Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

تحليل الاتصالات بين وحيدات وخلايا سرطان الثدي الأولية في مصفوفة خارج الخلية استخراج (أكمي)-على أساس نظام ثلاثي الأبعاد

Published: January 8, 2018 doi: 10.3791/56589
Automatic Translation
*1,2, *1, 1
1Unidad de Investigación en Virología y Cáncer, Hospital Infantil de México Federico Gómez, 2Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México
* These authors contributed equally

Summary

هنا، يمكننا وصف أسلوب ثقافة ثلاثي الأبعاد لتحليل مورفولوجية الابتدائي خلايا سرطان الثدي، كذلك فيما يتعلق بدراسة تفاعلها المباشر/غير المباشر مع وحيدات ونتائج مثل تدهور الكولاجين وتجنيد الخلايا المناعية والخلايا الغزو، والترويج للالتهابات المتصلة بالسرطان.

Abstract

مضمن في المصفوفة خارج الخلية (ECM)، الخلايا الظهارية العادي والورم وثيقا التواصل مع الخلايا المكونة للدم وغير-المكونة للدم، وبالتالي التأثير على أنسجة طبيعية نتيجة التوازن والمرض إلى حد كبير. الإصابة بسرطان الثدي، المرتبطة بورم الضامة (تامس) تلعب دوراً حاسما في تطور المرض وورم خبيث، والتكرار؛ ولذلك، فهم آليات تشيمواتراكشن الوحيدات إلى ورم المكروية وتفاعلها مع الخلايا السرطانية مهم للسيطرة على المرض. هنا، نحن نقدم وصفاً مفصلاً لنظام ثلاثي الأبعاد (3D) ثقافة المشارك للثدي الخلايا السرطانية (BrC) ووحيدات البشرية. إنتاج خلايا BrC ارتفاع مستويات التنظيم في تفعيل القاعدية، وعادي تي خلية أعرب ويفرز (رنتيس)، الوحيدات chemoattractant البروتين-1 (العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1)، وعامل تحفيز مستعمرة بلعم المحببات (ز-CSF)، بينما في الثقافة المشتركة مع وحيدات، تم إثراء بيتا انترلوكين (إيل)-1 برو-التهابات السيتوكينات (إيل-1β)، وايل-8 جنبا إلى جنب مع مصفوفة ميتالوبروتيناسيس (MMP)-1 ونظام التمثيل التناسبي المختلط-2 ونظام التمثيل التناسبي المختلط-10. هذا وورم المكروية ستروما تعزيز مقاومة anoikis في هياكل مثل acini 3D MCF-10A، تشيمواتراكشن وحيدات، والغزو العدواني BrC الخلايا. توفير بديل بأسعار معقولة لدراسة الاتصالات داخل ورم البروتوكولات المقدمة هنا وهي مثال على الإمكانات الكبيرة التي توفر في المختبر نظم خلية ثلاثية الأبعاد استجواب ميزات محددة بيولوجيا الأورام المتصلة بالورم العدوان.

Introduction

بيولوجيا الأورام الآن أكثر تعقيداً مما كان يعتقد سابقا. أدلة متزايدة تظهر أن الخلايا السرطانية أكثر من مجرد الجزء الأكبر من الخلايا المتكاثرة غير المنضبط؛ بدلاً من ذلك، تبدو الخلايا الورمية المختلفة لأداء وظائف مختلفة عرض عالية التنظيم والتسلسل الهرمي داخل الورم1. الخلايا السرطانية أيضا في التواصل الحميم مع عدم تحول الخلايا: الضامة، والخلايا الليفية، الخلايا الليمفاوية، adipocytes، خلايا بطانية، بين الخلايا الأخرى كلها مغمورة في سقالة البروتينات والسكريات التي تشكل إدارة المحتوى في المؤسسة. يتم إنشاء العديد من التفاعلات المباشرة وغير المباشرة بين الخلايا المحولة وعدم تحويلها، ومع إدارة المحتوى في المؤسسة، التي تمارس تأثيراً قويا على مدى ال2،نتائج المرض3. في قضية محددة من BrC، من المهم خاصة أن تشريح تبليغ الخلايا BrC مع تامس، إذ ترى أنه تم العثور تامس تلعب دوراً حاسما في تطور الورم، يزيد من مخاطر ورم خبيث، وتكرار المرض4 ،5.

لتحليل التفاعلات داخل الأورام ونتائجها المحتملة، نهج جديدة ثلاثية الأبعاد في المختبر وقد وضعت استناداً إلى استخدام مقتطفات إدارة المحتوى في المؤسسة التي تقدم المكروية أكثر تعقيداً بكثير، أقرب إلى واقع الأحياء الورم، بالمقارنة مع الثقافات الخلية أحادي الطبقة التقليدية التي تنمو فيها الخلايا المرفقة بالبلاستيك. بيترسن وبيسيل6 قدم أول نموذج من نونماليجنانت والخلايا الظهارية الثديية الخبيثة مثقف في غشاء الطابق السفلي الغنية laminin وكانوا الأول من وصف هياكل أورجانوتيبيك ثلاثية الأبعاد التي تميز الإنسان نونماليجنانت الثدي الخلايا الظهارية من نظرائهم الخبيثة. عقد من الزمان في وقت لاحق، النموذج الذي وضعته Debnath, موثوسوامي، وبروج7،،من89 توفير أداة قيمة توضيح الممرات البيولوجية للخطر أثناء التحول الخبيث من غدي acini، هذه كتشكيل acini كبيرة بسبب الانتشار غير المنضبط، توطن البروتينات مفرق ضيق كدليل على استقطاب الخلية البصر، وفقدان التجويف acini نتيجة لمقاومة الخلية anoikis، نوع من موت الخلايا المبرمج الذي يحدث في مرسى-تعتمد على الخلايا عند أنها فصل من ECM المحيطة بها. نماذج ساميني، جيديسزكو، وسلوان ركزت على النشاط proteolytic التصوير بالخلايا، الذي يرتبط ارتباطاً وثيقا اختزاع، سمة حاسمة أخرى من الورم الخبيث10،،من1112. تعتمد هذه النماذج على مصفوفات البروتين مختلطة مع ركائز البروتين تطفئ الأسفار المختلفة (الجيلاتين DQ، DQ-الكولاجين الأول والرابع DQ-الكولاجين)، في إشارات الفلورسنت التي هي إرشادية لتدهور الكولاجين proteolytic. نماذج ثلاثية الأبعاد وتستخدم أيضا لدراسة خصائص الخلايا الجذعية غير تحول على حد سواء، والخلايا السرطانية، كما وصف المجاميع، في الخلية التي الماغنيسيوم، يمكن أن يكون مثقف في التعليق أو في إدارة المحتوى في المؤسسة مثل البروتينات استجواب لآليات الخلية التمايز، غير متماثلة انقسام الخلية والتقيد خلية إلى خلية حركية13،14. فحوصات غزو السماح باختبار العدوانية المتأصلة للورم وتحديد الجزيئات التي تكون بمثابة تشيمواتراكتانتس أثناء عملية الغازية15. نماذج ثلاثية الأبعاد الشاملة، وتمثل تنويع بأسعار معقولة في المختبر الثقافة الخلية التي تعكس على نحو أوثق أنسجة طبيعية والنمطان morphogenesis.

لقد قمنا بتصميم نظام ثقافة المشارك خلية ثلاثية الأبعاد استناداً النماذج المذكورة أعلاه7،10،11، استخدام خطوط الخلية BrC كل البشرية التجارية إمكانات العدوانية المعروفة (أنواع لومينال وسالب الثلاثي) والابتدائية الخلايا اكسبلانتيد من المرضى BrC. ونحن أولاً وضع نموذج مثقف يشترك مع U937 وحيدات في مقتطف مصفوفة خارج الخلية (أكمي) فيها غير العدواني (MCF-7) أو عدوانية BrC (نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231) خلايا-استناداً إلى نظام ثلاثي الأبعاد الذي يسمح بالتفاعل المباشر خلية خلية. واستخدمت هذه الثقافات المشاركة لتحديد كيفية تأثير الاتصال بين هذه الأنساب الخلية اثنين النسخ من مجموعة من الجينات المتصلة بالسرطان السلوك العدواني. ولوحظ زيادة كبيرة في نسخة (كوكس-2) السيكلواوكسيجيناز-2 التي تزامنت مع زيادة إنتاج إحدى منتجاتها، البروستاغلاندين E2 (PGE2)، استنتاجا بأن أبرز دور الالتهاب في تطور السرطان. زيادة النسخ نظام التمثيل التناسبي المختلط لوحظ أيضا أن يرتبط بزيادة الكولاجين بروتيوليسيس عندما كانت شاركت مثقف العدوانية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا مع U937 وحيدات في الثقافات التي تحتوي على الكولاجين دي كيو "الرابع". من المذكرة، ثقافاتنا المشتركة لا تؤيد الافتراض بأن هناك حاجة إلى آليات التفاعل خلية خلية لتدهور الكولاجين. واقترح بدلاً من ذلك أن الاتصالات بين الأنساب الخلية اثنين وساطة من جزيئات يفرزها. وعلاوة على ذلك، الواردة supernatants تحصد من هذه الاختبارات ثقافة المشارك العوامل القابلة للذوبان التي مشوش acini غدي شكلتها غير تحول الخلايا MCF-10A13. وقد وجد أن العدوانية والابتدائي BrC الخلايا يفرز مستويات الجزيئات chemotactic الوحيدات العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1، GM-CSF، ورنتيس مرتفعة. وهكذا، أوضحنا ثقافة ثلاثية الأبعاد التي تم فصل الخلايا في خلية يدخل الثقافة لمنع التفاعلات خلية خلية. واستخدمت هذه الثقافات لمعالجة الاتصالات غير المباشرة بين الخلايا BrC ووحيدات. لهذه الاختبارات وغير عدوانية وعدوانية من خطوط الخلايا BrC التجارية والابتدائي BrC الخلايا وثلاثة أنواع مختلفة من وحيدات البشرية: خلايا U937 و THP-1 التجارية ووحيدات الأولية (PMs) المعزولة من الدم المحيطي صحية من الجهات المانحة (جميع واستخدمت وحيدات في حالة عدم تنشيط) استخدمت. ولوحظت زيادة تركيزات السيتوكينات الالتهابية 1β إيل وايل-8 إثراء الثقافة المشتركة. وبالمثل، وجد أن MMP-1 ونظام التمثيل التناسبي المختلط-2 ونظام التمثيل التناسبي المختلط-10 وزيدت أيضا في BrC خلايا الوحيدات الثقافات المشتركة، ومن ثم يعزز الاستنتاجات السابقة14. ويرد في هذه المخطوطة، سير عمل نقطة بنقطة لعزل الخلايا BrC الأولية واختبار في الثقافات 3D جنبا إلى جنب مع نتائج تمثيلية. ويشكل هذا العمل مثالاً جيدا للإمكانات الكبيرة التي توفر في المختبر نظم خلية ثلاثية الأبعاد استجواب جوانب محددة من الأحياء الورم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وتم الحصول على عينات من المرضى BrC من مصرف الأنسجة أون بحوث Unidad de Virología y المصابة، غوميز فيديريكو مستشفى الأطفال في المكسيك. أقر هذه الدراسة العلمية، والأخلاقية، والسلامة البيولوجية استعراض المجالس غوميز فيديريكو مستشفى الأطفال في المكسيك: لجنة بحوث، أون هي دي لجنة الدراسات ولجنة دي بيوسيجوريداد. جميع المرضى مقيدين في تاريخ لاحق، وأبلغ عن طبيعة الدراسة: الراغبين في المشاركة التوقيع موافقة خطية قبل جمع العينات ويعاملون وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية وأفضل الممارسة السريرية من المؤسسة. وقد تصبح مجهولة المصدر هوية المشاركين طوال فترة الدراسة. تم تشخيص مرضى وشملت مع سرطان الأقنية الغازية ونسيجية الصف 2 والسريرية في المرحلة الثانية، مع لا علاج نيوادجوفانت السابقة قبل استئصال الأنسجة. كان المرضى المسنين جميع الإناث في المتوسط 56.8 سنة (المدى 42 إلى 75)14.

1-الثقافات الخلية ثلاثي الأبعاد

  1. بذور 0.1 × 106 MCF 10A الخلايا أو الخلايا BrC الأولية في قوارير الثقافة2 25 سم مع DMEM/F12 الثقافة المتوسطة وتستكمل مع 5% الحصان المصل، 100 يو/مليلتر البنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، السمية الكوليرا 100 نانوغرام/ملليلتر، الهيدروكورتيزون 0.5 ميكروغرام/مل، 10 ميكروغرام/مل الأنسولين، و 20 نانوغرام/مليلتر من عامل نمو البشرة (مماثلة). بذور 0.1 × 106 التجاري BrC الخلايا وخلايا mcf-7 ونجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا في 75 سم2 ثقافة قوارير مع DMEM/F12 الثقافة المتوسطة وتستكمل مع 10% FBS و 100 يو/مليلتر البنسلين والستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل. احتضان عند 37 درجة مئوية في نسبة % 5 هوميديفيد CO2 البيئة.
  2. بعد 48 ساعة, شطف أحادي الخلية في الطبقة مع 10 مل 1 العقيمة x الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). تريبسينيزي أحادي الخلية في الطبقة مع الحل 3 مل من 0.05% التربسين و 0.48 ملم الإيثيلين حمض (يدتا) لمدة 5-10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. إضافة 200 ميليلتر من المصل المطابق لوقف تريبسينيزيشن و 7 مل من المتوسط دون ملاحق. ريسوسبيند الخلايا التي بيبيتينج وإزالة قاسمة 10 ميليلتر حساب عدد الخلايا في دائرة نويباور.
  3. في كل من نظام الشرائح الدائرة 8-جيدا جيدا، انتشار قاعدة ميليلتر 40 أكمي نقية، متبوعاً حضانة من 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. في كل بئر، مكان الخلايا 800 حراكه في 400 ميليلتر من دميم/F12 (دون الأحمر الفينول) تكملة كما في الخطوة 1، 1 ولكن مع التغييرات التالية: الابتدائي BrC الخلايا والخلايا MCF-10A، إضافة 4 نانوغرام/مليلتر 2% ولو أكمي؛ MCF-7 ونجمة داود الحمراء-ميغابايت-231، فقط إضافة 2% أكمي.
  5. احتضان الثقافات في 37 درجة مئوية في نسبة % 5 هوميديفيد CO2 البيئة. استبدال وسائط الثقافة كل 48 ساعة.
  6. التغيرات المورفولوجية سجل خلايا كل 24 ساعة لمدة 15 يوما مع مجهر ضوئي. لتحليل مورفولوجية BrC الابتدائي الخلايا و MCF-10A ونجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا خطوط الخلايا إشارة جيدة لأمثلة على تشكيل أسينار مرتبة واضطرابه الهياكل الشبيهة بالسرطان العدوانية، على التوالي.
  7. الحصول على صور للخلايا في المجهر الحقل مشرق في 100 X و 200 X التكبير، وقارن بين مورفولوجيا الخلايا مع مرجع MCF-10A وخطوط نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا (الشكل 1).

2-الحصول على الخلايا السرطانية الأولية من ورم الأنسجة

ملاحظة: للحصول على استخدام ورم الخلايا الظهارية الأنسجة من الأورام الأولية مستأصل من المرضى BrC مع لا علاج neoadjuvant السابقة؛ تجنب مناطق نخرية والعمل مع حد أدنى من 0.5 سم3 من أنسجة الورم.

  1. شطف ورم الأنسجة مع برنامج تلفزيوني x 1 العقيمة وتفصيل ميكانيكيا مع مشرط في الأجزاء 1-2 مم.
  2. هضم الأنسجة في قنينة زجاج معقمة 20 مل مع غطاء ح 2 في درجة حرارة الغرفة (RT) مع 2 مل من متابعة الحل: مزيج 1 ملغ/مل كولاجيناز النوع الأول والبروتين السكري المثبط يو/مليلتر 100 في DMEM/F12 المتوسطة تحتوي على 100 البنسلين يو/مليلتر و 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين ، مع التحريك المستمر.
  3. تصفية تعليق الناتجة عن طريق قطعة معقمة من قماش لإزالة أجزاء كبيرة من الأنسجة عسر الهضم. قم بتصفية تعليق خلية عن طريق غشاء 100 ميكرومتر المسامية معقمة.
  4. بيليه الخلايا في 430 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت وغسلها مرتين مع PBS العقيمة x 1. الثقافة الخلايا الأولية في المتوسط DMEM/F12 تستكمل مع مصل الحصان 5% 100 يو/مليلتر البنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، 100 نانوغرام/مليلتر الكوليرا السمية، 0.5 ميكروغرام/مل الهيدروكورتيزون، 10 ميكروغرام/مل الأنسولين و 20 نانوغرام/مليلتر من لو. استبدال المتوسطة كل حاء 48 المحافظة على الثقافات في 37 درجة مئوية في نسبة % 5 هوميديفيد CO2 البيئة.
  5. التأكد من وجود الخلايا المعزولة الخلايا الظهارية مع بروتوكول قياسي إيمونوسيتوتشيميستري14. اختبار ثلاث علامات طلائي: فريق سيتوكيراتينس (بنك)، الميوسين-1 (Muc-1)، وجزيء التصاق الخلايا الظهارية (ابكام).

3-عزل الخلايا بعد الظهر من "الدم المحيطي"

