Analyser la Communication entre les Monocytes et les cellules cancéreuses du sein primitif dans une matrice extracellulaire extrait (ECME)-système tridimensionnel
Summary
Nous décrivons ici une méthode de culture en trois dimensions pour analyser la morphologie des principales cellules cancéreuses du sein, aussi bien quant à étudier leurs interactions directes/indirectes avec les monocytes et les résultats tels que la dégradation du collagène et le recrutement de cellules immunitaires, cellules invasion et la promotion de l’inflammation liée au cancer.
Abstract
Incorporé dans la matrice extracellulaire (ECM), cellules épithéliales normales et néoplasiques communiquent intimement avec des cellules hématopoïétiques et non hématopoïétiques, influençant ainsi grandement issue de l’homéostasie et la maladie les tissus normaux. Dans le cancer du sein, les macrophages associées à la tumeur (EAPV) jouent un rôle essentiel dans la progression de la maladie, métastases et récidives ; par conséquent, la compréhension des mécanismes de monocyte chimioattraction le microenvironnement tumoral et leurs interactions avec les cellules tumorales est importante pour lutter contre la maladie. Ici, nous fournir une description détaillée d’un système en trois dimensions (3D) de co-culture de cellules mammaires humaines cancéreuses (BrC) et les monocytes humains. BrC cellules produisent des niveaux élevés de basales de réglementé sur activation, lymphocytes normal exprimé et sécrétée (RANTES), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) et le facteur stimulant les colonies de granulocytes et macrophages (G-CSF), tandis qu’en co-culture avec des monocytes, cytokines pro-inflammatoires interleukine (IL) -1 bêta (IL-1β) et IL-8 ont été enrichis avec les métalloprotéinases matricielles (MMP) -1 et MMP-2, MMP-10. Ce micro-environnement de stroma tumoral promu résistance à anoikis MCF-10 a 3D structures ressemblant à des acini, chimioattraction des monocytes et invasion des cellules agressives de BrC. Les protocoles présentés ici offrent une alternative abordable pour étudier la communication intra-tumeur et sont un exemple du grand potentiel qui fournissent des systèmes in vitro de cellule 3D pour interroger les fonctionnalités spécifiques de biologie tumorale, liés à la tumeur agression.
Introduction
Biologie de la tumeur est beaucoup plus complexe qu’on ne le pensait. Montage des éléments de preuve montre que les cellules tumorales sont plus qu’une simple en vrac des cellules en prolifération incontrôlées ; différentes cellules néoplasiques semblent plutôt, effectuer différentes fonctions affichage haute organisation et hiérarchie au sein de la tumeur1. Les cellules tumorales sont également en communication intime avec les cellules non transformées : macrophages, lymphocytes, adipocytes, fibroblastes, cellules endothéliales, les autres cellules sont tous plongés dans l’échafaud protéines et des polysaccharides qui constituent l’ECM. Nombreuses interactions directes ou indirectes sont établies entre les cellules transformées et non transformées et l’ECM, qui exerce une puissante influence sur le résultat de la maladie2,3. Dans le cas précis du BrC, il est particulièrement important de disséquer la communication des cellules BrC avec TAMs, considérant que TAMs ont été trouvés à jouer un rôle crucial dans l’évolution de la tumeur, augmentant le risque de métastases et de réapparition de la maladie4 ,,5.
Pour analyser les interactions intra-tumorale et leurs résultats possibles, nouvelles approches 3D in vitro ont été développés basée sur l’utilisation d’extraits de ECM qui fournissent un micro-environnement beaucoup plus complex, plus proche de la réalité de la biologie tumorale, en comparaison de les cultures de cellules de monocouche conventionnel dans lequel les cellules se développent attaché au plastique. Petersen et Bissell6 fourni le premier modèle de non malins et cellules épithéliales mammaires malignes cultivées sur une membrane de sous-sol riche laminine et furent les premiers à décrire les structures 3D organotypique discriminatoires à l’homme non malins cellules épithéliales mammaires de leurs homologues malignes. Une décennie plus tard, le modèle développé par Delphine, Muthuswamy, et Brugge7,8,9 a fourni un outil précieux pour élucider les voies biologiques compromises au cours de la transformation maligne des acini glandulaires, telle formation de grandes acini en raison de la prolifération incontrôlée, délocalisation des protéines de jonction serrées comme preuve de la polarisation de la cellule avec facultés affaiblies et perte de lumière des acini en raison de la résistance de la cellule à anoikis, un type de mort cellulaire programmée qui se produit dans Anchorage-dépendante des cellules quand ils se détachent de l’ECM environnante. Les modèles de Sloane, Jedeszko et Michael Schumacher ont mis l’accent sur l’activité protéolytique d’imagerie de cellules, qui est étroitement liée au caractère envahissant, un autre trait essentiel de tumeur maligne10,11,12. Ces modèles s’appuient sur des matrices de protéines mélangés avec des substrats protéiques trempé à fluorescence (DQ-gélatine, DQ-collagène I et IV DQ-collagène), dans quels signaux fluorescents sont révélateurs de la dégradation protéolytique du collagène. Modèles 3D sont également utilisés pour étudier les propriétés des cellules souches des deux non transformées et les cellules tumorales, dans quelle cellule agrégats, aussi appelées sphéroïdes, peuvent être cultivées en suspension ou en protéines ECM interroger pour les mécanismes de la différenciation cellulaire, asymétrique la division cellulaire, l’adhésion cellule-cellule et cellule motilité13,14. Analyses d’invasion permettent de tester l’agressivité intrinsèque de la tumeur et l’identification des molécules qui servent de chimioattractants durant le processus invasif15. Dans l’ensemble, 3D modèles représentent une diversification abordable in vitro de culture de cellules qui se rapprochent davantage la morphogenèse des tissus normaux et oncogènes.
Nous avons conçu un système de co-culture de cellule 3D basé sur les modèles susmentionnés7,10,11, les deux humains lignées de cellules BrC commercial potentiel agressif connu (types luminales et triple négatif) et primaire cellules explantées de BrC patients. Nous avons d’abord développé un modèle où non agressifs (MCF-7) ou agressifs (MDA-MB-231) BrC cellules ont été conjointement cultivés avec U937 monocytes dans un extrait de la matrice extracellulaire (ECME)-système 3D qui a permis des interactions directes de cellule-cellule. Ces cultures co ont été utilisées pour déterminer comment la communication entre ces deux lignées deux cellulaires influencé la transcription d’un ensemble de gènes associés à un comportement agressif du cancer. A observé une augmentation significative de cyclo-oxygénase-2 (COX-2) transcription, qui a coïncidé avec une augmentation de la production d’un de ses produits, la prostaglandine E2 (PGE2), une constatation qui a mis en évidence le rôle de l’inflammation dans la progression du cancer. Transcription accrue de MMP a également observée qu’en corrélation avec la protéolyse de collagène plus grande lorsque les cellules MDA-MB-231 agressifs ont été cultivées conjointement avec U937 monocytes dans DQ-collagène IV contenant des cultures. À noter, nos cultures co n’appuient pas l’hypothèse que les mécanismes d’interaction cellule-cellule sont nécessaires pour la dégradation du collagène. Il a plutôt suggéré que la communication entre les lignées de deux cellules était médiée par des molécules sécrétées. En outre, les surnageants récoltées sur ces tests de co-culture contenaient des facteurs solubles qui désorganisé des acini glandulaires formés par non transformées de cellules de MCF-10 a13. On a constaté qu’agressifs et des cellules primaires de BrC sécrétées des niveaux élevés de molécules chimiotactiques monocytes MCP-1, GM-CSF et RANTES. Ainsi, nous avons présenté une culture 3D dans lequel les cellules ont été séparés dans les inserts de culture cellulaire afin d’éviter les interactions cellule-cellule. Ces cultures ont été utilisées pour traiter la communication indirecte entre cellules BrC et les monocytes. Pour ces tests, lignées cellulaires non agressifs et agressives BrC commerciales et des cellules primaires de BrC et trois différents types de monocytes humains : les cellules U937 et THP-1 commerciales et les monocytes primaires (PMs) isolées du sang périphérique de donneurs sains (tous monocytes ont été utilisées dans un État non activé) ont été utilisés. Augmentation des concentrations de cytokines inflammatoires IL-1β et IL-8 ont été observées à s’enrichir en co-culture. De même, il a été constaté que les MMP-1 et MMP-2, MMP-10 ont été également augmentés dans le BrC cellules-monocyte co-cultures et donc l’armature précédentes conclusions14. Dans ce manuscrit, un flux de travail point par point d’isolement de cellules primaire BrC et essais en cultures 3D est présenté ainsi que des résultats représentatifs. Cet ouvrage constitue un bon exemple du grand potentiel qui fournissent des systèmes in vitro de cellule 3D pour interroger des aspects spécifiques de la biologie de la tumeur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les cellules épithéliales se développent dans une conformation spatiale 3D et leur interaction avec les protéines ECM est essentielle pour l’homéostasie tissulaire. Plusieurs études sur le cancer ont été fondées sur des cellules cultivées en monocouches (2D) et même si elles ont été essentielles à la compréhension de nombreux aspects de la formation de tumeurs et de la progression, les monocouches ne pas récapituler les caractéristiques que l’ECM impose aux cellules, pour instance : limitant la prol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par CONACyT FONSEC SSA/IMSS/ISSSTE projet no 233061 à Ezequiel M. Fuentes-Pananá et Fondo de Apoyo a la Investigación, Hospital Infantil de México Federico Gómez (numéro de projet lui-les-2014-053). Espinoza-Sánchez NA est étudiante au doctorat de Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) et a reçu la bourse 231663 du CONACYT. E-S NA, également reconnaître le soutien financier apporté par l’Institut mexicain de sécurité sociale (IMSS).
Materials
| U937 | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1593.2 | Monocytic cell line/histiocytic lymphoma |
| THP-1 | American Type Culture Collection ATCC | TIB-202 | Monocytic cell line/acute monocytic leukemia |
| MCF-10A | American Type Culture Collection ATCC | CRL-10317 | Non-transformed breast cell line |
| MCF-7 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-22 | Breast Cancer Cell line |
| T47D | American Type Culture Collection ATCC | HTB-133 | Breast Cancer Cell line |
| HS578T | American Type Culture Collection ATCC | HTB-126 | Breast Cancer Cell line |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-26 | Breast Cancer Cell line |
| RPMI 1640 medium | GIBCO BRL Life Technologies | 11875-093 | |
| DMEM High Glucose | GIBCO BRL Life Technologies | 11964-092 | 4.5 g/L glucose |
| DMEM/F12 | GIBCO BRL Life Technologies | 11039-021 | |
| Antibiotic/Antimycotic | GIBCO BRL Life Technologies | 15240-062 | 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16000-044 | |
| Horse serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16050114 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA 1X | GIBCO BRL Life Technologies | 25300-062 | |
| PBS 1X (Phosphate Buffered Saline | GIBCO BRL Life Technologies | 20012-027 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 (1.00mg) | |
| Insulin | SIGMA-ALDRICH | I1882-100MG | |
| Hydrocortisone | SIGMA-ALDRICH | H088-5G | |
| Cholera toxin Vibrio cholerae | SIGMA-ALDRICH | C8052-1MG | |
| Matrigel | Corning Inc | 356237 | Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| MCP-1 | PeproTech | 300-04 | |
| RANTES | PeproTech | 300-06 | |
| IL-8 | PeproTech | 200-08 | |
| IL-1β | PeproTech | 200-01B | |
| Crystal-violet | Hycel México | 541 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P6148 | |
| Transwell permeable supports (inserts) | Corning Inc | 3422 | 6.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates |
| Transwell permeable supports (inserts) | Thermofisher Scientific | 140620 | 6.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates |
| Monocyte Isolation Kit II Human | Miltenyi Biotec | 130-091-153 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate Assay | EMD Millipore | HCYTOMAG-60K | |
| Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation) | Luminex Corporation | 40-072 | |
| Lab-Tek chamber slide with cover (8 well) | Nalge Nunc International | 177402 | |
| Glass bottom microwell 35mm petri dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
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