Summary
여기, 우리는 기본 유 방 암 세포 뿐만 monocytes 그리고 콜라겐 저하, 면역 세포 모집, 셀 결과 함께 그들의 직접/간접적인 상호 작용 연구로 형태를 분석 하는 3 차원 문화 방법 설명 침공, 그리고 암 관련 된 염증의 승진.
Abstract
세포 외 기질 (ECM)에 포함 된 정상 및 종양 약 상피 세포 속속들이 조 혈 및 비 조 혈 세포, 따라서 크게 영향을 미치는 정상 조직의 항상성 및 질병 결과와 통신 합니다. 유방암, 종양 관련 된 대 식 세포 (Tam) 역할을 중요 한 질병의 진행과 전이, 재발; 따라서 질병을 제어 하는 것이 중요이 monocyte chemoattraction 종양 microenvironment 및 종양 세포와 그들의 상호 작용의 메커니즘을 이해. 여기, 우리는 인간 유방암 (BrC) 세포 및 인간 monocytes의 3 차원 (3D) 공동 문화 시스템에 대 한 자세한 설명을 제공합니다. BrC 셀 생산 활성화에 규제의 높은 기초 수준, 정상적인 T 세포 표현 (RANTES) 분 비, monocyte chemoattractant 단백질-1 (MCP-1), 그리고 granulocyte macrophage 식민지 자극 인자 (G-CSF), monocytes, 공동 문화에 프로 염증 성 cytokines 인터 루 킨 (IL)-1 베타 (IL 1β) 및 IL-8 매트릭스 metalloproteinases (MMP)-1, MMP-2, 및 MMP-10 풍성 하 게 했다. 이 종양 기질 microenvironment 승진 anoikis MCF 10A 3D acini 같은 구조, monocytes의 chemoattraction 그리고 적극적인 BrC 셀의 침공에 저항. 여기에 제시 된 프로토콜 내 종양 커뮤니케이션을 공부 하는 저렴 한 대안을 제공 하 고 3D 셀 시스템 생체 외에서 심문 종양 관련 종양 생물학의 특정 기능을 제공 하는 중대 한 잠재력의 예 침략입니다.
Introduction
종양 생물학은 이전에 생각 보다 훨씬 더 복잡 한. 종양 세포는 억제 되지 않는 확산 셀;의 단순한 대량 보다 더 많은 보여주는 증거를 장착 오히려, 다른 종양 약 세포 높은 조직과 종양1내에서 계층 구조를 표시 하는 다른 기능을 수행 같다. 종양 세포는 또한 비 변형 세포와의 친밀 한 커뮤니케이션에서: 대 식 세포, 섬유 아 세포, 림프 톨, adipocytes, 내 피 세포, 다른 셀 들 모두에 몰입 하는 비 계 단백질 및 다 당 류는 ECM을 구성 하는. 수많은 직접 및 간접적인 상호 작용 변환 및 비 변형 세포 사이 및 질병 결과2,3에 강력한 영향을 미치는 ECM으로 설정 됩니다. BrC의 특정 한 경우에 그것은 특히 Tam, 고려는 Tam 발견 되었습니다는 종양의 진화에 중요 한 역할을 증가 하는 전이의 위험과 질병 재발4의 BrC 셀의 통신을 해 부하는 것이 중요 ,5.
내부 종양 상호 작용 및 그들의 가능한 결과 분석, 새로운 3D 생체 외에서 방법을 개발 되었으며, 훨씬 더 복잡 한 microenvironment를 제공 하는 ECM 추출 물의 사용에 따라 종양 생물학, 비교에서의 현실에 가까운 기존의 단층 세포 배양 세포 성장 플라스틱에 첨부. 피터슨와 Bissell6 아의 첫 번째 모델을 제공 하 고 악성 유 방 상피 세포 laminin 풍부한 지하실 멤브레인에 교양 아 인간을 차별 하는 3D organotypic 구조를 설명 하는 첫번째 이었다 그들의 악성에서 유 방 상피 세포입니다. 10 년 뒤, 모델 Debnath, Muthuswamy에 의해 개발 및 브루 게7,,89 선의 acini의 악성 변환 하는 동안 손상 하는 생물 학적 경로 명료 하 게 하는 귀중 한 도구 제공 등 통제 확산, 장애인된 셀 분극의 증거 및 anoikis, 셀 저항 결과로 acini 루멘으로 꽉 접합 단백질의 delocalization 인해 큰 acini 형성으로 프로그램 된 세포 죽음의 종류를 발생 앵커리지-종속 셀 때 그들은 주변 ECM에서 분리. Sameni, Jedeszko, 및 슬론의 모델은 밀접 하 게 침입, 종양 암10,,1112의 또 다른 중요 한 특성에 관련 된 세포에 의해 이미징 분해 활동에 집중 했다. 섞인 다른 형광 침묵 단백질 기질 단백질 행렬에 의존 하는이 모델 (DQ 젤라틴, DQ-콜라겐, 그리고 DQ 콜라겐 IV), 어떤 형광 신호에는 콜라겐의 분해 저하의 지표. 3D 모델 변형 비 둘 다의 줄기 세포 속성과 셀의 집계, spheroids 라고 하는 종양 세포를 공부 하는 데도 사용, ECM 같은 단백질 세포 분화, 비대칭의 메커니즘에 대 한 질문 또는 정지에 경작 될 수 있습니다. 세포 분열, 세포 준수, 및 세포 운동 성13,14. 침공 분석 실험 종양의 본질적인 공격 성과 침략 과정15중 chemoattractants로 봉사 하는 분자의 식별의 테스트 수 있습니다. 전반적으로, 3D 모델의 체 외에서 세포 배양 정상 및 종양 조직 morphogenesis 더 밀접 하 게 반영 하는 저렴 한 다양화를 나타냅니다.
우리 인간의 상업 BrC 셀 라인 알려진된 공격적 잠재력 (luminal 및 트리플-네거티브 형식) 및 기본을 사용 하 여 상기 모델7,,1011에 따라 3D 셀 공동 문화 시스템 설계 셀 explanted BrC 환자에서. 우리가 먼저 적극적인 비 (MCF-7) 또는 공격적 (MDA-MB-231) BrC 셀 U937 monocytes 기질 추출 (ECME)와 공동 경작 했다 모델 개발-직접 셀 상호 작용을 허용 하는 3D 시스템을 기반으로. 이러한 공동 문화 어떻게이 두 세포 계보 간 통신 암 공격적인 행동에 관련 된 유전자의 세트의 녹음 방송에 영향을 결정 하기 위해 사용 되었다. 2 cyclooxygenase (COX-2) 대 본의 상당한 증가 하는 제품 중 하나는, 스타 글란 딘 E2 (PGE2), 암 진행에서 염증의 역할을 강조 하는 발견의 생산 증가와 동시에 관찰 되었다. MMP의 증가 전사 또한 적극적인 MDA-MB-231 셀 U937 monocytes DQ 콜라겐 IV 포함 된 문화에 함께 공동 경작 했다 때 큰 콜라겐 베이스와 상관 하는 관찰 되었다. 메모의, 우리의 공동 문화는 세포 세포 상호 작용 메커니즘 콜라겐 저하에 필요한 가정을 지원 하지 않았다. 그것은 오히려 두 세포 계보 간 통신 분 비 분자에 의해 중재 했다 제안 했다. 또한, 이러한 공동 문화 분석 실험에서 수확 supernatants 선의 acini MCF 10A 세포 변형 비13에 의해 형성 된 무질서 수용 성 요소 포함. 그것은 발견 하는 적극적인 고 기본 BrC 세포 분 비 상승 monocyte 혈 분자 MCP-1 GM-CSF와 RANTES의 수준. 따라서, 우리는 세포 세포 세포 상호 작용을 방지 하기 위해 셀 문화 삽입에서 분리 되었다 3D 문화 설명. 이러한 문화는 BrC 세포, monocytes 사이 간접 통신을 해결 하기 위해 사용 되었다. 이 분석 실험, 비 공격적이 고 적극적인 상업 BrC 셀 라인 및 기본 BrC 셀, 인간 monocytes의 세 가지 유형: 상업 U937 및 THP-1 셀, 그리고 기본 monocytes (PMs) (모두 건강 한 기증자의 주변 혈액에서 분리 monocytes는 활성화 되지 않은 상태에서 사용 했다) 사용 되었다. 염증 성 cytokines 일리노이-1β 및 IL-8의 증가 농도 공동 문화에 농축 될 관찰 되었다. 마찬가지로, MMP-1, MMP-2, 및 MMP 10 BrC 셀 monocyte 공동 문화, 그리고 이렇게 강화 이전 결과14에 증가 또한 했다 발견 했다. 이 원고에서 기본 BrC 세포 격리 및 3D 문화에서 테스트 포인트 워크플로 대표적인 결과 함께 제공 됩니다. 이 작품 구성 종양 생물학의 특정 측면이 3D 셀 시스템 생체 외에서 제공 하는 중대 한 잠재력의 좋은 예.
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Protocol
BrC 환자에서 샘플과 드 Investigación en Virología y Cáncer, 병원 Infantil 드 멕시코 페데리코 고메스의 조직 은행에서 얻은 했다. 이 연구는 과학에 의해 승인 되었다, 윤리, 및 생물 병원 Infantil 드 멕시코 페데리코 고메스의 보드 검토: 위원회 회의 드 Investigación, 위원회 회의 드 Ética en Investigación 및 위원회 회의 드 Bioseguridad. 모든 환자는 prospectively 등록 했다와 연구의 본질에 대 한 정보를 했다: 그 참여 하고자 표본 수집 전에 한 서 면된 동의 서명 하 고 윤리적 지침 및 최고의 임상 연습의 취급 했다 기관입니다. 참가자의 정체성 연구 기간에 대 한 익명 이었다. 포함 하는 환자는 침략 적인 ductal 암, 조직학 급료 2와 임상 단계 II, 조직 절제 하기 전에 아무 이전 neoadjuvant 요법으로 진단 했다. 환자 했다 모든 여성 세 평균 56.8 세 (범위 75 42)14.
1. 3D 세포 배양
- 시드 0.1 x 106 MCF 10A 셀 또는 기본 BrC 셀 5% 보충 DMEM/F12 문화 매체와 25 cm2 문화 플라스 크에 말 혈 청, 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 100 ng/mL 콜레라 독 소, 0.5 µ g/mL 날린, 10 µ g/mL 인슐린, 그리고 20 ng/mL의 표 피 성장 인자 (EGF). 시드 0.1 x 106 상업 BrC 셀, MCF-7 셀, 및 75 cm2 MDA-MB-231 셀 DMEM/F12 문화 매체와 10 %FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스 보충 플라스 크를 문화. 37 ° c 습도 5%에서 품 어 CO2 환경.
- 48 h 후 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 살 균 1의 10 mL와 함께 셀 단층을 씻어. 0.05 %trypsin 및 0.48 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 37 ° c.에 5-10 분의 3 mL 솔루션 셀 단층 trypsinize 200 µ L trypsinization 막으려고 해당 혈 청의 보충 없이 매체의 7 mL를 추가 합니다. Pipetting으로 셀 resuspend 고 Neubauer 챔버에 셀 10 µ L의 약 수를 제거 합니다.
- 8 잘 챔버 슬라이드 시스템의 각 우물에서 순수한 ECME, 37 ° c.에 30 분의 부 화 뒤의 40 µ L 기반 확산
- 각 잘에서 배치 단계 1.1 하지만 다음 변경 보완 (페 놀 레드) 없이 DMEM/F12의 400 µ L에서 resuspended 800 셀: 4 ng/mL EGF와 2%의 추가 기본 BrC 셀 및 MCF 10A 셀, ECME; MCF-7 및 MDA-MB-231, 추가 2 %ECME.
- 습도 5%에서 37 ° C에서 문화를 품 어 CO2 환경. 문화 미디어 모든 48 h를 교체 합니다.
- 형태학 상 기록 변경 셀의 모든 24 h 15 일 광학 현미경으로 합니다. 기본 BrC의 형태를 분석 하 셀, MCF 10A 및 MDA-MB-231 셀 회선이 좋은 참조 셀에 대 한 정렬 된 포상 대형 그리고 무질서 공격적인 암 같은 구조, 예 각각 합니다.
- 100 X 200 X 확대의에 밝은 분야 현미경 검사 법에 있는 셀의 이미지를 얻 및 참조 MCF 10A와 MDA-MB-231 셀 라인 (그림 1) 셀 형태를 비교 합니다.
2. 종양 조직에서 기본 암 세포를 얻기
참고: 얻기 위해 종양 상피 세포 사용 BrC 환자에서 절제 기본 종양에서 조직 없이 이전 neoadjuvant 요법; 괴 사 성 영역을 방지 하 고 종양 조직의 0.5 c m3 의 최소와 함께 작동.
- 살 균 1 x PBS 가진 종양 조직 린스를 기계적으로 메스와 함께 1-2 m m 조각으로 세분화 합니다.
- 실내 온도 (RT) 따라 솔루션의 2 mL에 2 h에 모자 살 균 20 mL 유리 유리병에 조직 소화: 어 DMEM/F12 매체 포함 100 U/mL 페니실린에 100 µ g/mL 스 100 U/mL hyaluronidase 1 mg/mL 콜라 유형 혼합 지속적인 교 반으로.
- 소화 되지 않은 조직의 큰 조각을 제거에 얇은 명주 그물의 멸 균된 조각 통해 결과 정지를 필터링 합니다. 다음 필터링 소독된 100 µ m 기 공 세포 막을 통해 세포 현 탁 액.
- 430 x g RT에서 5 분 동안에 세포를 작은 하 고 살 균 1 x PBS로 두 번 그들을 씻어. DMEM/F12 매체와 5% 말 혈 청, 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 100 ng/mL 콜레라 독 소, 0.5 µ g/mL 날린, 10 µ g/mL 인슐린, EGF의 20 ng/mL 보충에 문화 기본 셀. 모든 48 h. 유지 습도 5%에서 37 ° C에서 문화 매체를 대체 CO2 환경.
- 고립 된 세포 상피 세포 immunocytochemistry14의 표준 프로토콜 인지 확인 합니다. 3 상피 마커 테스트: cytokeratins (PanCK)의 패널 mucin-1 (Muc-1), 그리고 상피 세포 접착 분자 (EpCAM).
3. 말 초 혈액에서 오후 세포 분리
- 건강에서 말 초 혈액의 추출 약 40 mL 자원 봉사, 살 균도 무료 1 x PBS와 1:3 비율에서 혈액을 희석 하 고 밀도 그라데이션 분리 대상.
- 원뿔 튜브에서 1.077 g/mL의 조밀도 가진 polysucrose와 나트륨 diatrizoate 매체의 2 개 mL를 놓습니다. 신중 하 고 천천히 8 mL 희석된 혈액의 오버레이. 실시간 사용은 원심 분리기의 느린 가속-감속 속도에서 765 x g 30 분 동안 원심 분리기.
참고: 원심, 후 4 층 형성 됩니다 아래에서 위로: 적혈구 펠 릿, 밀도 그라데이션 중간 레이어, 단 세포 층 (정밀한 백색 반지로 표시), 그리고 플라즈마 레이어. - 신중 하 게 살 균 파스퇴르 피 펫으로 그라데이션에서 단 셀 계층을 검색 하 고 그들을 씻어 세 번 1 x PBS를 가진 느린 원심 분리 하 여 각 시간 (430, 275, 및 191 x g) 실시간에서 10 분
- 부정적인 선택 프로토콜을 사용 하 여 세포의 활성화를 방지. 이러한 프로토콜의 예로 다음과 같은:
- 단 셀 버퍼링 세척 솔루션 (0.5% 소 혈 청 알 부 민, 2 mM 1 x PBS에 EDTA)을 한번 씻는 다. Neubauer 챔버에 셀 고 버퍼 솔루션의 1 x 107 셀/30 µ L의 밀도에 그들을 조정 합니다.
