Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

התפתחות ביוסנסור אלקטרוכימי דנ א כדי לזהות חיידק והקאה

Published: June 3, 2018 doi: 10.3791/56585
Automatic Translation
1, 2,3, 1, 4
1Laboratory of Food Safety and Food Integrity, Institute of Tropical Agriculture and Food Security, Universiti Putra Malaysia, 2Laboratory of Functional Device, Institute of Advanced Technology, Universiti Putra Malaysia, 3Department of Chemistry, Faculty of Science, Universiti Putra Malaysia, 4La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University

Summary

פרוטוקול לפיתוח ביוסנסור אלקטרוכימי DNA הכוללת של אלקטרודות פחמן חלקיקי-לאחרונה, המסך המודפס מיוצב חומצה, זהב polylactic לזהות ויבריו parahaemolyticus מוצג.

Abstract

ויבריו parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) הוא. חיידק נפוץ והקאה אשר תורם חלק ניכר של בעיות בריאות הציבור ברחבי העולם, באופן משמעותי משפיע על הקצב של האדם תמותה ותחלואה קרדיווסקולרית. שיטות קונבנציונליות איתור נ' parahaemolyticus כגון שיטות מבוססות-תרבות, מבחני אימונולוגי מולקולרי המבוסס על שיטות דורשים טיפול מסובך לדוגמה, זמן רב, מייגע, ויקרות. לאחרונה, ביולוגיים הוכיחו להיות שיטה לזיהוי מבטיח ומקיף עם היתרונות של זיהוי מהיר, משתלמת, ו המעשיות. מחקר זה מתמקד בפיתוח שיטה מהירה של גילוי נ' parahaemolyticus סלקטיביות גבוהה ורגישות שימוש בעקרונות ה-DNA הכלאה. עבודה, אפיון polylactic מסונתז מיוצב חומצה חלקיקי זהב (PLA-AuNPs) הושג באמצעות קרני רנטגן (XRD), ספקטרוסקופיה הגלוי אולטרה סגול (UV-Vis), הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM), פליטת שדה מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (FESEM), וולטמטריה ציקלית (CV). אנחנו גם ביצעו בדיקה נוספת של יציבות, רגישות הפארמצבטית של ה-PLA-AuNPs. . מצאנו ה-PLA AuNPs נוצר מבנה הקול של חלקיקים מיוצב בתמיסה המימית. גם הבחנו כי שיפרה הרגישות כתוצאה ערך התנגדות (Rct) קטן יותר תשלום העברה, גידול של פעיל שטח (2ס מ 0.41). פיתוח ביוסנסור הדנ א שלנו מבוססת על שינוי של אלקטרודות פחמן המסך המודפס (SPCE) עם ה-PLA-AuNPs ושימוש מתילן כחול (MB) כאינדיקטור חמצון-חיזור. אנחנו לאומדן האירועים הנייח והכלאה הדופק דיפרנציאלי voltammetry (DPV). מצאנו כי משלימים, שאינם משלימים, oligonucleotides לא תואמת במיוחד היו מכובדים על ידי החיישן מפוברק. זה הראה גם זיהוי רגיש בצורה אמינה במחקרים אשיג נגד פתוגנים שונים שמקורם במזון, הזיהוי של נ' parahaemolyticus בתוך הלב טריים.

Introduction

נושא מרכזי של הדיון הציבורי ומדעיים בשנים האחרונות, הרעלת מזון היא מזוהה בעיקר עם שלושה סוכנים: מיקרואורגניזמים1, כימיקלים2וטפילים3. מזון מזוהם עלול לגרום לתוצאות בריאות רציניות בבני אדם, במיוחד אצל קבוצת סיכון גבוה יותר של אלה עם מערכות החיסון חלשה, נשים בהריון, קשישים, תינוקות, ילדים צעירים4. עם יותר ממיליון מקרים של שלשול אקוטי המתרחשים מדי שנה אצל ילדים מתחת לגיל 5 שנים ב אפריקה, אסיה, אמריקה הלטינית, הרעלת מזון היא מחלה הגלובלית הגדולות5,6 , הקימה ארגון הבריאות העולמי מיקרואורגניזמים כמו התורם החשוב ביותר7. ויבריו parahaemolyticus בולטת בין זנים מידבק ביותר המוכר. בדרך כלל שנמצאו לאורך החוף, estuarine, ימית סביבות8, הוא חיידק גראם שליליים, אשר הופכת לפעילה בסביבות מלח גבוהה, והוא גורם להרעלתו אנושי רציני כאשר אוכלים מבושל כראוי, כושלת או raw ימית מוצרים9. בנוסף, קיימים מצבים רפואיים אצל אנשים מסוימים להפוך אותם נוטה פצע הזיהום זיהום, ספטיסמיה או האוזן הנובעים נ' parahaemolyticus10. הגורמים התקפה אלימה של נ' parahaemolyticus hemolysins נחלקים לשני סוגים אשר לתרום בפתוגנזה המחלה: thermostable המוליזין ישירה (TDH) מקודד על ידי הגנים tdh ולאחר הקשורות TDH המוליזין מקודד על ידי גנים trh11. הקריטריונים התקפה אלימה (גנים tdh ו- trh) של parahaemolyticus (פ') נמצאים בעיקר דגימות קליניות, במקום דגימות סביבתיים.

(פ') parahaemolyticus יש את היכולת לשרוד תחת מגוון רחב של תנאים, להגיב במהירות על שינויים סביבתיים12. מנגנון התפשטות שלה מסלים את פוטנציאל הסיכון שלו ככל שלה רעילות במקביל תא המוני13. חמור מכך, שינוי האקלים מספקת חיידקים אלה בתנאים בשפע כדי להאיץ את הצמיחה שלהם האוכלוסייה תא14. בשל תדירותו גבוהה, נ' parahaemolyticus צריך להיות במעקב לאורך שרשרת אספקת המזון, במיוחד בתחום הסחר והייצור של פירות ים מאז מוצרים אלה הם שבו הם נמצאים בכמויות עצומות15,16 ברחבי העולם. כיום החיידקים מזוהות ואת וזמינותו מבודדים באמצעות מגוון של שיטות כולל בדיקות ביוכימיות, העשרה, מדיה סלקטיבי17, מקושרים-אנזים immunomagnetic sorbent (אליסה)18, הדופק-שדה בג'ל (PFGE) 19התלכדות לייטקס בדיקות, בדיקות פולימראז תגובת שרשרת (PCR)20. שיטות אלו דורשות בדרך כלל מוסמכים, מכשירים מתוחכמים וטכניקות מפרך אשר אינם מספקים מידע אודות זיהום באופן מיידי. זה קשות מגביל את הסבירות מיד גילוי זיהום מזיקים ויישומים באתר. כלי איתור מהיר עדיין מהווה אתגר יוצא מן הכלל.

Biosensing מתגלה כאופציה מבטיחה איתור והקאה פתוגנים משום שהיא מציעה לחיסכון בזמן, חסכונית, מעשית, בזמן אמת וניתוח בשיטת21,22,23,24 . עם זאת, אמנם היו תוצאות חיוביות רבות של analyte בזיהוי כל פתרון באמצעות ביולוגיים ודוגמאות מחודדים, יש עדיין חוסר מחקר חלה על דוגמאות אמיתיות או תערובות מימית או תמציות אורגניות25. לאחרונה, ביולוגיים אלקטרוכימי באמצעות זיהוי ישיר ו/או עקיף חומצה deoxyribonucleic (DNA) קיבלו תשומת לב מוגברת בקרב מדענים, עקב שלהם זיהוי ספציפי של המטרה משלימים באמצעות אירוע הכלאה26 , 27 , 28 , 29. גישות ייחודיות אלה יציבים יותר בהשוואה ביולוגיים מבוססי אנזים, ובכך מציע טכנולוגיה מבטיח המזעור, מסחור. המטרה של המחקר דיווח הנה כדי לבנות כלי מהיר יכול לזהות נ' parahaemolyticus עם סלקטיביות גבוהה, רגישות, מעשיות, המבוססת על רצף ה-DNA יחודיות במהלך הכלאה. זיהוי אסטרטגיות כוללות השילוב של חומצה מיוצב חלקיקי זהב (PLA-AuNPs) polylactic30 ואלקטרודות פחמן המסך המודפס (SPCEs) בנוכחות מחוון הכלאה, מתילן כחול (MB). הפוטנציאל של הבונה הזיהוי מפותחת הוא חקר נוסף באמצעות חיידקים דגימות די אן איי פשוט נתעלף lysate ורענן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: כל ריאגנטים כימי וביוכימי כדי לשמש צריך להיות של כיתה אנליטית, ללא טיהור נוסף. להכין את כל הפתרונות באמצעות מים יונים סטרילי. אוטוקלב כל כלי זכוכית לפני העיקור.

התראה: אנא השתמש כל נוהלי בטיחות המתאים בעת ביצוע פעילויות מעבדה, כולל את השימוש הנדסה פקדים (fume הוד, הכפפות), ציוד מגן אישי (בטיחות משקפיים, כפפות, חלוק המעבדה, מכנסיים באורך מלא, סגורות נעלי).

1. ייצור, אפיון של שינוי אלקטרודה באמצעות ה-PLA-AuNPs

  1. הכנה ואפיון של ה-PLA-AuNPs
    1. להוסיף 10 מ של הפתרון סודיום ציטרט (38.8 מ מ) ל- 100 מ של רותחים chloroauric מימית תמיסה חומצית (1 מ מ) ובמהירות תירגע עד טמפרטורת הסביבה. לבחון את השינויים בצבע בפתרון AuNPs מוכן אשר מתחיל כמו צהוב, שינויים שחור ומסתיים לבסוף כמו אדום רובי כהה.
    2. מניחים את כדורי ה-PLA תבנית מפלדת לתהליך ההיתוך ומחממים אותם בטמפרטורה של 190 מעלות במשך 10 דקות אחרי ההליך הקשה: שים אותם תחת לחץ של MPa 2.2 עבור 1 דקות כחלק הכנת גיליון ה-PLA. הגיליון PLA יהיה מוכן לשימוש לאחר קירור במשך כ-3 שעות.
    3. לערבב נמרצות, להמיס 0.68 מ ג של הסדינים PLA ב 5 מ של כלורופורם בטמפרטורת החדר. מערבבים ה-PLA מומס עם 10 מ"ל של הפתרון AuNPs בעבר מוכן ומערבבים homogeneously זה בטמפרטורת החדר. תערובות הומוגנית אז יכול להיות denoted כמו ה-PLA-AuNPs, מאופיין באמצעות UV-Vis, XRD, TEM, ו- FESEM עם EDX.
  2. הכנה ואפיון של פחמן המסך המודפס ששונה אלקטרודה
    הערה: SPCE השתמשו במחקר זה כוללת מערכת 3-אלקטרודה: אלקטרודה מונה אלקטרודה עבודה של פחמן, אלקטרודה הפניה Ag/AgCl.
    1. במהירות פיפטה 25 µL של פתרון הומוגני של ה-PLA-AuNPs על גבי SPCE ולאחר מכן אוויר יבש זה עבור 24 שעות לפני השימוש.
    2. Electrochemically לאפיין את האלקטרודות ששונה, SPCE/ה-PLA-AuNPs, בפרו אשלגני (K3[Fe(CN)6]3 -/4 -) כדי למדוד את שטח פעיל, ספקטרוסקופיה עכבה אלקטרוכימי, הדיר, הפארמצבטית, יציבות30.

2. פיתוח ביוסנסור אלקטרוכימי DNA

  1. בדיקה הכנה
    הערה: הרצף של בדיקה ssDNA ו- DNA משלימים נבחרו בהתבסס על מידע של המרכז הארצי עבור מסד הנתונים ביוטכנולוגיה מידע (NCBI).
    1. לרכוש oligonucleotides סינתטי (20-מר ssDNA בדיקה, DNA משלימים 20-mer, 20-מר לא תואמים DNA ו 21-מר-משלימה דנ א) אבקת lyophilized ממעבדות מסחרי, בהתבסס על רצפי הבאים:
      thiolated ssDNA בדיקה: יונקות - / 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG - 3′
      DNA משלימים: יונקות - CAGTGCTTCTGCATAATCCG - 3′
      DNA שאינם תואמים אחד-בסיס: יונקות - CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG - 3′
      3-בסיס DNA שאינם תואמים: יונקות - CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG - 3′
      DNA שאינם משלימים: יונקות - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA - 3′
    2. להכין מלאי פתרונות של כל oligonucleotides (100 מיקרומטר) באמצעות סטרילי טה פתרון (10 מ מ טריס-HCl, 1 מ"מ EDTA, pH 7.5), מחולק לחלקים אנליטית. לשמור את זה ב-4 ° C ולאחר מכן בצע את דילולים המתאים רק לפני השימוש.
  2. אופטימיזציה של קיבעון של הכלאה
    הערה: SPCE שופרת PLA-AuNPs, מסומן בתור SPCE/ה-PLA-AuNPs, נעשה שימוש במחקר זה, שיטת הליהוק טיפה שימש כדי להפוך את ה-DNA הנייח הכלאה.
    1. ראשית, לשתק 25 µL של thiolated ssDNA בדיקה על ה-PLA/SPCE-AuNPs, ואז האוויר יבש זה עבור 24 שעות בטמפרטורת החדר, לאחר מכן זה להיות סוף סוף מסומן בתור SPCE/ה-PLA-AuNPs/ssDNA. לקבוע אופטימיזציה של התנאי הנייח באמצעות שלושה גורמים: הריכוז של ssDNA (החל 0.2 1.4 µM), זמן (החל מ-30 ועד 210 דקות), טמפרטורה (החל מ- 25 ועד 75 ° C).
    2. פיפטה 25 µL של ה-DNA משלימים על פני השטח של SPCE/ה-PLA-AuNPs/ssDNA כדי לבצע את האירוע הכלאה לאחר מכן זה יכול להיות סוף סוף מסומן בתור SPCE/ה-PLA-AuNPs/dsDNA. לקבוע אופטימיזציה של התנאי הכלאה באמצעות שני גורמים של זמן (החל מ-5 עד 30 דקות) וטמפרטורה (החל מ- 25 ועד 75 ° C).
    3. לטבול את קיבוע של אלקטרודות hybridized ב- 20 מיקרומטר MB עבור 30 דקות להסיר את ה-DNA הלא ספציפית הספוחה ו MB עודף על ידי כביסה עם 0.5 M ABS/20 מ מ NaCl (pH 4.5) ולאחר מכן שטיפה בעזרת יונים מים. מדד השיא הנוכחי של הפחתת MB DPV בטכניקה. לבצע את המדידה DPV באמצעות 0.1 M PBS (pH 7) המכיל אין מחוון.
  3. אפיון החיישן DNA מפוברק
    1. לטבול את SPCE/ה-PLA-AuNPs ב- 20 מיקרומטר MB במשך 30 דקות, לשטוף עם 0.5 M ABS/20 מ מ NaCl (pH 4.5) ולאחר מכן לשטוף עם מים יונים לפני מדידה. בצע הליך דומה עבור כל האינטראקציות לרבות בדיקת DNA, DNA משלימים, DNA שאינם תואמים, דגימות די אן איי שאינם משלימים.
    2. למדוד ההפחתה אלקטרוכימי.
      הערה: מדדנו DPV באמצעות ממשק התוכנה של Autolab מיוצרים באופן מסחרי.
      המדידות DPV MB להפחתת אלקטרוכימי בנטילת פוטנציאלי ועד-V 0.5 0.25 V, בצעד פוטנציאלי של 0.005 V, אפנון משרעת של 0.05 V, ושיעור סריקה של 7.73 mVs-1 ב- PBS 0.1 M (pH 7), המכיל אין מחוון. סלקטיביות, רגישות, הפארמצבטית, יציבות החום של החיישן DNA מפוברק נחקרו בהמשך. התוצאות המדווחות הוצגו מדידות ערך רשע ב משכפל שלוש.

3. אימות של החיישן מפוברק הדנ א באמצעות דוגמאות אמיתיות

  1. הכנה של זני חיידקים
    1. בחר דגימות בקטריאליות בהתבסס על שלהם זיהום משמעותי של מאכלי ים31,32 .
      הערה: נ' parahaemolyticus וגם הפניה זנים 8 אחרים זני חיידקים (קמפילובקטר jejuni ליסטריה, סלמונלה typhimurium, סלמונלה דלקת מעיים, דלקת ריאות קלבסיאלה, Escherichia coli O157:H7, Bacillus קובו, ויבריו alginolyticus) של והקאה נפוצות הפתוגן הועסקו לשם אימות ביוסנסור אלקטרוכימי DNA במחקר זה.
    2. התנהגות שגרתית תת תרבות של זני חיידקים על אגר בהתאמה שלהם כל שבועיים כדי לשמור על יכולת הקיום שלהם, עיין טבלה 1 עבור תנאים תרבות.
    3. לשמור על שימור לטווח ארוך זני חיידקים ב שלהם broths גדל בהתאמה המכיל 20% (v/v) גליצרול ב-80 מעלות צלזיוס כפי גליצרול מגן על חיידקים על ידי מניעת היווצרות של גבישי קרח אשר יכולים לגרום להם נזק במהלך תהליך ההקפאה. בשלב הבא, לחסן לולאה של תא החיידק משומרת תרבות במניות גליצרול לתוך broths בהתאמה. דגירה את broths על פי טמפרטורה וזמן צמיחה בהתאמה שלהם בעת הצורך להחיות את החיידקים.
    4. לקבוע את הכמות נ' parahaemolyticus תאים באמצעות טכניקה של צלחת כפולה33, תקן ושיטה ידועה לספירת מיקרואורגניזמים נגזר סדרת דילולים.
      1. תרבות נ' parahaemolyticus ב Trypticase סויה מרק (TSB + 3% NaCl) ב 37 מעלות צלזיוס במצב חזק 140-סל ד. לאחר מכן, להעביר 1 מ"ל של התרבות תאי חיידקים לתוך 9 מיליליטר TSB + 3% NaCl להשיג גורם לדילול 10-1 .
    5. חזור על שלב זה תשע פעמים כדי לקבל סדרה מלאה של גורם לדילול-10 עד 10. הבא, התפשטה 0.1 מ"ל של כל גורם לדילול (החל מ 10-1 כדי 10-10) על צלחת אגר סלקטיבי של ויבריו המושבה ספירה, בהתאמה. דגירה הלוחות מודגרות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
    6. השתמש מונה המושבה כדי לספור מושבות בודדות, ואז חזרה-לחשב (ספירת הסכום CFU/pipetted x פקטור דילול) כדי לקבל יחידת המושבה יוצרי לאדם צפיפות מיליליטר (מ"ל CFU-1). שואבים את הריכוז של המושבה יוצרי יחידות (CFUs) ב השעיות התא חיידקים מן העלילה כיול של mL CFU-1 נגד ספיגת.
  2. הכנת וזמינותו PCR
    1. תמצית הדנ א בעקבות ששונה מבושלים הליך פירוק34. עם הנץ החמה בקטריאלי בודדים זן במדיה אגר, לחסן אותו בתקשורת מרק, ואחריו המקננת זה על מצבו היחסי צמיחה, סל"ד 140 רועד תנאי.
    2. Pipette תרבות 1 מ"ל של מרק לתוך שפופרת צנטרפוגה מיקרו. Centrifuge זה-4830-g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה להשיג כדורי. השתמש בערך 500 µL מאגר טה סטרילי re-השעיה עם בגדר. להחזיק ההשעיה וכתוצאה מכך במשך 10 דקות על 98 ± 2 ° C בתוך גוש חימום, מיד תרגעו ב-18 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות lyse התאים ולשחרר את ה-DNA.
    3. Centrifuge ה-DNA גנומי-4830-g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות לקבל השעיה ברורה ולשמור את תגובת שיקוע ב-20 ° C לשימוש נוסף. השתמש מדידה biophotometer עם הקליטה UV באורך-גל של 260 ננומטר (כמו חומצות גרעין קליטת אורך הגל של אור) וגם ב אורך גל של 280 ננומטר (כמו החלבונים סופגי אורך הגל של אור) כדי לקבוע את הריכוז ואת טוהר חילוץ דנ א גנומי ולאחר מכן לזהות את כל זני באמצעות מבחני הביוכימי רגיל35 ואימות אותם על ידי מטוסי אף-16 rRNA ג'ין רצף36. לבסוף, denature ה-DNA גנומי ב 92 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, לצנן את זה במהירות במי קרח לפני היישום החיישן.
    4. נוסף לאשר הנוכחות נ' parahaemolyticus באמצעות PCR למקד את הגן toxR. ביצוע הליך זה thermocycler באמצעות זוג פריימר (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3' ו 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3'). למטב את הגברה PCR נפח התגובה הכולל של 25 µL המורכב במים סטריליים (15.5 µL), מאגר (5 µL), פריימר (1 µL, 10 מיקרומטר), dNTP מיקס (1 µL), תבנית ה-DNA (2 µL) ו- Taq DNA פולימראז (0.2 µL, 10 x).
    5. מערבבים את רכיבי היטב, לארגן הגברה PCR של הרצף היעד ב- thermocycler מתוכנת מחזורים של הגברה. במחקר שלנו, בכל מחזור כללה שלושה שלבים תגובות כלומר., דנטורציה הראשונית (94 ° C, 3 דקות) ואחריו 30 מחזורי דנטורציה (94 ° C, 1 דקות), חישול (63 ° C, כ- 1.5 דקות) והסיומת (72 ° C, כ- 1.5 דקות), ואחריו הסיומת הסופי (72 ° C, 7 דקות).
    6. לקבוע את המוצרים מוגבר, הגדלים שלהם באמצעות אלקטרופורזה על 1.5% agarose ג'ל. ללכוד את התמונות ג'ל עם מערכת ג'ל המיוצר מסחרית-תיעוד.
  3. הכנת דוגמאות פשוט נתעלף
    1. להשיג דגימות טריות.
      הערה: הלב שלנו טריים (Anadara granosa) היו המתקבל בשוק רטוב Serdang, Selangor, והביא במהירות את המעבדה בתיבת קרח קריר יותר לניתוח. לחלק את הדגימות 2 קבוצות, כלומר קבוצת טיפול ללא טיפול, בהנחה כי הלב נבצרו בצורה אחידה מתחילת הקציר עד הצבתם לתוך אחסון הקרה.
    2. מראש לטפל הלב בקבוצה שטופלו על ידי אחסונם ב-20 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות, ואחריו חשיפה לאור UV ב 20 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות לפני מיצוי הדנ א.
      הערה: את טמפרטורת הקיפאון ואת חשיפה UV המשמש מבוקרת קבוצה או לפחות מגביל את צבירת באופן טבעי נ' parahaemolyticus ב הלב. אל תחיל משטר פסטור גבוה יותר של 70 מעלות צלזיוס כמו מטרת התנאי מבוקרת במחקר זה היא לחקות את המצב בפועל של הלב טריים. בינתיים, לנתח דגימות ישירות מן הקבוצה מטופל ללא כל טיפול קדם ברגע שהם מגיעים במעבדה.
    3. תת-תרבות זן של נ' parahaemolyticus בקרת האוויר 17802 ב TSB (3% NaCl). לקבוע את רמת התאים קיימא ב inoculum באמצעות ציפוי של דילולים המתאים של TSB (3% NaCl) ב- CA על מנת לקבל את inoculum של 104 CFU מ ל-1 של נ' parahaemolyticus. לשטוף כל אחרים במים מזוקקים, לקרצף אותה ללא לכלוך לפני באמצעות מלקחיים סטרילי זרימה שכבתית בארון כדי להסיר הרקמות הקליפה.
    4. Homogenize בערך 10 גרם של דגימות רקמה אחרים עם מהמגן ב- 90 מיליליטר TSB סטרילי (3% NaCl) 60 s. הוסף כמות ידועה של נ' parahaemolyticus 9 מ ל ציר מדגם הומוגני על הדגימות מחודדים. השתמש הדגימות unspiked כפקד שלילי. מעריכים את ספירת תאים של נ' parahaemolyticus עלה על הדגימות אחרים על ידי ציפוי 0.1 מ"ל של הדגימות על CA, לאחר מכן, pipetting 1 מ"ל של דגימות לתוך צינור microcentrifuge עבור ה-DNA לטעום החילוץ, כדי לשמש את ביוסנסור ואת וזמינותו PCR.
    5. תמצית ה-DNA גנומי של נ' parahaemolyticus בין דגימות מחודדים, unspiked בעקבות ששונה מבושלים הליך פירוק36. לבסוף, לקבוע את ריכוז הדנ א ואת טוהר באמצעות מדידה photometer ביו עם הקליטה UV באורך-גל של 260 ננומטר (כמו חומצות גרעין קליטת אורך הגל של אור) וגם ב אורך גל של 280 ננומטר (כמו החלבונים סופגי אורך הגל של אור).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

היווצרות AuNPs התגלה באמצעות בשינוי הצבע של התמיסה המימית עם סודיום ציטרט הנוכחי. זה גרם את הצבע לשנות מן צהוב בהיר אדום רובי עמוק. הדור של ה-PLA-AuNPs אושרה של ספקטרום UV-vis (איור 1) שבו הצמיחה של הפסגה תהודה (SPR) משטח פלזמון נמצאה כ 540 nm. היווצרות ואת קיומו של ה-PLA-AuNPs הייתה מצוינת בטווחים גל nm 500-600, בהתאם לגודל החלקיקים37. הדפוסים XRD של AuNPs, פלה-AuNPs מוצגים באיור2. כל פסגות crystallite נצפו ב 2θ של 31.7, 38.2, 44.4, 64.7, ו- 77.7°. הם יוחסו (100) (111) (200) (220), מטוסים לחקר הגבישים (311) מעוקב-FCC (ממורכז פנים מעוקב) זהב (מתכת) nanostructures (JCPDS הקובץ מס-00-004-0783). עוצמות שיא crystallite PLA-AuNPs גדל גם בתור לשיא עקיפה רחבה יותר מרוכז בכל ° 31.7, רומז כי AuNPs הוטבעו בתוך ה-PLA, רומז היווצרות של polyphasic nanostructures זהב38. יתר על כן, כל פסגות עקיפה של AuNP, המוצג על פלה-AuNPs ציין כי AuNPs היה מבנה יציב. הגודל הממוצע של PLA-AuNPs מחושב באמצעות המשוואה של Scherrer (L = kλ/βcosθ), על-ידי קביעת הרוחב של ההשתקפות של בראג (100). FWHM ו d-המרווח (טבלה 2), הגודל crystallite של ה-PLA-AuNPs מחושב כמו 27 ננומטר.

הממדים של ה-PLA-AuNPs ומורפולוגיה שלה נחקרו בהמשך באמצעות TEM. עקומת התפלגות החלקיקים TEM, תמונות של ה-PLA-AuNPs, זה היה נראה כי חלקיקי זהב היו כמעט כדורית במצב (איור 3). גודל חלקיקים היה בטווח של 37 nm, מעט יותר גדול. ממה שהתקבל מן הנוסחה של Scherrer, מציע בעל אופי polycrystalline של חלקיקים מסונתז39. גודל קטן הנובע XRD בניגוד TEM גם נצפתה במחקרים קודמים, סביר כי מבנה החלקיקים polycrystalline בטבע בשל כמות משמעותית וגידולו כי הם קטנים יותר (חלקיקים תת)40 . איור 4 מציג את התמונה FESEM של איך מכינים PLA-AuNPs SPCE. זה מתבטא מן FESEM תמונות EDX ספקטרה PLA/SPCE-AuNPs היו באחוז הגבוה ביותר של משקל של צפיפות הזהב, הגדול ביותר, השטח הגדול ביותר של ננו-חלקיק כיסוי. זה יכול גם לציין, במיוחד, כי איור 4() מראה את התמונה FESEM של SPCE החשופות. התמונה FESEM איור 4(b) מציגה PLA מבוזר היטב-AuNPs. כדי לאשר את ההרכב הכימי מסונתז PLA-AuNPs', EDX הועסק לחקור את ההרכב הכימי של המיוצר כמו פלה-AuNPs, לפי איור 4()ו - 4(b). הקשת EDX אישר כי כמו המיוצר PLA-AuNPs היו המורכבת של זהב (Au) בלבד, מוצג אין גורם אחר מלבד הפסגה המתאים פחמן (C) ו חמצן (O). הנוכחות של הפסגה C היה בגלל האלקטרודה פחמן על אשר המדגם היה טיפה יצוקה.

הקשת EDX גם הראה הנוכחות של O המציין כי החמצן היה הספוחה על האלקטרודה פחמן כי הסרט נחשף לאוויר. זה מאשרת כי חמצן הוא הספוחה על פחמן, אם הם נחשפים לאוויר במשך זמן רב41. למרות שיש מולקולות גז שונים באוויר, חמצן היה ככל הנראה adsorbate הראשי על פחמן החשופים אוויר צינוריות42, כנראה עקב שלה ספיחה מהיר יותר בהשוואה עם מולקולות אחרות43. זה היה מבוסס על מציאת חמצן היה adsorbate הראשי על האלקטרודה פחמן במהלך החשיפה אוויר לילה בהכנת הדוגמא ותגברו את הטוהר כימי של פלה-AuNPs. היחס של שיא אנודי ו- cathodic (אניאבאאניpc) היה כמעט 1, אשר נתן קבוע שיא הפוטנציאל כמו הסריקה קצב מוגבר44. יתר על כן, הפוטנציאליות שיא אנודי, cathodic היו עקביים ב סריקה אחר המחירים45 רומז כי התגובה אלקטרוכימי היה הפיך המבוסס על שיא הפרדה (איור 5). פעיל שטח הפנים של האלקטרודה ששונה מחושב באמצעות המשוואה Randles-Sevick (אניpc = (2.69 × 105) n3/2 עד1/2 Cv1/2. מן המדרון של העלילה אניpc לעומת v1/2 איור 5() ו- (b), פני השטח של האלקטרודות מחושב כמו 0.26 ס מ2 ו- 0.41 ס מ2 כדי להפוך את חשופים SPCE PLA-AuNPs, בהתאמה. תוצאה זו אישר כי השיפור המוענקת על ידי פלה-AuNPs על פני השטח פעיל היה בהשוואה יחסית גבוה SPCE חשופות. התוצאה הנגזרת הייתה דומה לזו של פולימר-מוטבע זהב חלקיקים (מטריצה β-CD-EDAS(N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylene-diamine אנקפסולציה חלקיקי זהב), אשר חשף גבוהה, פעיל שטח משופרת התהליך של העברת-אלקטרונים, ולכן הביא יותר רגישות46.

התגובה אלקטרוכימי ששונה SPCE היה בתהליך של דיפוזיה מבוקרת, המוצגת על-ידי צמצום K3[Fe(CN)6]3 -/4 - השיא הנוכחי, אשר בתורו הסתמכה על הנוכחי של השורש הריבועי קצב סריקה (v 1/2). כדי לזכות בשדה ראייה טוב יותר של המאפיינים שהשתנו אלקטרודה, לימוד ספקטרוסקופיה (EIS) עכבה אלקטרוכימי בוצעה לתאם עם הביצועים של האלקטרודה ששונה הציג מבחינת המידות קורות חיים. המקטע שנגד ראיתי בתדרים הגבוהים עם תהליך המגביל של העברת אלקטרונים ב EIS בקורלציה. ההתנגדות העברת תשלום (Rct) נמדדה ישירות כמו הקוטר של חצי עיגול. תוצאה זו שפגישה עם הערך של Rct של SPCE חשופות, אשר היה 1932 Ω, איפה השינוי של SPCE/ה-PLA-AuNPs ירד עד 1444 Ω (איור 6). הירידה של ערךct R SPCE/ה-PLA-AuNPs ייתכן נבעה לירידה קבוע דיאלקטרי המקומי ו/או עלייה בעובי של האדם המשוכפל חשמלי שכבה47, רומז כי K3[Fe(CN)6]3 - /4 - הפונקציה על-ידי ספיחה-הממשק מתכת/פתרון. תפוקות אלה תאמו אלה נגזר את המידות של קורות חיים (איור 7). הזרמים שיא גדל בהדרגה עם השינוי של SPCEs באמצעות ה-PLA-AuNPs, אשר הראו כי רגישות גבוהה יותר היא ההופכי שלctR התחתון48. לפיכך, עליית הערך של קורות חיים האלקטרודות ששונה ואת הירידה ערכי Rct יתכן עקב החלפה הדרגתית של מולקולות המים (הנפח של מולקולות מים הוא 27.19 Å3) מאת ספיחה של K3 [Fe(CN)6] 3/4 - על פני השטח מתכת, להקטין את היקף התגובה התפרקות49.

טבלה 3 מציין היחסי סטיית התקן (RSD) של הדיר, הפארמצבטית של האלקטרודה ששונה. הקלטה קורות חיים שגרתי של K3[Fe(CN)6]3 -/4 - בוצע עבור שישה סטים רצופים לחקור את הדיר של האלקטרודות ששונה. RSD של SPCE/ה-PLA-AuNPs נגזר כ- 4.26%. האלקטרודה בשינוי PLA-AuNPs נתן יותר RSD לאחר מספר מדידות. יתר על כן, באמצעות ההליך אותו, שישה אלקטרודות ששונה באופן עצמאי זוייפו, אשר נתן RSD ערכים של 4.05% עבור SPCE/ה-PLA-AuNPs, המציינת הפארמצבטית טוב יותר של הזיוף אלקטרודה עבור ה-PLA-AuNPs. המצע שונה בהתאם PLA-AuNPs נשמר ב 37 ° C עבור משך המורחבת. זה גם היה מנוצל עבור הרשומה מחזורים 20 וירידה של 18% איכות האות. על מנת להשיג את המקסימום פלט ביוסנסור, תקופת הנייח, טמפרטורה, יחד עם נבחנו ssDNA ריכוז וקריטריונים של הכלאה. תנאים אלה צריך להיות מוטב, גם הם להשפיע על הזרם שיא של DPV. כדי למטב את הריכוז ssDNA, SPCE/ה-PLA-AuNPs היה pipetted עם ריכוז שונים (0.2 0.4 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 ו 1.4 מיקרומטר) של ssDNA עבור 60 דקות כך נקבע ריכוז אופטימלי של ssDNA. על סמך באיור 8, הפסגה DPV הנוכחית גברה עם ריכוז גבוה של ה-DNA שימשו. המחקר גילה גם כי ריכוז ה-DNA ממוטבת היה 1.2 ssDNA מיקרומטר.

כדי למטב את התקופה הנייח לערב חד גדילי הדנ א ב SPCE/ה-PLA-AuNPs, 25 µL של ssDNA (1.2 מיקרומטר) נבדקו מעל בזמנים שונים (30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 דקות). איור 9, הממצאים מראים עלייה בתקופה הנייח, וכתוצאה מכך גידול מתמשך DPV השיא הנוכחי. לכן, הזמן האופטימלי הנייח של ssDNA נבחר כ 180 דקות. כדי למטב את הטמפרטורה הנייח, היה ה-PLA/SPCE-AuNPs pipetted עם ssDNA (1.2 מיקרומטר) בטמפרטורות שונות (75, 65, 55, 45, 35 ו- 25 ° C) 180 דקות. מצאנו כי כאשר הטמפרטורה של קיבעון הוגדל ל 55 ° צלזיוס, הזרם שיא DPV בתחילה החמיר ואחריו פחת עוקבות (איור 10); לפיכך, 55 ° C נבחר הטמפרטורה הנייח ממוטבת כדי לשמש בניסויים הבאים. ההפרדה של ssDNA כי הוא משותק של משטחי disablement האלקטרודה, הכלאה נגרמה טמפרטורות מוגברת. היו דיווחים אחרים עם תוצאות דומות50. מהר יותר פיצול וניוון של ה-DNA של המשטחים של חלקיקי זהב אירעה בטמפרטורות גבוהות יותר51. מחקר שנערך דיווחו לאחרונה כי הקשר בין זהב תיול מתחמצן ונמחקות במהירות, בפשטות במצב זה אמביינט, לדוגמה כאשר הם נחשפים מים, אוויר, והדליקו53,52,54. השפעת הזמן הכלאה נחקר גם במחקר זה.

מפוברק SPCE/ה-PLA-AuNPs/ssDNA היה טיפה-שחקנים עם פתרון של יעד ה-DNA (0.2 µM)-הכלאה שונה פעמים (5, 10, 15, 20, 25, ו- 30 דקות). התגובה של DPV רוז. ברור, עם עלייה 5-מין בזמן של דגירה (בין 5 ל 10 דקות) (איור 11). ברגע ערך זה הושג, דפוס כלפי מטה 10-30 דקות נצפתה אז הזמן המבוקש של הכלאה נבחר 10 דקות. היעילות של הכלאה גדל עם עלייה בטמפרטורה של 25 º C עד 35 ° צ' (איור 12). הזרם גבוהה נראתה להפחתת לאט בטמפרטורה גבוהה יותר מאשר 35 ° C. הסיבה לכך יוחס דנטורציה מבנה כריך להפחית את אות הזיהוי. לפיכך, הטמפרטורה האופטימלית הכלאה שנבחר היה 35 ° C. תהליך שהשתמשנו באיתור שנ' parahaemolyticus מורכבת AuNPs כדי לשפר את פני השטח הפעיל של האלקטרודה עבודה, פלה לתווך של השינוי משטח, חמצון-חיזור מורכבים, מגה, לצמצם את זה ל LB. התוצאה של תהליך חמצון זה הייתה זיקה טובה יותר בין ssDNA ל- MB55. DPV הנוכחי היה ירד עקב מספר נמוך יותר של מולקולות MB צמוד במהלך הכלאה של ssDNA עם רצף המשלים שלו.

ערכנו עוד יותר חקירות הביצועים של החיישן מפותחת. התוצאות DPV באיור 13 להראות כי זה היה מסוגל להבחין באופן סלקטיבי בדיקה DNA DNA משלימים, DNA שאינם תואמים אחד-בסיס, בסיס שלוש DNA שאינם תואמים, DNA שאינם משלימים בנוכחות MB בתור תווית זיהוי56, 57. הנמוך השיא הנוכחי (0.73 µA) הוצגה על ידי DNA משלימים, אשר עלה בהדרגה על ידי אחד-בסיס DNA שאינם תואמים (0.94 µA), שלוש-בסיסים תואמים דנ א (1.05 µA), DNA שאינם משלימים (3.25 µA), ולאחר בדיקה דנ א (4.79 µA). ה-DNA היעד הנוכחי היה הקטן ביותר של כל הזרמים של רצפים oligonucleotide המאפשר שלנו ביוסנסור להפלות בין רצפי oligonucleotide ברגישות ודיוק. מגה מאוגד חריפה עם ssDNA של קיבוע בדיקה DNA בהפקת לשיא DPV גדול הנוכחי. דנ א SPCE/ה-PLA-AuNPs/הלא-משלימים מופחת בדיקה קיבוע הדנ א הנוכחי על ידי כמעט חצי רק כמות קטנה של MB התאספו על פני השטח של SPCE/ה-PLA-AuNPs/dsDNA. . זה עשוי להיות בשל לא נגיש אינטראקציות בין מגה גואנין בסיסים. דרכי אינטראקציה DNA ו MB תלויות בחום כזה ניסיוני בתנאי pH, טמפרטורה, DNA ריכוז, כוח יונית, וסוג של מאגר58,59. מגה בדרך כלל קישורים dsDNA על-ידי groove ואת מצבי intercalative, וכתוצאה מכך MB הצטברות dsDNA משטח60. חשיפת שלנו לווין לכידת DNA DNA שאינם תואמים בסיס אחד ו 3-בסיס DNA שאינם תואמים באופן עקבי מופחתת DPV שיא זרמי והמשיך ה-DNA משלימים היעד מגמה זו. בטבלה 4 מציג את האחוז של סלקטיביות שיעור עבור שיא MB הנוכחי. ממצא הכולל שלנו היה הכלאה של החיישן DNA בנוי סלקטיבי מאוד באמצעות בדיקה קיבוע DNA על פני השטח SPCE/ה-PLA-AuNPs'.

הרגישות של החיישן DNA מפותחת נחקר עוד יותר עם ריכוזים שונים של היעד משלימים oligonucleotide. איור 14 מתאר דלדול הדרגתי של DPV השיא הנוכחי של מגה-בתים on PLA/SPCE-AuNPs כמו ריכוז ה-DNA משלימים גדל. איור 15 תערוכות מקדם רגרסיה ליניארית 0.96 אשר נוצר בין ביומן שיא MB מופחתת הנוכחי של יומן הרישום של ריכוז מספר של יעד ה-DNA (0-שתיים בערב עד 0.02 נקודות מ מ). גרף של השינויים הנוכחיים שיא (ΔP) הייתה להתוות באמצעות הנוסחה 3σ/m (σ להיות סטיית התקן של פתרון ריק ו- m להיות המדרון של העקומה לינארי)61,62,63. גבול זיהוי החיישן DNA מפוברק מחושב להיות 4-43 pM אשר למעשה היה גדול יותר הקטן שלנו נמדד הדגימה. התוצאה היה מסכים עם העובדה הזאת ΔP 0-שתיים pM ו-2 בצהריים (2.65 × 10-6 A ו סיכון 2.81 × 10-6 A) עם סטיית תקן של 1.19 × 10-7 א' ל- 1.06 × 10-7 א', בהתאמה, חופף.

כדי לחשב את LOQ עבור החיישן DNA מפוברק, השתמשנו הנוסחה 10σ/m בו (הוא סטיית התקן של פתרון ריק ו- m הוא השיפוע של העקומה לינארי) ומצאתי את התוצאה יהיה רווח של 14-8 בערב. דנטורציה חוזרות ונשנות של ה-DNA משלימים בוצעה כדי להעריך את החיישן דנ א מבחינת יכולת ההתחדשות שלה. אנחנו עשינו את זה על ידי המקננת 0.2 µM משלימים DNA מהונדס אלקטרודה במים חמים ב 86 מעלות צלזיוס במשך 8 דקות כדי denature כפול גדילי הדנ א, ולאחריו קירור מהיר באמבט קרח כדי לשמור על denatured חד גדילי הדנ א64

הפעילות הכלאה נשמר ב 91% תגובתה הראשונית לאחר מאמצים 8 של התחדשות (n = 5, RSD = 4.05%). החיישן DNA המבוסס על שיטת סם עבור ה-DNA הנייח בדיקה ל- SPCE/ה-PLA-AuNPs היה יציב מאוד, להשגת תגובה טובה באיתור דנ א משלים לאחר תהליכי דנטורציה חוזרות ונשנות. היציבות שלנו ביוסנסור דנ א לגבי החום היה חקר נוסף. כדי לעשות זאת, אחסנו האלקטרודה PLA-AuNPs/SPCE/ssDNA בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 25 ° C ו- 45 ° C בנרתיק אלומיניום אטום המכיל ג'ל סיליקה. בקצה של 6 חודשים, אנחנו העריכו את ה-DNA משלימים ומהו האחוז של שחזור האות הייצור. איור 16 מראה כי החללית SPCE/ה-PLA-AuNPs/ssDNA היה יציב מאוד עם יותר מ- 80% של אותות הראשונית שלה עדיין ההשבה לאחר אחסון 6 חודשים. התגובה חזק בין ה-PLA-AuNPs ssDNA נמצא יש יציבות לטווח ארוך בטמפרטורה מתחת 45 מעלות צלזיוס.

תשעה מינים שונים של חיידקים (נולד ב- קובו, ל' monocytogenes, ג. jejuni, e. coli O157:H7 נ' alginolyticus, ס typhimurium, ס' דלקת מעיים, דלקת ריאות ק' , V. parahaemolyticus) הוקרנו על ידי זיהוי ה-PCR. המוצרים הגברה PCR לזיהוי תלויי מין של נ' parahaemolyticus מן התרבות חיידקים מוצגים באיור17. הגן toxR של נ' parahaemolyticus היה מנוצל כמו פריימר PCR לזיהוי נ' parahaemolyticus בשל נוכחותה מבודד פתוגניים. מניתוח PCR, נ' parahaemolyticus הראו תוצאות חיוביות בשל ייחודה של מאיץ ה-PCR של הגן toxR לכיוון נ' parahaemolyticus. אין מוצרים PCR של זני חיידקים אחרים אותרו. DPV השיא הנוכחי שהושג לאחר הערכה אשיג הראה זיהוי ברור של נ' parahaemolyticus בהשוואה מיני חיידקים אחרים, כפי שהיא מתוארת באיור 18. האות DPV גדל ככל שמספר בסיסים ירד, עקב כמות גדולה יותר מולקולות MB חייב את הגששים. (פ') parahaemolyticus הצליחו בבירור שיפלו מפני פתוגנים והקאה אחרים אשר חיקה את הסביבה של המדגם מזון.

הלב נבחרו כדוגמאות אמיתי לשם אימות ביוסנסור DNA במחקר זה, מאז הם מרכיבים פופולריים כמה סוגים של אוכל מקומי. ידוע היטב כי הלב raw לעיתים קרובות לבצע פתוגניים V. parahaemolyticus , יכול להעביר חיידקים אלו לבני אדם, במיוחד אם הם נמצאים בקירור כראוי במהלך האחסון קטיפתו65. קבוצת פשוט נתעלף דגימות שטופלו היה מאוחסן ב-20 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה, חשיפה לאור UV ב 20 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות לפני מיצוי DNA במהלך שלב טרום טיפול שלנו. איור 19 מראה כי הניתוח PCR מצאה נ' parahaemolyticus הן טיפול ללא טיפול (מחודדים) הדגימות. זה מוצג בליין 7, 8, 9, 10, 11 ו- 12 מתאם עם המושבה לספור בדיון הקודם. אין V. parahaemolyticus מופיעה הדגימות (unspiked) טיפול ללא טיפול, כפי שמוצג ליין 1, 2, 3, 4, 5 ו- 6 בתוצאות ה-PCR למרות הרוזן המושבה לציין את נוכחותה הדגימות. סיבה אפשרית לכך היא הנוכחות של מזהמים מטבוליטים כגון חלבון ב- DNA שחולץ66.

באיור 20 מסכם את התוצאות זיהוי באמצעות את החיישן DNA מפותחת, שקבעה את הנוכחות של נ' parahaemolyticus בקבוצה שטופלו המורכב דגימות מחודדים unspiked בהצלחה. תוצאות אלו באופן חיובי לתאם עם תוצאות ה-PCR הקודמות. בכל דגימה של ה-PCR שהראו תוצאות חיוביות התגלה בטכניקה מיוצב PLA ביוסנסור אלקטרוכימי, שהינו מבוסס-AuNP, והתכתב האזור שיא DPV ברור עם הלהקות בעוצמה כתוצאה PCR (איור 19 ו באיור 20). תוצאות אלו מצביעות על המוצע מבוסס על ננו-חלקיק אלקטרוכימי החיישן במחקר זה זוהה נ' parahaemolyticus בהצלחה הדגימות אמיתי, והוכיחה כי היא מעולה ל- PCR עם אין השפעה על האותנטיות של התוצאות.

Figure 1
איור 1 : ספיגת של ה-PLA-AuNPs אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : קרני רנטגן הספקטרום של ה-PLA-AuNPs. הותאם באישור הפניה למעורר [30]. זכויות יוצרים (2016) שימור אורח Brasileira דה Química. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : התפלגות בקוטר תדירות TEM ותמונות של ה-PLA-AuNPs-מידה קנה מידה של 50 ננומטר. הודפס מחדש באישור של הפניה למעורר [30]. זכויות יוצרים (2016) שימור אורח Brasileira דה Química. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : EDX ספקטרה ותמונות FESEM חשופות (א) SPCE, (ב) SPCE/ה-PLA-AuNPs. הודפס מחדש באישור של הפניה למעורר [30]. זכויות יוצרים (2016) שימור אורח Brasileira דה Química. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : העלילה של חמצון הנוכחי שיא נגד השורש הריבועי של קצב סריקה voltammograms מחזורית: SPCE חשופות (א) ו- (ב) SPCE/ה-PLA-AuNPs ב mmol L 1.0-1 K3[Fe(CN)6] (pH 7). תעריפי סריקה 300, 250, 200, 150, 100 ו- 50 mV s−1. הותאם באישור הפניה למעורר [30]. זכויות יוצרים (2016) שימור אורח Brasileira דה Química. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 : עכבה ספקטרום של אלקטרודות ששונה ב mmol L 1.0-1 K 3 [Fe(CN)6] (pH 7). משרעת: 5 mV, ואת טווח תדר: 0.1-105 הרץ-Adapted באישור הפניה למעורר [22]. זכויות יוצרים (2016) Elsevier. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7 : שיא אנודי הנוכחי של שינוי אלקטרודות ב mmol L 1.0-1 K 3 [Fe(CN)6] (pH 7) בקצב הסריקה של 0.1 V s -1 באמצעות מדידה וולטמטריה ציקלית אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8 : השפעת ריכוז עבור קיבעון ssDNA על SPCE/ה-PLA-AuNPs ב 0.1 מול L-1 PBS (pH 7) בקצבי סריקה של 0.1 V s -1 לאחר דגירה 30 דקות במיקרומטר 20 MB באמצעות הדופק דיפרנציאלי voltammetry מדידה אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 9
איור 9 : השפעת זמן קיבעון ssDNA על SPCE/ה-PLA-AuNPs ב- 0.1 מול L -1 PBS (pH 7) בקצב הסריקה של 0.1 V s -1 לאחר דגירה 30 דקות במיקרומטר 20 MB באמצעות הדופק דיפרנציאלי voltammetry מדידה אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 10
איור 10 : השפעת טמפרטורה הנייח ssDNA על SPCE/ה-PLA-AuNPs בקצב הסריקה של 0.1 V s -1 ב 0.1 מול L -1 PBS (pH 7) לאחר תקופת דגירה של 30 דקות ב- 20 מיקרומטר של מגה באמצעות הדופק דיפרנציאלי voltammetry מדידה אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 11
איור 11 : ההשפעה של הכלאה זמן על SPCE/ה-PLA-AuNPs/ssDNA ב- 0.1 מול L -1 PBS (pH 7) בקצב הסריקה של 0.1 V s -1 לאחר דגירה 30 דקות במיקרומטר 20 MB באמצעות הדופק דיפרנציאלי voltammetry מדידה אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 12
איור 12 : השפעת טמפרטורה הכלאה על SPCE/ה-PLA-AuNPs/ssDNA ב- 0.1 מול L -1 PBS (pH 7) בקצב הסריקה של 0.1 V s -1 לאחר דגירה 30 דקות במיקרומטר 20 MB באמצעות הדופק דיפרנציאלי voltammetry מדידה. הודפס מחדש באישור של הפניה למעורר [22]. זכויות יוצרים (2016) Elsevier. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 13
איור 13 : היסטוגרמה של הפסגה הפחתת MB הנוכחי באמצעות סוגים שונים של ה-DNA ב- 0.1 מול L –1 PBS (pH 7) בקצב הסריקה של 0.1 V s -1 לאחר דגירה 30 דקות ב- 20 מיקרומטר MB. שיבוץ ממחישה את הדופק דיפרנציאלי voltammograms באותם התנאים. הודפס מחדש באישור של הפניה למעורר [22]. זכויות יוצרים (2016) Elsevier. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 14
איור 14 : היסטוגרמה של הפסגה הפחתת MB הנוכחי באמצעות ריכוז דנ א שונה ב- 0.1 מול L –1 PBS (pH 7) בקצב הסריקה של 0.1 V s -1 לאחר דגירה 30 דקות במיקרומטר 20 MB באמצעות הדופק דיפרנציאלי voltammetry מדידה. הודפס מחדש באישור של הפניה למעורר [22]. זכויות יוצרים (2016) Elsevier. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 15
איור 15 : מגרש ליניארי של ההפחתה לשיא הנוכחי של MB נגד יומן הרישום של ריכוז דנ א שונה ב- 0.1 מול L -1 PBS (pH 7) בקצב הסריקה של 0.1 V s -1 לאחר דגירה 30 דקות במיקרומטר 20 MB באמצעות הדופק דיפרנציאלי voltammetry מדידה. הודפס מחדש באישור של הפניה למעורר [22]. זכויות יוצרים (2016) Elsevier. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 16
איור 16 : השפעת טמפרטורות שונות הכלאה על SPCE/ה-PLA-AuNPs/ssDNA-6 חודשים של אחסון מרווח (n = 3). נעשו מדידות ב- 0.1 מול L-1 PBS (pH 7) בקצב הסריקה של 0.1 V s-1 לאחר דגירה 30 דקות במיקרומטר 20 MB באמצעות הדופק דיפרנציאלי voltammetry מדידה. הודפס מחדש באישור של הפניה למעורר [22]. זכויות יוצרים (2016) Elsevier. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 17
איור 17 : Agarose-ג'ל-אלקטרופורזה-PCR-הגברה באמצעות מטוסי אף-16 rRNA ג'ין רצף מוצרים של חיידקים שנבחרו מן התרבות חיידקים. M: ליין 1kb DNA הסולם, ליין C−: שלילי שליטה (מים מזוקקים סטריליים), סי + ליין: בקרה חיובית (DNA מופק e. coli משמש כתבנית), EC ליין: e. coli O157:H7, ליין CJ: ג jejuni , ליין לפנה ס: קובו נולד ב-, KP ליין: ריאות ק', ליין ST: ס typhimurium, ליין LM: monocytogenes ל', ליין SE: ס דלקת מעיים, ליין סמנכ ל: V. parahaemolyticus , ליין VV: נ' alginolyticus אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 18
איור 18 : היסטוגרמה של הפסגה הפחתת MB הנוכחי עבור חקר אשיג החיישן דנ א נגד פתוגנים שונים והקאה ב- 0.1 מול L -1 PBS (pH 7) בקצב הסריקה של 0.1 V s -1 לאחר דגירה 30 דקות במיקרומטר 20 MB באמצעות הדופק דיפרנציאלי voltammetry מדידה. הודפס מחדש באישור של הפניה למעורר [23]. זכויות יוצרים (2017) ספרינגר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 19
איור 19 : Agarose ג'ל אלקטרופורזה-PCR מוצרי הגברה של (פ') parahaemolyticus מדגימות פשוט נתעלף טריים. M: ליין 2ul של סולם הדנ א bp 100, ליין 1-3: לא מטופל דגימות unspiked, ליין 4-6: מטופלים דגימות unspiked, ליין 7-9: מטופל דגימות מחודדים, ליין 10-12: מטופלים דגימות מחודדים, סי + ליין: בקרה חיובית (נ' parahaemolyticus בקרת האוויר 17802), ליין: C - שליליות שליטה (מים מזוקקים סטריליים). הודפס מחדש באישור של הפניה למעורר [23]. זכויות יוצרים (2017) ספרינגר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 20
באיור 20 : היסטוגרמה של הפסגה הפחתת MB הנוכחי לצורך זיהוי של (פ') parahaemolyticus בדגימות טריים אחרים באמצעות את החיישן DNA ב- 0.1 מול L-1 PBS (pH 7) בקצב הסריקה של 0.1 V s-1 לאחר דגירה 30 דקות ב- 20 מיקרומטר MB באמצעות הדופק דיפרנציאלי voltammetry מדידה. הודפס מחדש באישור של הפניה למעורר [23]. זכויות יוצרים (2017) ספרינגר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

קומפוזיציה אלקטרודה זמן הדגירה (h) טמפרטורה (° C) צמיחה מדיה
קמפילובקטר jejuni 48 42 BA / BB
ליסטריה 48 30 TSA / TSB
סלמונלה typhimurium 24 37 TSA / TSB
סלמונלה enteritidis 24 37 TSA / TSB
דלקת ריאות קלבסיאלה 24 37 EMBA / TSB
Escherichia coli O157:H7 24 37 אמא / TSB
Bacillus קובו 24 37 MYPA / TSB
ויבריו alginolyticus 24 37 TSA + 3% NaCl/TSB+3% NaCl
ויבריו parahaemolyticus 24 37 CA/TSA+3% NaCl/TSB+3% NaCl

טבלה 1: תרבות בתנאים של חיידקים שנבחר.

מדגם Pos. [° קודמת.] FWHM [° קודמת.] d-המרווח [Å] גודל crystallite (אן אם)
PLA-AuNPs 31.682 0.3149 2.8243 27

בטבלה 2: גודל וגידולו ה-PLA-AuNP. Adapted באישור הפניה למעורר [30]. זכויות יוצרים (2016) שימור אורח Brasileira דה Química.

אלקטרודה ששונה % RSD (n = 6) הפחתת אות (%) (n = 20)
הדיר הפארמצבטית
SPCE/ה-PLA-AuNPs 4.26 4.05 18

טבלה 3: מאפיינים של אלקטרודות ששונה הנוגעים AuNPs של ה-PLA-AuNPs שינוי ב- K 3 [Fe(CN)6] עם 1.0 mmol L -1 ריכוז בקצב הסריקה של 0.1 V s -1 . הותאם באישור הפניה למעורר [30]. זכויות יוצרים (2016) שימור אורח Brasileira דה Química.

קומפוזיציה אלקטרודה אניהרשות הפלסטינית (µA) Eהרשות הפלסטינית סלקטיביות קצב (%)
(n = 3) (V)
SPCE/ה-PLA-AuNP/בדיקת דנ א 4.79 ± 0.10 -0.46 -
SPCE/ה-PLA-AuNP/הלא-משלימים את הדנ א 3.25 ± 0.12 -0.44 67.85
DNA שאינם תואמים SPCE/ה-PLA-AuNP/3-בסיסים 1.05 ± 0.11 -0.45 21.92
DNA שאינם תואמים SPCE/ה-PLA-AuNP/1-הבסיס 0.94 ± 0.12 -0.46 19.62
דנ א SPCE/ה-PLA-AuNP/משלימים 0.73 ± 0.10 -0.45 15.24

בטבלה 4: DPV סלקטיביות של MB השיא הנוכחי ב- 0.1 מול L -1 PBS (pH 7) בקצב הסריקה של 0.1 V s -1 לאחר דגירה 30 דקות ב- 20 מיקרומטר MB

ההרכב של האלקטרודות שיטת זיהוי טווח ליניארי (ז) זיהוי מגבלת (ז) הפניות
AuNPs תלת-ממד DPV 1.5 × 10-6 - 7.0 × 10-9 2.0 × 10-10 69
(+) AuNPs DPV 1.0 × 10-9 - 1.5 × 10-12 2.6 × 10-12 70
AuNPs/GR DPV 1.3 × 10-9 - 2.5 × 10-11 8.3 × 10-12 71
AuNPs-ADH-השב DPV 5.0 × 10-8 - 3.0 × 10-13  3.0 × 10-13 72
AuNPs-mpts DPV 5.0 × 10-9 - 1.0 × 10-11  5.0 × 10-11 73
AuNPs – קדימה DPV 1.0 × 10-9 - 1.0 × 10-14 3.5 × 10-15 74
כי / AuNPs DPV 1.0 × 10-9 - 1.0 × 10-12 7.0 × 10-13 75
PLA-AuNPs DPV 2.0 × 10-8 - 2.0 × 10-13 5.3 × 10-12 עבודה זו

טבלה 5: השוואה של חלק nanosensors DNA אלקטרוכימי שפותחו לאחרונה. הודפס מחדש באישור של הפניה למעורר [22]. Elsevier זכויות יוצרים (2016).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השלבים הקריטיים במסגרת להתפתחותן של סוג זה של ביוסנסור אלקטרוכימי הם מבחר אלמנטים המתאימים זיהוי ביולוגי המתמר (חומצת גרעין או DNA כאן); הגישה כימיים עבור בניית השכבה חישה של המתמר; התמרה חושית חומר; אופטימיזציה של ה-DNA הנייח, הכלאה; ואימות החיישן מפותחת באמצעות דוגמאות אמיתיות.

ליבה להתפתחות מוצלחת של רגיש, סלקטיבי אלקטרוכימי DNA ביוסנסור, אופטימיזציה של התנאי הנייח של הכלאה. בעבודה זו, השתמשנו MB בתור מורכבים חמצון-חיזור. עקרונות שונים של אינטראקציות MB-DNA: (i) על ידי האינטראקציה אלקטרוסטטית של החיוב cationic MB עם פוספט את עמוד השדרה המטען anionic של ssDNA ו- dsDNA; (ii) על ידי העיבור MB דרך הכניסה המוצלחת של MB בין לסירוגין G-C בסיסי זוגות ב- dsDNA; (iii) על-ידי קשר קוולנטי לסוף ssDNA המטרה, אשר מייצרת תווית נמוך צפיפות (אחד או שניים MB מולקולות לכל צירוף ד. נ); ו- (ד) על ידי MB אינטראקציות עם גואנין לא מאוגד לבסיס ssDNA. אנחנו מיושם העיקרון הרביעי, אשר מזהה במדויק נ' parahaemolyticus מן הצלב תגובתיות של חיידקים, הלב טריים. אחרי oxidization עניין מיוחד, היה יש זיקה חזקה בין מגה ssDNA. הכלאה של ssDNA עם רצף משלים שלו מחליף את המולקולות MB בונדד, ובכך מפחית את האות.

הסדרה של תוצאות ניסויית שהובאו לעיל מתמקדת בפיתוח של שיטה מהירה של גילוי נ' parahaemolyticus סלקטיביות גבוהה ורגישות שימוש בעקרונות ה-DNA הכלאה. הצעד הראשון הוא סינתזה אפיון polylactic מיוצב חומצה חלקיקי זהב (PLA-AuNPs) עבור שינוי של האלקטרודה (המספרים 1-6 ו לטבלה 2). איכות חלקיקי זהב הוערך באמצעות ספקטרוסקופית הגלוי אולטרה סגול (UV-Vis), קרני רנטגן (XRD), מיקרוסקופ אלקטרונים סורק פליטת שדה (FESEM), הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM), Voltammetry מחזורית (CV) ו ניתוח אימפדנס. החלק השני של ההתפתחות מעורב של אפיון אלקטרוכימי של האלקטרודה ששונתה (איורים 7-12 ו לטבלה 3-4) אשר קבע שיפור מוצלחת של האלקטרודה שהשתנה ביחס האלקטרודה חשופים ב תנאי גילוי האירוע הכלאה.

הצעד השלישי של פיתוח ביוסנסור DNA מבוסס התבססה על אופטימיזציה של התנאים ניסיוני של האירוע הכלאה והיישום של החיישן מפותחת כדי הגילוי של המחלה בפועל (דמויות 13-20). האירוע הכלאה שקבעה את ההצלחה של הגילוי של המחלה הוערכה באמצעות הדופק דיפרנציאלי voltammetry (DPV). קיום חיובי הפתוגן יישוב הייתה מצוינת דרך הפחתת של הזרם. הרגישות של החיישן מפותחת הוערך באמצעות הקמת מגרש כיול והוא החישוב של לוד (איור 15). החיישן מפוברק היה מסוגל להבחין במיוחד נ' parahaemolyticus מפני פתוגנים אחרים בהתבסס על רמות שונות של הפחתת הנוכחי (דמויות 17 ו-18). הערכת היתכנות החיישן שפותחו לצורך זיהוי של נ' parahaemolyticus אוכל אמיתי מדגם מוצג דמויות 19 ו-20 ומצוין קיום המחלה יישוב חיובי על ידי הפחתת הנוכחי . פיתוח מוצלח של ביולוגיים מבוססי DNA תלויה מאוד בחירה בדיקה דנ א, שיפור של האלקטרודה ששונתה וכן אופטימיזציה של התנאים ניסיוני. החללית ה-DNA כאן כבר ממאמרו של העבודה הקודמת של נאקאנו67. שיפור של האלקטרודות ששונה בוצעה באמצעות חלקיקי זהב התייצב עם חומצה polylactic כדי לאפשר את התקינה של nanosize. הפונקציה חלקיקי זהב כמו אלקטרו גשמי קטליטי68 ולפעול כדי להגביר את קצב ההעברה של האלקטרון ולספק גם משטח שעליו ניתן לעגן את החללית ה-DNA. הפרמטרים ניסיוני אופטימציה מבחינת טמפרטורה וזמן הדגירה אשר הוא קריטי עבור ה-DNA לטופס דופלקס. הטמפרטורה הכלאה משפיע מההפרדה בין ספיחה לא ספציפית את זה מגביר את מידת הבררנות של החיישן. זמן הדגירה של הכלאה מגדיל את הסיכויים של היווצרות דופלקס. חייב להיות מוטבת ההליך הנייח על מנת לוודא כי המכשיר דנ א יהיה בכיוון מתאים לשם יצירת דופלקס לטופס.

משווה בין טבלה 5 מדגם של פותח לאחרונה אלקטרוכימי DNA ביולוגיים69,70,71,72,73,74,75 ,. Biosensing מבוסס DNA היא שיטה מבטיחה להחלפת טכניקות מולקולריות מבוסס אמנם ישנן כמה מגבלות שמחייבות לפני השיטה יכולה להיות מספיק נייד לשימוש באתר. המגבלה העיקרית היא דוגמת עיבוד ה-DNA החילוץ כמו הטוהר, כמות ה-DNA שחולצו באתר אינו עשוי להיות טוב כמו זה מופק בשיטה מבוססת-מעבדה סטנדרטיים. עם זאת, חלופה מבטיח אם ה-PCR וג'ל אלקטרופורזה יכול להיות מוחלף עם דוגמת מערכת pretreatment כגון microfluidic.

ביולוגיים מבוססי דנ א יכולות להיות שימושיות עבור יישומים רבים כולל אבחון רפואי, ניטור סביבתי וניטור מזון. טכניקה זו יאפשר ניטור מקוון של תהליכי בקרת איכות, כמו גם בשלב של טיפול ניטור של חולים. הניידות של חיישן כל המערכת תאפשר את ביזור של תהליכי האבחון שבו הצרכן יכול להשתמש במערכת זיהוי בנוחות של הבית שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים רוצה להכיר את התמיכה של מלזיה Universiti Putra.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Merck 100056
Chloroform Merck 102445
Diaminoethane tetraacetic acid Promega E5134
Dibasic sodium phosphate  Sigma-Aldrich S9763
Disodium hydrogen phosphate Sigma-Aldrich 255793
Ethanol  Sigma-Aldrich 16368
Gold (III) chloride trihydrate Sigma-Aldrich 520918
Hydrochloric acid Merck 100317
Methylene blue Sigma-Aldrich M44907
Monobasic sodium phosphate, monohydrate Sigma-Aldrich S3522
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich P5119
Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D NatureWorks 4042D
Potassium chloride R&M Chemicals 59435
Potassium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich P9791
Potassium hexacyanoferrate III R&M Chemicals 208019
Sodium acetate anhydrous salt Sigma-Aldrich S2889
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888
Trisodium citrate Sigma-Aldrich S1804
Tris(hydroxymethyl) aminomethane Fisher Scientific T395-100
Tris-Base Fisher Scientific BP152-500
2X PCR Master Mix with Dual-Dye Norgen Biotek 28240
Agarose gel Merck 101236
Bolton Agar Merck 100079
Bolton Broth Merck 100079
CHROMagar Vibrio CHROMagar VB910
dNTPs Promega U1511
Nuclease-free water Thermo Scientific R0581
Eosin methylene blue agar  Merck 101347
GelRed Biotium 41001
Glycerol Merck 104092
Go Taq Buffer Promega M7911
Loading dye 100 bp DNA ladder Promega G2101
Loading dye 1kb DNA ladder Promega G5711
Magnesium chloride Promega 91176
Mannitol egg yolk polymyxin agar Merck 105267
McConkey Agar Merck 105465
Nutrient Broth Merck 105443
Taq polymerase Merck 71003
Trypticase Soy Broth Merck 105459
Trypticase Soy Agar Merck 105458

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gould, L. H., Rosenblum, I., Nicholas, D., Phan, Q., Jones, T. F. Contributing factors in restaurant-associated foodborne disease outbreaks, FoodNet sites, 2006 and 2007. Journal of Food Protection. 76, 1824-1828 (2013).
  2. Arvanitoyannis, I. S., Kotsanopoulos, K. V., Papadopoulou, A. Rapid detection of chemical hazards (toxins, dioxins, and PCBs) in seafood. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 54, 1473-1528 (2014).
  3. Robertson, L. J., Sprong, H., Ortega, Y. R., van der Giessen, J. W. B., Fayer, R. Impacts of globalisation on foodborne parasites. Trends in Parasitology. 30, 37-52 (2014).
  4. Sandilands, E. A., Bateman, D. N. The epidemiology of poisoning. Medicine. 44, 76-79 (2016).
  5. Boschi-Pinto, C., Velebit, L., Shibuya, K. Estimating child mortality due to diarrhoea in developing countries. Bulletin of the World Health Organization. 86, 710-717 (2008).
  6. Farthing, M. J. G. Diarrhoea: A Significant Worldwide Problem. International Journal of Antimicrobial Agents. 14, 65-69 (2000).
  7. World Health Organization. WHO estimates of the global burden of foodborne diseases: foodborne disease burden epidemiology reference group 2007-2015. , 1-255 (2015).
  8. Yeung, M., Boor, K. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathogens and Disease. 1, 74-88 (2004).
  9. Sakazaki, R. Foodborne Diseases. Cliver, D. O., Riemann, H. P. , Academic Press. 127-136 (2002).
  10. Grochowsky, J., Odom, S. R., Akuthota, P., Stead, W. Primary Septicemia and Abdominal Compartment Syndrome From Vibrio parahaemolyticus Infection in a 40-Year-Old Patient With No Known Immunocompromise. Infectious Disease in Clinical Practice. 22, (2013).
  11. Raghunath, P. Roles of thermostable direct hemolysin (TDH) and TDH-related hemolysin (TRH) in Vibrio parahaemolyticus. Frontiers in Microbiology. 5, 805 (2014).
  12. Kalburge, S. S., Whitaker, W. B., Boyd, E. F. High-Salt Preadaptation of Vibrio parahaemolyticus Enhances Survival in Response to Lethal Environmental Stresses. Journal of Food Protection. 77, 246-253 (2014).
  13. Esteves, K., Hervio-Heath, D., Mosser, T., Rodier, C., Tournoud, M. G., Jumas-Bilak, E., Colwell, R. R., Monfort, P. Rapid proliferation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, and Vibrio cholerae during freshwater flash floods in French Mediterranean Coastal lagoons. Applied and Environmental Microbiology. 81, 7600-7609 (2015).
  14. Khandeparker, L., Anil, A. C., Naik, S. D., Gaonkar, C. C. Daily variations in pathogenic bacterial populations in a monsoon influenced tropical environment. Marine Pollution Bulletin. 96, 337-343 (2015).
  15. Caburlotto, G., Suffredini, E., Toson, M., Fasolato, L., Antonetti, P., Zambon, M., Manfrin, A. Occurrence and molecular characterization of Vibrio parahaemolyticus in crustaceans commercialised in Venice area, Italy. International Journal of Food Microbiology. 220, 39-49 (2016).
  16. Wong, H. C., Chen, M. C., Liu, S. H., Liu, D. P. Incidence of highly genetically diversified Vibrio parahaemolyticus in seafood imported from Asian countries. International Journal of Food Microbiology. 52, 181-188 (1999).
  17. Rosec, J. P., Causse, V., Cruz, B., Rauzier, J., Carnat, L. The international standard ISO/TS 21872-1 to study the occurence of total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae in seafood: ITS improvement by use of a chromogenic medium and PCR. International Journal of Food Microbiology. 157, 189-194 (2012).
  18. Maniyankode, R. A., Kingston, J. J., Murali, H. S., Batra, H. V. Specific identification of vibrio parahaemolyticus employing monoclonal antibody based immunoassay. International Journal of Pharmacy and Biological Sciences. 4 (2), B156-B164 (2013).
  19. Suffredini, E., Lopez-Joven, C., Maddalena, L., Croci, L., Roque, A. Pulsed-field gel electrophoresis and PCR characterization of environmental Vibrio parahaemolyticus strains of different origins. Applied and Environmental Microbiology. 77, 6301-6304 (2011).
  20. Bhattacharyya, N., Hou, A. A pentaplex PCR assay for detection and characterization of Vibrio vulnificus and Vibrio parahaemolyticus isolates. Letters in Applied Microbiology. 57, 233-240 (2013).
  21. da Silva, E. T. S. G., et al. Electrochemical Biosensors in Point-of-Care Devices: Recent Advances and Future Trends. ChemElectroChem. 4 (4), 778-794 (2017).
  22. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hushiarian, R. Sensitive detection of multiple pathogens using a single DNA probe. Biosensors and Bioelectronics. 86, 398-405 (2016).
  23. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hushiarian, R. A simple, portable, electrochemical biosensor to screen shellfish for Vibrio parahaemolyticus. AMB Express. 7 (1), 41 (2017).
  24. Zhang, J., Li, Z., Zhang, H., Wang, J., Liu, Y., Chen, G. Rapid detection of several foodborne pathogens by F0F1-ATPase molecular motor biosensor. Journal of Microbiological Methods. 93, 37-41 (2013).
  25. Barsan, M. M., Ghica, E. M., Brett, C. M. A. Portable biosensing of food toxicants and environmental pollutants. Nikolelis, D. P., Varzakas , T., Erdem, A., Nikoleli, G. P. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Boca Raton. 33-69 (2014).
  26. Kwun, J., Yun, S., Park, L., Lee, J. H. Development of 1,1'-oxalyldiimidazole chemiluminescent biosensor using the combination of graphene oxide and hairpin aptamer and its application. Talanta. 119, 262-267 (2014).
  27. Thavanathan, J., Huang, N. M., Thong, K. L. Colorimetric biosensing of targeted gene sequence using dual nanoparticle platforms. International Journal of Nanomedicine. 10, 2711-2722 (2015).
  28. Hushiarian, R., Yusof, N. A., Abdullah, A. H., Ahmad, S. A. A., Dutse, S. W. Facilitating the indirect detection of genomic DNA in an electrochemical DNA biosensor using magnetic nanoparticles and DNA ligase. Analytical Chemistry Research. 6, 17-25 (2015).
  29. Dutse, S. W., Yusof, N. A., Ahmad, H., Hussein, M. Z., Zainal, Z., Hushiarian, R., Hajian, R. An Electrochemical Biosensor for the Determination of Ganoderma boninense Pathogen Based on a Novel Modified Gold Nanocomposite Film Electrode. Analytical Letters. 47 (5), 819-832 (2014).
  30. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hajian, R. Characterization of Polylactide-Stabilized Gold Nanoparticles and Its Application in the Fabrication of Electrochemical DNA Biosensors. Journal of the Brazilian Chemical Society. 27 (9), 1679-1686 (2016).
  31. Vongkamjan, K., Wang, S., Moreno Switt, A. I. Rapid detection of foodborne bacterial pathogens in seafood. Handbook of Seafood: Quality and Safety Maintenance and Applications. , 247-257 (2016).
  32. Wang, F., Jiang, L., Yang, Q., Han, F., Chen, S., Pu, S., Vance, A., Ge, B. Prevalence and antimicrobial susceptibility of major foodborne pathogens in imported seafood. Journal of Food Protection. 74 (9), 1451-1461 (2011).
  33. Szermer-Olearnik, B., Sochocka, M., Zwolinska, K., Ciekot, J., Czarny, A., Szydzik, J., Kowalski, K., Boratynski, J. Comparison of microbiological and physicochemical methods for enumeration of microorganisms. Postepy Higieny i Medycyny Doswiadczalnej. 68, 1392-1396 (2014).
  34. Ivanov, I. G., Bachvarov, D. R. Determination of plasmid copy number by the "boiling" method. Analytical Biochemistry. 165 (1), 137-141 (1987).
  35. Gopireddy, V. R. Biochemical tests for the identification of bacteria. International Journal of Pharmacy and Technology. 3 (4), 1536-1555 (2011).
  36. Böhme, K., Fernández-No, I. C., Pazos, M., Gallardo, J. M., Barros-Velázquez, J., Cañas, B., Calo-Mata, P. Identification and classification of seafood-borne pathogenic and spoilage bacteria: 16S rRNA sequencing versus MALDI-TOF MS fingerprinting. Electrophoresis. 34 (6), 877-887 (2013).
  37. Seoudi, R., Fouda, A. A., Elmenshawy, D. A. Synthesis, characterization and vibrational spectroscopic studies of different particle size of gold nanoparticle capped with polyvinylpyrrolidone. Physica B: Condensed Matter. 405, 906-911 (2010).
  38. Mishra, A., Harper, S., Yun, S. I. Interaction of biosynthesized gold nanoparticles with genomic DNA isolated from E. coli and S. aureus. Nanotechnology (IEEE-NANO). , 1745-1750 (2011).
  39. Sugimoto, T. Formation of modoispersed nano- and micro-particles controlled in size, shape, and internal structure. Chemical Engineering and Technology. 26, 313-321 (2003).
  40. Rath, C., Sahu, K. K., Kulkarni, S. D., Anand, S., Date, S. K., Das, R. P., Mishra, N. C. Microstructure-dependent coercivity in monodispersed hematite particles. Applied Physics Letters. 75, 4171-4173 (1999).
  41. Abbas, M., Wu, Z. Y., Zhong, J., Ibrahim, K., Fiori, A., Orlanducci, S., Sessa, V., Terranova, M. L., Davoli, I. X-ray absorption and photoelectron spectroscopy studies on graphite and single-walled carbon nanotubes: Oxygen effect. Applied Physics Letters. 87 (5), 051923 (2005).
  42. Lim, S. C., Choi, Y. C., Jeong, H. J., Shin, Y. M., An, K. H., Bae, D. J., Lee, Y. H., Lee, N. S., Kim, J. M. Effect of gas exposure on field emission properties of carbon nanotubes arrays. Advanced Materials. 13, 1563-1567 (2001).
  43. Kim, B. H., Kim, B. R., Seo, Y. G. A study on adsorption equilibrium for oxygen and nitrogen into carbon nanotubes. Adsorption. 11, 207-212 (2005).
  44. Bard, A. J., Faulkner, L. R. Electrochemical methods: Fundamentals and applications. , John Wiley & Sons Inc. (2000).
  45. Tan, Q., Wang, L., Ma, L., Yu, H., Ding, J., Liu, Q., Xiao, A., Ren, G. Study on anion electrochemical recognition based on a novel ferrocenyl compound with multiple binding sites. Journal of Physical Chemistry B. 112, 11171-11176 (2008).
  46. Manivannan, S., Ramaraj, R. Polymer-embedded gold and gold/silver nanoparticle-modified electrodes and their applications in catalysis and sensors. Pure and Applied Chemistry. 83, 2041-2053 (2011).
  47. Benali, O., Larabi, L., Traisnel, M., Gengembre, L., Hareka, Y. Electrochemical, theoretical and XPS studies of 2-mercapto-1-methylimidazole adsorption on carbon steel in 1 M HClO4. Applied Surface Science. 253, 6130-6139 (2007).
  48. Shi, Y., Wen, L., Li, F., Cheng, H. M. Nanosized Li4Ti5O12/graphene hybrid materials with low polarization for high rate lithium ion batteries. Journal of Power Sources. 196, 8610-8617 (2011).
  49. Bentiss, F., Traisnel, M., Lagrenee, M. The substituted 1,3,4-oxadiazoles: a new class of corrosion inhibitors of mild steel in acidic media. Corrosion Science. 42, 127-146 (2000).
  50. Wang, M., Gong, W., Meng, Q., Zhang, Y. Electrochemical DNA impedance biosensor for the detection of DNA hybridization with polymeric film, single walled carbon nanotubes modified glassy carbon electrode. Russian Journal of Electrochemistry. 47, 1368-1373 (2011).
  51. Herdt, A. R., Drawz, S. M., Kang, Y., Taton, T. A. DNA dissociation and degradation at gold nanoparticle surfaces. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 51 (2), 130-139 (2006).
  52. Bhatt, N., Huang, P. J. J., Dave, N., Liu, J. Dissociation and degradation of thiol-modified DNA on gold nanoparticles in aqueous and organic solvents. Langmuir. 27, 6132-6137 (2011).
  53. Liu, X., Jang, C. H., Zheng, F., Jürgensen, A., Denlinger, J. D., Dickson, K. A., Raines, R. T., Abbott, N. L., Himpsel, F. J. Characterization of protein immobilisation at silver surfaces by near edge X-ray absorption fine structure spectroscopy. Langmuir. 22, 7719-7725 (2006).
  54. Willey, T. M., Andrew, L., Vance, T., Buuren, V., Bostedt, C., Terminello, L. J., Fadley, C. S. Rapid degradation of alkanethiol-based self-assembled monolayers on gold in ambient laboratory conditions. Surface Science. 576 (1), 188-196 (2005).
  55. Farjami, E., Clima, L., Gothelf, K., Ferapontova, E. E. DNA interactions with a Methylene Blue redox indicator depend on the DNA length and are sequence specific. Analyst. 135, 1443-1448 (2010).
  56. Lin, X., Ni, Y., Kokot, S. An electrochemical DNA-sensor developed with the use of methylene blue as a redox indicator for the detection of DNA damage induced by endocrine-disrupting compounds. Analytica Chimica Acta. 867, 29-37 (2015).
  57. Zhang, F. T., Nie, J., Zhang, D. W., Chen, J. T., Zhou, Y. L., Zhang, X. X. Methylene Blue as a G-Quadruplex Binding Probe for Label-Free Homogeneous Electrochemical Biosensing. Analytical Chemistry. 86, 9489-9495 (2014).
  58. Ning, L., Li, X., Yang, D., Miao, P., Ye, Z., Li, G. Measurement of Intracellular pH Changes Based on DNA-Templated Capsid Protein Nanotubes. Analytical Chemistry. 86, 8042-8047 (2014).
  59. Sani, N. D. M., Heng, L. Y., Surif, S., Lazim, A. M., et al. AIP Conference Proceedings. Murad, A., et al. 1571, 636-640 (2013).
  60. Xu, P., Wang, J., Xu, Y., Chu, H., Shen, H., Zhang, D., Zhao, M., Liu, J., Li, G. Binding modes and interaction mechanism between different base pairs and methylene blue trihydrate: a quantum mechanics study. Advances in Experimental Medicine and Biology. 827, 187-203 (2015).
  61. Guo, Y., Chen, J., Chen, G. A label-free electrochemical biosensor for detection of HIV related gene based on interaction between DNA and protein. Sensors & Actuators, B: Chemical. 184, 113-117 (2013).
  62. Huang, K. J., Liu, Y. J., Wang, H. B., Wang, Y. Y., Liu, Y. M. Sub-femtomolar DNA detection based on layered molybdenum disulfide/multi-walled carbon nanotube composites, au nanoparticle and enzyme multiple signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 55, 195-202 (2014).
  63. Kong, R. M., Song, Z. L., Meng, H. M., Zhang, X. B., Shen, G. L., Yu, R. Q. A label-free electrochemical biosensor for highly sensitive and selective detection of DNA via a dual-amplified strategy. Biosensors and Bioelectronics. 54, 442-447 (2014).
  64. Rashid, J. I. A., Yusof, N. A., Abdullah, J., Hashim, U., Hajian, R. Novel Disposable Biosensor Based on SiNWs/AuNPs Modified-Screen Printed Electrode for Dengue Virus DNA Oligomer Detection. IEEE Sensors Journal. 15, 4420-4421 (2015).
  65. Yingkajorn, M., Sermwitayawong, N., Palittapongarnpimp, P., Nishibuchi, M., Robins, W. P., Mekalanos, J. J., Vuddhakul, V. Vibrio parahaemolyticus and its specific bacteriophages as an indicator in cockles (Anadara granosa) for the risk of V. parahaemolyticus infection in Southern Thailand. Microbial Ecology. 67, 849-856 (2014).
  66. Ahmad Ganaie, H., Ali, M. N. Short term protocol for the isolation and purification of DNA for molecular analysis. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research. 24, 266-270 (2014).
  67. Nakano, K., Kimura, T., Kitamura, Y., Ihara, T., Ishimatsu, R., Imato, T. Potentiometric DNA sensing platform using redox-active DNA probe pair for sandwich-type dual hybridization at indicator electrode surface. Journal of Electroanalytical Chemistry. 720-721, 71-75 (2014).
  68. Yang, J., Jim Yang, L., Heng-Phon, T., Gan-Moog, C. Inhibition of DNA hybridization by small metal nanoparticles. Biophysical Chemistry. 120, 87-95 (2006).
  69. Niu, L. M., Liu, F., Wang, W., Lian, K. Q., Ma, L., Shi, H. M., Kang, W. J. Electrochemical Behavior of Paraquat on a Highly Ordered Biosensor Based on an Unmodified DNA-3D Gold Nanoparticle Composite and Its Application. Electrochimica Acta. 153, 190-199 (2015).
  70. Li, Z., Miao, X., Xing, K., Zhu, A., Ling, L. Enhanced electrochemical recognition of double-stranded DNA by using hybridization chain reaction and positively charged gold nanoparticles. Biosensors and Bioelectronics. 74, 687-690 (2015).
  71. Niu, S., Sun, J., Nan, C., Lin, J. Sensitive DNA biosensor improved by 1,10-phenanthroline cobalt complex as indicator based on the electrode modified by gold nanoparticles and graphene. Sensors and Actuators B: Chemical. 176, 58-63 (2013).
  72. Yi, H., Xu, W., Yuan, Y., Bai, L., Wu, Y., Chai, Y., Yuan, R. A pseudo triple-enzyme cascade amplified aptasensor for thrombin detection based on hemin/G-quadruplex as signal label. Biosensors and Bioelectronics. 54, 415-420 (2014).
  73. Das, R., Sharma, M. K., Rao, V. K., Bhattacharya, B. K., Garg, I., Venkatesh, V., Upadhyay, S. An electrochemical genosensor for Salmonella typhi on gold nanoparticles-mercaptosilane modified screen printed electrode. Journal of Biotechnology. 188, 9-16 (2014).
  74. Han, X., Fang, X., Shi, A., Wang, J., Zhang, Y. An electrochemical DNA biosensor based on gold nanorods decorated graphene oxide sheets for sensing platform. Analytical Biochemistry. 443 (2), 117-123 (2013).
  75. Huang, K. J., Liu, Y. J., Zhang, J. Z., Cao, J. T., Liu, Y. M. Aptamer/Au nanoparticles/cobalt sulfide nanosheets biosensor for 17β-estradiol detection using a guanine-rich complementary DNA sequence for signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 67, 184-191 (2015).

Tags

בביו-הנדסה גיליון 136 מיוצב חומצה חלקיקי זהב Polylactic המסך המודפס פחמן האלקטרודה DNA ביוסנסור ויבריו parahaemolyticus חיישן אלקטרוכימי הכלאה דנ א
התפתחות ביוסנסור אלקטרוכימי דנ א כדי לזהות חיידק והקאה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nordin, N., Yusof, N. A., Radu, S.,… More

Nordin, N., Yusof, N. A., Radu, S., Hushiarian, R. Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen. J. Vis. Exp. (136), e56585, doi:10.3791/56585 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter