Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Utvikling av en elektrokjemisk DNA Biosensor å oppdage en infeksjon patogen

Published: June 3, 2018 doi: 10.3791/56585
Automatic Translation
1, 2,3, 1, 4
1Laboratory of Food Safety and Food Integrity, Institute of Tropical Agriculture and Food Security, Universiti Putra Malaysia, 2Laboratory of Functional Device, Institute of Advanced Technology, Universiti Putra Malaysia, 3Department of Chemistry, Faculty of Science, Universiti Putra Malaysia, 4La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University

Summary

En protokoll for utviklingen av en elektrokjemisk DNA biosensor bestående av en polylactic syre-stabilisert, gull nanopartikler endret, trykt karbon elektrode for å oppdage Vibrio parahaemolyticus presenteres.

Abstract

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) er en felles infeksjon patogen som bidrar til en stor andel av folkehelseproblemer globalt, betydelig påvirker frekvensen av menneskelige dødelighet og sykelighet. Konvensjonelle metoder for påvisning av V. parahaemolyticus som kultur-baserte metoder, immunologiske analyser og molekylær-baserte metoder krever komplisert eksempel håndtering og er tidkrevende, kjedelig og dyrt. Nylig har biosensors vist seg for å være en lovende og omfattende gjenkjennings-metoden med fordelene ved rask oppdagelsen, kostnadseffektivitet og praktiske. Denne forskningen fokuserer på å utvikle en rask metode for å oppdage V. parahaemolyticus med høy selektivitet og følsomhet bruker prinsippene om DNA hybridisering. I arbeidet, ble karakterisering av syntetisk polylactic syre-stabilisert gull nanopartikler (PLA-AuNPs) oppnådd med X-ray Diffraksjon (XRD), UV-synlig spektroskopi (UV-Vis), overføring elektronmikroskop (TEM), felt-utslipp Skanning elektronmikroskop (FESEM), og syklisk Voltammetry (CV). Vi har også gjennomført ytterligere testing stabilitet, følsomhet og reproduserbarhet for PLA-AuNPs. Vi fant at PLA-AuNPs dannet en lyd struktur av stabilisert nanopartikler i vandig løsning. Vi har også observert at følsomheten forbedret mindre kostnad overføring motstand (Rct) verdien og en økning av aktive areal (0.41 cm2). Utviklingen av vårt DNA biosensor var basert på endring av en trykt karbon elektrode (SPCE) med PLA-AuNPs og bruke methylene Blåfarge (MB) som redoks indikator. Vi vurdert hendelsene immobilisering og blanding av differensial puls voltammetry (DPV). Vi fant ut at komplementære, ikke-utfyllende, og oligonucleotides var spesielt preget av den ferdige biosensor. Det viste også pålitelig følsom oppdagelsen kryssreaktivitet studier mot ulike mat-borne patogener og identifikasjon av V. parahaemolyticus i ferske.

Introduction

Et sentralt tema offentlige og vitenskapelig debatt de siste årene, matforgiftning er hovedsakelig forbundet med 3 agenter: mikroorganismer1, kjemikalier2og parasitter3. Forurenset mat kan føre til alvorlige helseproblemer hos mennesker, spesielt i risikogruppen for høyere i de med svak uimottakelig systemer, eldre, gravide kvinner, spedbarn og små barn4. Med mer enn en million tilfeller av akutt diaré forekommer årlig i barn under 5 år i Afrika, Asia og Latin-Amerika, matforgiftning er en stor global sykdom5,6 og Verdens helseorganisasjon har etablert mikroorganismer som det viktigste bidragsyter7. Vibrio parahaemolyticus skiller seg ut blant de mest anerkjente virulente stammene. Vanligvis finner i kyst, marinsystemer og hav8, er det en Gram-negative bakterie, som blir aktivt i høy salt miljøer, og forårsaker alvorlige menneskelige gastroenteritt når spist i mangelfullt kokte, feilsendt eller rå marine produkter9. I tillegg gjør eksisterende medisinske tilstander i noen mennesker dem utsatt for sår infeksjon, septicemia eller øre infeksjon oppstår fra V. parahaemolyticus10. Virulens faktorene av V. parahaemolyticus hemolysins er delt inn i to typer som bidrar til sykdom patogenesen: thermostable direkte hemolysin (TDH) kodet av tdh gener og TDH-relaterte hemolysin kodet av trh gener11. Virulens markører (tdh og trh gener) av V. parahaemolyticus finnes hovedsakelig i klinisk prøver ikke i miljømessige prøver.

V. parahaemolyticus har muligheten til å overleve under en rekke forhold, reagerer raskt miljøendringer12. Dens spredning mekanikk eskalerer dens farepotensial som sin toksisitet øker parallelt med cellen masse13. Enda verre, klimaendringer gir disse bakteriene med rikelig forhold å akselerere deres celle befolkningen vekst14. På grunn av dens høy frekvens må V. parahaemolyticus overvåkes langs verdikjeden mat, særlig i handel og produksjon av sjømat siden disse produktene er hvor de finnes i enorme mengder15,16 over hele verden. Foreløpig bakterier er identifisert og isolert bruker en rekke metoder inkludert biokjemiske tester, berikelse og selektiv media17, enzym knyttet immunomagnetic absorberende analysen (ELISA)18, puls-feltet gel geleelektroforese (PFGE) 19, latex agglutinerende tester og polymerase kjedereaksjon (PCR)-tester20. Disse metodene krever vanligvis kvalifisert personell, komplekse instrumenter og arbeidskrevende teknikker som ikke gir informasjon om forurensning umiddelbart. Dette begrenser alvorlig sannsynligheten for raskt oppdage skadelig forurensning og stedets programmer. Rask søkeverktøy forblir en enestående utfordring.

Biosensing fremstår som en lovende alternativ for påvisning av matbårne patogener fordi det tilbyr en tidsbesparende, kostnadseffektive, praktiske og sanntids analyse metoden21,22,23,24 . Men selv om det har vært mange positive resultater av analytt piggete prøver og standard løsning ved hjelp av biosensors, er det fortsatt en mangel på forskning på virkelige eksempler i vandig blandinger eller organisk ekstrakter25. Nylig har elektrokjemisk biosensors bruker direkte og/eller indirekte deoksyribonukleinsyre (DNA) oppdagelsen fått økt oppmerksomhet blant forskere, på grunn av deres spesifikke oppdaget komplementære målet via en hybridisering hendelsen26 , 27 , 28 , 29. disse unike tilnærminger er mer stabile forhold enzym-baserte biosensors, dermed tilby en lovende teknologi for miniatyrisering og kommersialisering. Målet for studien rapporterte her er å bygge en rask verktøy som kan oppdage V. parahaemolyticus med høy selektivitet, følsomhet og praktiske, basert på DNA sekvensen spesifisitet under hybridisering. Identifikasjon strategier innebærer kombinasjonen av polylactic syre-stabilisert gull nanopartikler (PLA-AuNPs)30 og trykt karbon elektroder (SPCEs) i nærvær av hybridisering indikatoren, methylene Blåfarge (MB). Potensialet i den utviklede oppdagelse konstruere er utforsket bakterier DNA lysate og frisk hjerteskjell utvalg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: Alle kjemiske og biokjemiske reagensene brukes bør være analytisk klasse og uten videre rensing. Forberede alle løsninger ved hjelp av sterilt deionisert vann. Autoclave alle glass før sterilisering.

Forsiktig: Bruk alle nødvendige sikkerhets praksis når laboratorie aktiviteter inkludert bruk av engineering kontroller (avtrekksvifte, glovebox) og personlig verneutstyr (vernebriller, hansker, laboratoriefrakk, full lengde bukser, lukket tå sko).

1. fabrikasjon og karakterisering av endret elektrode bruker PLA-AuNPs

  1. Forberedelse og karakterisering av PLA-AuNPs
    1. Raskt legge 10 mL natriumsitrat løsning (38.8 mM) til 100 mL kokende vandig chloroauric sur løsning (1 mM) og kjøle den ned til romtemperatur. Observere fargeendringer i AuNPs løsningen som starter som gul, endringer i gråsort og til slutt ender som mørke ruby rød.
    2. Plasser PLA pellets i en rustfritt stål mold av smelteprosessen og Forvarm dem ved en temperatur på 190 ° C i 10 min. følge trykke fremgangsmåten: put dem under et trykk på 2,2 MPa for 1 min som en PLA ark forberedelse. PLA arket vil være klar til bruk etter avkjøling ca 3 h.
    3. Stirring kraft, løses 0.68 mg PLA ark i 5 mL kloroform ved romtemperatur. Bland oppløst PLA med 10 mL av tidligere AuNPs løsningen og homogent rør det ved romtemperatur. Homogen blandinger deretter kan betegnes som PLA-AuNPs og preget med UV-Vis, XRD, TEM og FESEM EDX.
  2. Forberedelse og karakterisering av endrede trykt karbon elektrode
    Merk: SPCE brukt i denne studien omfatter et tre elektrode system: en counter elektrode, en karbon arbeider elektrode og en Ag/AgCl referanse elektrode.
    1. Raskt pipette 25 µL av homogene løsningen av PLA-AuNPs på SPCE og deretter luft tørke det i 24 timer før bruk.
    2. Electrochemically karakteriserer endret elektrodene, SPCE/PLA-AuNPs, i kalium ferro cyanid (K3[Fe(CN)6]3 -/4 -) til å måle aktiv overflate, elektrokjemiske impedans spektroskopi, repeterbarhet, reproduserbarhet og stabilitet30.

2. utvikling av elektrokjemiske DNA-Biosensor

  1. Sonden forberedelse
    Merk: Sekvensene av ssDNA sonde og komplementære DNA ble valgt basert på informasjon fra National Center for bioteknologi informasjon (NCBI)-databasen.
    1. Kjøp syntetisk oligonucleotides (20-mer ssDNA sonde, 20-mer komplementære DNA, 20-mer Feilkoblede DNA og 21-mer ikke-komplementære DNA) som lyofiliserte pulveret fra kommersielle laboratorier, basert på følgende sekvenser:
      thiolated ssDNA sonde: 5 ' - / 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG - 3
      komplementære DNA: 5 ' - CAGTGCTTCTGCATAATCCG - 3
      en-base DNA: 5 ' - CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG - 3
      tre-base DNA: 5 ' - CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG - 3
      ikke-komplementære DNA: 5 ' - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA - 3
    2. Klargjør lager løsninger av alle oligonucleotides (100 µM) bruker en steril TE løsning (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) delt i analytisk deler. Holde dette på 4 ° C, og gjør deretter de aktuelle fortynninger bare før å bruke.
  2. Optimalisering av immobilisering og hybridisering
    Merk: En SPCE endret med PLA-AuNPs, som SPCE/PLA-AuNPs, ble brukt for denne studien og slipp støping metode ble brukt for DNA immobilisering og hybridisering.
    1. Først nakkens 25 µL av thiolated ssDNA sonde på SPCE/PLA-AuNPs og deretter lufttørke det 24 h i romtemperatur, etter som det vil være endelig betegnet som SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA. Finne optimalisering av betingelsen immobilisering ved hjelp av tre faktorer: konsentrasjonen av ssDNA (varierer fra 0,2 til 1,4 µM), klokkeslett (alt fra 30 til 210 min) og temperatur (oppstiller fra 25 til 75 ° C).
    2. Pipetter 25 µL av komplementære DNA på overflaten av SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA å utføre hendelsen hybridisering etter som det kan endelig betegnes som SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA. Bestemme optimalisering av hybridisering tilstand via de to faktorene tid (alt fra 5 til 30 min) og temperatur (oppstiller fra 25 å 75 ° C).
    3. Lev den immobilisert og hybridisert elektrodene 20 µM MB for 30 min. fjerne nonspecifically adsorbert DNA og overflødig MB ved å vaske med 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4.5) og deretter skylle med vaskebuffer vann. Mål peak gjeldende MB reduksjon bruker DPV teknikk. Utføre DPV måling med 0.1 M PBS (pH 7) med ingen indikator.
  3. Karakterisering av de fabrikkerte DNA-biosensor
    1. Fordype SPCE/PLA-AuNPs i 20 µM MB i 30 min, vaske med 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4.5) og deretter skylle med deionisert vann før måling. Følg samme fremgangsmåte for alle samhandlinger inkludert sonde DNA, komplementære DNA, DNA og ikke-komplementære DNA-prøver.
    2. Måle elektrokjemiske reduksjon.
      Merk: Vi målt DPV med et kommersielt produsert Autolab grensesnitt programvare.
      DPV målinger av MB elektrokjemiske reduksjon på et potensial mellom-0.5 V 0,25 V, med et steg potensielle av 0.005 V, modulering amplituden til 0,05 V og en avsøkingshastigheten av 7.73 mVs-1 i 0.1 M PBS (pH 7), med ingen indikator. Den selektivitet følsomhet, reproduserbarhet og varme stabilitet fabrikkerte DNA biosensor ble ytterligere studert. Rapporterte resultater ble presentert som betyr verdien målinger i tre gjentak.

3. validering av fabrikkerte DNA Biosensor bruker virkelige eksempler

  1. Utarbeidelse av bakteriell stammer
    1. Velg bakteriell eksempler basert på betydelige forurensning av sjømat31,32 .
      Merk: V. parahaemolyticus som referanse stammer og 8 andre bakterielle stammer (Campylobacter jejuni Listeria monocytogenes Salmonella typhimurium, Salmonella enteritt, Klebsiella lungebetennelse, Escherichia coli O157: H7, Bacillus cereusog Vibrio alginolyticus) av den felles infeksjon patogen var ansatt for den elektrokjemiske DNA biosensor valideringen i denne studien.
    2. Gjennomføre en rutinemessig sub kultur for bakteriell påkjenningene på sine respektive agar annenhver uke å opprettholde sin levedyktighet, se tabell 1 for kultur forhold.
    3. Opprettholde langtidsoppbevaring av bakteriell stammene i deres respektive voksende broths inneholder 20% (v/v) glyserol ved-80 ° C som glyserol beskytter bakterier ved å hindre dannelse av iskrystaller som kan skade dem under frysepunktet prosessen. Deretter vaksinere en løkke av bevarte bakteriell cellekultur i glyserol aksjer i de respektive broths. Inkuber broths ifølge deres respektive vekst tid og temperatur når trenger å gjenopplive bakterier.
    4. Bestemme mengden av V. parahaemolyticus celler med en spredning platen teknikk33, en standard og en velkjent metode for nummerering mikroorganismer avledet fra en rekke fortynninger.
      1. Kultur V. parahaemolyticus i Trypticase soya kjøttkraft (TSB + 3% NaCl) på 37 ° C i en 140-rpm risting tilstand. Deretter overføre 1 mL av bakterier cellekultur i 9 mL TSB + 3% NaCl å få en fortynningsfaktoren for 10-1 .
    5. Gjenta dette trinnet ni ganger for å få en hel serie med opptil 10-10 fortynningsfaktoren. Deretter spredt 0,1 mL av hver fortynningsfaktoren (starter fra 10-1 til 10-10) på en Vibrio selektiv agar platen i kolonien teller, henholdsvis. Inkuber platene ruges ved 37 ° C i 24 timer.
    6. Bruk en koloni teller telle personlige koloniene, og deretter tilbake-beregne (antall hvor CFU/pipetted x fortynningsfaktoren) for å få en colony-forming enhet per milliliter tetthet (CFU mL-1). Utlede konsentrasjonen av kolonien danner enheter (CFUs) i av bakterier celle suspensjon fra kalibrering plottet av CFU mL-1 mot absorbance.
  2. Utarbeidelse av PCR analysen
    1. Ekstra genomisk DNA etter en modifisert kokt lysis prosedyren34. Først strek en personlige bakteriell belastning på agar media og vaksinere det i kjøttkraft medier, etterfulgt av rugende den på sin relative vekst tilstand, en 140 rpm risting tilstand.
    2. Pipetter en 1 mL kultur av kjøttkraft i en mikro sentrifuge rør. Sentrifuge dette på 4830 x g og 4 ° C i 1 min å få pellets. Bruk ca 500 µL sterilt TE bufferen for re-oppheng med pellet. Hold den resulterende suspensjonen for 10 min på 98 ± 2 ° C i en oppvarming blokk og umiddelbart chill det på-18 ° C i 10 min å lyse cellene og slipp DNA.
    3. Sentrifuge genomisk DNA på 4830 x g og 4 ° C i 3 minutter å få en klar suspensjon og holde nedbryting på 20 ° C for videre bruk. Bruke en biophotometer måling med UV absorpsjon på en bølgelengde på 260 nm (som nukleinsyrer absorbere lysets bølgelengde) og også en bølgelengde på 280 nm (som proteiner absorbere lysets bølgelengde) å bestemme konsentrasjonen og renhet av den utpakkede genomic DNA og identifisere alle stammer bruker standard biokjemiske analyser35 og bekrefte dem av 16S rRNA genet sekvensering36. Endelig denature genomisk DNA ved 92 ° C i 2 minutter og avkjøle den raskt i vann før å biosensor.
    4. Videre påvise V. parahaemolyticus bruker PCR målrette toxR genet. Følg denne fremgangsmåten i en thermocycler med en primer (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3 "og 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3"). Optimalisere PCR forsterkning i et totalt reaksjon volum på 25 µL bestående av sterilt vann (15.5 µL), buffer (5 µL), primer (1 µL, 10 µM), dNTP mix (1 µL), DNA-mal (2 µL) og Taq DNA utvalg (0,2 µL, 10 x).
    5. Bland komponentene godt og ordne PCR forsterkning av målet sekvensen i en thermocycler programmert for 30 sykluser av forsterkning. I vår studie hver syklus besto av tre-trinns reaksjoner dvs., første rødsprit (94 ° C, 3 min) etterfulgt av 30 sykluser av rødsprit (94 ° C, 1 min), annealing (63 ° C, 1,5 min) og forlengelse (72 ° C, 1,5 min), etterfulgt av endelig utvidelse (72 ° C, 7 min).
    6. Bestemme forsterket produktene og størrelsene via geleelektroforese på 1,5% agarose gel. Ta gel bilder med en kommersielt produsert gel-dokumentasjon.
  3. Forberedelse av hjerteskjell prøver
    1. Skaffe frisk prøver.
      Merk: Våre frisk hjerteskjell (Anadara granosa) ble innhentet fra våte markedet i Serdang, Selangor, og raskt brakt til laboratoriet i en isen kjøler boks for analyse. Dele opp prøvene i 2 grupper, nemlig behandlet og ubehandlet gruppen forutsatt at hjerteskjell ble høstet jevnt fra starten av avlingen til å plassere dem i kjølelager.
    2. Pre-spandere hjerteskjell i gruppen behandlet ved å lagre dem på 20 ° C for 24 h, etterfulgt av eksponering for UV-lys på 20 ° C 4 h før DNA ekstraksjon.
      Merk: Frysing temperatur og UV-stråling brukes for den kontrollerte dreper eller minst begrenser den naturlig samler V. parahaemolyticus i hjerteskjell. Gjelde ikke en høyere pasteurisering regimet til 70 ° C som målet med kontrollert tilstanden i denne studien er å etterligne den faktiske situasjonen for frisk hjerteskjell. I mellomtiden analysere prøver direkte fra gruppen ubehandlet uten pre behandling så snart de ankommer i laboratoriet.
    3. Subkultur en stamme av V. parahaemolyticus ATCC 17802 i TSB (3% NaCl). Bestemme nivået av levedyktig celler i inoculum via plating av aktuelle fortynninger av TSB (3% NaCl) på CA for å få en inoculum av 104 CFU mL-1 av V. parahaemolyticus. Vask hver hjerteskjell i destillert vann og skrubbe den frie for skitt før sterilt tang i en laminær strømning CAB fjerne vev fra skallet.
    4. Homogenize om 10 g av hjerteskjell med en homogenizer i 90 mL steril TSB (3% NaCl) 60 s. Legg til en kjent mengde V. parahaemolyticus til 9 mL homogenisert eksempel suppen for piggete prøvene. Bruke unspiked prøvene som en negativ kontroll. Beregne celletall av V. parahaemolyticus piggete på hjerteskjell prøvene av plating 0,1 mL av prøvene på CA, og deretter pipettering 1 mL av prøver inn i et microcentrifuge rør for DNA smak utvinning, skal brukes i biosensor og PCR analysen.
    5. Ekstra genomisk DNA av den V. parahaemolyticus fra piggete og unspiked prøvene etter en modifisert kokt lysis prosedyren36. Til slutt bestemmer DNA konsentrasjon og renhet en bio fotometer måling med UV absorpsjon på en bølgelengde på 260 nm (som nukleinsyrer absorbere lysets bølgelengde) og også en bølgelengde på 280 nm (som proteiner absorbere lysets bølgelengde).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dannelse av AuNPs ble avslørt gjennom endring i fargen i vandig løsningen med natriumsitrat stede. Dette forårsaket fargen endre fra lys gul til en dypt ruby rød. Generering av PLA-AuNPs ble bekreftet fra UV-vis spectra (figur 1) der veksten av overflaten plasmon resonans (SPR) toppen ble funnet på rundt 540 nm. Dannelse og eksistensen av PLA-AuNPs ble angitt på 500-600 nm wavelength områder, avhengig av partikkel størrelse37. XRD mønstre av AuNPs og PLA-AuNPs er vist i figur 2. Alle crystallite topper ble det observert 2θ 31,7, 38,2, 44.4, 64.7 og 77.7°. De ble tilskrevet (100) (111) (200) (220), og (311) krystallografisk fly kubikk-FCC (ansikt-sentrert kubikkmeter) gull (metall) nanostrukturer (JCPDS fil nei-00-004-0783). PLA-AuNPs crystallite peak intensiteter også økt som en bredere Diffraksjon topp sentrert på 31,7 °, noe som tyder på at AuNPs var innebygd i PLA og foreslå dannelsen av polyphasic gull nanostrukturer38. Videre, alle AuNP Diffraksjon topper på PLA-AuNPs indikerte at AuNPs hadde en stabil struktur. Betyr størrelsen på PLA-AuNPs ble beregnet med Scherrers formel (L = kλ/βcosθ), ved å bestemme bredden på den (100) Bragg refleksjon. Fra FWHM og d-avstand (tabell 2), crystallite størrelsen på PLA-AuNPs ble beregnet som 27 nm.

Dimensjonene for PLA-AuNPs og sin morfologi ble videre undersøkt med TEM. Fra TEM partikkel distribusjon kurve og bilder av PLA-AuNPs, ble det sett at gull nanopartikler var nesten sfærisk i form (Figur 3). Størrelsen på nanopartikler var i området rundt 37 nm, litt større enn innhentet fra Scherrers formel, antyder en polycrystalline natur som syntetisert nanopartikler39. Mindre størrelse fra XRD i motsetning til TEM har også blitt observert i tidligere forskning, sannsynligvis fordi partikkel er polycrystalline i naturen på grunn av den betydelige mengden av crystallites som er mindre (sub partikler)40 . Figur 4 viser FESEM bildet av som forberedt PLA-AuNPs på SPCE. Det er tydelig fra FESEM bilder og EDX spectra at SPCE/PLA-AuNPs hadde den høyeste vekt andelen av gull, største, og største overflaten hydrogenion dekning. Det kan også være bemerket, spesielt at Figur 4(en) viser FESEM bilde av en naken SPCE. FESEM bildet i Figur 4(b) viser godt distribuert PLA-AuNPs. For å bekrefte den syntetiserte PLA-AuNPs' kjemiske sammensetning, var EDX ansatt å undersøke den kjemiske sammensetningen av den som produserte PLA-AuNPs, henhold til Figur 4(en)og 4(b). EDX spekteret bekreftet at de som produserte PLA-AuNPs var sammensatt av gull (Au) bare, og vises andre elementer unntatt toppen tilsvarer karbon (C) og oksygen (O). Tilstedeværelsen av C toppen var karbon elektroden på som utvalget var slipp cast.

EDX spekteret viste også tilstedeværelsen av O indikerer at oksygen var adsorbert på karbon elektroden fordi filmen ble eksponert for luft. Dette bekrefter at oksygen er adsorbert på Karbonnanorør hvis de blir utsatt for luft for en lang tid41. Selv om det er ulike gassmolekyler i luften, ble oksygen antatt å være den viktigste adsorbate på luft-eksponerte karbon nanorør42, muligens på grunn av sin raskere adsorpsjon sammenlignet med andre molekyler43. Den var basert på å finne at oksygen var den viktigste adsorbate på karbon elektroden i natten luften eksponering eksempel forberedelse og forsterket kjemiske renheten på PLA-AuNPs. Forholdet mellom anodic og Katodisk topp (jegpa/ipc) var nesten 1, som ga konstant peak potensial skanningen rangere økt44. Videre var anodic og Katodisk peak potensialer konsekvent på ulike skanne priser45 antyder at elektrokjemisk reaksjon var reversibel basert på topp separasjon (figur 5). Aktive areal på endrede elektroden ble beregnet ved hjelp av øyeblikk-Sevick formelen (jegpc = (2,69 × 105) n3/2 AD1/2 Cv1/2. Fra skråningen av handlingen jegpc kontra v1/2 i figur 5(en) og (b), areal på elektrodene er beregnet som 0,26 cm2 og 0.41 cm2 for bare SPCE og PLA-AuNPs, henholdsvis. Dette resultatet bekreftet at forbedring by av PLA-AuNPs på aktive overflaten var relativt høyere sammenlignet med bare SPCE. Avledede resultatet var sammenlignes med polymer-embedded gull nanopartikler (β-CD-EDAS(N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylene-diamine matrise innkapslet gull nanopartikler), som viste at en høy aktive areal forbedret prosessen med elektron-overføring og derfor resulterte i bedre følsomhet46.

Endret SPCE elektrokjemisk reaksjon var en prosess med kontrollert diffusjon, vist av en reduksjon i K3[Fe(CN)6]:3 -/4 - peak strøm, som igjen er avhengig av gjeldende av skanning rate kvadratroten (v 1/2). For å få en bedre visning av egenskapene endret elektrode, ble en elektrokjemisk impedans spektroskopi (EIS) studien utført for å korrelere med ytelsen til endrede elektroden presentert i CV målinger. Delen halvsirkel sett på høye frekvenser korrelert med begrensende prosessen av elektron i EIS. Gratis overføre motstanden (Rct) ble målt direkte som diameteren på halvsirkel. Dette resultatet registrert med verdien av Rct av nakne SPCE, som var 1932 Ω og der endring av SPCE/PLA-AuNPs redusert til 1444 Ω (figur 6). Nedgangen av Rct verdi i SPCE/PLA-AuNPs kan være et resultat av en nedgang i lokale dielektrisk konstant og/eller en økning i dybden på den elektriske doblingen lag47, antyder at K3[Fe(CN)6]3 - /4 - funksjon av adsorpsjon på metal/løsning grensesnittet. Disse utgangene overholdt de avledet fra målinger av CV (figur 7). Peak strøm økt gradvis med endring av SPCEs bruker PLA-AuNPs, som viste at en høyere følsomhet var inverse av den nedre Rct48. Dermed kan økningen i verdien av CV av endrede elektrodene og nedgangen i Rct verdier ha vært på grunn av gradvis utskifting av vannmolekyler (volumet av molekylene er 27.19 Å3) av opptak av K3 [Fe(CN)6] 3 -/4 - på metalloverflate, redusere omfanget av oppløsning reaksjon49.

Tabell 3 viser relativ standardavviket (RSD) repeterbarhet og reproduserbarhet av endrede elektroden. Rutinemessig CV opptak av K3[Fe(CN)6]3 -/4 - ble laget for seks påfølgende apparater å undersøke repeatability av endrede elektrodene. SPCE/PLA-AuNPs-RSD ble utledet som 4.26%. Elektroden PLA-AuNPs modifikasjoner ga bedre RSD etter flere målinger. Videre ble bruker samme fremgangsmåte, seks endret elektroder uavhengig fabrikert, som ga RSD verdier 4.05% for SPCE/PLA-AuNPs, som indikerer bedre reproduserbarhet av elektroden fabrikasjon for PLA-AuNPs. Modifisert underlaget avhengig av PLA-AuNPs ble holdt på 37 ° C for en lengre varighet. Det ble også benyttet for registrering av 20 sykluser og en nedgang på 18% i signalkvalitet. For å oppnå maksimal effekt fra biosensor, immobilisering periode, temperatur, sammen med ble ssDNA konsentrasjon og kriterier for hybridisering undersøkt. Disse betingelsene for å være optimalisert, som de påvirker den peak strømmen av DPV. For å optimalisere ssDNA konsentrasjonen, SPCE/PLA-AuNPs var pipetted med ulike konsentrasjon (0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1.0, 1,2 og 1,4 µM) av ssDNA for 60 min slik at optimal konsentrasjon av ssDNA ble bestemt. Basert på Figur 8, DPV toppen gjeldende økt som høyere DNA konsentrasjoner ble brukt. Studien fant også at optimalisert konsentrasjonen av DNA var 1,2 µM ssDNA.

For å optimalisere immobilisering perioden med enkelt-strandet DNA i SPCE/PLA-AuNPs, 25 µL av ssDNA (1,2 µM) ble testet over forskjellige tider (30, 60, 90, 120, 150, 180 og 210 min). I figur 9viser resultatene en økning i immobilisering perioden resulterer i kontinuerlig økning av DPV toppen gjeldende. Dermed ble optimal immobilisering skrivende ssDNA valgt som 180 min. For å optimalisere immobilisering temperaturen, SPCE/PLA-AuNPs var pipetted med ssDNA (1,2 µM) i ulike temperaturer (75, 65, 55, 45, 35 og 25 ° C) for 180 min. Vi fant at når temperaturen på immobilisering ble økt til 55 ° C, DPV peak gjeldende utgangspunktet eskalerte etterfulgt av en påfølgende avskrivning (Figur 10); Dermed ble 55 ° C valgt som optimalisert immobilisering temperaturen skal brukes i etterfølgende eksperimenter. Separasjon av ssDNA som er immobile fra overflater av elektroden og hybridisering funksjonshemming skyldtes økt temperatur. Det har vært andre rapporter med lignende resultater50. Raskere dele og degenerasjon av DNA fra overflater på nanopartikler gull oppstod ved høyere temperaturer51. Forskning utført nylig rapportert at bindingen mellom gull og thiol oxidizes forringer raskt og enkelt i en situasjon som er ambient, for eksempel når utsatt for vann, luft og lys52,53,54. Virkningen av hybridisering ble også undersøkt i denne studien.

Den ferdige SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA var slipp-cast med en løsning på målet DNA (0,2 µM) på forskjellige hybridisering ganger (5, 10, 15, 20, 25 og 30 min). Svar på DPV steg selvfølgelig med en 5 minutters økning i tid med inkubering (fra 5 til 10 min) (Figur 11). Når denne verdien ble innhentet, ble en 10-30 min nedadgående mønster observert så tiden for hybridisering ble valgt som 10 min. Effektiviteten av hybridisering økt med en økning i temperaturen fra 25 ° C til 35 ° C (Figur 12). Høy gjeldende ble sett sakte redusere ved en temperatur høyere enn 35 ° C. Grunnen til dette ble tilskrevet sandwich struktur rødsprit redusere oppdagelsen signalet. Derfor var optimal hybridisering temperaturen valgt 35 ° C. Prosessen vi brukte oppdage V. parahaemolyticus består AuNPs for å forbedre aktive areal på arbeider elektroden, PLA å megle overflaten endring og av redoks komplekse, MB, til redusert det til LB. Resultatet av denne oksidasjonsprosessen var en bedre slektskap mellom ssDNA og MB55. DPV gjeldende ble redusert på grunn av lavere antall vedlagte MB molekyler under blanding av ssDNA med komplementære sekvensen.

Vi gjennomførte videre etterforskning ytelsen til de utviklet biosensor. DPV resultatene i figur 13 viser at det kunne skille selektivt sonde DNA, komplementære DNA, en-base DNA, tre-base DNA og ikke-komplementære DNA i nærvær av MB som gjenkjenning etiketten56, 57. laveste toppen gjeldende (0.73 µA) ble stilt ut av komplementære DNA, som langsomt økt med en-base DNA (0.94 µA), tre-baser Feilkoblede DNA (1.05 µA), ikke-komplementære DNA (3,25 µA), og sonde DNA (4.79 µA). Målet DNA gjeldende var den minste av alle strømmene av oligonucleotide sekvenser slik at våre biosensor å forskjellsbehandle sekvenser av oligonucleotide varsomt og spesielt. MB bundet sterkt med ssDNA av immobilisert probe DNA produserer en stor DPV topp gjeldende. SPCE/PLA-AuNPs/ikke-komplementære DNA redusert immobilisert sonde DNA gjeldende med nesten halvparten så bare en liten mengde MB montert på overflaten av SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA. Dette er sannsynlig å være utilgjengelige interaksjoner mellom MB og guanine baser. Samhandling moduser av DNA og MB er sterkt avhengig av slike eksperimentelle forhold som pH, temperatur, DNA konsentrasjon, ionisk styrke og type buffer58,59. MB kobler vanligvis til dsDNA av groove og intercalative moduser, som resulterer i MB akkumulering på dsDNA overflate60. Eksponering for våre fange sonde DNA ett-base DNA og tre-base DNA redusert konsekvent DPV peak strøm og komplementære målet DNA fortsatte denne trenden. Tabell 4 viser prosentandelen av selektivitet sats for MB peak gjeldende. Våre samlede oppdagelse var at blanding av konstruert DNA biosensor var svært selektive via immobilisert sonde DNA på den SPCE/PLA-AuNPs' overflate.

Følsomheten til utviklet DNA biosensor ble videre undersøkt med ulike konsentrasjoner av komplementære målet oligonucleotide. Figur 14 viser gradvis uttømming av DPV peak strøm av MB på SPCE/PLA-AuNPs som komplementære DNA konsentrasjonen økt. Figur 15 viser en lineær regresjon koeffisient av 0.96 som ble generert mellom loggen av redusert MB peak gjeldende og loggen over flere konsentrasjon av målet DNA (0:2 pM 0.02 mm). En graf av topp gjeldende endringer (ΔP) ble tegnet ved hjelp av 3σ/m formel (σ blir standardavviket for tomme løsning og m er stigningstallet for den lineære kurven)61,62,63. Gjenkjenning grensen på fabrikkerte DNA biosensor ble beregnet å være 4 43 00 som var større enn våre minste faktisk målt prøven. Dette resultatet var med faktum at ΔP for 0 2 pM og 2 pM (2,65 × 10-6 A og 2,81 × 10-6 A) med et standardavvik 1,19 × 10-7 A og 1,06 × 10-7 A, henholdsvis overlappes.

For å beregne LOQ for fabrikkerte DNA biosensor, vi brukte 10σ/m formelen som (σ er tom løsning standardavvik og m er stigningstallet for den lineære kurven) og fant at resultatet skal være en gevinst på 14 8 pM. Gjentatte denaturering av komplementære DNA ble utført for å vurdere DNA biosensor i sin gjenfødelse kapasitet. Vi gjorde dette ved rugende 0,2 µM komplementære DNA-endret elektrode varmt vann 86 ° C i 8 min for å denature double-strandet DNA, etterfulgt av rask nedkjøling i en isbadet å opprettholde den denaturert single-strandet DNA64.

Hybridisering aktiviteten ble opprettholdt på 91% av sine første reaksjon etter 8 innsatsen til gjenfødelse (n = 5, RSD = 4.05%). DNA biosensor basert på SAM metode for DNA sonde immobilisering på SPCE/PLA-AuNPs var svært stabile, å oppnå god respons oppdage komplementære DNA etter gjentatte rødsprit prosesser. Stabiliteten i vårt DNA biosensor vedrørende varme ble utforsket. Dette gjør lagret vi PLA-AuNPs/SPCE/ssDNA elektroden ved temperaturer på 4 ° C og 25 ° C 45 ° C i en forseglet aluminium pose som inneholder silica gelé. På slutten av 6 måneder, vi vurdert komplementære DNA og anslått prosentandelen av utvinning av signalet. Figur 16 viser at sonden SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA var svært stabil med mer enn 80% av sine første signalet fortsatt gjenopprettes etter 6 måneders lagring. Sterk reaksjonen PLA-AuNPs og ssDNA ble funnet for å ha langsiktig stabilitet ved en temperatur under 45 ° C.

Ni forskjellige arter av bakterier (B. cereus, L. monocytogenes, C. jejuni, E. coli O157: H7 V. alginolyticus, S. typhimurium, S. enteritt, K. lungebetennelse og V. parahaemolyticus) ble vist av PCR gjenkjenning. PCR forsterkning produktene artsspesifikke deteksjon av V. parahaemolyticus fra bakterier kulturen er vist i Figur 17. ToxR genet av V. parahaemolyticus ble benyttet som PCR primer for V. parahaemolyticus identifikasjon på grunn av sin tilstedeværelse i patogene isolater. Fra PCR analysen, V. parahaemolyticus viste positive resultater på grunn av spesifisitet av PCR primer av toxR genet mot V. parahaemolyticus. PCR produkter fra andre bakterielle stammer ble oppdaget. DPV toppen gjeldende innhentet etter en kryssreaktivitet vurdering viste klart påvisning av V. parahaemolyticus sammenlignet med andre bakterier arter, som vist i Figur 18. DPV signalet økt antall base par redusert på grunn av den store mengden av MB molekyler bundet til sonder. V. parahaemolyticus kunne tydelig bli diskriminert fra andre matbårne patogener som etterlignet miljøet av mat prøven.

Hjerteskjell ble valgt som virkelige eksempler for DNA biosensor validering i denne studien siden de populære ingredienser i flere typer lokal mat. Det er velkjent at rå hjerteskjell ofte bære patogene V. parahaemolyticus og kan overføre disse bakteriene mennesker, spesielt hvis de er ikke tilstrekkelig nedkjølt under lagring etter høsting65. Gruppen behandlet av hjerteskjell prøver var lagret på 20 ° C 24 h, og utsatt for UV-lys på 20 ° C 4 h før DNA utvinning under vårt forbehandling skritt. Figur 19 viser at PCR analyse funnet V. parahaemolyticus i begge behandlet og ubehandlet (piggete) prøvene. Dette vises i Lane 7, 8, 9, 10, 11 og 12 samkjøre med kolonien telle i forrige diskusjonen. Ingen V. parahaemolyticus vises i de behandlede og ubehandlet (unspiked) prøvene, som vist i Lane 1, 2, 3, 4, 5 og 6 i PCR resultatene selv om kolonien greven indikere sin tilstedeværelse i prøvene. En mulig årsak til dette er tilstedeværelsen av forurensende metabolitter som protein i utdraget DNA66.

Figur 20 oppsummerer søkeresultatene bruker det utviklet DNA-biosensor, som er bestemt tilstedeværelsen av V. parahaemolyticus i gruppen behandlet bestående piggete og unspiked. Disse resultatene korrelerer positivt med tidligere omtalte PCR resultatene. Hvert utvalg av PCR som viste positive resultater ble oppdaget ved hjelp av PLA-stabilisert elektrokjemisk biosensor teknikk, som er AuNP-basert, og DPV peak området klart korresponderte med de resulterende PCR intensitet bandene (Figur 19 og Figur 20). Disse resultatene indikerer at den foreslåtte hydrogenion-baserte elektrokjemiske sensoren i denne studien oppdaget V. parahaemolyticus i ekte utvalgene, dermed beviser at det er bedre enn PCR med nei bevirke på ektheten av resultatene.

Figure 1
Figur 1 : Absorbance av PLA-AuNPs Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : X-ray Diffraksjon spekteret av PLA-AuNPs. Tilpasset med tillatelse fra ref. [30]. Opphavsrett (2016) Sociedade Brasileira de Química. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : TEM frekvensfordeling diameter og bilder av PLA-AuNPs på en måling skala på 50 nm. Gjengitt med tillatelse fra ref. [30]. Opphavsrett (2016) Sociedade Brasileira de Química. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : EDX spectra og FESEM bilder av (a) bare SPCE og (b) SPCE/PLA-AuNPs. Gjengitt med tillatelse fra ref. [30]. Opphavsrett (2016) Sociedade Brasileira de Química. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Handlingen i topp gjeldende oksidasjon mot skanning rate kvadratroten og syklisk voltammograms: (a) bare SPCE og (b) SPCE/PLA-AuNPs i 1.0 mmol L-1 K3[Fe(CN)6] (pH 7). Skanning ratene var 300, 250, 200, 150, 100 og 50 mV s−1. Tilpasset med tillatelse fra ref. [30]. Opphavsrett (2016) Sociedade Brasileira de Química. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Impedans spektra av endrede elektrodene 1.0 mmol L-1 K 3 [Fe(CN)6] (pH 7). Amplituden: 5 mV, og frekvensområde: 0,1-105 Hz. tilpasset med tillatelse fra ref. [22]. Opphavsrett (2016) Elsevier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7 : Anodic peak strøm av endret elektrodene 1.0 mmol L-1 K 3 [Fe(CN)6] (pH 7) med en skanning hastighet på 0,1 V s -1 ved hjelp av syklisk voltammetry måling Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8 : Effekten av konsentrasjon ssDNA Dyna på SPCE/PLA-AuNPs i 0.1 mol L-1 for PBS (pH 7) til scan priser 0.1 V s -1 etter 30 min inkubasjon i 20 µM MB ved hjelp av differensial pulsmåling voltammetry Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9 : Effekten av ssDNA immobilisering tid på SPCE/PLA-AuNPs i 0.1 mol L -1 PBS (pH 7) med en skanning hastighet på 0,1 V s -1 etter 30 min inkubasjon i 20 µM MB ved hjelp av differensial pulsmåling voltammetry Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 10
Figur 10 : Effekten av ssDNA immobilisering temperatur på SPCE/PLA-AuNPs med en skanning hastighet på 0,1 V s -1 på 0.1 mol L -1 PBS (pH 7) etter en inkubasjonsperiode 30 min i 20 µM MB ved hjelp av differensial voltammetry pulsmåling Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 11
Figur 11 : Effekten av hybridisering tid på SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA i 0.1 mol L -1 PBS (pH 7) med en skanning hastighet på 0,1 V s -1 etter 30 min inkubasjon i 20 µM MB ved hjelp av differensial pulsmåling voltammetry Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 12
Figur 12 : Effekten av hybridisering temperatur på SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA i 0.1 mol L -1 PBS (pH 7) med en skanning hastighet på 0,1 V s -1 etter 30 min inkubasjon i 20 µM MB ved hjelp av differensial pulsmåling voltammetry. Gjengitt med tillatelse fra ref. [22]. Opphavsrett (2016) Elsevier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 13
Figur 13 : Histogram av MB reduksjon toppen gjeldende bruker ulike typer DNA i 0.1 mol L -1 PBS (pH 7) med en skanning hastighet på 0,1 V s -1 etter 30 min inkubasjon i 20 µM MB. Rammemargen illustrerer differensial puls voltammograms i samme vilkår. Gjengitt med tillatelse fra ref. [22]. Opphavsrett (2016) Elsevier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 14
Figur 14 : Histogram av MB reduksjon toppen gjeldende bruker forskjellige DNA konsentrasjon i 0.1 mol L -1 PBS (pH 7) med en skanning hastighet på 0,1 V s -1 etter 30 min inkubasjon i 20 µM MB ved hjelp av differensial pulsmåling voltammetry. Gjengitt med tillatelse fra ref. [22]. Opphavsrett (2016) Elsevier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 15
Figur 15 : En lineær handling av reduksjonen topp gjeldende MB mot loggen over forskjellige DNA konsentrasjon i 0.1 mol L -1 PBS (pH 7) med en skanning hastighet på 0,1 V s -1 etter 30 min inkubasjon i 20 µM MB ved hjelp av differensial pulsmåling voltammetry. Gjengitt med tillatelse fra ref. [22]. Opphavsrett (2016) Elsevier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 16
Figur 16 : Effekten av ulike hybridisering temperaturer på SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA på 6 måneders lagring intervall (n = 3). Målinger ble gjort i 0.1 mol L-1 PBS (pH 7) med en skanning hastighet på 0,1 V s-1 etter 30 min inkubasjon i 20 µM MB ved hjelp av differensial pulsmåling voltammetry. Gjengitt med tillatelse fra ref. [22]. Opphavsrett (2016) Elsevier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 17
Figur 17 : Agarose gel geleelektroforese PCR forsterkning med 16S rRNA genet sekvensering produkter av valgte bakterier fra bakterier kultur. Lane M: 1kb DNA stigen, Lane C−: negative kontroll (sterilt destillert vann), Lane C+: positiv kontroll (DNA utvunnet fra E. coli brukes som mal), Lane EC: E. coli O157: H7, Lane CJ: C. jejuni , Lane BC: B. cereus, Lane KP: K. lungebetennelse, Lane ST: S. typhimurium, Lane LM: L. monocytogenes, Lane SE: S. enteritt, Lane VP: V. parahaemolyticus og Lane VV: V. alginolyticus Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 18
Figur 18 : Histogram av MB reduksjon toppen gjeldende for kryssreaktivitet av DNA biosensor mot ulike matbårne patogener i 0.1 mol L -1 PBS (pH 7) med en skanning hastighet på 0,1 V s -1 etter 30 min inkubasjon i 20 µM MB ved hjelp av differensial pulsmåling voltammetry. Gjengitt med tillatelse fra ref. [23]. Opphavsrett (2017) Springer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 19
Figur 19 : Agarose gel geleelektroforese PCR forsterkning produkter av V. parahaemolyticus fra ferske hjerteskjell prøver. Lane M: 2ul av 100 bp DNA stigen, Lane 1-3: ubehandlet unspiked prøver, Lane 4-6: behandlet unspiked prøver, Lane 7-9: ubehandlet piggete prøver, Lane 10-12: behandlet piggete prøver, Lane C+: positiv kontroll (V. parahaemolyticus ATCC 17802), Lane C-: negativ kontroll (sterilt destillert vann). Gjengitt med tillatelse fra ref. [23]. Opphavsrett (2017) Springer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 20
Figur 20 : Histogram av MB reduksjon toppen gjeldende deteksjon av V. parahaemolyticus i frisk hjerteskjell prøver ved hjelp av DNA-biosensor i 0.1 mol L-1 PBS (pH 7) med en skanning hastighet på 0,1 V s-1 etter 30 min inkubasjon i 20 µM MB ved hjelp av differensial pulsmåling voltammetry. Gjengitt med tillatelse fra ref. [23]. Opphavsrett (2017) Springer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Elektroden sammensetning Inkubasjon tid (h) Temperatur (° C) Vekst medier
Campylobacter jejuni 48 42 BA / BB
Listeria monocytogenes 48 30 TSA / TSB
Salmonella typhimurium 24 37 TSA / TSB
Salmonella enteritidis 24 37 TSA / TSB
Klebsiella lungebetennelse 24 37 EMBA / TSB
Escherichia coli O157: H7 24 37 MA / TSB
Bacillus cereus 24 37 MYPA / TSB
Vibrio alginolyticus 24 37 TSA + 3% NaCl/TSB+3% NaCl
Vibrio parahaemolyticus 24 37 CA/TSA+3% NaCl/TSB+3% NaCl

Tabell 1: Kultur for valgte bakterier.

Eksempel POS. [° 2Th.] FWHM [° 2TH.] d-avstand [Å] Crystallite størrelse (nm)
PLA-AuNPs 31.682 0.3149 2.8243 27

Tabell 2: Størrelsen på PLA-AuNP-crystallites. Tilpasset med tillatelse fra ref. [30]. Opphavsrett (2016) Sociedade Brasileira de Química.

Modifisert elektrode % RSD (n = 6) Signalet reduksjon (%) (n = 20)
Repeterbarhet Reproduserbarhet
SPCE/PLA-AuNPs 4.26 4.05 18

Tabell 3: egenskaper for endret elektroder knyttet til AuNPs og PLA-AuNPs endring i K 3 [Fe(CN)6] med 1,0 mmol L -1 konsentrasjonen på et avsøkingshastigheten 0,1 V s -1 . Tilpasset med tillatelse fra ref. [30]. Opphavsrett (2016) Sociedade Brasileira de Química.

Elektroden sammensetning Jegpa (µA) Epa Selektivitet rate (%)
(n = 3) (V)
SPCE/PLA-AuNP/sonden DNA 4.79 ± 0,10 -0.46 -
SPCE/PLA-AuNP/ikke-komplementære DNA 3,25 ± 0,12 -0.44 67.85
SPCE/PLA-AuNP/3-baser DNA 1.05 ± 0,11 -0.45 21.92
SPCE/PLA-AuNP/1-base DNA 0.94 ± 0,12 -0.46 19.62
SPCE/PLA-AuNP/komplementære DNA 0.73 ± 0,10 -0.45 15.24

Tabell 4: DPV selektivitet av MB peak gjeldende i 0.1 mol L -1 PBS (pH 7) med en skanning hastighet på 0,1 V s -1 etter 30 min inkubasjon i 20 µM MB

Sammensetningen av elektrodene Oppdagelse metode Lineær utvalg (M) Grensen for påvisning (M) Referanser
3D AuNPs DPV 1,5 × 10-6 - 7.0 × 10-9 2.0 × 10-10 69
(+) AuNPs DPV 1.0 × 10-9 - 1,5 × 10-12 2.6 × 10-12 70
AuNPs/GR DPV 1.3 × 10-9 - 2.5 × 10-11 8.3 × 10-12 71
AuNPs-ADH-GSs DPV 5.0 × 10-8 - 3.0 × 10-13  3.0 × 10-13 72
AuNPs-MPTS DPV 5.0 × 10-9 - 1.0 × 10-11  5.0 × 10-11 73
AuNPs – gå DPV 1.0 × 10-9 - 1.0 × 10-14 3.5 × 10-15 74
CoS / AuNPs DPV 1.0 × 10-9 - 1.0 × 10-12 7.0 × 10-13 75
PLA-AuNPs DPV 2.0 × 10-8 - 2.0 × 10-13 5.3 × 10-12 Dette arbeidet

Tabell 5: Sammenligning av noen av de nylig utviklet elektrokjemiske DNA nanosensors. Gjengitt med tillatelse fra ref. [22]. Opphavsrett (2016) Elsevier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritisk trinnene i et rammeverk for vellykkede utviklingen av denne typen elektrokjemisk biosensor er valg av riktige biologiske anerkjennelse elementer for svingeren (nukleinsyre eller DNA her); kjemisk tilnærming for å konstruere sensing laget svingeren; signaltransduksjon materiale; optimalisering av DNA immobilisering og hybridisering; og validering av den utviklede biosensor bruker virkelige eksempler.

Kjernen for en vellykket utbygging av en følsom og selektiv elektrokjemiske DNA biosensor er optimalisering av betingelsen immobilisering og blanding. I dette arbeidet brukte vi MB som av redoks komplekse. Det er ulike prinsipper MB-DNA samhandlinger: (i) av elektrostatisk interaksjon MB kationisk kostnadsfritt med fosfat ryggraden anionic lader ssDNA og dsDNA; (ii) av MB innskudd gjennom vellykket innsetting MB mellom vekslende G-C base parene i dsDNA; (iii) av kovalent binding til slutten av målet ssDNA, som produserer en lav etiketten tetthet (én eller to MB molekyler per DNA strand); og (iv) MB samspill med en ubundet guanine base i ssDNA. Vi brukt fjerde prinsippet, som nøyaktig identifiserer V. parahaemolyticus fra korset reaktivitet av bakterier og ferske. Etter oksidering av spesiell interesse var det en sterkere affinitet mellom MB og ssDNA. Blanding av ssDNA med komplementære sekvensen erstatter limt MB molekyler, og dermed reduseres signalet.

En rekke eksperimentelle resultater presentert ovenfor fokuserer på utvikling av en rask metode for å oppdage V. parahaemolyticus med høy selektivitet og følsomhet bruker prinsippene om DNA hybridisering. Det første trinnet er syntese og karakterisering av polylactic syre-stabilisert gull nanopartikler (PLA-AuNPs) for endring av elektroden (tall 1-6 og tabell 2). Kvaliteten på gull nanopartikler ble evaluert med UV-synlig spektroskopi (UV-Vis), røntgen Diffraksjon (XRD), felt-utslipp skanning elektronmikroskop (FESEM), overføring elektronmikroskop (TEM), syklisk Voltammetry (CV) og Impedans analyse. Den andre delen av utviklingen involvert en elektrokjemisk karakteristikk av endrede elektroden (tall 7-12 og tabell 3-4) som bestemt vellykket styrking av endrede elektroden i forhold til nakne elektroden i vilkår for å oppdage hybridisering hendelsen.

Det tredje trinnet av DNA basert biosensor basert på optimalisering av eksperimentelle forhold av hybridisering hendelsen og anvendelse av den utviklede biosensor til deteksjon av faktiske patogen (tall 13-20). Hybridisering hendelsen som bestemmes suksess for påvisning av patogene ble vurdert ved hjelp av differensial puls voltammetry (DPV). Positiv eksistensen av målrettet patogene ble vist gjennom reduksjon av gjeldende. Følsomheten til de utviklet biosensor ble evaluert gjennom byggingen av en kalibrering plott og beregning av LOD (Figur 15). Den ferdige biosensor kunne spesielt skille V. parahaemolyticus fra andre patogener basert på de ulike nivåene av gjeldende reduksjon (tall 17 og 18). Evalueringen av muligheten for den utviklede biosensor for påvisning av V. parahaemolyticus i faktiske mat utvalg er presentert i tallene 19 og 20 og positiv eksistensen av målrettet patogen indikeres med reduksjon av gjeldende . Den vellykkede utviklingen av DNA-baserte biosensors er svært avhengig av DNA sonde utvalg, forbedring av endrede elektroden og optimalisering av eksperimentelle forhold. DNA sonden her har vært tilpasset fra tidligere arbeid Nakano67. Forbedring av endrede elektrodene ble utført ved hjelp av gull nanopartikler stabilisert med polylactic syre aktivere standardisering av nanosize. Funksjonen gull nanopartikler som electro katalytisk materiale68 og handle for å øke overføringshastighet på elektronet og også gi en overflate som å forankre DNA sonden. Parameterne eksperimentelle var optimalisert med tanke temperatur og inkubasjon tid som er avgjørende for DNA skjemaet dupleks. Hybridisering temperaturen påvirker avstanden mellom ikke-spesifikke opptak og dette øker selektivitet av sensoren. Inkubasjon tid hybridization øker sjansene for dobbeltsidig dannelsen. Immobilisering prosedyren må være optimalisert for å sikre DNA sonden vil være egnet papirretning for dobbeltsidig dannelsen skjemaet.

Tabell 5 sammenligner et utvalg av nylig utviklet elektrokjemiske DNA biosensors69,70,71,72,73,74,75 ,. DNA-baserte biosensing er en lovende metode for å erstatte molekylær basert teknikker selv om det er noen begrensninger som må tas opp før metoden kan være bærbare nok for bruk på stedet. Hovedbegrensningen er prøve behandling DNA utvinning som renhet og mengden av DNA utdraget på nettstedet er ikke sannsynlig å være så bra som hentes av standard lab-basert metode. Det er imidlertid en lovende alternativ hvis PCR og gel geleelektroforese kan erstattes med eksempel forbehandling system som microfluidic.

DNA-baserte biosensors er potensielt nyttig for mange programmer inkludert medisinsk diagnostikk, miljøovervåking og mat overvåking. Denne teknikken gjør online overvåking av kvalitetskontroll prosesser samt point-of-care overvåking av pasienter. Portabilitet av hele sensor kan desentralisering av diagnostiske prosesser der forbrukeren kan bruke gjenkjenning systemet i komforten av deres hjem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å erkjenne støtte fra Universiti Putra Malaysia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Merck 100056
Chloroform Merck 102445
Diaminoethane tetraacetic acid Promega E5134
Dibasic sodium phosphate  Sigma-Aldrich S9763
Disodium hydrogen phosphate Sigma-Aldrich 255793
Ethanol  Sigma-Aldrich 16368
Gold (III) chloride trihydrate Sigma-Aldrich 520918
Hydrochloric acid Merck 100317
Methylene blue Sigma-Aldrich M44907
Monobasic sodium phosphate, monohydrate Sigma-Aldrich S3522
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich P5119
Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D NatureWorks 4042D
Potassium chloride R&M Chemicals 59435
Potassium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich P9791
Potassium hexacyanoferrate III R&M Chemicals 208019
Sodium acetate anhydrous salt Sigma-Aldrich S2889
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888
Trisodium citrate Sigma-Aldrich S1804
Tris(hydroxymethyl) aminomethane Fisher Scientific T395-100
Tris-Base Fisher Scientific BP152-500
2X PCR Master Mix with Dual-Dye Norgen Biotek 28240
Agarose gel Merck 101236
Bolton Agar Merck 100079
Bolton Broth Merck 100079
CHROMagar Vibrio CHROMagar VB910
dNTPs Promega U1511
Nuclease-free water Thermo Scientific R0581
Eosin methylene blue agar  Merck 101347
GelRed Biotium 41001
Glycerol Merck 104092
Go Taq Buffer Promega M7911
Loading dye 100 bp DNA ladder Promega G2101
Loading dye 1kb DNA ladder Promega G5711
Magnesium chloride Promega 91176
Mannitol egg yolk polymyxin agar Merck 105267
McConkey Agar Merck 105465
Nutrient Broth Merck 105443
Taq polymerase Merck 71003
Trypticase Soy Broth Merck 105459
Trypticase Soy Agar Merck 105458

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gould, L. H., Rosenblum, I., Nicholas, D., Phan, Q., Jones, T. F. Contributing factors in restaurant-associated foodborne disease outbreaks, FoodNet sites, 2006 and 2007. Journal of Food Protection. 76, 1824-1828 (2013).
  2. Arvanitoyannis, I. S., Kotsanopoulos, K. V., Papadopoulou, A. Rapid detection of chemical hazards (toxins, dioxins, and PCBs) in seafood. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 54, 1473-1528 (2014).
  3. Robertson, L. J., Sprong, H., Ortega, Y. R., van der Giessen, J. W. B., Fayer, R. Impacts of globalisation on foodborne parasites. Trends in Parasitology. 30, 37-52 (2014).
  4. Sandilands, E. A., Bateman, D. N. The epidemiology of poisoning. Medicine. 44, 76-79 (2016).
  5. Boschi-Pinto, C., Velebit, L., Shibuya, K. Estimating child mortality due to diarrhoea in developing countries. Bulletin of the World Health Organization. 86, 710-717 (2008).
  6. Farthing, M. J. G. Diarrhoea: A Significant Worldwide Problem. International Journal of Antimicrobial Agents. 14, 65-69 (2000).
  7. World Health Organization. WHO estimates of the global burden of foodborne diseases: foodborne disease burden epidemiology reference group 2007-2015. , 1-255 (2015).
  8. Yeung, M., Boor, K. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathogens and Disease. 1, 74-88 (2004).
  9. Sakazaki, R. Foodborne Diseases. Cliver, D. O., Riemann, H. P. , Academic Press. 127-136 (2002).
  10. Grochowsky, J., Odom, S. R., Akuthota, P., Stead, W. Primary Septicemia and Abdominal Compartment Syndrome From Vibrio parahaemolyticus Infection in a 40-Year-Old Patient With No Known Immunocompromise. Infectious Disease in Clinical Practice. 22, (2013).
  11. Raghunath, P. Roles of thermostable direct hemolysin (TDH) and TDH-related hemolysin (TRH) in Vibrio parahaemolyticus. Frontiers in Microbiology. 5, 805 (2014).
  12. Kalburge, S. S., Whitaker, W. B., Boyd, E. F. High-Salt Preadaptation of Vibrio parahaemolyticus Enhances Survival in Response to Lethal Environmental Stresses. Journal of Food Protection. 77, 246-253 (2014).
  13. Esteves, K., Hervio-Heath, D., Mosser, T., Rodier, C., Tournoud, M. G., Jumas-Bilak, E., Colwell, R. R., Monfort, P. Rapid proliferation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, and Vibrio cholerae during freshwater flash floods in French Mediterranean Coastal lagoons. Applied and Environmental Microbiology. 81, 7600-7609 (2015).
  14. Khandeparker, L., Anil, A. C., Naik, S. D., Gaonkar, C. C. Daily variations in pathogenic bacterial populations in a monsoon influenced tropical environment. Marine Pollution Bulletin. 96, 337-343 (2015).
  15. Caburlotto, G., Suffredini, E., Toson, M., Fasolato, L., Antonetti, P., Zambon, M., Manfrin, A. Occurrence and molecular characterization of Vibrio parahaemolyticus in crustaceans commercialised in Venice area, Italy. International Journal of Food Microbiology. 220, 39-49 (2016).
  16. Wong, H. C., Chen, M. C., Liu, S. H., Liu, D. P. Incidence of highly genetically diversified Vibrio parahaemolyticus in seafood imported from Asian countries. International Journal of Food Microbiology. 52, 181-188 (1999).
  17. Rosec, J. P., Causse, V., Cruz, B., Rauzier, J., Carnat, L. The international standard ISO/TS 21872-1 to study the occurence of total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae in seafood: ITS improvement by use of a chromogenic medium and PCR. International Journal of Food Microbiology. 157, 189-194 (2012).
  18. Maniyankode, R. A., Kingston, J. J., Murali, H. S., Batra, H. V. Specific identification of vibrio parahaemolyticus employing monoclonal antibody based immunoassay. International Journal of Pharmacy and Biological Sciences. 4 (2), B156-B164 (2013).
  19. Suffredini, E., Lopez-Joven, C., Maddalena, L., Croci, L., Roque, A. Pulsed-field gel electrophoresis and PCR characterization of environmental Vibrio parahaemolyticus strains of different origins. Applied and Environmental Microbiology. 77, 6301-6304 (2011).
  20. Bhattacharyya, N., Hou, A. A pentaplex PCR assay for detection and characterization of Vibrio vulnificus and Vibrio parahaemolyticus isolates. Letters in Applied Microbiology. 57, 233-240 (2013).
  21. da Silva, E. T. S. G., et al. Electrochemical Biosensors in Point-of-Care Devices: Recent Advances and Future Trends. ChemElectroChem. 4 (4), 778-794 (2017).
  22. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hushiarian, R. Sensitive detection of multiple pathogens using a single DNA probe. Biosensors and Bioelectronics. 86, 398-405 (2016).
  23. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hushiarian, R. A simple, portable, electrochemical biosensor to screen shellfish for Vibrio parahaemolyticus. AMB Express. 7 (1), 41 (2017).
  24. Zhang, J., Li, Z., Zhang, H., Wang, J., Liu, Y., Chen, G. Rapid detection of several foodborne pathogens by F0F1-ATPase molecular motor biosensor. Journal of Microbiological Methods. 93, 37-41 (2013).
  25. Barsan, M. M., Ghica, E. M., Brett, C. M. A. Portable biosensing of food toxicants and environmental pollutants. Nikolelis, D. P., Varzakas , T., Erdem, A., Nikoleli, G. P. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Boca Raton. 33-69 (2014).
  26. Kwun, J., Yun, S., Park, L., Lee, J. H. Development of 1,1'-oxalyldiimidazole chemiluminescent biosensor using the combination of graphene oxide and hairpin aptamer and its application. Talanta. 119, 262-267 (2014).
  27. Thavanathan, J., Huang, N. M., Thong, K. L. Colorimetric biosensing of targeted gene sequence using dual nanoparticle platforms. International Journal of Nanomedicine. 10, 2711-2722 (2015).
  28. Hushiarian, R., Yusof, N. A., Abdullah, A. H., Ahmad, S. A. A., Dutse, S. W. Facilitating the indirect detection of genomic DNA in an electrochemical DNA biosensor using magnetic nanoparticles and DNA ligase. Analytical Chemistry Research. 6, 17-25 (2015).
  29. Dutse, S. W., Yusof, N. A., Ahmad, H., Hussein, M. Z., Zainal, Z., Hushiarian, R., Hajian, R. An Electrochemical Biosensor for the Determination of Ganoderma boninense Pathogen Based on a Novel Modified Gold Nanocomposite Film Electrode. Analytical Letters. 47 (5), 819-832 (2014).
  30. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hajian, R. Characterization of Polylactide-Stabilized Gold Nanoparticles and Its Application in the Fabrication of Electrochemical DNA Biosensors. Journal of the Brazilian Chemical Society. 27 (9), 1679-1686 (2016).
  31. Vongkamjan, K., Wang, S., Moreno Switt, A. I. Rapid detection of foodborne bacterial pathogens in seafood. Handbook of Seafood: Quality and Safety Maintenance and Applications. , 247-257 (2016).
  32. Wang, F., Jiang, L., Yang, Q., Han, F., Chen, S., Pu, S., Vance, A., Ge, B. Prevalence and antimicrobial susceptibility of major foodborne pathogens in imported seafood. Journal of Food Protection. 74 (9), 1451-1461 (2011).
  33. Szermer-Olearnik, B., Sochocka, M., Zwolinska, K., Ciekot, J., Czarny, A., Szydzik, J., Kowalski, K., Boratynski, J. Comparison of microbiological and physicochemical methods for enumeration of microorganisms. Postepy Higieny i Medycyny Doswiadczalnej. 68, 1392-1396 (2014).
  34. Ivanov, I. G., Bachvarov, D. R. Determination of plasmid copy number by the "boiling" method. Analytical Biochemistry. 165 (1), 137-141 (1987).
  35. Gopireddy, V. R. Biochemical tests for the identification of bacteria. International Journal of Pharmacy and Technology. 3 (4), 1536-1555 (2011).
  36. Böhme, K., Fernández-No, I. C., Pazos, M., Gallardo, J. M., Barros-Velázquez, J., Cañas, B., Calo-Mata, P. Identification and classification of seafood-borne pathogenic and spoilage bacteria: 16S rRNA sequencing versus MALDI-TOF MS fingerprinting. Electrophoresis. 34 (6), 877-887 (2013).
  37. Seoudi, R., Fouda, A. A., Elmenshawy, D. A. Synthesis, characterization and vibrational spectroscopic studies of different particle size of gold nanoparticle capped with polyvinylpyrrolidone. Physica B: Condensed Matter. 405, 906-911 (2010).
  38. Mishra, A., Harper, S., Yun, S. I. Interaction of biosynthesized gold nanoparticles with genomic DNA isolated from E. coli and S. aureus. Nanotechnology (IEEE-NANO). , 1745-1750 (2011).
  39. Sugimoto, T. Formation of modoispersed nano- and micro-particles controlled in size, shape, and internal structure. Chemical Engineering and Technology. 26, 313-321 (2003).
  40. Rath, C., Sahu, K. K., Kulkarni, S. D., Anand, S., Date, S. K., Das, R. P., Mishra, N. C. Microstructure-dependent coercivity in monodispersed hematite particles. Applied Physics Letters. 75, 4171-4173 (1999).
  41. Abbas, M., Wu, Z. Y., Zhong, J., Ibrahim, K., Fiori, A., Orlanducci, S., Sessa, V., Terranova, M. L., Davoli, I. X-ray absorption and photoelectron spectroscopy studies on graphite and single-walled carbon nanotubes: Oxygen effect. Applied Physics Letters. 87 (5), 051923 (2005).
  42. Lim, S. C., Choi, Y. C., Jeong, H. J., Shin, Y. M., An, K. H., Bae, D. J., Lee, Y. H., Lee, N. S., Kim, J. M. Effect of gas exposure on field emission properties of carbon nanotubes arrays. Advanced Materials. 13, 1563-1567 (2001).
  43. Kim, B. H., Kim, B. R., Seo, Y. G. A study on adsorption equilibrium for oxygen and nitrogen into carbon nanotubes. Adsorption. 11, 207-212 (2005).
  44. Bard, A. J., Faulkner, L. R. Electrochemical methods: Fundamentals and applications. , John Wiley & Sons Inc. (2000).
  45. Tan, Q., Wang, L., Ma, L., Yu, H., Ding, J., Liu, Q., Xiao, A., Ren, G. Study on anion electrochemical recognition based on a novel ferrocenyl compound with multiple binding sites. Journal of Physical Chemistry B. 112, 11171-11176 (2008).
  46. Manivannan, S., Ramaraj, R. Polymer-embedded gold and gold/silver nanoparticle-modified electrodes and their applications in catalysis and sensors. Pure and Applied Chemistry. 83, 2041-2053 (2011).
  47. Benali, O., Larabi, L., Traisnel, M., Gengembre, L., Hareka, Y. Electrochemical, theoretical and XPS studies of 2-mercapto-1-methylimidazole adsorption on carbon steel in 1 M HClO4. Applied Surface Science. 253, 6130-6139 (2007).
  48. Shi, Y., Wen, L., Li, F., Cheng, H. M. Nanosized Li4Ti5O12/graphene hybrid materials with low polarization for high rate lithium ion batteries. Journal of Power Sources. 196, 8610-8617 (2011).
  49. Bentiss, F., Traisnel, M., Lagrenee, M. The substituted 1,3,4-oxadiazoles: a new class of corrosion inhibitors of mild steel in acidic media. Corrosion Science. 42, 127-146 (2000).
  50. Wang, M., Gong, W., Meng, Q., Zhang, Y. Electrochemical DNA impedance biosensor for the detection of DNA hybridization with polymeric film, single walled carbon nanotubes modified glassy carbon electrode. Russian Journal of Electrochemistry. 47, 1368-1373 (2011).
  51. Herdt, A. R., Drawz, S. M., Kang, Y., Taton, T. A. DNA dissociation and degradation at gold nanoparticle surfaces. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 51 (2), 130-139 (2006).
  52. Bhatt, N., Huang, P. J. J., Dave, N., Liu, J. Dissociation and degradation of thiol-modified DNA on gold nanoparticles in aqueous and organic solvents. Langmuir. 27, 6132-6137 (2011).
  53. Liu, X., Jang, C. H., Zheng, F., Jürgensen, A., Denlinger, J. D., Dickson, K. A., Raines, R. T., Abbott, N. L., Himpsel, F. J. Characterization of protein immobilisation at silver surfaces by near edge X-ray absorption fine structure spectroscopy. Langmuir. 22, 7719-7725 (2006).
  54. Willey, T. M., Andrew, L., Vance, T., Buuren, V., Bostedt, C., Terminello, L. J., Fadley, C. S. Rapid degradation of alkanethiol-based self-assembled monolayers on gold in ambient laboratory conditions. Surface Science. 576 (1), 188-196 (2005).
  55. Farjami, E., Clima, L., Gothelf, K., Ferapontova, E. E. DNA interactions with a Methylene Blue redox indicator depend on the DNA length and are sequence specific. Analyst. 135, 1443-1448 (2010).
  56. Lin, X., Ni, Y., Kokot, S. An electrochemical DNA-sensor developed with the use of methylene blue as a redox indicator for the detection of DNA damage induced by endocrine-disrupting compounds. Analytica Chimica Acta. 867, 29-37 (2015).
  57. Zhang, F. T., Nie, J., Zhang, D. W., Chen, J. T., Zhou, Y. L., Zhang, X. X. Methylene Blue as a G-Quadruplex Binding Probe for Label-Free Homogeneous Electrochemical Biosensing. Analytical Chemistry. 86, 9489-9495 (2014).
  58. Ning, L., Li, X., Yang, D., Miao, P., Ye, Z., Li, G. Measurement of Intracellular pH Changes Based on DNA-Templated Capsid Protein Nanotubes. Analytical Chemistry. 86, 8042-8047 (2014).
  59. Sani, N. D. M., Heng, L. Y., Surif, S., Lazim, A. M., et al. AIP Conference Proceedings. Murad, A., et al. 1571, 636-640 (2013).
  60. Xu, P., Wang, J., Xu, Y., Chu, H., Shen, H., Zhang, D., Zhao, M., Liu, J., Li, G. Binding modes and interaction mechanism between different base pairs and methylene blue trihydrate: a quantum mechanics study. Advances in Experimental Medicine and Biology. 827, 187-203 (2015).
  61. Guo, Y., Chen, J., Chen, G. A label-free electrochemical biosensor for detection of HIV related gene based on interaction between DNA and protein. Sensors & Actuators, B: Chemical. 184, 113-117 (2013).
  62. Huang, K. J., Liu, Y. J., Wang, H. B., Wang, Y. Y., Liu, Y. M. Sub-femtomolar DNA detection based on layered molybdenum disulfide/multi-walled carbon nanotube composites, au nanoparticle and enzyme multiple signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 55, 195-202 (2014).
  63. Kong, R. M., Song, Z. L., Meng, H. M., Zhang, X. B., Shen, G. L., Yu, R. Q. A label-free electrochemical biosensor for highly sensitive and selective detection of DNA via a dual-amplified strategy. Biosensors and Bioelectronics. 54, 442-447 (2014).
  64. Rashid, J. I. A., Yusof, N. A., Abdullah, J., Hashim, U., Hajian, R. Novel Disposable Biosensor Based on SiNWs/AuNPs Modified-Screen Printed Electrode for Dengue Virus DNA Oligomer Detection. IEEE Sensors Journal. 15, 4420-4421 (2015).
  65. Yingkajorn, M., Sermwitayawong, N., Palittapongarnpimp, P., Nishibuchi, M., Robins, W. P., Mekalanos, J. J., Vuddhakul, V. Vibrio parahaemolyticus and its specific bacteriophages as an indicator in cockles (Anadara granosa) for the risk of V. parahaemolyticus infection in Southern Thailand. Microbial Ecology. 67, 849-856 (2014).
  66. Ahmad Ganaie, H., Ali, M. N. Short term protocol for the isolation and purification of DNA for molecular analysis. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research. 24, 266-270 (2014).
  67. Nakano, K., Kimura, T., Kitamura, Y., Ihara, T., Ishimatsu, R., Imato, T. Potentiometric DNA sensing platform using redox-active DNA probe pair for sandwich-type dual hybridization at indicator electrode surface. Journal of Electroanalytical Chemistry. 720-721, 71-75 (2014).
  68. Yang, J., Jim Yang, L., Heng-Phon, T., Gan-Moog, C. Inhibition of DNA hybridization by small metal nanoparticles. Biophysical Chemistry. 120, 87-95 (2006).
  69. Niu, L. M., Liu, F., Wang, W., Lian, K. Q., Ma, L., Shi, H. M., Kang, W. J. Electrochemical Behavior of Paraquat on a Highly Ordered Biosensor Based on an Unmodified DNA-3D Gold Nanoparticle Composite and Its Application. Electrochimica Acta. 153, 190-199 (2015).
  70. Li, Z., Miao, X., Xing, K., Zhu, A., Ling, L. Enhanced electrochemical recognition of double-stranded DNA by using hybridization chain reaction and positively charged gold nanoparticles. Biosensors and Bioelectronics. 74, 687-690 (2015).
  71. Niu, S., Sun, J., Nan, C., Lin, J. Sensitive DNA biosensor improved by 1,10-phenanthroline cobalt complex as indicator based on the electrode modified by gold nanoparticles and graphene. Sensors and Actuators B: Chemical. 176, 58-63 (2013).
  72. Yi, H., Xu, W., Yuan, Y., Bai, L., Wu, Y., Chai, Y., Yuan, R. A pseudo triple-enzyme cascade amplified aptasensor for thrombin detection based on hemin/G-quadruplex as signal label. Biosensors and Bioelectronics. 54, 415-420 (2014).
  73. Das, R., Sharma, M. K., Rao, V. K., Bhattacharya, B. K., Garg, I., Venkatesh, V., Upadhyay, S. An electrochemical genosensor for Salmonella typhi on gold nanoparticles-mercaptosilane modified screen printed electrode. Journal of Biotechnology. 188, 9-16 (2014).
  74. Han, X., Fang, X., Shi, A., Wang, J., Zhang, Y. An electrochemical DNA biosensor based on gold nanorods decorated graphene oxide sheets for sensing platform. Analytical Biochemistry. 443 (2), 117-123 (2013).
  75. Huang, K. J., Liu, Y. J., Zhang, J. Z., Cao, J. T., Liu, Y. M. Aptamer/Au nanoparticles/cobalt sulfide nanosheets biosensor for 17β-estradiol detection using a guanine-rich complementary DNA sequence for signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 67, 184-191 (2015).

Tags

Bioteknologi problemet 136 Polylactic syre-stabilisert gull nanopartikler trykt karbon elektrode DNA biosensor Vibrio parahaemolyticus elektrokjemiske sensor DNA hybridisering
Utvikling av en elektrokjemisk DNA Biosensor å oppdage en infeksjon patogen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nordin, N., Yusof, N. A., Radu, S.,… More

Nordin, N., Yusof, N. A., Radu, S., Hushiarian, R. Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen. J. Vis. Exp. (136), e56585, doi:10.3791/56585 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter