : SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA 0.1 몰 L에 교 잡 시간의 영향 -1 0.1 V s의 스캔 속도로 PBS (pH 7) -1 20 µ M에서 30 분 부 화 후 MB 차동 펄스 voltammetry 측정을 사용 하 여 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 12
그림 12 : SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA 0.1 몰 L에 교 잡 온도 효과 -1 0.1 V s의 스캔 속도로 PBS (pH 7) -1 20 µ M에서 30 분 부 화 후 차동 펄스 voltammetry 측정을 사용 하 여 MB. 참고 [22]에서 허가로 증 쇄. 저작권 (2016) Elsevier. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 13
그림 13 : MB 감소 피크 0.1 몰 L DNA의 다른 종류를 사용 하 여 전류의 히스토그램 -1 0.1 V s의 스캔 속도로 PBS (pH 7) -1 20 µ m B M 부 화 30 분 후. 삽입 동일한 조건에서 차동 펄스 voltammograms를 보여 줍니다. 참고 [22]에서 허가로 증 쇄. 저작권 (2016) Elsevier. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 14
그림 14 : MB 감소 피크 0.1 몰 L 다른 DNA 농도 사용 하 여 전류의 히스토그램 -1 0.1 V s의 스캔 속도로 PBS (pH 7) -1 20 µ M에서 30 분 부 화 후 차동 펄스 voltammetry 측정을 사용 하 여 MB. 참고 [22]에서 허가로 증 쇄. 저작권 (2016) Elsevier. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 15
그림 15 : 감소의 선형 플롯 피크 0.1 몰 L 다른 DNA 농도의 로그에 대 한 MB의 현재 -1 0.1 V s의 스캔 속도로 PBS (pH 7) -1 20 µ M에서 30 분 부 화 후 차동 펄스 voltammetry 측정을 사용 하 여 MB. 참고 [22]에서 허가로 증 쇄. 저작권 (2016) Elsevier. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 16
그림 16 : SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA 저장 간격의 6 개월에 다른 교 잡의 효과 (n = 3). 0.1 몰 L 측정 되었다-1 0.1 V s의 스캔 속도로 PBS (pH 7)-1 20 µ M에서 30 분 부 화 후 차동 펄스 voltammetry 측정을 사용 하 여 MB. 참고 [22]에서 허가로 증 쇄. 저작권 (2016) Elsevier. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 17
그림 17 : Agarose 젤 전기 이동 법-PCR 증폭 박테리아 문화에서 선택 된 세균의 16S rRNA 유전자 시퀀싱 제품을 사용 하 여. 레인 m: 1 kb DNA 사다리, 레인 C−: 음성 제어 (멸 균 증류수), 레인 기반: 긍정적인 통제 (DNA에서 추출한 대장균 템플릿으로 사용 됩니다), 레인 EC: 대장균 O157:H7, 레인 CJ: C. jejuni , 레인 BC: B. cereus, 레인 KP: K. 폐 렴, 레인 세인트: S. typhimurium, 레인 LM: L. monocytogenes, 레인 SE: S. 장 염, 레인 부사장: V. parahaemolyticus 및 레인 VV: alginolyticus 대 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 18
그림 18 : MB 감소 피크 분 0.1 몰 L 각종 foodborne 병원 체에 대 한 DNA 바이오 센서의 연구에 대 한 전류의 히스토그램 -1 0.1 V s의 스캔 속도로 PBS (pH 7) -1 20 µ M에서 30 분 부 화 후 차동 펄스 voltammetry 측정을 사용 하 여 MB. 참고 [23]에서 허가로 증 쇄. 저작권 (2017) 스프링 거. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 19
그림 19 : Agarose 젤 전기 이동 법-PCR 증폭 제품의 Parahaemolyticus V. 신선한 코 클 샘플에서. 100 bp DNA 사다리, 레인 1-3의 레인 m: 2ul: unspiked 샘플, 레인 4-6 치료: 치료 unspiked 샘플, 레인 7-9: 아군된 샘플, 10-12 레인 치료: 아군된 샘플, 레인 기반 처리: 긍정적인 제어 (parahaemolyticus V. ATCC 17802), 레인 C-: 부정적인 제어 (멸 균 증류수). 참고 [23]에서 허가로 증 쇄. 저작권 (2017) 스프링 거. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 20
그림 20 : MB 감소 피크의 검출에 대 한 전류의 히스토그램 Parahaemolyticus V. 0.1 몰 L DNA 바이오 센서를 사용 하 여 신선한 코 클 샘플에서-1 0.1 V s의 스캔 속도로 PBS (pH 7)-1 20 µ M에서 30 분 부 화 후 차동 펄스 voltammetry 측정을 사용 하 여 MB. 참고 [23]에서 허가로 증 쇄. 저작권 (2017) 스프링 거. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

전극 구성 보육 시간 (h) 온도 (° C) 성장 매체
Campylobacter jejuni 48 42 학사 / BB
Listeria monocytogenes 48 30 TSA / TSB
살 모 넬 라 typhimurium 24 37 TSA / TSB
살 모 넬 라 enteritidis 24 37 TSA / TSB
Klebsiella 폐 렴 24 37 EMBA / TSB
병원 성 대장균 O157:H7 24 37 MA / TSB
균 cereus 24 37 MYPA / TSB
비 브리 오 alginolyticus 24 37 TSA + 3% NaCl/TSB+3% NaCl
비 브리 오 parahaemolyticus 24 37 CA/TSA+3% NaCl/TSB+3% NaCl

표 1: 선택 된 박테리아의 문화.

샘플 게재 순위 [° 2Th.] FWHM [° 2TH.] d-간격 [Å] Crystallite 크기 (nm)
PLA AuNPs 31.682 0.3149 2.8243 27

표 2: PLA AuNP 정자의 크기입니다. 참고 [30] 허가 적응. 저작권 (2016) 하 고 있다 Brasileira 드 Química.

수정 된 전극 %RSD (n = 6) 신호 감소 (%) (n = 20)
반복성 재현성
SPCE/PLA-AuNPs 4.26 4.05 18

표 3: k에서 AuNPs 및 PLA AuNPs 수정에 관련 된 수정 된 전극의 속성 3 [Fe(CN)6] 1.0 mmol L 함께 -1 0.1 V s의 스캔 속도로 농도 -1 . 참고 [30] 허가 적응. 저작권 (2016) 하 고 있다 Brasileira 드 Química.

전극 구성 내가펜 실바 니 아 (µ A) 전자펜 실바 니 아 선택도 비율 (%)
(n = 3) (V)
SPCE/PLA-AuNP/프로브 DNA 4.79 ± 0.10 -0.46 -
SPCE/PLA-AuNP/비-무료 DNA 3.25 ± 0.12 -0.44 67.85
일치 하지 않는 DNA SPCE/PLA-AuNP/3-기초 1.05 ± 0.11 -0.45 21.92
일치 하지 않는 DNA SPCE/PLA AuNP/1-베이스 0.94 ± 0.12 -0.46 19.62
SPCE/PLA-AuNP/보완 DNA 0.73 ± 0.10 -0.45 15.24

표 4: MB 피크 전류 0.1 몰 L의 선택도 DPV -1 0.1 V s의 스캔 속도로 PBS (pH 7) -1 20 µ m B M 부 화 30 분 후

전극의 구성 검출 방식 선형 범위 (M) 검출 한계 (M) 참조
3D AuNPs DPV 1.5 × 10-6 -7.0 × 10-9 2.0 × 10-10 69
(+) AuNPs DPV 1.0 × 10-9 -1.5 × 10-12 2.6 × 10-12 70
AuNPs/GR DPV 1.3 × 10-9 -2.5 × 10-11 8.3 × 10-12 71
AuNPs ADH GSs DPV 5.0 × 10-8 -3.0 × 10-13  3.0 × 10-13 72
AuNPs MPTS DPV 5.0 × 10-9 -1.0 × 10-11  5.0 × 10-11 73
AuNPs-이동 DPV 1.0 × 10-9 -1.0 × 10-14 3.5 × 10-15 74
왜냐하면 / AuNPs DPV 1.0 × 10-9 -1.0 × 10-12 7.0 × 10-13 75
PLA AuNPs DPV 2.0 × 10-8 -2.0 × 10-13 5.3 × 10-12 이 작품

표 5: 최근에 개발 된 전기 화학 DNA nanosensors의 일부의 비교. 참고 [22]에서 허가로 증 쇄. 저작권 (2016) Elsevier입니다.

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Discussion

전기 화학 바이오 센서의이 종류의 성공적인 개발을 위한 프레임 워크의 중요 한 단계는 핵 산 (DNA 여기); 변환기에 대 한 적절 한 생물학적 인식 요소 선택 트랜스듀서;의 감지 레이어를 생성 하기 위한 화학 접근 변환 자료; 최적화 DNA 동원 정지 및 교 잡; 그리고 실제 예제를 사용 하 여 개발 된 바이오 센서의 유효성 검사.

민감하고 선택적 전기 화학 DNA 바이오 센서의 성공적인 개발을 코어, immobilization와 교 잡 조건의 최적화입니다. 이 작품에서는, 우리는 복잡 한 산화로 MB를 사용. MB-DNA 상호 작용의 다양 한 원리는: (i) ssDNA와 dsDNA;의 인산 염 등뼈 음이온 혐의로 MB 양이온 책임의 정전기 상호 작용에 의해 (ii)에 의해 번갈아 dsDNA;에 G-C 기본 쌍 사이의 MB의 성공적인 삽입을 통해 MB 윤 (iii)에 의해 대상 ssDNA의 끝에 공유 결합, 생성 낮은 레이블 밀도 (하나 또는 두 개의 메가바이트 분자 DNA 가닥 당); 및 (iv) 언바운드 구 아닌 ssDNA 기지와 MB의 상호 작용에 의해. 우리는 정확 하 게 식별 parahaemolyticus 대 에서 교차 하는 반응성 및 신선한 cockles 박테리아의 4 원칙을 적용. 특정 관심의 산화, 후 MB와 ssDNA 사이 결합을 강하게 했다. SsDNA 보완 시퀀스와의 교 잡 보 세 MB 분자를 대체 하 고 따라서 신호를 감소 시킨다.

위의 실험 결과의 시리즈는 높은 선택도 및 DNA 교 잡의 원리를 사용 하 여 감도 parahaemolyticus 대 감지 하는 빠른 방법의 개발에 초점을 맞추고. 첫 번째 단계는 합성과 polylactic 산 안정 금 나노 입자 (PLA-AuNPs) (그림 1-6 , 표 2) 전극의 수정에 대 한 특성입니다. 금 나노 입자의 자외선 보이는 분광학 (UV-Vi), x 선 회절 (XRD), 필드-방출 스캐닝 전자 현미경 검사 법 (FESEM), 전송 전자 현미경 (TEM), 주기적 Voltammetry (CV)를 사용 하 여 평가 했다 그리고 임피던스 분석입니다. 개발의 두 번째 부분 관련 수정된 전극 (그림 7-12 및 표 3-4)에서 맨 손으로 전극 기준 수정 된 전극의 성공적인 향상 결정의 전기 화학적 특성 교 잡 이벤트 감지의 조건입니다.

DNA 기반 바이오 센서 개발의 세 번째 단계는 교 잡 이벤트의 실험 조건의 최적화와 실제 병원 체 (그림 13-20)의 탐지에 개발 된 바이오 센서의 응용 프로그램에 근거 했다. 병원 체의 검색의 성공을 결정 하는 교 잡 이벤트 차동 펄스 voltammetry (DPV)를 사용 하 여 평가 했다. 대상된 병원 체의 긍정적인 존재 했다 전류의 감소를 통해 표시 됩니다. 개발 된 바이오 센서의 감도 교정 플롯의 구조와 LOD (그림 15)의 계산을 통해 평가 했다. 조작된 바이오 센서 특별히 parahaemolyticus 대 전류 감소 (그림 17 및 18)의 다른 수준에 따라 다른 병원 체에서 구별할 수 있었다. 그림 19와 20에서 검출 parahaemolyticus 대 의 실제 식품 샘플에 개발 된 바이오 센서의 타당성의 평가 제시 하 고 대상된 병원 체의 긍정적인 존재 전류의 감소에 의해 표시 됩니다. . DNA 기반 바이오 센서의 개발 성공 높은 DNA 프로브 선택, 수정 된 전극의 실험 조건의 최적화에 따라 달라 집니다. 여기에 DNA 프로브 나카노67의 이전 작품에서 적응 되었습니다. 수정 된 전극의 향상 polylactic 산 안정 금 나노 입자는 나노의 표준화 활성화를 사용 하 여 수행 되었다. 전기 촉매 소재68 와 전자의 전송 속도 증가 하 고 또한 DNA 프로브를 고정 하는 표면을 제공 하는 행위는 금 나노 입자 함수. 실험적인 매개 변수는 이중 형태를 DNA에 대 한 중요 한 온도 및 보육 시간 최적화 했다. 교 잡 온도 센서의 선택 도를 일반적인 흡착와이 증가 구분 영향을 줍니다. 교 잡의 부 화 시간이 이중 형성의 기회가 증가합니다. 동원 정지 절차 DNA 프로브 양식에 이중 형성을 위한 적당 한 방향에 있을 것입니다 다는 것을 확인 하기 위하여 낙관 되어야 한다.

표 5 의 샘플을 비교 최근 개발 된 전기 화학 DNA 바이오 센서69,70,,7172,73,74,75 ,. DNA 기반 바이오 센 싱 메서드는 현장 사용을 위한 충분히 휴대용 수 전에 해결 되어야 하는 몇 가지 제한이 있지만 분자 기반된 기술을 대체 하는 유망한 방법 이다. 주요 제한은 순수성으로 샘플 처리 DNA 추출 이며 사이트에서 추출한 DNA의 양을 표준 연구소 기반 방법으로 추출 만큼 될 것입니다. 그러나 그것은,, 유망한 대안 경우 PCR 및 젤 전기 이동 법 미세 같은 샘플 전처리 시스템으로 대체 될 수 있다.

DNA 기반 바이오 센서는 의료 진단, 환경 모니터링, 식품 모니터링 등 많은 응용 프로그램에 대 한 잠재적으로 유용 합니다. 이 기술에는 포인트의 케어의 환자 모니터링 뿐만 아니라 품질 관리 프로세스의 온라인 모니터링 수 있게 된다. 전체 센서 시스템의 이동성 소비자의 그들의 정의 안락에서 검출 시스템을 사용할 수 있습니다 진단 프로세스의 지방 분권을 수 있게 된다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

저자는 Universiti 푸 트 라 말레이시아의 지원을 하 고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Merck 100056
Chloroform Merck 102445
Diaminoethane tetraacetic acid Promega E5134
Dibasic sodium phosphate  Sigma-Aldrich S9763
Disodium hydrogen phosphate Sigma-Aldrich 255793
Ethanol  Sigma-Aldrich 16368
Gold (III) chloride trihydrate Sigma-Aldrich 520918
Hydrochloric acid Merck 100317
Methylene blue Sigma-Aldrich M44907
Monobasic sodium phosphate, monohydrate Sigma-Aldrich S3522
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich P5119
Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D NatureWorks 4042D
Potassium chloride R&M Chemicals 59435
Potassium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich P9791
Potassium hexacyanoferrate III R&M Chemicals 208019
Sodium acetate anhydrous salt Sigma-Aldrich S2889
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888
Trisodium citrate Sigma-Aldrich S1804
Tris(hydroxymethyl) aminomethane Fisher Scientific T395-100
Tris-Base Fisher Scientific BP152-500
2X PCR Master Mix with Dual-Dye Norgen Biotek 28240
Agarose gel Merck 101236
Bolton Agar Merck 100079
Bolton Broth Merck 100079
CHROMagar Vibrio CHROMagar VB910
dNTPs Promega U1511
Nuclease-free water Thermo Scientific R0581
Eosin methylene blue agar  Merck 101347
GelRed Biotium 41001
Glycerol Merck 104092
Go Taq Buffer Promega M7911
Loading dye 100 bp DNA ladder Promega G2101
Loading dye 1kb DNA ladder Promega G5711
Magnesium chloride Promega 91176
Mannitol egg yolk polymyxin agar Merck 105267
McConkey Agar Merck 105465
Nutrient Broth Merck 105443
Taq polymerase Merck 71003
Trypticase Soy Broth Merck 105459
Trypticase Soy Agar Merck 105458

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Nordin, N., Yusof, N. A., Radu, S.,… More

Nordin, N., Yusof, N. A., Radu, S., Hushiarian, R. Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen. J. Vis. Exp. (136), e56585, doi:10.3791/56585 (2018).

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