- 모든 1 x 107 셀에 대 한 FcR 차단 시 약 및 안티 인간 CD3, CD7, CD16, CD19, CD56, CD123, 및 Glycophorin A (상업 키트에 포함)를 포함 하는 monocyte biotin 항 체 칵테일의 10 µ L의 10 µ L를 추가 합니다.
- 혼합 셀 및 4 ° c.에 15 분 동안 품 어 추가 버퍼링 세척 솔루션의 추가 30 µ L 플러스 20 µ L의 안티 비오 microbeads (키트에 포함); 혼합 셀 및 4 ° c.에 20 분 동안 품 어
- 워시 셀 한번 버퍼링된 솔루션 RT에서 5 분 동안 430 x g에서 원심과 1.5 mL에 resuspend 자력 분리에 대 한 솔루션을 버퍼링 합니다.
- 미리 씻어 서 자력 분리 열에 세포 현 탁 액을 로드 하 고 버퍼 솔루션의 7 mL를 추가 합니다. 15 mL 원뿔 튜브에 monocyte 농축 분수 수집, 셀, 및 즉시 경작 하지, 하는 경우 동결 monocytes DMEM/F12 매체 −80 ° C에서 50 %FBS 10 %DMSO 보충의 2 x 106 셀/1 mL의 농도에서
참고: 그들의 생존을 손상 될 수 있습니다 대로 동결, 2 개월 이상 후 monocytes를 사용 하지 마십시오.
- DMEM/F12 매체와 6 %FBS, 100 U/mL 페니실린, 습도 5%에서 37 ° C에서 100 µ g/mL 스 보충에 PMs의 문화를 유지 CO2 환경.
- 활용 하 여 하지 PMs 적어도 두 명의 다른 기증자 로부터 독립적으로, 다른 기증자 로부터 풀링 monocytes monocyte 활성화 될 수 있습니다 실험의 각 세트를 수행 합니다.
4. 3D 구축 공동 문화
-
간접적인 상호 작용 3D 공동 문화
참고: 24-잘 평면 바닥 문화 접시 0.4 µ m 기 공 크기의 멤브레인과 폴 리 카보 네이트 셀 문화 삽입을 사용 하 여 이러한 분석을 수행. 이 분석 결과에서 supernatants 및 세포 실험의 끝에 검색할 수 있습니다.- 10% 보충 RPMI 1640 매체의 10 mL에 2 x 106 U937 및 THP 1 monocytes 육성 FBS, 1% 항생제/antimycotic, 신선한 PMs 보충된 DMEM/F12 매체 (이전에 표시 된 단계 3.5), 습도 5%에서 37 ° c에서 배양 하 고 CO2 환경입니다.
- 4 x 105 monocytes 1 mL/그들의 해당 매체의 접시 (2 ECME %와 2% 보완 U937 및 THP 1 monocytes, 또는 2 %ECME 및 6% FBS FBS PMs에 대 한).
- 각 잘에 삽입 하 고 해당 매체에 0.9 mL 4 x 105 BrC 세포 현 탁 액의 추가 (보완 2 ECME %와 2 %FBS 상업 세포 선 또는 5%에 대 한 기본 BrC 셀에 대 한 혈 청 말). 총 미디어의 절반 대체 모든 48 h.
- 37 ° c 습도 5%에서 품 어 5 일에 대 한 CO2 환경은 supernatants 복구. 이후 분석을 수행 하는 경우 trypsinization으로 셀을 검색 합니다.
- 개별 셀 문화는 해당 미디어의 컨트롤을 포함 합니다.
-
직접 상호와 3D 공동 문화
- BrC 전지와 monocytes mRNA 및 단백질 발현의 분석에 대 한 문화 후 각 세포 계보의 독립적인 정렬 있도록 세포 배양 전에 다른 형광 성 염료와 레이블을 지정 합니다. 자유롭게 살아있는 세포의 세포 막 통과 coumarin rhodamine의 상용 파생 상품을 사용 합니다. 라벨에 대 한 일반적인 프로토콜은 다음과 같습니다.
- BrC (25 cm2 문화 플라스 크에 2 × 106 세포)의 세포의 단층을 준비 하 고 형광 염료 표준 기본 매체에 형광 염료의 (1:2, 000의 충분 한 사전 예 열된 작업 솔루션으로 표준 매체를 대체 없이 어떤 보충). 습도 5%에서 37 ° C에서 30 분을 품 어 CO2 환경. 염료 솔루션을 발음 하 고 린스 부드럽게 충분 한 1 x PBS. PBS를 발음 하 고 표준 매체를 추가 합니다.
- 37 ° c.에 5-10 분에 대 한 0.05 %trypsin 및 0.48 m m EDTA의 솔루션의 2 mL로 세포 단층 trypsinize 200 µ L trypsinization 막으려고 FBS의 보충 없이 특 파 원 매체의 7 mL를 추가 합니다. Pipetting으로 세포를 resuspend. 셀 Neubauer 챔버에 10 µ L의 약 수를 가져가 라. 셀 계산 후 공동 문화 프로토콜 계속 합니다.
- 430 x g RT에서 5 분 동안에 세포를 작은 (이것을 수행 하는 것은 처음 monocytes 정지에서 성장 하기 때문). 상쾌한 삭제 하 고 형광 염료 (보충 없이 표준 기본 매체에 형광 염료의 1:2, 000)의 미리 데워 작동 솔루션의 3 mL로 세포를 부드럽게 resuspend. 습도 5%에서 37 ° C에서 30 분 동안 품 어 CO2 환경.
- 셀을 다시 작은 염료 작업 솔루션을 삭제 하 고, 부드럽게 1 x PBS의 5-7 mL와 함께 resuspend. 한 번 더 작은, PBS, 삭제 하 고 표준 매체의 5-7 ml에서 셀 resuspend. 셀 Neubauer 챔버에 세포 현 탁 액의 10 µ L의 약 수를 가져가 라. 셀 계산 후 공동 문화 프로토콜 계속 합니다.
- 공동 문화를 다음과 같이 설정:: 4-그럼 챔버 슬라이드 시스템의 각 음에도 레이어를 우물의 바닥에 충분 한 ECME 확산. 5 × 105 잘 당 BrC 셀 표시를 포함 하는 단일 셀 서 스 펜 션의 20 µ L 플레이트.
- 37 ° C에 외피의 15-20 분 추가 2.5 x 10의 정지 후5 표시 80 µ L 분석 결과 매체에 monocytes (60% 보충 ECME).
- 37 ° c.에 15-20 분을 강화 하기 위해 ECME를 허용
- BrC 셀 및 monocyte 문화 미디어의 1:1 믹스의 1 mL를 추가 합니다.
- 습도 5%에서 37 ° C에서 공동 문화를 품 어 24 h, 48 h, 또는 다른 시간 지점에서 변경 내용을 추적 하는 5 일 공동2 환경.
- 문화에서 세포를 회복 하기 위해 ECM 단백질을 저하. 발음 매체 삭제, 0.1 %trypsin 1 x PBS와 0.25 %EDTA 0.5 mL을 추가 하 고 37 ° c.에 3 h에 대 한 품 어 부 화, 후 추가 10 %1 x PBS의 0.5 mL FBS 트립 신, 중화 하 고 세포를 단일 세포 현 탁 액을 얻기 위해 적극적으로 pipetting으로 resuspend를.
- RT에 5 분 동안 765 x g에서 세포를 작은, 상쾌한, 폐기 및 10 %1 x PBS의 5 mL에 셀 resuspend FBS. 일단이 단계를 반복 합니다.
- 적절 한 장비 (FACS)를 정렬 하는 형광 활성화 셀으로 셀 서 스 펜 션 적용. 확인 마지막 인구는 적어도 95% 순수).
- 정렬 후 살 균 1 x PBS, 펠 릿 (430 x g RT 5 분), 셀을 세척 하 고 살 균 1 x PBS에 resuspend. 세포는 RNA 격리 또는 단백질 분석에 대 한 특정 프로토콜에 따라 처리할 수 있습니다.
- 반복 각 분석 결과 3 번, 각 개별 셀 혈통의 컨트롤로 3D 문화를 포함 하 여.
- BrC 전지와 monocytes mRNA 및 단백질 발현의 분석에 대 한 문화 후 각 세포 계보의 독립적인 정렬 있도록 세포 배양 전에 다른 형광 성 염료와 레이블을 지정 합니다. 자유롭게 살아있는 세포의 세포 막 통과 coumarin rhodamine의 상용 파생 상품을 사용 합니다. 라벨에 대 한 일반적인 프로토콜은 다음과 같습니다.
-
콜라겐 저하를 평가 하기 위해 3D 공동 문화의 직접 상호 작용
- 4.2, 유형 IV 콜라겐 fluorescein isothiocyanate는 ECME에 표시의 32.5 µ g/mL을 추가 하는 추가 단계와 단계에 설명 된 대로 3D 셀 공동 문화를 설정 합니다. 콜라겐 IV는 ECME에서의 최종 농도 0.5% 이다. 페 트리 접시에 35 mm coverslip에 문화를 성장.
- 페 트리 접시의 바닥에 ECME의 40 µ L의 레이어를 확산. 37 ° c.에 공고히 ECME 허용
- 매체의 10 µ L에서 2.5 x 105 BrC 셀을 추가 하 고 셀 정착을 허용.
- (DQ 콜라겐 IV 라는 ECME의 60% 보충) 40 µ L 분석 결과 매체에 1.25 x 105 U937 monocytes 정지를 추가 합니다.
- 37 ° c.에 15-20 분을 강화 하기 위해 ECME를 허용
- BrC 셀 및 monocyte 문화 미디어의 1:1 혼합의 2 개 mL를 추가 합니다.
- 습도 5%에서 37 ° C에서 5 일 동안 공동 문화를 품 어 CO2 환경. 문화 미디어 모든 48 h를 교체 합니다.
- 공초점 레이저 스캔 현미경에서 형광 방출 분석 하 고 문화의 50 µ m2 당 (IOD) 통합된 광학 밀도 측정. IODs를 비교 하 여 개별 문화와 문화 시간 0에서 (그림 2)에 대 한.
5. 3d에서 Supernatants의 분석 공동 간접 상호 문화
- 5 일 후 공동 문화, 상단 및 3D 공동 문화의 더 낮은 구획 및 개별 3D 문화 컨트롤은 supernatants를 복구 합니다. 잘 각 상쾌한 pipetting으로 혼합. 약 수, 그리고 저장소 사용 (최대 한 달)까지 −20 ° C에 상쾌한.
참고: 저장 한 달 이상 될 경우 supernatants −80 ° C에 유지. - 분석 결과, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISA), 또는 제조 업체의 권장된 절차에 따라 비드 기반 immunoassays 멀티플렉싱과 supernatants 분석.
참고: Supernatants 또한 서쪽 오 점 분석 하거나 특정 기 공 필터 zymography 분석16,17수행 하 크기 농축 단백질 분수를 통해 집중 수 있습니다. 또는 사용 하는 supernatants 바른된 미디어로 다른 실험에 대 한 아래 설명 된 대로. 바른된 미디어는 일반적으로 5 일 문화 (그림 3)에서 얻어진 다.
6. 특성화는 효과의 Supernatants 기본 BrC 셀에서 Acini 형성과 Acini 구조에의
- 8 잘 챔버 슬라이드의 각 잘에서 시스템 ECME의 40 µ L 기반을 확산 하 고 37 ° c.에 30 분 동안 응고
- 씨 800 MCF-셀/잘 1.2 단계에서 설명한 대로 보충된 DMEM/F12 문화 매체의 400 µ L에서에서 최대 10A
- 인간 재조합 형 일 1β의 20 ng/mL와 바른된 미디어 또는 보충된 DMEM/F12 문화 매체의 400 µ L를 추가 합니다.
- 장소 챔버 슬라이드 35 mm 페 트리 접시를 포함 하는 유리 페 트리 접시에 습도 환경을 만들기 위해 PBS의 2 mL으로 가득 합니다.
- 미디어/상쾌한 모든 48 h를 교체 합니다.
- 기록 선 acini 형성 모든 24 h 14 일에 대 한 광학 현미경으로.
- 14 일 후 문화, 100 µ L의 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 100의 농도에서 acini 얼룩 세포 핵을 관찰 하기 위해 1 x PBS에 nM. 지속적인 교 반에 RT에 25 분 동안 품 어. 지속적인 교 반 실시간 마운트에 형광 염색에 대 한 특정 설치 매체와 준비에 각 시간 5 분, 1 x PBS로 3 번을 씻어. 투명 매니큐어로 밀봉 하 고 유지 4 ° c.에 빛 으로부터 보호
- acini acini (그림 4A, B, C)의 다른 깊이 횡단 스택 이미지를 복용 하는 confocal 현미경으로 분석 합니다.
- 적절 한 얼룩 프로토콜 acini에 다른 세포 단백질을 시각화. 예를 들어, 전자 cadherin은 세포 세포 접착, 세포 극성 및 루멘 형성18 (그림 4D) 평가 하 스테인드.
7. 마이그레이션 분석 실험
참고: U937의 마이그레이션 분석을 수행, 폴 리 카보 네이트를 사용 하 여 24-잘 평면 바닥 문화 접시에 THP-1, 그리고 신선한 PMs 셀 8 µ m 기 공 크기의 멤브레인과 문화 삽입. 그것은 이전 발산 GM-CSF, MCP-1, 그리고 RANTES 공격적 BrC 셀 라인의 개별 3D 문화에 높은 농도에서 분 비 발견 했다 시연 했다. 그것은 이러한 cytokines 유치 monocytes 기본 종양;의 사이트에 중요 했다 제안 했다 이 chemoattractants는 cytokines를 사용 하 여 마이그레이션 분석 실험에서 시험 되었다.
- 문화 U937, THP-1, 또는 신선한 PMs 4.1.1 단계에 설명 된 대로.
- 막 화에 세라 없이 RPMI 1640의 200 µ L로 한 번 각 삽입 린스.
- 찬 ECME의 50 µ L 채워, 삽입 바닥이-24-잘 빠진 문화 접시에 놓고 1 시간 37 ° c.에 대 한 유해를 ECME를 허용
- 접시의 위 구획에서 FBS 없이 RPMI의 180 µ L를 추가 합니다. GM-CSF의 어느 100 ng/mL으로 보충 RPMI의 버블링 800 µ L 없이 낮은 챔버에 추가 MCP-1, 또는 chemoattractant로 RANTES. cytokines 없이 매체를 사용 하 여 부정적인 컨트롤. Chemokine 그라데이션 설정 하 37 ° C에서 30 분 동안 품 어.
- 1.5 x 105 monocyte 무 균 튜브, 세척 두 번의 각 유형의 1 mL PBS, FBS 없이 RPMI의 20 µ L에서 실시간 Resuspend monocytes에 5 분 동안 430 x g에서 원심 분리기 x 1의,와 함께에서 넣어 삽입 그리고 매우 신중 하 게 균질 세포 현 탁 액 (상단 챔버의 최종 볼륨은 200 µ L).
- 습도 5%에서 37 ° C에서 24 h에 대 한 진행에 셀 마이그레이션 허용 CO2 환경.
참고: Monocytes는 비 점착, 철새 셀 일반적으로 더 낮은 구획의 미디어에 있을 것입니다. - 삽입을 제거 하 고, 미디어, 검색 하 고 2, 4, 6, 및 24 h Neubauer 챔버 또는 교류 cytometer;를 사용 하 여 셀의 개수 또는 셀 미디어에서 발견 하는 경우에 특히 디지털 카메라 이미지 삽입의 하단 부분을 취득. 3 임의의 필드 (100 배 확대)에서 평균 세포 수 분석 (그림 5)에 사용 됩니다.
8. 침공 분석
참고: 8 µ m 기 공 크기의 멤브레인과 폴 리 카보 네이트 셀 문화 삽입을 사용 하 여 24-잘 평면 바닥 문화 접시에 BrC 셀의 침입 분석을 수행 합니다. 우리의 원래 학문에서는, IL-8 BrC 셀/monocyte 3D 공동 문화 supernatants에 농축 하는 cytokines 중 하나 였다. 이 cytokine BrC 셀 라인의 침공에 참여 하 고 있는지 여부를 테스트 했다.
- BrC 75 cm2 플라스 크에 세포를 확장 합니다. MCF-7, T47D, HS578T, 및 MDA-MB-231로 설명 단계에서 1.2 (그러나 ECME 없이) 및 기본 BrC 셀 2.4 단계에서 설명한 대로.
- 각 폴 리 카보 네이트 8 µ m-공 막 세포 배양 세라 (사용 하는 매체는 테스트 셀 라인에 따라 달라 집니다) 없이 매체의 200 µ L로 삽입 한 번 씻어 수 화 멤브레인을.
- 50 µ L 찬 ECME (FBS 없이 1:4 희석 ECME:cold 매체)의 삽입을 채워, 삽입 바닥이-24-잘 빠진 문화 접시에 놓고 1 시간 37 ° c.에 대 한 유해를 ECME를 허용
- ECME 생산은 일단 FBS 없이 각각 셀 미디어의 180 µ L를 추가 합니다. 삽입의 가늘고 길게 찢어진 곳을 통해 FBS 없이 800 µ L 미디어를 추가 합니다. IL-8 그라데이션 설정 하 37 ° C에서 30 분 동안 품 어.
참고: 미디어에 거품을 만들지 마십시오. 미디어 사용 하지만 FBS 없이 100 ng/mL IL-8의 chemoattractant, 또는 FBS, 부정적인 컨트롤 없이 순수한 미디어로 보충. - 다음과 같이 6 x 10의 총 각 셀 라인의5 셀 얻을.
- Supernatants 폐기, 1 x PBS의 10 mL와 함께 한 번 헹 구 고 셀 분리를 37 ° C에서 0.05 %trypsin / 0.48 m m EDTA 2 분의 2 개 mL를 추가. 트립 신 반응을 중지 pipetting으로 적극적으로 resuspend 보충된 매체의 4 mL를 추가 합니다.
- 10 µ L Neubauer 챔버에 셀 셀 서 스 펜 션의 aliquot 가져가 라. 6 x 105 셀을 포함 하는 세포 현 탁 액의 볼륨을 가져가 라. RT에 5 분 동안 430 x g에서 centrifuge, 상쾌한, 삭제 하 고 셀 1 x PBS의 1 mL에 린스. 한 번 더는 린스를 반복 합니다.
- FBS 없이 각각 미디어의 20 µ L에서 세포와 FBS 없이 각각 미디어의 180 µ L을 포함 하는 삽입에서 resuspend. 조심 스럽게 pipetting으로 세포 현 탁 액을 균질.
- 습도 5%에서 37 ° C에서 48 h에 대 한 진행에 셀 침공을 허용 CO2 환경.
- 48 h 후 삽입을 제거 하 고 삭제는 상쾌한 린스 1 x PBS의 200 µ L로 한 번 아주 신중 하 게 삽입. 솜 밀고 주걱으로 PBS의 과잉을 제거 합니다.
참고: 침략 적 세포 일반적으로에 연결 삽입의 다른 쪽으로이 경우에 어디 셀 부착. - 1 mL를 포함 하는 24-잘 평면 바닥 문화 접시의 우물에 삽입을 배치 하 여 셀을 수정/실시간 후에 15 분 동안 4 %paraformaldehyde의 잘 씻어 1 x PBS 한번 삽입.
- 1 mL를 포함 하는 24-잘 평면 바닥 문화 접시/솜 밀고 주걱 제거 막의 상단에서 모든 ECME와 실시간 신중 하 게,에서 45 분 동안 0.2% 크리스탈 바이올렛으로 1 x PBS의 우물에 삽입을 배치 하 여 세포를 얼룩 마이그레이션되지 않은 셀을 포함 하 고 매우 신중 하 게 제거 하지 않으려면 증류수 린스 침략 셀 고정.
- 거꾸로 현미경 삽입의 하단 측면을 관찰 하 여 침입 세포를 계산. 3 임의의 필드 (100 배 확대)에서 평균 세포 수 사용 됩니다. 셀 클러스터로 침공 하 고 개별적으로 계산 하기 어려운 경우, 디지털 카메라와 함께 (100 배 확대)에서 3 임의의 필드에서 이미지를 획득. 이미지 분석 소프트웨어와 함께 이미지를 분석 하 고는 IOD를 사용 하 여 계량 셀 침공 (그림 6).
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Representative Results
BrC 셀 3D 문화에서의 형태소 분석:
낮은 높은 밀도에서 3D 문화에서 성장 하는 기본 BrC 셀의 형태는 5 일 동안 연구 했다. 첫 번째 48 h 동안 세포는 ECME를 준수 하 고 낮은 밀도 유지. 이 시간이 시점에서 그것은 명확 하 게 감상할 수 있습니다 세포는 길쭉한 스핀 들-모양, 명백한 셀 연락처를 표시 하지 않고 두 개 이상의 긴 세포질 예측와 일부 제시. 5 일 후 문화, 세포는 그들의 초기 형태를 유지 하면서 확산. 또한, 그들은 특정 구조 조직 없이 그물을 닮은 구조를 형성 하 고 아무 접촉 금지와 위로 쌓여 나타납니다. MCF 10A 세포 변형 비 비교는 구형 구조 선의 acini 닮은 형성 되었다. 이러한 세포 동종 크기 (약 50 µ m)의 둥근 잘 구분 및 조직 구조의 특성 형태를 표시합니다. 반대로, 기본 BrC 셀 공유할 훨씬 가까이 닮 았 공격적 BrC 셀 MDA-MB-231 (그림 1).
셀에 직접 상호 작용 및 콜라겐 저하의 분석:
우리는 다음을 평가 하기 위해 3 차원 공동 문화 모델을 설계: 세포 형태학, 콜라겐 파괴, 셀 마이그레이션, BrC 셀과 공동 문화에 monocytes 간의 직접적인 상호 작용 여부와. 그러나 5 일 후 두 MCF-7과 MDA-MB-231 상업 BrC 셀 3D 문화에서 무질서 집계를 형성,, 그들은 그들의 형태에 다. 적극적인 셀 MDA-MB-231 양식 길쭉한 형태와 비 공격적 MCF-7 셀 형성 세포는 둥근된 형태를 유지 하 고 그들은 더 조밀 하 게 압축된 (그림 2 표시 집계 하는 동안, 나머지에서 분리 하는 경향이 일부 셀 집계 A, B). DQ 콜라겐 IV 분해 저하 (녹색), 형광 활동 전시 두 BrC 문화와 시각화를 통합 했다. 양적 분해 활동 평가, 녹색 형광 6 50 µ m2 필드의 IOD로 측정 되었다. 비교 개별 3D MDA-MB-231 셀의 문화와 사이의 U937 monocytes 공동 문화 되었다. (그림 2C) 공동 문화에 베이스의 통계적으로 유의 한 증가 관찰 했다. 또한, 직렬 통과의 confocal 현미경 분석 스택 MDA-MB-231의 모든 10 µ m 및 공동 문화는 U937 monocytes 수행 (그림 2D). 이 분석 U937 monocytes 몇 monocytes BrC 셀 계층에 도달로 공격적 셀 MDA-MB-231 쪽으로 마이그레이션 밝혔다. 그러나, 그것은 분명 셀 직접 상호 사이트 높은 분해 활동의 분야와 반드시 동시 하지 했다: 대신, 콜라겐 파괴의 지역 균일 하 게 확산 됐다 추론으로 이어지는 문화에는 콜라겐 저하는 간접 통신 분 비 요인에 의해 중재의 결과 이었다. 따라서, 3D 공동 문화 모델 세포 분 비 요소에 따라 셀 셀 통신을 허용 하는 다공성 막으로 구분 하는 다른 구획에 놓고 셀 라벨 및 문화 후 정렬 하지 않도록 변경 되었습니다.
3D 문화에서 Supernatants에 IL 1β의 분석:
간접적인 상호 작용 3D 문화, 개별 기본 BrC에서 supernatants 작업 문화와 그들의 5 일 오후 공동 문화 수확 했다. 이러한 supernatants 18 cytokines 및 상업 키트 및이 분석을 위해 설계 된 악기를 사용 하 여 5 MMPs의 동시 분석을 복종 되었다. 모든 analytes 테스트, IL 1β, IL-8의 크게 증가 수준 기본 BrC 셀 monocyte 공동 문화, 이전 악성 진행15, 와 연결 된 두 중요 한 염증 성 cytokines에서에서 관찰 되었다 18 , 19 , 20 (그림 3, 일리노이-1β에 대 한 결과). 이 예에서는 3D 문화 모방 모양 종양 microenvironment 통신 네트워크를 허용 하는 분석의 또 다른 유형입니다.
Supernatants Acini 구조의 특성:
MCF 10A 발암 여부의 평가와 관련 된 메커니즘의 모델로 설립 했다 Debnath, Muthuswamy, 그리고 브루 게7을 개발한 3D 실험 시스템 기초 기본 BrC 셀에서 secreted 요소 supernatants는 MCF 10A 3D acini 같은 구조, 유사 바이러스 및 세포질 oncogenes7,21 의 변환 수행한 후 관찰 하는 활동의 형성을 영향을 받습니다. MCF 10A 셀 (anoikis 저항의 조치로) 루멘 형성을 관찰 하 두 기본 BrC 셀 라인에서 두 개의 다른 supernatants 함께 재배 했다. 14 일에는 spheroids 0, 25, 50, 75, 및 100% 깊이에 confocal 현미경 검사 법 횡단 인하 하 여 평가 했다 그리고 두 경우 모두, 그것은 (acini (그림 4에서에서 중앙 (luminal) 셀의 수를 계산 하 여 측정 한 그 MCF 10A 셀 피할된 anoikis 발견 B, C)). 따라서, MCF 10A 셀 acini BrC 셀에서 바른된 미디어와 함께 형성 되는 그것의 표준 문화 매체 (에서 설명한 단계 1.2)(그림 4)와 함께 성장 하는 MCF 10A 달리 올바른된 빈 루멘을 부족 합니다. 3D 공동 문화 시스템에서 IL 1β는 높게 분 비; 따라서, MCF 10A 세포 인간 재조합 형 일 1β18로 재배 했다. 그림 4 D 는 confocal 현미경 검사 법 횡단 acini IL 1β (낮은 패널), 존재의 50% 깊이에서 잘라 보여줍니다 그리고이 cytokine anoikis 저항을 또한 수 여 보여. 따라서, IL 1β, 같은 기본 BrC 세포에 의해 분 비 성 요인 침략 암의 특성 비 변형 MCF 10A 잃을 ECM 상호 작용, 세포의 생존을 촉진 합니다.
3D 공동 문화 홍보 Monocytes의 마이그레이션 및 암 세포의 침입과 관련 된 염증 반응:
우리는 이전 기본 BrC 셀 3D 문화에 monocytes14유치 알려진 프로-염증 성 발산의 상부 기저 분 시연 했다. 따라서, 우리는 응답 발견 발산으로 BrC 셀의 조건된 미디어에 농축 monocytes의 철새 용량 분석. 상업적인 monocytes U937 및 THP-1 신선한 PMs의 철새 용량 3 다른 발산에 평가 되었다: GM-CSF, MCP-1, 그리고 RANTES. U937 및 THP 1 monocytes 두 monocytes RANTES null 응답 했다 GM-CSF와 MCP-1, 대부분의 반응으로 U937 마이그레이션 할 수 있었다. 중요 한 것은, PMs는 높은 기저 철새 활동과 MCP-1 (그림 5)에 대 한 가장 강력한 응답을 보였다. IL-8 기본 BrC 셀 및 monocytes의 3D 공동 문화 후 농축도 했다. 따라서, 우리는 상업 및 기본 BrC 셀 라인의 용량을 수정 하는 IL-8 여부 분석. 상업 적극적인 BrC 셀 라인 (HS578T 및 MDA-MB-231)는 비 공격적 (MCF-7와 T47D) 침공 하지 않았다 하는 동안 IL-8에 대 한 응답에 침공. 놀랍게도, 기본 BrC 세포 응답 IL-8 (그림 6A, 오른쪽 패널)으로 상업 적극적인 BrC 셀 라인 보다 더 많은 침략 했다. 경우에 따라 셀 클러스터로 침략 하 고 따라서 IOD 분석 필요 하다 (그림 6B).
그림 1 : 3D 문화에서 BrC 셀의 대표 이미지. 왼쪽에서 오른쪽: 제어와 특성 선의 acini 형성 비 변형 MCF 10A 세포의 형태학, 잘 구분 된 셀 연락처, 둥글게 하 고 동종 크기 (약 50 µ m, 광학 배율에의 구조 조직 200 X). 가운데 패널 기본 BrC 셀 낮은 밀도 (2 일) 및 높은 밀도 (5 일)에서 양식 표시. 세포는 ECME를 준수 하 고 초기 시간 지점에서 낮은 밀도 유지. 그것은 분명 세포는 길쭉한 스핀 들-모양, 일부 두 개 이상의 긴 세포질 예측, 그리고 아무 명백한 세포 세포 접착을 제시. 다른 한편으로, 나중에 지점에서 고밀도 세포 특정 구조 조직 없이 그물을 닮은 구조를 형성. 이러한 세포 등장 쌓여 아무 접촉 저해를 보여주는 최대. 5 일 후에 3D 문화 상업 MDA-MB-231 셀의 컨트롤 표시 됩니다; 이러한 적극적인 BrC 셀 기본 BrC 문화 (100 X의 광학 확대)는 훨씬 더 가까이 닮 았을 공유할 수 있습니다. 대표 50 µ m. 800 셀 바 규모 실험 시작 시드 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : ECM 저하의 분석. 노란색 형광 색소 (A)와 적극적인 MDA-MB-231 셀 스테인드 비 공격적 MCF-7 세포는 빨간색 형광 색소 (B) 3 차원 조건;에서 5 일 동안 재배로 얼룩진 0.5%의 녹색 형광 표시 된 콜라겐 IV ECM 저하 시각화를 통합 했다. A 와 B, 위 왼쪽된 사진 콜라겐 저하의 수준을 나타내는, 상단 오른쪽 패널 광 사진 대표, 왼쪽 아래 BrC 셀 나타내고 하단 오른쪽 패널 보기 형광 및 광학의 병합 이미지입니다. A 와 B에 대 한 200 X의 광학 배율, 100 µ m의 눈금 막대 표시 됩니다. (C) 대표 이미지 (녹색) 컨트롤로, 개별 MDA-MB-231 셀의 3 차원 문화에 ECM 베이스의 U937 monocytes MDA-MB-231의 3D 공동 문화의 ECM 베이스와 비교. 스케일 바 10 µ m을 나타냅니다. 각 조건에서 6 50 µ m2 필드의 IOD (통합된 광학 밀도) 측정 했다. 평균 표준 오차는 quantifications에서 평균 (SEM)의 표시 됩니다. 두 개의 별표 p < 0.01 (맨-휘트니 테스트)와 통계적으로 유의 한 차이 나타냅니다. (D) MDA-MB-231 세포의 직접적인 상호 작용 (회색 그늘 대량) 붙일 스테인드 U937 monocytes (오렌지);와 녹색 형광 베이스에 해당합니다. 직렬 조각 생성 된 지역화 및 두 셀 라인 간의 직접적인 상호 작용에 confocal 현미경 검사 법에 의해 모든 10 µ m. 200 X;의 광학 확대 스케일 바 대표 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: IL 1β 농도 3D 공동 문화에서 증가 된다. IL 1β 수준 (pg/mL) supernatants 8 (p c 1-8) 기본 BrC 셀에서 개별적으로 3d (3 차원), 교양 및 오후 (CC)와 그들의 3 차원 공동 문화에 대 한 비교에 한 대표적인 결과. 개별 3D 문화에 오후의 제어 비교 (오후)에 대 한 포함 되었다. 결과 여러 가지 cytokines 했다 동시에 탐지는 각 샘플에서 상업 키트로 수 있는 immunodetection 기반 기술에 의하여 더 큰 멀티플렉싱 분석에서 추출 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 기본 BrC 세포에서 분 비 요인 유도 anoikis MCF 10A 셀 비 변화에 저항. MCF 10A 셀 3D 표준 문화 미디어 (열 A와 D의 상위 패널), 있는 그것은 관찰 될 수 있다는 acini 전형적인 빈 루멘 (25-75% 깊이 빨간색 사각형으로 강조); 현재 조건에서 성장 했다 MCF 10A 셀은 두 개의 기본 BrC 문화 (열 B와 C)에서 두 개의 다른 supernatants로 성장, 루멘 않습니다 빈 하지만 채워진 셀 anoikis에 저항을 나타내는. MCF 10A 셀 3D 조건 추가 인간 재조합 형 일 1β에서에서 경작 했다 때에 유사 하 게, (20 ng/mL), 아니 빈 루멘 acini (D의 낮은 패널)의 50% 깊이 confocal 현미경 검사 법 부분에서 평가 될 수 있다. 바로 타원형 풍자 만화는 acini의 0, 25, 50, 75 및 100% 깊이에서 만들어진 confocal 현미경 검사 법 섹션을 나타냅니다. 이미지는 녹색에서 DAPI (파란색)와 E-cadherin 스테인드 핵을 표시 합니다. 200 X의 광학 확대, 스케일 바 대표 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : Monocytes의 철새 용량. U937, THP-1 GM-CSF, MCP-1에 대 한 응답에서 오후의 철새 용량의 대표 이미지와 RANTES. Chemokine 없이 컨트롤 포함 (첫 번째 열 왼쪽에서 오른쪽) 있습니다. 이미지 아래 숫자 표시 각 조건; 철새 셀 수 오후는 철새 고용량 se 당, 그리고 MCP-1 가장 반응 셀을 했다 하는 동안 U937 및 THP 1 monocytes GM-CSF 및 MCP-1, 주로 응답 했다. 100 X;의 광학 확대 스케일 바 나타냅니다 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : 공격적이 고 기본 BrC 셀 IL-8 응답에서 침공. A. 침공 2 비 공격적 (MCF-7 T47D), 두 개의 매우 공격적 (HS578T 및 MDA-MB-231) 분석 실험 BrC 셀 라인 그리고 IL-8 chemoattractant로 사용에 대 한 응답에 하나의 기본 BrC 문화. 상위 패널 chemokine 낮은 패널 매우 공격적 BrC 셀 및 셀 문화 삽입의 세포 막을 통해 침입 기본 BrC 셀 IL-8, 반응을 보여 아무 침공을 보여주는 하지 않고 컨트롤에 해당 합니다. B. 클러스터;에 침략 하는 셀의 예 이러한 경우에 침략의 측정 영역 당 IOD (통합된 광학 밀도) 측면에서 침공을 결정 하는 이미지 분석 프로그램을 이루어집니다. 이미지 아래 숫자를 각 조건에 침입 셀의 수를 나타냅니다. 100 X;의 광학 확대 스케일 바 대표 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
3D 공간 구조에서 상피 세포 성장 그리고 ECM 단백질의 상호 작용은 조직 항상성에 대 한. Monolayers (2D)에서 성장 하는 세포에 많은 암 연구 기반으로 되어, 비록 그들은 종양 형성 및 진행의 여러 측면을 이해 하는 데 중요 한 되어, monolayers ECM에 대 한 셀에 부과 하는 특징을 정리 하지 않습니다. 인스턴스: 확산, 접착 종속 세포 생존, 꼭대기 basolateral 극성, 개장 하는 ECM, 세포 분화, 등 제한 중요 한 것은, 뿐만 아니라 종양 세포와 ECM 사이 상호 작용은 암의 진행을 위한 필수 하지만 종양 및 비 종양 세포, 면역 세포 등 사이 통신 설립. 제공 하는 ECM에 의해 염증 반응을 이러한 상호 작용에 의해 추진 하 고이 염증 성 조건 만드는 방법 여기에 제공 된 프로토콜 환경 내에서 암 세포와 면역 세포 사이 상호 작용의 이해를 촉진 한 긍정적인 루프 monocytes의 chemoattraction과 암 세포의 더 많은 침략을 육성.
ECME를 사용 하 여의 큰 장점은 생물 비 계 실험 3D의 다양 한 수행 적합 모델22제공 이다. 그것은 ECM 등 laminin, 콜라겐 IV, entactin, heparan 황산 proteoglycan, 성장 인자, 상피 세포 상호 작용 수는 vivo에서 단백질 농축입니다. 불리는 murine sarcomas lysates에서 온다, 때문에 그들의 구성 요소의 농도 사이 변화 한다 다른 많은 것 이다. 그래서, 그것은 종종 더 균질 데이터를 얻기 위해 여러 많은 특성화 하는 데 필요한입니다. 각 새로운 많은 두 가지 방법으로 테스트 실험실에서: 1)의 MCF 10A 셀의 올바른 acini 형성 평가 하 여 고 2) BrC의 침입을 평가 하 여 셀 라인 잘 설립 침략 적 능력의. 또 다른 옵션은 히드로, 합성 nanofiber 펩 티 드 비 계는 다른 비 계 제품을 사용. 하이드로 겔23,24의 농도 조정 하 여 3D 문화의 강성을 제어할 수 있습니다. 중요 한 것은,이 시스템 연구 및 조 혈 종양 약 셀의 어떤 종류 또는 비 조 혈 세포 사이 상호 작용에 적용할 수 있습니다. 그것은 두 개 이상의 다른 세포 계보를 사용 하 여 더 복잡 한 시스템 설계 수 수 있습니다. 3D 모델의 중요 한 장점 중 하나입니다 그들은 셀 형태학 및 세포 조직 종양 변환 하는 동안 변경 되는 ECM 상호 작용에 의해 형성의 연구 허용. 마찬가지로, 하나 분해 저하 등의 종양 기능을 공부할 수 있는 셀 처음 직접 상호 작용/통신 홍보 서로 문화 신호의 다른 층에 배치 여부. 또한, 다른 세포 계보 그들은 주소를 사용 하 여, 예를 들어 RNA 또는 단백질 표정 분석13각 개별 셀 형식으로 특정 질문에 실험 후 격리 될 수 있도록 다른 형광으로 표시 될 수 있습니다. 여기, 기본 BrC 셀/오후 공동 문화에 중간에 IL 1β 분 비 표시 됩니다, 종양 세포, monocytes는 악성 진행 사이 간접 통신에이 cytokine의 가능한 중추적인 역할을 지원.
실험실에서 다른 필수적인 실험 프로토콜 비 변형 MCF 10A 셀의 3 차원 문화에서 acini 형성의 분석 이다. 이 분석 결과 바이러스 및 세포질 oncogene 활동에 대 한 테스트 하 고 종양 microenvironment 공격적인 암에 관련 된 기능에 영향을 어떻게 테스트 사용 되었다. 예를 들어,는 acini의 정상적인 발전 동안 luminal 중앙 셀 손실 접촉 기저 막 단백질 (ECME에서 제공)와 anoikis로 알려진 세포 죽음의 메커니즘을 트리거링. 기본 BrC 셀 또는 재조합 IL 1β는 모두 supernatants MCF 10A 셀 저항 anoikis 홍보 관찰 되었다. IL 1β의 높은 농도 BrC 셀 monocyte 상호 작용에 따라 승진은, 때문에이 관측 종양 기질 매우 공격적 단계 종양 진행의 필수적인 구성 요소는 지원 합니다.
여기에 설명 된 마이그레이션 및 침략 프로토콜 구성 마이그레이션하거나 종양 기질에서 파생 된 자극에 대 한 응답에서 침략 세포의 기능을 지원할 수 있습니다 우리 유용한 3D 무료 분석 실험. 그것은 발산 (GM-CSF 및 MCP-1) 기본 BrC 셀의 3 차원 문화에 높은 농도에서 발견, U937의 마이그레이션 홍보할 수 표시 했다 THP-1, 그리고 PMs, 프로-염증 성 microenvironment를 홍보 하는 공격적인 종양 세포의 기능을 지 원하는. 또한, IL-8 BrC 셀/monocytes의 공동 문화에서 supernatants에 증가 농도에서 또한 있는 상업 적극적인 BrC 셀 (HS578T MDA-MB-231)와 기본 BrC 세포의 증가 침략 승진.
셀의 상태에 대하여 그들의 확산 피크의 활용 및 잠재적인 후 격리 유전과 후 성적인 변화에 체 외에서 발생 하지 않도록 10 구절을 도달 하기 전에 기본 BrC 셀을 사용 하는 것이 중요 하다 문화입니다. 또 다른 필수 측면 1 차 셀을 작업할 때 격리 후 자신의 정체성을 확인 하는 것입니다. 우리는 확인할 수 그들의 상피 혈통, PanCK, Muc-1, EpCAM (2.5 단계에서 지정 된)를 포함 하 biomarkers의 패널을 사용 합니다. 마찬가지로,이는 각 일괄 처리는 차별화의 동일한 단계에서 다는 것을 보장 테스트는 신선한 PMs를 사용 하 여 좋습니다. 각 새 일괄 처리를 사용 하는 표현 형 CD34neg CD11bpos CD14pos CD64pos CD68neg CD16neg, 대응 미 숙 monocytes 비 활성화 하는 제시. 중요 한 것은, 우리가 monocyte 활성화에 결과 혼합으로 다른 기증자 로부터 monocytes을 혼합 하지 마십시오. 대신, 우리가 독립적으로 테스트 BrC 공동 사용 하 여 두 개 이상의 다른 기증자 로부터 monocytes 문화.
3D 문화 시스템은 여전히 제한 종양 생물학의 몇 가지 요소만 안정적으로 모델링 될 수 있다. 새로운 대안은 이다 organoids, 확장 및 줄기 세포의 분화에 근거 하는의 더 복잡 한 3D 모델 생체 외에서. Organoids는 또한 고도로 조직된 상피 구조를 개발합니다. 예로 위 25,26, 간 27및 신장 organoids28있습니다. 그러나, organoid 모델 모든 인간 장기에 대 한 남아 달성 될; 또한, 그들은 훨씬 더 복잡 하 고 비싼 실험 조건 필요합니다.
끝으로, 여기 우리가 자세하게에서 설명 분석 실험의 워크플로: BrC 환자, ECME 기반 3D 문화 모델, 그들의 선 동적인 용량을 테스트 테스트 그 염증 성 microenvironment을 그들을 제공 하는 방법에서 종양 세포의 격리에서 시작 추가 염증 세포, monocytes, 마지막으로, 세포의 종류와 어떻게 그 통신을 더 육성 공격적인 암 단계에 진행을 촉진 하는 염증 성 microenvironment 간의 통신을 분석을 등. 또한, 우리는 형태학과 기본 BrC 세포의 표현 형을 설명합니다. 미래에 연구, 그것은 다른 염증 세포를 테스트 하거나 심지어 BrC 세포 및 종양 기질에서 자주 발견 하는 여러 셀 간의 통신을 테스트 재미 있을 것입니다. 이러한 다중 셀 3D 문화 중에 일어나 생물학적으로 생체 내에서 암 진행의 큰 그림을 제공 합니다. 생체 외에서 데이터와 환자 임상 결과 비교 암 적극성에 높은 영향을 미칠 잠재적인 메커니즘을 식별 합니다.
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Disclosures
저자는 그들이 하지 않아도 어떤 상충 선언 합니다.
Acknowledgments
이 작품은 Fondo de Apoyo Investigación, 병원 Infantil 드 멕시코 페데리코 고메스 (프로젝트 번호 그-2014-053) 라와 CONACyT FONSEC SSA/IMSS/ISSSTE 프로젝트 번호 233061 Ezequiel M. 푸 엔 테 스-Pananá에 의해 지원 되었다. 프란 산체스 나 프로그램이 드 Doctorado en Ciencias Biomédicas, 대학 나시오날 Autónoma 드 멕시코 (UNAM)과 수신된 친목 231663 CONACYT에서에서 박사 학생입니다. E-S 나, 사회 보장 (IMSS)의 멕시코 연구소에서 제공 하는 금융 지원 인정.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U937 | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1593.2 | Monocytic cell line/histiocytic lymphoma |
| THP-1 | American Type Culture Collection ATCC | TIB-202 | Monocytic cell line/acute monocytic leukemia |
| MCF-10A | American Type Culture Collection ATCC | CRL-10317 | Non-transformed breast cell line |
| MCF-7 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-22 | Breast Cancer Cell line |
| T47D | American Type Culture Collection ATCC | HTB-133 | Breast Cancer Cell line |
| HS578T | American Type Culture Collection ATCC | HTB-126 | Breast Cancer Cell line |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-26 | Breast Cancer Cell line |
| RPMI 1640 medium | GIBCO BRL Life Technologies | 11875-093 | |
| DMEM High Glucose | GIBCO BRL Life Technologies | 11964-092 | 4.5 g/L glucose |
| DMEM/F12 | GIBCO BRL Life Technologies | 11039-021 | |
| Antibiotic/Antimycotic | GIBCO BRL Life Technologies | 15240-062 | 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16000-044 | |
| Horse serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16050114 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA 1X | GIBCO BRL Life Technologies | 25300-062 | |
| PBS 1X (Phosphate Buffered Saline | GIBCO BRL Life Technologies | 20012-027 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 (1.00mg) | |
| Insulin | SIGMA-ALDRICH | I1882-100MG | |
| Hydrocortisone | SIGMA-ALDRICH | H088-5G | |
| Cholera toxin Vibrio cholerae | SIGMA-ALDRICH | C8052-1MG | |
| Matrigel | Corning Inc | 356237 | Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| MCP-1 | PeproTech | 300-04 | |
| RANTES | PeproTech | 300-06 | |
| IL-8 | PeproTech | 200-08 | |
| IL-1β | PeproTech | 200-01B | |
| Crystal-violet | Hycel México | 541 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P6148 | |
| Transwell permeable supports (inserts) | Corning Inc | 3422 | 6.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates |
| Transwell permeable supports (inserts) | Thermofisher Scientific | 140620 | 6.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates |
| Monocyte Isolation Kit II Human | Miltenyi Biotec | 130-091-153 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate Assay | EMD Millipore | HCYTOMAG-60K | |
| Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation) | Luminex Corporation | 40-072 | |
| Lab-Tek chamber slide with cover (8 well) | Nalge Nunc International | 177402 | |
| Glass bottom microwell 35mm petri dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
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