  1. استخراج حوالي 40 مل من الدم المحيطي من صحي متطوع، وتمييع الدم بنسبة 1:3 مع برنامج تلفزيوني عقيمة خالية من الذيفان 1 x، وإخضاعها لكثافة فصل تدرج.
  2. في أنبوب مخروطي، ضع 2 مل وسيلة دياتريزواتي بوليسوكروسي والصوديوم مع كثافة 1.077 غ/مل. بعناية وبطء تراكب 8 مل الدم المخفف. مدة 30 دقيقة، ز x 765 في استخدام الرايت أبطأ سرعة تسارع التباطؤ النابذة للطرد المركزي.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي، سوف تشكل أربع طبقات من الأسفل إلى الأعلى: بيليه خلايا الدم الحمراء وكثافة الطبقة المتوسطة التدرج وطبقة الخلايا وحيدات النوى (يبدو كحلقة بيضاء غرامة) وطبقة البلازما.
  3. استرداد طبقة الخلايا وحيدات النوى من التدرج مع ماصة باستور معقمة بعناية وغسلها ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1 x، في كل مرة متبوعاً بالطرد المركزي أبطأ (430 و 275 و 191 س ز) لمدة 10 دقائق في الرايت
  4. استخدام بروتوكولات الانتقاء السلبي لتجنب تنشيط الخلايا. مثال من هذا البروتوكول هو ما يلي:
    1. تغسل الخلايا وحيدات النوى مرة مع محلول غسيل مخزنة (0.5% البقري ألبومين المصل، 2 مم يدتا في برنامج تلفزيوني 1 x). عد الخلايا في دائرة نويباور وتكييفها لكثافة 1 × 107 خلايا/30 ميليلتر من حل مخزنة بشكل مؤقت.
    2. لكل الخلايا7 1 × 10، إضافة 10 ميليلتر من FcR حجب الكاشف و 10 ميليلتر من الكوكتيل البيوتين-جسم الوحيدات يحتوي على الإنسان المضادة CD3 CD7 و CD16، CD19، CD56، CD123، و A جليكوفورين (المضمنة في مجموعات تجارية).
    3. مزيج الخلايا واحتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. إضافة ميليلتر 30 إضافية من الحل الغسيل مخزنة بالإضافة إلى 20 ميليلتر من البيوتين المضادة ميكروبيدس (ضمن الطقم)؛ مزيج الخلايا واحتضان لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    4. أغسل الخلايا مرة واحدة مع حل مخزنة بشكل مؤقت، الطرد المركزي في 430 x ز لمدة 5 دقائق في RT، وريسوسبيند في 1.5 مل من مخزنة الحل لفصل المغناطيسية.
    5. تحميل تعليق خلية في عمود الفاصل مغناطيسي مشطوف مسبقاً وإضافة 7 مل من محلول مخزنة بشكل مؤقت. جمع الكسر أثري الوحيدات في أنبوب مخروطي 15 مل، عد الخلايا، وإذا لم مثقف فورا، تجميد وحيدات في كثافة 2 × 106 خلايا/1 مل من DMEM/F12 المتوسطة وتستكمل مع 50% FBS و 10% [دمس] في −80 درجة مئوية.
      ملاحظة: تجنب استخدام وحيدات بعد أكثر من شهرين من التجميد، كما يمكن أن يتعرض للخطر قدرتها على الاستمرار.
  5. الحفاظ على الثقافات للدورة الشهرية في المتوسط DMEM/F12 تستكمل مع 6% FBS و 100 يو/مليلتر البنسلين والستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل، في 37 درجة مئوية في 5% هوميديفيد CO2 البيئة.
  6. أداء كل مجموعة من تجارب استخدام الدورة الشهرية من اثنين على الأقل من الجهات المانحة المختلفة بشكل مستقل، كما وحيدات تجميع الموارد من الجهات المانحة المختلفة يمكن أن ينتج التنشيط الوحيدات.

4-إنشاء 3D اشتركت الثقافات

  1. الثقافات المشتركة 3D التفاعل غير المباشر
    ملاحظة:     إجراء هذه الاختبارات في لوحات الثقافة 24-جيدا مسطحة القاع باستخدام إدراج ثقافة الخلية البولي مع أغشية حجم المسام ميكرومتر 0.4. في هذا التحليل، يمكن استرداد supernatants وخلايا في نهاية التجربة.
    1. زراعة 2 × 106 وحيدات U937 و THP-1 في 10 مل متوسط RPMI 1640 تستكمل مع 10% FBS، 1% المضادات الحيوية/فطري، وزراعة جديدة الدورة الشهرية في المتوسط DMEM/F12 المكملة (على النحو المشار إليه سابقا في الخطوة 3، 5)، في 37 درجة مئوية في هوميديفيد 5% CO2 البيئة.
    2. لوحة 4 × 105 وحيدات في 1 مل/جيدا من المتوسطة على المقابلة (تستكمل مع 2% أكمي و 2% FBS وحيدات U937 و THP-1، أو 2% أكمي و 6% FBS للدورة الشهرية).
    3. إدراج في كل بئر وإضافة 0.9 مل من 4 × 105 BrC تعليق خلية في المتوسط المقابلة (تستكمل مع 2% أكمي و 2% FBS لخطوط الخلايا التجارية أو 5% الحصان المصل للابتدائي BrC الخلايا). استبدال نصف مجموع وسائل الإعلام كل 48 ساعة.
    4. احتضان عند 37 درجة مئوية في نسبة % 5 هوميديفيد CO2 البيئة لمدة 5 أيام واسترداد في سوبيرناتانتس. استرداد خلايا من تريبسينيزيشن إذا كان يتم إجراء التحليل اللاحق.
    5. وتشمل عناصر الثقافات الخلية الفردية مع وسائط الإعلام الخاصة بكل منها.
  2. الثقافات المشتركة 3D التفاعل المباشر
    1. قم بتسمية الخلايا BrC ووحيدات مع الأصباغ الفلورية المختلفة قبل زراعة الخلايا للسماح بفرز مستقلة لكل خلية النسب بعد الثقافة لتحليل التعبير مرناً والبروتين. استخدام المشتقات المالية المتاحة تجارياً من الكومارين ووالرودامين بحرية تمر عبر غشاء الخلية من الخلايا الحية. بروتوكول عام لوضع العلامات هو ما يلي:
      1. إعداد أحادي الطبقة خلايا BrC من الفائدة (2 × 106 خلايا في قارورة ثقافة2 سم 25) ويستعاض عن المتوسط القياسي بحل العامل المعالجون مسبقاً كاف من صبغة الفلورسنت (1:2، 000 من صبغة الفلورسنت في المتوسط قاعدة قياسية دون أي ملحق). احتضان 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في نسبة % 5 هوميديفيد CO2 البيئة. نضح الحل صبغ وشطف بلطف مع كافية 1 x برنامج تلفزيوني. نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة وسيلة قياسية.
      2. تريبسينيزي أحادي الخلية في الطبقة مع 2 مل حل يدتا التربسين و 0.48 ملم 0.05% لمدة 5-10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. إضافة 200 ميليلتر من FBS لوقف تريبسينيزيشن و 7 مل من المتوسط المراسل دون ملاحق. ريسوسبيند الخلايا التي بيبيتينج. تأخذ قاسمة 10 ميليلتر حساب عدد الخلايا في دائرة نويباور. تواصل مع البروتوكول ثقافة المشارك بعد عد الخلايا.
      3. بيليه الخلايا في 430 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت (أداء هذا الأول من نوعه منذ وحيدات تنمو في التعليق). تجاهل المادة طافية ولطف ريسوسبيند الخلايا مع 3 مل من إيجاد حل عملي المعالجون مسبقاً من صبغة الفلورسنت (1:2، 000 من صبغة الفلورسنت في متوسط قاعدة قياسية دون ملاحق). احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في هوميديفيد 5% CO2 البيئة.
      4. بيليه الخلايا مرة أخرى، تجاهل الحل العامل الصبغ، وريسوسبيند برفق مع 5-7 مل من برنامج تلفزيوني 1 x. بيليه مرة أخرى، تجاهل برنامج تلفزيوني، ومن ريسوسبيند الخلايا في 5-7 مل متوسط القياسي. تأخذ قاسمة 10 ميليلتر من تعليق خلية حساب عدد الخلايا في دائرة نويباور. تواصل مع البروتوكول ثقافة المشارك بعد عد الخلايا.
    2. تعيين الثقافة المشتركة على النحو التالي:: انتشار أكمي كافية في أسفل البئر لتشكيل طبقة حتى في كل من نظام الشرائح الدائرة 4-جيدا جيدا. لوحة 20 ميليلتر من تعليق خلية واحدة تحتوي على 5 × 105 المسمى BrC الخلايا كل بئر.
    3. بعد 15-20 دقيقة من الحضانة عند 37 درجة مئوية، إضافة تعليق 2.5 × 105 المسمى وحيدات في 80 المتوسطة الإنزيم ميليلتر (تستكمل مع 60% أكمي).
    4. تسمح أكمي يصلب لمدة 15-20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    5. أضف 1 مل مزيج 1:1 خلايا BrC ووسائط الثقافة الوحيدات.
    6. احتضان ثقافات المشارك في 37 درجة مئوية في 5% هوميديفيد CO2 البيئة ح 24 أو 48 ساعة أو 5 أيام لتعقب التغييرات في نقاط زمنية مختلفة.
    7. تتحلل بروتينات ECM لاستعادة الخلايا من الثقافات. نضح وتجاهل المتوسطة، وإضافة 0.5 مل من س 1 برنامج تلفزيوني مع التربسين 0.1% و 0.25% يدتا واحتضانها ح 3 في 37 درجة مئوية. بعد التفريخ، إضافة 0.5 مل من برنامج تلفزيوني 1 x مع 10% FBS لتحييد التربسين، وريسوسبيند الخلايا التي بيبيتينج بشدة للحصول على تعليق خلية واحدة.
    8. بيليه الخلايا في 765 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت وتجاهل المادة طافية ريسوسبيند الخلايا في 5 مل من برنامج تلفزيوني 1 x مع 10% FBS. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
    9. موضوع تعليق خلية إلى خلية تنشيط fluorescence الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) مع الأداة المناسبة. التأكد من وجود السكان النهائي نقية على الأقل 95 ٪).
    10. بعد الفرز، تغسل الخلايا مع PBS العقيمة x 1، بيليه (430 غ س لمدة 5 دقائق في RT)، وريسوسبيند في برنامج تلفزيوني x 1 العقيمة. يمكن معالجة الخلايا وفقا لبروتوكولات معينة لعزل الحمض النووي الريبي أو تحليل البروتين.
    11. كرر من الفحص كل ثلاث مرات، بما في ذلك الثقافات 3D من كل سلالة الخلايا الفردية كعناصر تحكم.
  3. التفاعل المباشر 3D الثقافات المشتركة لتقييم تدهور الكولاجين
    1. إنشاء خلية 3D الثقافات المشتركة كما هو موضح في الخطوة 4، 2، مع خطوة إضافية لإضافة 32.5 ميكروغرام/مل من نوع الكولاجين الرابع المسمى مع fluorescein isothiocyanate إلى أكمي. تركيز الكولاجين الرابع في أكمي النهائي هو 0.5%. تنمو الثقافات في ساترة 35 ملم وضعها في أطباق بتري.
    2. انتشار طبقة من 40 ميليلتر من أكمي في الجزء السفلي من صحن بيتري. تسمح أكمي على ترسيخ عند 37 درجة مئوية.
    3. إضافة 2.5 × 10 خلايا BrC5 في 10 ميليلتر من الوسط وتسمح للخلايا ليستقر.
    4. أضف تعليق 1.25 × 105 U937 وحيدات في 40 المتوسطة الإنزيم ميليلتر (تستكمل مع 60% من الكولاجين دي كيو "الرابع" المسمى-أكمي).
    5. تسمح أكمي يصلب لمدة 15-20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    6. إضافة 2 مل 1:1 مزيج من الخلايا BrC ووسائط الثقافة الوحيدات.
    7. احتضان ثقافات المشارك لمدة 5 أيام في 37 درجة مئوية في نسبة % 5 هوميديفيد CO2 البيئة. استبدال وسائط الثقافة كل 48 ساعة.
    8. تحليل الانبعاثات fluorescence في مجهر مسح [كنفوكل] وقياس الكثافة الضوئية المتكاملة (المدراء) الواحد 50 ميكرومتر2 للثقافة. مقارنة IODs ضد الثقافات الفردية والثقافة في وقت صفر (الشكل 2).

5-تحليل سوبيرناتانتس من 3D اشتركت الثقافات التفاعل غير المباشر

  1. بعد 5 أيام ثقافة المشتركة، استرداد في سوبيرناتانتس من الأعلى والمقصورات أقل من الثقافات المشتركة 3D، ومن عناصر الثقافة 3D الفردية. خلط المادة طافية أيضا كل من بيبيتينج. قاسمة، وتخزين المادة طافية في −20 درجة مئوية حتى الاستخدام (لمدة شهر).
    ملاحظة: الحفاظ على سوبيرناتانتس في −80 درجة مئوية إذا كان سيتم تخزين أطول من شهر واحد.
  2. تحليل supernatants مع الإرسال المتعدد منصات المقايسة، وفحوصات الممتز المرتبط بالانزيم (ELISA)، أو تحديدكم المستندة إلى حبة عقب الإجراءات الموصى بها الشركة المصنعة.
    ملاحظة: سوبيرناتانتس يمكن أيضا تحليل لطخة غربية أو مركزة من خلال مرشحات المسام محددة للحصول على حجم أثري البروتين الكسور لإجراء تحليل زيموجرافي16،17. بدلاً من ذلك، استخدم في supernatants كوسائل مكيفة لتجارب أخرى، كما هو موضح أدناه. عادة ما يتم الحصول على وسائط مكيفة من ثقافة 5 أيام (الشكل 3).

6-توصيف تأثيرات Supernatants من الخلايا BrC الأولية في تشكيل أسيني وهيكل أسيني

  1. في كل بئر شريحة الدائرة 8-جيدا نظام انتشار قاعدة أكمي ميليلتر 40 والسماح لها بترسيخ لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  2. بذور 800 MCF-10A خلايا/بئر في 400 ميليلتر لتستكمل DMEM/F12 الثقافة المتوسطة، كما هو موضح في الخطوة 1، 2.
  3. إضافة 400 ميليلتر مكيفة وسائل الإعلام أو المتوسطة الثقافة DMEM/F12 تستكمل مع 20 نانوغرام/مليلتر من إيل الماشوب البشري-1β.
  4. مكان الشريحة الدائرة إلى طبق بيتري زجاجية التي تحتوي على طبق بتري 35 ملم مليئة 2 مل من برنامج تلفزيوني لخلق بيئة رطوبة.
  5. استبدال وسائط الإعلام/المادة طافية كل 48 ساعة.
  6. سجل تشكيل acini غدي كل 24 ساعة لمدة 14 يوما مع مجهر ضوئي.
  7. وبعد 14 يوما ثقافة، وصمة عار acini مع 100 ميليلتر من 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) بتركيز 100 نانومتر في برنامج تلفزيوني 1 x لمراقبة نواة الخلية. احتضان لمدة 25 دقيقة في RT في التحريك المستمر. شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني x 1 لمدة 5 دقائق، كل مرة في التحريك المستمر في جبل الرايت الأعمال التحضيرية مع تصاعد متوسطة محددة لتلطيخ الفلورسنت. ختم مع البولندية شفافة والحفاظ على محمية من الضوء في 4 درجات مئوية.
  8. تحليل في أسيني مع مجهر [كنفوكل] التقاط صور لمداخن مستعرضة في أعماق مختلفة من أسيني (الشكل 4أ، ب، ج).
  9. تصور مختلف البروتينات الخلوية في أسيني مع البروتوكولات المصبوغة السليم. على سبيل المثال، كان ملون ه-كادهيرين تقييم التصاق خلية إلى خلية، والخلية القطبية، و/أو التجويف تشكيل18 (الشكل 4د).

7-الهجرة معبراً

ملاحظة: إجراء فحوصات الهجرة من U937، PMs THP-1، وجديدة في الثقافة 24-جيدا مسطحة القاع ألواح البولي باستخدام الخلية إدراج الثقافة مع أغشية من 8 حجم المسام ميكرومتر. سبق يتضح أن المستقطبات GM-CSF، العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1، ورنتيس عثر يفرز بتركيزات عالية في الثقافات 3D الفردية من خطوط الخلايا BrC العدوانية. واقترح أن هذه السيتوكينات ذات أهمية حاسمة لاجتذاب وحيدات إلى موقع الورم الرئيسي؛ تم اختبار هذا في فحوصات الترحيل باستخدام السيتوكينات وصفها تشيمواتراكتانتس.

  1. U937 الثقافة، الدورة الشهرية THP-1، أو جديدة كما هو موضح في الخطوة 4.1.1.
  2. يشطف مرة واحدة كل إدراج مع 200 ميليلتر من RPMI 1640 دون سيرا هيدرات الغشاء.
  3. ملء مع 50 ميليلتر من أكمي الباردة ووضع تدرج في لوحة ثقافة 24-جيدا مسطحة القاع، وتسمح أكمي بلمرة ح 1 في 37 درجة مئوية.
  4. إضافة 180 ميليلتر من ربمي دون FBS في المقصورة العلوية اللوحة. إضافة في مجلس النواب دون ميليلتر 800 محتدما لتستكمل مع أما 100 نانوغرام/مليلتر من GM-CSF، ربمي العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1، أو رنتيس ك chemoattractant. استخدام المتوسط دون السيتوكينات كعنصر سلبي. احتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية إنشاء تدرج لوني تشيموكيني.
  5. مكان 1.5 × 105 من كل نوع من الوحيدات في أنبوب عقيم، يغسل مرتين مع 1 مل 1 x برنامج تلفزيوني، وأجهزة الطرد المركزي في 430 x ز لمدة 5 دقائق في "الرايت ريسوسبيند" وحيدات في 20 ميليلتر من ربمي دون FBS، مكان لهم في يدخل ، وتجانسه بعناية فائقة بتعليق خلية (الحجم النهائي لمجلس الشيوخ وهو 200 ميليلتر).
  6. السماح بهجرة الخلية للتقدم من أجل 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في هوميديفيد 5% CO2 البيئة.
    ملاحظة: كما وحيدات غير ملتصقة، سيتم عادة الخلايا المهاجرة في وسائط الإعلام في حجرة أقل.
  7. إزالة تدرج واسترداد وسائط الإعلام وحساب عدد الخلايا في 2، 4 و 6، و 24 ساعة استخدام دائرة نويباور أو تدفق سيتوميتير؛ وبدلاً من ذلك، خاصة إذا تم العثور على لا خلايا في وسائط الإعلام، الحصول على صور الجزء السفلي من إدراج مع كاميرا رقمية. يتم استخدام عدد الخلايا يعني من 3 حقول عشوائية (في التكبير X 100) للتحليل (الشكل 5).

8-الغزو فحوصات

ملاحظة: إجراء فحوصات غزو الخلايا BrC في لوحات الثقافة 24-جيدا مسطحة القاع باستخدام إدراج ثقافة الخلية البولي مع أغشية حجم المسام ميكرومتر 8. في دراساتنا الأصلي، إيل-8 كانت واحدة من السيتوكينات أثرت في supernatants BrC خلية/الوحيدات 3D الثقافات المشارك. تم اختبار ما إذا كان هذا سيتوكين كانت تشارك في غزو خطوط الخلايا BrC.

  1. توسيع نطاق الخلايا BrC في قوارير2 75 سم. MCF-7، T47D، HS578T، وجمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 هو موضح في الخطوة الأولية BrC الخلايا و 1.2 (ولكن دون أكمي) كما هو موضح في الخطوة 2، 4.
  2. أغسل بمجرد إدراج كل البولي 8 ميكرومتر المسامية غشاء الخلية والثقافة مع 200 ميليلتر من المتوسط دون سيرا (الوسيلة المستخدمة يعتمد على خط الخلية اختبار) هيدرات الغشاء.
  3. ملء الإدراج مع 50 ميليلتر من أكمي الباردة (1:4 إضعاف ECME:cold المتوسطة دون FBS) ووضع تدرج في لوحة ثقافة 24-جيدا مسطحة القاع وتسمح أكمي بلمرة ح 1 في 37 درجة مئوية.
  4. مرة واحدة قد بلمرة أكمي، إضافة ميليلتر 180 خلية كل منها وسائل الإعلام دون FBS. إضافة 800 ميليلتر الوسائط بدون FBS من خلال الشقوق الإدراج. احتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية إنشاء تدرج إيل-8.
    ملاحظة: تجنب خلق الفقاعات في وسائل الإعلام. الوسائط المستخدمة دون FBS ولكن تكملها 100 نانوغرام/مليلتر من إيل-8 ك chemoattractant أو وسائل الإعلام النقي دون FBS، كعناصر سلبية.
  5. الحصول على ما مجموعة 6 × 105 خلايا لكل خط الخلية كما يلي:
    1. تجاهل سوبيرناتانتس وشطف مرة واحدة مع 10 مل من 1 x برنامج تلفزيوني، وإضافة 2 مل من 0.05% التربسين/0.48 ملم يدتا لمدة 2 دقيقة في 37 درجة مئوية لفصل الخلايا. إضافة 4 مل متوسطة المكملة التوقف عن رد فعل التربسين وريسوسبيند بشدة من بيبيتينج.
  6. أن 10 ميليلتر الكوة من تعليق خلية لحساب عدد الخلايا في دائرة نويباور. تأخذ كمية من تعليق خلية تحتوي على خلايا5 6 × 10. الطرد المركزي في 430 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت وتجاهل المادة طافية وشطف الخلايا في 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني. كرر الشطف مرة أخرى.
  7. ريسوسبيند الخلايا في 20 ميليلتر لوسائل الإعلام الخاصة بكل منها دون FBS ومكان في إدراج تحتوي على 180 ميليلتر لوسائل الإعلام الخاصة بكل منها دون FBS. مجانسة تعليق خلية بعناية قبل بيبيتينج.
  8. تسمح غزو الخلية للتقدم من أجل 48 ساعة عند 37 درجة مئوية في هوميديفيد 5% CO2 البيئة.
  9. بعد 48 ساعة، قم بإزالة الأقراص وتجاهل المادة طافية وشطف إدراج مرة جداً بعناية مع 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x. مع قضيب القطن ذات الرؤوس إزالة الفائض في برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: الخلايا الغازية وعادة ما يتم إرفاق إلى الجانب الآخر من الإدراج كما في هذه الحالة حيث تكون الخلايا ملتصقة.
  10. إصلاح الخلايا عن طريق وضع الإدراج في بئر لوحة الثقافة 24-جيدا مسطحة القاع الذي يحتوي على 1 مل/جيدا من بارافورمالدهيد 4% لمدة 15 دقيقة في الرايت Afterwards, شطف إدراج مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1 x.
  11. وصمة عار الخلايا عن طريق الإدراج في بئر من لوحة الثقافة 24-جيدا مسطحة القاع الذي يحتوي على 1 مل/جيدا لبرنامج تلفزيوني 1 x مع 0.2% الكريستال البنفسجي لمدة 45 دقيقة في "الرايت بعناية"، مع إزالة القطن ذات الرؤوس قضيب أكمي كل من الجزء العلوي من الغشاء ، التي تحتوي على الخلايا التي غير ترحيل، وشطف بعناية فائقة مع الماء المقطر لتجنب القضاء على إصلاح الخلايا الغازية.
  12. حساب عدد الخلايا الغازية بمراقبة الجانب السفلي من إدراج تحت المجهر المقلوب. يتم استخدام عدد الخلايا يعني من 3 حقول عشوائية (في التكبير X 100). في الحالات حيث قد غزت ككتل الخلايا ومن الصعب الاعتماد على حدة، الحصول على الصور من 3 حقول عشوائية (في التكبير X 100) مع كاميرا رقمية. تحليل الصور باستخدام برنامج لتحليل الصور واستخدم المدراء للتحديد الكمي لغزو الخلية (الشكل 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تحليل BrC الخلايا في الثقافات 3D المورفولوجية:

تم دراسة مورفولوجية الابتدائي BrC خلايا تنمو في الثقافات 3D كثافات منخفضة وعالية على مدى 5 أيام. خلال 48 ساعة الأولى، التمسك أكمي الخلايا والحفاظ على كثافة منخفضة. في هذه النقطة الزمنية، يمكن وضوح تقدير أن الخلايا الحالية على شكل يشبه شوكي ممدود، بعضها مع إسقاطات طويلة هيولى اثنين أو أكثر، ودون أن تظهر جهات الاتصال الظاهر خلية خلية. بعد 5 أيام ثقافة، تكاثرت الخلايا مع الاحتفاظ بهم مورفولوجيا أولية. وعلاوة على ذلك، تشكيل هياكل تشبه شبكات دون مؤسسة هيكلية معينة، وتظهر تكدست حتى مع لا إعاقة الاتصال. أجريت مقارنة مع عدم تحول الخلايا MCF-10A، التي تشكل هياكل كروية تشبه acini غدي. عرض هذه الخلايا مورفولوجيا مميزة لتقريب هياكل محددة جيدا ومنظم في أحجام متجانسة (من حوالي 50 ميكرومتر). على العكس من ذلك، مشاركة الابتدائي BrC الخلايا تشابه كثير أوثق مع العدوانية BrC الخلايا MDA-ميغابايت-231 (الشكل 1).

تحليل التفاعلات المباشرة خلية إلى خلية وتدهور الكولاجين:

لقد قمنا بتصميم نموذج 3D ثقافة المشتركة لتقييم ما يلي: خلية مورفولوجيا، وتدهور الكولاجين، هجرة الخلايا، وما إذا كان هناك تفاعل مباشر بين الخلايا BrC ووحيدات في ثقافة المشارك. بعد 5 أيام، سواء MCF-7 ونجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا BrC التجارية تشكل المجاميع غير منظم في الثقافات 3D، بيد أنها تختلف في مورفولوجيا بهم. شكل نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا العدوانية المجاميع مع أشكال ممدود مع بعض الخلايا التي تميل إلى فصل عن البقية، في حين تشكل خلايا mcf-7 غير العدواني المجاميع فيها الخلايا الحفاظ على أشكال دائرية ويبدو أنها أكثر كثافة المضغوطة (رقم 2 أ وب). رابعا الكولاجين دي كيو تأسست لتصور تدهور proteolytic (الخضراء)، مع كلتا الثقافتين BrC نستعرض النشاط الفلورسنت. لتقييم نشاط proteolytic كمياً، وتم قياس الفلورية الخضراء تفاؤلاً للميادين2 ميكرومتر 50 ستة. تم إجراء مقارنة بين الثقافات 3D الفردية لجمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا والثقافات المشتركة مع U937 وحيدات. ولوحظت زيادة يعتد به إحصائيا من بروتيوليسيس في ثقافة المشارك (الشكل 2-ج). أيضا، إجراء تحليل مجهرية [كنفوكل] للمسلسل مستقيمين مكدسات كل 10 ميكرون من جمعية نجمة داود الحمراء ميغابايت-231 ووحيدات U937 ثقافة المشارك كان يؤديها (الشكل 2د). وكشف هذا التحليل أن وحيدات U937 هاجر نحو الخلايا العدوانية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 مع بضع وحيدات التوصل إلى طبقة الخلايا BrC. ومع ذلك، فمن الواضح أن مواقع التفاعل المباشر-خلية لا يتزامن بالضرورة مع مجالات النشاط proteolytic أعلى: بدلاً من ذلك، مجالات تدهور الكولاجين موحد انتشرت في الثقافة، مما يؤدي إلى استنتاج أن الكولاجين وكان التدهور نتيجة للاتصالات غير المباشرة بوساطة عوامل يفرزها. ولذلك، تم تغيير نموذج ثلاثي الأبعاد الثقافة المشارك إلى مكان الخلايا في الأقسام المختلفة مفصولة بغشاء مسامية للسماح بالاتصال خلية استناداً إلى عوامل يفرزها، وتجنب خلية وسم والفرز بعد الثقافة.

تحليل لايل--1β في سوبيرناتانتس من الثقافات ثلاثي الأبعاد:

العمل مع ثقافات 3D التفاعل غير المباشر، سوبيرناتانتس من BrC الأولية الفردية كانت تحصد الثقافات وثقافاتها المشارك 5 أيام مع م. هذه supernatants تعرضوا لتحليل متزامنة السيتوكينات 18 ويتولى 5 استخدام مجموعات تجارية وأداة مصممة خصيصا لهذا التحليل. من تحليلها كل اختبار، لوحظ ارتفاع كبير في مستويات 1β إيل وايل-8 في الابتدائي BrC الوحيدات الخلية المشارك الثقافات، سواء السيتوكينات الالتهابية الحاسمة التي ارتبطت سابقا بالتقدم الخبيثة15، 18 , 19 , 20 (الشكل 3؛ والنتائج لايل-1β). هذا المثال هو نوع آخر من التحليل أن الثقافات 3D يسمح لتحاكي شبكة الاتصالات بالأشكال وورم المكروية.

توصيف سوبيرناتانتس وبنية أسيني:

استناداً إلى النظام التجريبي 3D وضعتها Debnath موثوسوامي وبروج7، حيث أنشئت MCF 10A كنموذج للآليات المرتبطة أونكوجينيسيس، تقييم ما إذا كانت العوامل التي يفرزها من الخلية BrC الأولية supernatants تأثر تشكيل MCF-10A 3D acini تشبه هياكل، مماثل للنشاط الذي لاحظ بعد توصيل المسرطنة الفيروسية والخلوية7،21 . وكانت الزنزانات MCF-10A المزروعة مع supernatants مختلفة اثنين من خطوط الخلايا BrC الابتدائية اثنين لمراقبة تشكيل التجويف (كمقياس لمقاومة anoikis). في يوم 14، قيمت الماغنيسيوم بالفحص المجهري [كنفوكل] تخفيضات مستعرضة في 0، 25، 50، 75، وعمق 100%، وفي كلتا الحالتين، ووجد أن MCF-10A الخلايا anoikis فرضوا (تقاس بإحصاء عدد الخلايا المركزية (لومينال) في أسيني (الرقم 4 ب، ج)). وهكذا، acini MCF-10A الخلية التي تتشكل مع وسائط الإعلام مكيفة من الخلايا BrC، تفتقر إلى تجويف أجوف بشكل جيد، على عكس 10A MCF التي تزرع مع المتوسط الثقافة القياسية (كما هو موضح في الخطوة 1، 2) (الشكل 4أ). في نظام الثقافة المشارك 3D، عاليا كان يفرز إيل-1β؛ ولذلك، كما كانت الخلايا MCF-10A المزروعة مع الإنسان المؤتلف 1β إيل18. الشكل 4 د يظهر مستعرضة مجهرية [كنفوكل] قص على عمق 50% من أسيني حضور إيل-1β (أفرقة أقل)، ويكشف عن أن هذا سيتوكين يمنح أيضا مقاومة anoikis. وبالتالي، تعزيز العوامل القابلة للذوبان يفرز من الخلايا BrC الأولية، مثل إيل-1β، البقاء غير تحول MCF 10A الخلايا التي تفقد التفاعلات ECM، سمة من سمات السرطانات الغازية.

الثقافات المشتركة 3D تعزيز استجابة التهابات المرتبطة بهجرة وحيدات وغزو الخلايا السرطانية:

أظهرنا سابقا أن تفرز خلايا BrC أولية في ثقافة 3D المستويات القاعدية العالية من المستقطبات برو التحريضية المعروفة لجذب وحيدات14. ومن ثم، قمنا بتحليل قدرات وحيدات استجابة المستقطبات وجدت أثري في وسائط الإعلام مكيفة من الخلايا BrC المهاجرة. تم تقييم قدرة المهاجرة وحيدات التجاري U937 و THP-1 والدورة الشهرية جديدة استجابة المستقطبات مختلفة ثلاث: GM-CSF، العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1، ورنتيس. وحيدات U937 و THP-1 كانت قادرة على ترحيل ردا على GM-CSF والعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1، مع U937 كالأكثر استجابة، بينما كان كلا وحيدات استجابة فارغة إلى رنتيس. الأهم من ذلك، أظهرت الدورة الشهرية نشاطا المهاجرة القاعدية عالية واستجابة أقوى للعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 (الشكل 5). كما اثريت إيل-8 بعد ثقافة المشارك 3D الابتدائي BrC الخلايا ووحيدات. ومن ثم، قمنا بتحليل سواء إيل-8 تعديل قدرة غزو خطوط الخلايا BrC التجاري والابتدائي. العدوانية BrC الخلية الخطوط التجارية (HS578T ونجمة داود الحمراء-ميغابايت-231) غزت استجابة لايل-8، في حين غير العدواني (MCF-7 و T47D) لا تغزو. المثير للدهشة، كانت خلايا أولية BrC الغازية أكثر من خطوط الخلايا BrC العدوانية التجارية استجابة لايل-8 (الشكل 6A، لوحات الحق). وفي بعض الحالات، تغزو الخلايا كمجموعات ومن الضروري لذلك التحليل المدراء (الشكل 6ب).

Figure 1
الشكل 1 : صور الممثل من الخلايا BrC في الثقافات 3D- من اليسار إلى اليمين: السيطرة على عدم تحول الخلايا MCF-10A تشكيل acini غدي المميزة، مع تقريب مورفولوجيا، الاتصالات خلية محددة جيدا، وتنظيم الهياكل ذات أحجام متجانسة (حوالي 50 ميكرون على التكبير البصري، ومتوسط 200 X). إظهار لوحات الأوسط الأولية BrC الخلايا المزروعة في الكثافة السكانية المنخفضة (3 أيام) وكثافة عالية (5 أيام). التمسك أكمي الخلايا والاحتفاظ بكثافة منخفضة في نقاط زمنية مبكرة. فمن الواضح أن الخلايا الحالية على شكل يشبه شوكي ممدود، بعضها مع إسقاطات طويلة هيولى اثنين أو أكثر، ومع لا التصاق الظاهر خلية خلية. من ناحية أخرى، شكلت الخلايا عالية الكثافة في نقطة لاحقة هياكل تشبه شبكات دون مؤسسة هيكلية معينة. هذه الخلايا يبدو تكدست يظهر تثبيط لا جهة اتصال. يتم عرض عنصر تحكم التجاري نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا بعد 5 أيام في الثقافة 3D؛ حصة هذه الخلايا BrC العدوانية تشابه أوثق كثيرا مع الثقافات BrC الأولية (التكبير البصري من 100 X). كانت تبذر مقياس بار يمثل 50 ميكرومتر. 800 الخلايا في بداية التجربة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : تحليل لتدهور إدارة المحتوى في المؤسسة. عدم العدوانية خلايا mcf-7 ملطخة أصفر فلوروتشرومي (A) والعدوانية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا الملون مع فلوروتشرومي أحمر (ب) المزروعة لمدة 5 أيام في ظروف 3D؛ 0.5 وأدرج % الكولاجين المسمى الفلورية الخضراء رابعا لتصور تدهور إدارة المحتوى في المؤسسة. في A و B، الصور اليسرى العليا تمثل مستويات تدهور الكولاجين ولوحات اليمين العلوي تمثل الصور الضوئية، اليسار السفلي تمثل الخلايا BrC ولوحات اليمين أسفل إظهار الدمج الفلورسنت وبصرى الصور. A و B، يتم عرض التكبير البصري من 200 X وشريط مقياس من 100 ميكرومتر. (ج) ممثل صور proteolysis ECM (الأخضر) في الثقافة 3D لجمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا الفردية كعنصر تحكم، مقارنة مع proteolysis ECM 3D الثقافة المشارك لجمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 مع U937 وحيدات. تمثل أشرطة مقياس 10 ميكرون. وتم قياس المدراء (الكثافة الضوئية المتكاملة) للحقول2 ميكرومتر 50 ستة من كل شرط. ويرد يعني والخطأ المعياري للوسط (SEM) من كوانتيفيكيشنز؛ وتمثل العلامات النجمية اثنين فرقا يعتد به إحصائيا مع ف < 0.01 (اختبار مان-ويتني). (د) التفاعل المباشر لجمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا (رمادي الظل الشامل) مع الملون فلوريسسينتلي U937 وحيدات (برتقالي)؛ ويناظر الفلورية الخضراء بروتيوليسيس. تم إنشاء شرائح المسلسل كل 10 ميكرون بالفحص المجهري [كنفوكل] لمعالجة الترجمة والتفاعل المباشر بين كل خطوط الخلايا. التكبير البصري من 200 ×؛ تمثل أشرطة مقياس 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: هو زيادة تركيز إيل-1β في الثقافات المشارك 3D- نتيجة الممثل واحد من مستويات إيل-1β (pg/mL) في supernatants من ثمانية (PC1-8) BrC خلايا أولية، مثقف فردي في 3D (3D)، ومقارنة ضد ثقافاتهم المشارك 3D مع الساعة (CC). وأدرج عنصر تحكم من بعد الظهر في الثقافة 3D الفردية للمقارنة (بعد الظهر). تم استخلاص النتائج من تحليل المتنوعة أكبر، حيث السيتوكينات عدة تم اكتشاف في وقت واحد في كل عينة عن طريق أسلوب المستندة إلى إيمونوديتيكتيون متاحة كمجموعة تجارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : حمل عوامل يفرز من خلايا أولية BrC مقاومة anoikis في عدم تحول الخلايا MCF 10A. كانت تزرع الخلايا MCF 10A في ظروف 3D مع معيار ثقافة الإعلام (العمود A ولوحات العلوي (د))، الذي يمكن أن يلاحظ أن أسيني تقديم لومن أجوف نموذجية (25-75% عمق أبرزت مع مربع أحمر)؛ عندما تكون الخلايا MCF-10A نمت مع اثنين سوبيرناتانتس مختلفة من ثقافتين BrC الأولية (الأعمدة B و C)، لومن ليست جوفاء ولكنها مليئة مع خلايا تدل على مقاومة anoikis. وبالمثل، عندما كانت الخلايا MCF-10A مثقف في ظروف 3D إضافة إيل الماشوب البشري-1β (20 نانوغرام/ملليلتر)، يمكن تقدير لا التجويف جوفاء في أقسام الفحص المجهري [كنفوكل] عمق 50% من أسيني (أفرقة أقل من (د)). يمثل الكاريكاتير البيضاوي حق مقاطع مجهرية [كنفوكل] التي تم إجراؤها على عمق 0، 25، 50 و 75 و 100% أسيني. صور تظهر الأنوية ملطخة DAPI (أزرق) وهاء-كادهيرين باللون الأخضر. التكبير البصري من 200 X، تمثل الأشرطة مقياس 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : القدرات المهاجرة من وحيدات. صور الممثلة المهاجرة قدرة U937، THP-1 وبعد الظهر ردا على GM-CSF، العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 ورانتيس. عناصر التحكم بدون تشيموكيني يتم تضمين (العمود الأول من اليسار إلى اليمين). الأرقام أدناه الصور تشير إلى عدد الخلايا المهاجرة في كل حالة؛ U937 ووحيدات THP-1 أساسا استجابة للآلية العالمية-CSF والعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1، بينما كانت الساعة أظهر قدرة عالية من هجرة في حد ذاتها، وكانت الخلايا الأكثر استجابة للعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1. التكبير البصري من 100 ×؛ تمثل أشرطة مقياس 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الرقم 6 : تغزو الخلايا BrC العدوانية والابتدائي في استجابة لايل-8- ألف غزو فحوصات مع اثنين غير العدواني (MCF-7 و T47D)، هما شديدة العدوانية (HS578T ونجمة داود الحمراء-ميغابايت-231) BrC خطوط الخلايا والثقافة BrC الابتدائي واحد استجابة لايل-8 تستخدم ك chemoattractant. لوحات العلوي تتوافق مع الضوابط دون chemokine عرض لا غزو، إظهار فريقي أقل استجابة لايل-8، مع عدوانية شديدة BrC الخلايا والخلايا BrC الأولية الغازية عن طريق الغشاء لإدراج ثقافة الخلية. ب مثال للخلايا التي تغزو في مجموعات؛ وفي هذه الحالات، يتم قياس لغزو مع برنامج تحليل صورة لتحديد الغزو من حيث المدراء (الكثافة الضوئية المتكاملة) كل منطقة. تمثل الأرقام أدناه الصور عدد الخلايا الغازية في كل حالة. التكبير البصري من 100 ×؛ تمثل أشرطة مقياس 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تنمو الخلايا الظهارية في تكيف ثلاثية الأبعاد مكانية وتفاعلها مع بروتينات ECM المحوري للتوازن الأنسجة. دراسات السرطان كثيرة تستند إلى خلايا تزرع في مونولاييرس (2D) وعلى الرغم من أنها كانت حاسمة بالنسبة لفهم جوانب عديدة من تشكيل الورم والتقدم، مونولاييرس لا الخص الخصائص التي يفرض إدارة المحتوى في المؤسسة في الخلايا، مثيل: الحد من انتشار وبقاء الخلية تعتمد على الالتصاق، قطبية قمي باسولاتيرال، إعادة عرض المحتوى، وتمايز الخلية، إلخ الأهم من ذلك، ليس فقط بالتفاعل بين الخلايا السرطانية وإدارة المحتوى في المؤسسة ضرورية لتطور السرطان، ولكن أيضا إقامة الاتصال بين الورم والخلايا غير السرطانية، مثل الخلايا المناعية. البروتوكولات المقدمة هنا تيسير فهم التفاعلات بين الخلايا المناعية والخلايا السرطانية داخل البيئة تعزز الاستجابة الالتهابية من إدارة المحتوى في المؤسسة، بهذه التفاعلات، وكيفية إنشاء هذا الشرط التحريضية حلقة إيجابية تعزيز تشيمواتراكشن وحيدات وغزو المزيد من الخلايا السرطانية.

ميزة كبيرة لاستخدام أكمي أنه يوفر نماذج سقالة بيولوجية مناسبة لأداء مجموعة متنوعة من 3D تجريبية22. هو إثراء مع بروتينات ECM مثل laminin والكولاجين الرابع، انتاكتين، وبروتيوغليكان كبريتات heparan وعوامل النمو، التي في فيفو سوف تتفاعل مع الخلايا الظهارية. عيب أن لأنها تأتي من ليساتيس من موريني اللحمية، وتركيز مكوناتها يتراوح بين الكثير مختلفة. لذا، من الضروري غالباً ما تميز الكثير عدة للحصول على بيانات أكثر تجانساً. في المختبر، يتم اختبار كل الكثير الجديدة بطريقتين: 1) بتقييم تشكيل خلايا MCF 10A acini الصحيح، 2) تقييم اختزاع BrC الخلية خطوط القدرة الغازية الراسخة. ثمة خيار آخر هو للعمل مع منتجات السقالات الأخرى، مثل المائية، وسقالة ببتيد نانوفيبير اصطناعية. يمكن التحكم بصلابة للثقافة 3D بضبط تركيز المائية23،24. الأهم من ذلك، يمكن تطبيق هذا النظام دراسة التفاعل بين أي نوع من الخلايا الورمية والمكونة للدم أو خلايا غير-المكونة للدم. من الممكن حتى لتصميم أنظمة أكثر تعقيداً باستخدام اثنين أو أكثر خلية مختلفة الأنساب. ميزة هامة واحدة من النماذج ثلاثية الأبعاد هو أنها تسمح لدراسة مورفولوجيا الخلايا والخلايا منظمة تشكلها التفاعلات إدارة المحتوى في المؤسسة، التي تتغير أثناء التحول النمطان. وبالمثل، واحد يمكن دراسة النمطان ميزات مثل تدهور بروتيوليتيك، وما إذا كان وضع الخلايا في البداية في طبقات مختلفة من الثقافة إشارة إلى بعضها البعض لتعزيز التفاعل والاتصالات المباشرة. علاوة على ذلك، يمكن أن يكون المسمى الأنساب خلية مختلفة مع فلوروتشروميس مختلفة حتى يمكن أن تكون معزولة بعد التجربة لمعالجة مسائل محددة لكل نوع من أنواع الخلايا الفردية، على سبيل المثال باستخدام الحمض النووي الريبي و/أو البروتين تحليل التعبير13،. هنا، يظهر إفراز 1β إيل إلى المتوسطة في الابتدائي BrC الخلايا/م الثقافات المشارك، دعم دور محوري ممكنة من هذا سيتوكين في الاتصالات غير المباشرة بين الخلايا السرطانية ووحيدات أن يؤدي التقدم الخبيث.

هو بروتوكول تجريبي أساسي آخر في المختبر تحليل لتشكيل acini في الثقافات 3D MCF-10A غير تحول الخلايا. كان يستخدم هذا التحليل لاختبار النشاط السرطاني الفيروسية والخلوية، واختبار كيف يؤثر وورم المكروية ميزة تتصل بالسرطانات العدوانية. خلال التطور الطبيعي أسيني، على سبيل المثال، تفقد الخلايا المركزية لومينال الاتصال مع بروتينات الغشاء القاعدي (تقدمها أكمي) أحداث آليات لموت الخلية، يعرف باسم anoikis. ولوحظ أن كلا سوبيرناتانتس من خلايا أولية BrC أو 1β إيل المؤتلف تعزيز MCF 10A خلايا المقاومة إلى anoikis. لأنه يتم تشجيع تركيز عال لايل-1β عند التفاعل الوحيدات الخلية BrC، تدعم هذه الملاحظة أن ستروما الورم جزءا لا يتجزأ من تطور الورم إلى مراحل شديدة العدوانية.

وتشكل البروتوكولات الهجرة وغزو الموصوفة هنا فحوصات مكملة 3D المفيدة التي يمكن أن ندعم قدرة الخلايا على الهجرة أو غزو في الاستجابة للمحفزات المستمدة من ستروما الورم. فقد تبين أن المستقطبات (GM-CSF والعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1) وجدت بتركيزات مرتفعة في الثقافات 3D الابتدائي BrC الخلايا يمكن أن تعزز هجرة U937، THP-1، والدورة الشهرية، دعم قدرة الخلايا السرطانية العدوانية على تشجيع المكروية برو تحريضية. وعلاوة على ذلك، عززت إيل-8 موجودة أيضا في زيادة تركيز في supernatants من الثقافات المشتركة BrC الخلايا/وحيدات، زيادة غزو تجاري من خلايا BrC العدوانية (HS578T ونجمة داود الحمراء-ميغابايت-231) وخلايا أولية BrC.

فيما يتعلق بحالة الخلايا، من المهم العمل مع خلايا BrC أولية قبل أن تصل إلى عشرة مقاطع الاستفادة من ذروتها الانتشار وتجنب العزلة بعد وراثية وجينيه التغييرات المحتملة الناتجة في المختبر الثقافة. جانب أساسي آخر عند العمل مع الخلايا الأولية لتأكيد هويتهم بعد عزلة. كنا فريقا من المؤشرات الحيوية لتحديد هويتهم النسب الظهارية، التي تشمل بنك "و" Muc-1 "و" ابكام (المحدد في الخطوة 2، 5). وبالمثل، فمن الأفضل استخدام الدورة الشهرية الطازجة، التي يتم اختبار كل دفعة مؤكدا أنهم في المرحلة نفسها من التمايز. وقدم كل دفعة جديدة تستخدم النمط الظاهري CD34الراتب CD11bpos CD14نقاط البيع CD64نقاط البيع CD68neg CD16neg، الذي يتوافق مع عدم تفعيلها وحيدات غير ناضجة. الأهم من ذلك، أننا لا تخلط وحيدات من مختلف الجهات المانحة، كخلط النتائج في تفعيل الوحيدات. بدلاً من ذلك، نحن اختبارها بشكل مستقل BrC اشتركت الثقافات استخدام وحيدات من جهات مانحة مختلفة اثنين على الأقل.

لا تزال لديها نظم الثقافة 3D الحد أن إلا عدد قليل من العناصر للبيولوجيا الورم يمكن أن تكون على غرار موثوق بها. بديل جديد هو 3D نماذج أكثر تعقيداً من أورجانويدس، التي تقوم على التوسع وتمايز الخلايا الجذعية في المختبر. أورجانويدس أيضا تطوير هياكل الظهارية درجة عالية من التنظيم. وتشمل الأمثلة المعدة 25،26، 27من الكبد، والكلى أورجانويدس28. ومع ذلك، تظل نماذج أورجانويد لكل الأعضاء البشرية تحقيقها؛ وعلاوة على ذلك، فإنها تتطلب الظروف التجريبية أكثر تعقيداً وتكلفة.

وفي الختام، هنا يصف لنا بالتفصيل سير عمل لفحوصات: بدءاً من عزل الخلايا السرطانية من المرضى BrC، اختبار قدراتها التحريضية في نموذج ثقافة 3D على أساس أكمي، اختبار كيف تخدمهم تلك المكروية التحريضية لتجنيد التهاب خلايا إضافية، مثل وحيدات، وأخيراً تحليل الاتصالات بين كل أنواع الخلايا، وكيف أن هذه الرسالة كذلك يشجع المكروية تحريضية التي تعزز التقدم إلى مراحل السرطان أكثر عدوانية. بالإضافة إلى ذلك، يصف لنا بالتشكل والنمط الظاهري لخلايا أولية BrC. في المستقبل دراسات، سيكون من المثير للاهتمام أن اختبار الخلايا التحريضية الأخرى أو حتى اختبار الاتصال بين الخلايا BrC، وغالباً ما توجد في ستروما ورم خلايا متعددة. ستوفر هذه الخلية متعددة الثقافات 3D صورة أكبر من ما يحدث بيولوجيا في فيفو أثناء تطور السرطان. إجراء مقارنات بين البيانات في المختبر والنتائج السريرية المريض ستحدد الآليات المحتملة التي لها تأثير أكبر على سرطان العدوانية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أنه ليس لديهم أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من مبرزين فونسيك أفريقيا جنوبي الصحراء/الضمان الاجتماعي/عمال المشروع رقم 233061 إلى ازكويل م فوينتس-Pananá وفوندو دي الدعم على غرار الدراسات، مستشفى الأطفال في المكسيك فريدريكو غوميز (المشروع رقم HIM-2014-053). نا اسبينوزا-سانشيز طالب دكتوراه من Programa de دوكتورادو en Biomédicas العلوم، الجامعة الوطنية المستقلة بالمكسيك (يونام) وتلقت زمالة 231663 من المجلس الوطني. ه-ق "نا"، نعترف أيضا بالدعم المالي المقدم من المعهد المكسيكي "الضمان الاجتماعي" (الضمان الاجتماعي).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
U937 American Type Culture Collection ATCC  CRL-1593.2 Monocytic cell line/histiocytic lymphoma 
THP-1 American Type Culture Collection ATCC  TIB-202 Monocytic cell line/acute monocytic leukemia 
MCF-10A American Type Culture Collection ATCC  CRL-10317 Non-transformed breast cell line
MCF-7 American Type Culture Collection ATCC  HTB-22 Breast Cancer Cell line
T47D American Type Culture Collection ATCC  HTB-133 Breast Cancer Cell line
HS578T American Type Culture Collection ATCC  HTB-126 Breast Cancer Cell line
MDA-MB-231 American Type Culture Collection ATCC  HTB-26 Breast Cancer Cell line
RPMI 1640 medium GIBCO BRL Life Technologies 11875-093
DMEM High Glucose  GIBCO BRL Life Technologies 11964-092 4.5 g/L glucose
DMEM/F12 GIBCO BRL Life Technologies 11039-021
Antibiotic/Antimycotic GIBCO BRL Life Technologies 15240-062 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone
Fetal Bovine Serum GIBCO BRL Life Technologies 16000-044
Horse serum  GIBCO BRL Life Technologies 16050114
0.05% Trypsin-EDTA 1X GIBCO BRL Life Technologies 25300-062
PBS 1X (Phosphate Buffered Saline GIBCO BRL Life Technologies 20012-027
Epidermal Growth Factor (EGF) PeproTech AF-100-15 (1.00mg)
Insulin SIGMA-ALDRICH I1882-100MG
Hydrocortisone SIGMA-ALDRICH H088-5G
Cholera toxin Vibrio cholerae SIGMA-ALDRICH C8052-1MG
Matrigel  Corning Inc 356237 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C
GM-CSF PeproTech 300-03
MCP-1 PeproTech 300-04
RANTES PeproTech 300-06
IL-8 PeproTech 200-08
IL-1β PeproTech 200-01B
Crystal-violet Hycel México 541
Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH P6148
Transwell permeable supports (inserts) Corning Inc 3422 6.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates 
Transwell permeable supports (inserts) Thermofisher Scientific 140620 6.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates 
Monocyte Isolation Kit II Human  Miltenyi Biotec 130-091-153
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate Assay EMD Millipore HCYTOMAG-60K
Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation) Luminex Corporation 40-072
Lab-Tek chamber slide with cover (8 well) Nalge Nunc International 177402
Glass bottom microwell 35mm petri  dishes MatTek Corp. P35G-1.5-14-C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rich, J. N. Cancer stem cells: understanding tumor hierarchy and heterogeneity. Medicine (Baltimore). 95 (1), Suppl 1 2-7 (2016).
  2. Wang, M., et al. Role of tumor microenvironment in tumorigenesis. J Cancer. 8 (5), 761-773 (2017).
  3. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  4. Sica, A., et al. Macrophage polarization in tumour progression. Semin Cancer Biol. 18 (5), 349-355 (2008).
  5. Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
  6. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  7. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  8. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111 (1), 29-40 (2002).
  9. Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nat Cell Biol. 3 (9), 785-792 (2001).
  10. Sameni, M., Dosescu, J., Moin, K., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol Imaging. 2 (3), 159-175 (2003).
  11. Sameni, M., et al. MAME models for 4D live-cell imaging of tumor: microenvironment interactions that impact malignant progression. J Vis Exp. (60), (2012).
  12. Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr Protoc Cell Biol. 4, Chapter 4 Unit 4 20 (2008).
  13. Chimal-Ramirez, G. K., et al. MMP1, MMP9, and COX2 expressions in promonocytes are induced by breast cancer cells and correlate with collagen degradation, transformation-like morphological changes in MCF-10A acini, and tumor aggressiveness. Biomed Res Int. 2013, 279505 (2013).
  14. Espinoza-Sanchez, N. A., Chimal-Ramirez, G. K., Mantilla, A., Fuentes-Panana, E. M. IL-1beta, IL-8, and Matrix Metalloproteinases-1, -2, and -10 Are Enriched upon Monocyte-Breast Cancer Cell Cocultivation in a Matrigel-Based Three-Dimensional System. Front Immunol. 8, 205 (2017).
  15. Li, Y., Wang, L., Pappan, L., Galliher-Beckley, A., Shi, J. IL-1beta promotes stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation. Mol Cancer. 11, 87 (2012).
  16. Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Curr Protoc Mol Biol. 10, Chapter 10 Unit 10 18 (2008).
  17. Troeberg, L., Nagase, H. Zymography of metalloproteinases. Curr Protoc Protein Sci. 21, Chapter 21 Unit 21 15 (2004).
  18. Arevalo-Romero, H., Meza, I., Vallejo-Flores, G., Fuentes-Panana, E. M. Helicobacter pylori CagA and IL-1beta Promote the Epithelial-to-Mesenchymal Transition in a Nontransformed Epithelial Cell Model. Gastroenterol Res Pract. 2016, 4969163 (2016).
  19. Reed, J. R., Leon, R. P., Hall, M. K., Schwertfeger, K. L. Interleukin-1beta and fibroblast growth factor receptor 1 cooperate to induce cyclooxygenase-2 during early mammary tumourigenesis. Breast Cancer Res. 11 (2), 21 (2009).
  20. Ma, L., et al. Epidermal growth factor (EGF) and interleukin (IL)-1beta synergistically promote ERK1/2-mediated invasive breast ductal cancer cell migration and invasion. Mol Cancer. 11, 79 (2012).
  21. Grande, S. M., Bannish, G., Fuentes-Panana, E. M., Katz, E., Monroe, J. G. Tonic B-cell and viral ITAM signaling: context is everything. Immunol Rev. 218, 214-234 (2007).
  22. Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev. 79-80, 3-18 (2014).
  23. Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
  24. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  25. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
  26. Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric Organoids: An Emerging Model System to Study Helicobacter pylori Pathogenesis. Curr Top Microbiol Immunol. 400, 149-168 (2017).
  27. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  28. Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nat Cell Biol. 16 (1), 118-126 (2014).

Tags

سرطان علم الأحياء، العدد 131، "ثلاثي الأبعاد" (3D) الثقافة، استخراج المصفوفة خارج الخلية (أكمي)، اشتركت الثقافة وحيدات، سرطان الثدي (BrC)، والورم الخبيث، النظام، ورم المكروية الاتصالات
تحليل الاتصالات بين وحيدات وخلايا سرطان الثدي الأولية في مصفوفة خارج الخلية استخراج (أكمي)-على أساس نظام ثلاثي الأبعاد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Espinoza-Sánchez, N. A.,… More

Espinoza-Sánchez, N. A., Chimal-Ramírez, G. K., Fuentes-Pananá, E. M. Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System. J. Vis. Exp. (131), e56589, doi:10.3791/56589 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter