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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

एक Extracellular मैट्रिक्स निकालने में Monocytes और प्राथमिक स्तन कैंसर कोशिकाओं के बीच संचार का विश्लेषण (ECME)-तीन आयामी प्रणाली आधारित

Published: January 8, 2018 doi: 10.3791/56589
Automatic Translation
*1,2, *1, 1
1Unidad de Investigación en Virología y Cáncer, Hospital Infantil de México Federico Gómez, 2Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एक तीन आयामी संस्कृति विधि का वर्णन करने के लिए प्राथमिक स्तन कैंसर की कोशिकाओं की आकृति विज्ञान का विश्लेषण, के रूप में अच्छी तरह के रूप में अध्ययन करने के लिए अपने प्रत्यक्ष/monocytes के साथ अप्रत्यक्ष बातचीत और ऐसे कोलेजन क्षरण के रूप में परिणाम, प्रतिरक्षा सेल भर्ती, सेल आक्रमण, और कैंसर से संबंधित सूजन को बढ़ावा देने के ।

Abstract

extracellular मैट्रिक्स (ECM) में एंबेडेड, सामांय और नवोत्पादित उपकला कोशिकाओं को अच्छी तरह से टेम और गैर टेम कोशिकाओं के साथ संवाद, इस प्रकार बहुत सामांय ऊतक homeostasis और रोग के परिणाम को प्रभावित । स्तन कैंसर में ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज (TAMs) रोग प्रगति, मेटास्टेसिस, और पुनरावृत्ति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं; इसलिए, ट्यूमर microenvironment और उनके ट्यूमर कोशिकाओं के साथ बातचीत करने के लिए monocyte chemoattraction के तंत्र को समझने की बीमारी को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है । यहां, हम मानव स्तन कैंसर (BrC) कोशिकाओं और मानव monocytes के एक तीन आयामी (3 डी) सह संस्कृति प्रणाली का एक विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं । BrC कोशिकाओं पर विनियमित के उच्च बेसल स्तर का उत्पादन-सक्रियण, सामांय टी सेल व्यक्त की है और secreted (rants), monocyte chemoattractant प्रोटीन-1 (एमसीपी-1), और granulocyte-macrophage कॉलोनी-उत्तेजक फैक्टर (जी सीएसएफ), जबकि सह में monocytes के साथ संस्कृति, प्रो भड़काऊ साइटोकिंस Interleukin (il)-1 बीटा (il-1β) और il-8 मैट्रिक्स metalloproteinases (एमएमपी)-1, एमएमपी-2, और एमएमपी-10 के साथ एक साथ समृद्ध थे । इस ट्यूमर स्ट्रोमा microenvironment MCF में anoikis के प्रतिरोध को बढ़ावा दिया-10A 3d acini-संरचनाओं की तरह, chemoattraction के monocytes, और आक्रामक BrC कोशिकाओं के आक्रमण । प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत एक किफायती विकल्प के लिए इंट्रा ट्यूमर संचार का अध्ययन प्रदान करते है और महान क्षमता का एक उदाहरण है कि इन विट्रो में 3 डी सेल सिस्टम ट्यूमर ट्यूमर से संबंधित जीव विज्ञान की विशिष्ट सुविधाओं से पूछताछ करने के लिए प्रदान आक्रामकता.

Introduction

ट्यूमर जीव विज्ञान पहले से सोचा से कहीं अधिक जटिल है । बढ़ते सबूत से पता चलता है कि ट्यूमर कोशिकाओं अनियंत्रित proliferating कोशिकाओं के एक मात्र थोक से अधिक कर रहे हैं; बल्कि, विभिंन नवोत्पादित कोशिकाओं को विभिंन ट्यूमर1के भीतर उच्च संगठन और पदानुक्रम प्रदर्शित करने के कार्यों प्रदर्शन करने लगते हैं । ट्यूमर कोशिकाओं को भी गैर-रूपांतरित कोशिकाओं के साथ अंतरंग संचार में कर रहे हैं: मैक्रोफेज, fibroblasts, लिम्फोसाइटों, adipocytes, endothelial कोशिकाओं, अन्य कोशिकाओं के बीच सब पाड़ प्रोटीन और polysaccharides कि ECM गठन में डूबे हुए हैं । कई प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष बातचीत रूपांतरित और गैर-रूपांतरित कोशिकाओं और ECM, जो रोग के परिणाम2,3पर एक शक्तिशाली प्रभाव डालती है के बीच स्थापित कर रहे हैं । BrC के विशिष्ट मामले में, यह विशेष रूप से TAMs के साथ BrC कोशिकाओं के संचार टुकड़े महत्वपूर्ण है, यह देखते हुए कि TAMs ट्यूमर के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा पाया गया है, मेटास्टेसिस के जोखिम में वृद्धि और रोग पुनरावृत्ति4 ,5.

अंतर-ट्यूमर बातचीत और उनके संभावित परिणामों का विश्लेषण करने के लिए, नए 3 डी इन विट्रो दृष्टिकोण ECM निष्कर्षों के उपयोग के आधार पर विकसित किया गया है कि एक बहुत अधिक जटिल microenvironment प्रदान, ट्यूमर जीव विज्ञान की वास्तविकता के करीब, की तुलना में पारंपरिक monolayer कोशिका संस्कृतियों जिसमें कोशिकाओं प्लास्टिक से जुड़ी हो जाना । पीटरसन और बिसेल6 घातक और घातक स्तन उपकला एक laminin-अमीर तहखाने झिल्ली पर प्रसंस्कृत कोशिकाओं के पहले मॉडल प्रदान की और 3 डी organotypic संरचनाओं कि भेदभाव घातक मानव का वर्णन करने के लिए पहले थे उनके घातक समकक्षों से स्तन उपकला कोशिकाओं. एक दशक बाद, Debnath द्वारा विकसित मॉडल, Muthuswamy, और Brugge7,8,9 ग्रंथियों acini के घातक परिवर्तन के दौरान समझौता जैविक रास्ते स्पष्ट करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान की, ऐसे अनियंत्रित प्रसार के कारण बड़े acini गठन के रूप में, बिगड़ा सेल ध्रुवीकरण के सबूत के रूप में तंग जंक्शन प्रोटीन के स्थानीयकरण, और anoikis के लिए सेल प्रतिरोध का एक परिणाम के रूप में acini लुमेन के नुकसान, क्रमादेशित सेल मौत का एक प्रकार है कि में होता है anchorage-निर्भर कोशिकाओं को जब वे आसपास के ECM से अलग । Sameni, Jedeszko, और Sloane के मॉडल कोशिकाओं द्वारा इमेजिंग proteolytic गतिविधि पर ध्यान केंद्रित किया है, जो बारीकी से इनवेसिव करने के लिए संबंधित है, ट्यूमर द्रोह के एक अन्य महत्वपूर्ण लक्षण10,11,12. इन मॉडलों पर निर्भर प्रोटीन अलग प्रतिदीप्ति के साथ मिश्रित मैट्रिक्स-बुझती प्रोटीन सब्सट्रेट (डीक्यू-जिलेटिन, डीक्यू-कोलेजन मैं, और डीक्यू-कोलेजन IV), जिसमें फ्लोरोसेंट संकेतों कोलेजन का proteolytic गिरावट का संकेत कर रहे हैं । 3 डी मॉडल भी दोनों गैर रूपांतरित और ट्यूमर कोशिकाओं के स्टेम सेल गुणों का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है, जिसमें सेल समुच्चय, भी spheroids पद, निलंबन में या ECM में कल्चरित किया जा सकता है-जैसे प्रोटीन सेल भेदभाव के तंत्र के लिए पूछताछ, असममित सेल प्रभाग, सेल-टू-सेल पालन, और सेल गतिशीलता13,14. आक्रमण परख ट्यूमर के आंतरिक आक्रामकता और अणुओं है कि इनवेसिव प्रक्रिया15के दौरान chemoattractants के रूप में सेवा की पहचान के परीक्षण की अनुमति । कुल मिलाकर, 3d मॉडल इन विट्रो सेल संस्कृति के एक किफायती विविधीकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं जो और अधिक बारीकी से सामान्य और oncogenic ऊतक morphogenesis को प्रतिबिंबित करते हैं ।

हम एक 3 डी सेल सह संस्कृति प्रणाली aforementioned मॉडल7,10,11के आधार पर बनाया गया है, ज्ञात आक्रामक क्षमता के दोनों मानव वाणिज्यिक BrC सेल लाइनों का उपयोग (चमकदार और ट्रिपल-नकारात्मक प्रकार) और प्राथमिक कोशिकाएँ BrC रोगियों से explanted हैं. हम पहले जहां या तो गैर आक्रामक (MCF-7) या आक्रामक (एमडीए-एमबी-२३१) BrC कोशिकाओं सह एक extracellular मैट्रिक्स निकालने में U937 monocytes के साथ संस्कृति थे विकसित (ECME)-आधारित 3 डी प्रणाली है कि सीधे सेल सेल बातचीत की अनुमति दी । इन सह संस्कृतियों का निर्धारण कैसे इन दो कोशिका वंश के बीच संचार कैंसर आक्रामक व्यवहार से संबंधित जीन का एक सेट की प्रतिलिपि को प्रभावित किया गया । साइक्लोऑक्सीजिनेज-2 की एक महत्वपूर्ण वृद्धि (कॉक्स-2) प्रतिलिपि देखा गया था कि अपने उत्पादों में से एक की वृद्धि हुई उत्पादन के साथ मेल, प्रोस्टाग्लैंडीन E2 (PGE2), एक खोज है कि कैंसर प्रगति में सूजन की भूमिका पर प्रकाश डाला । एमएमपी की वृद्धि की प्रतिलेखन भी देखा गया था कि अधिक से अधिक कोलेजन प्रोटियोलिसिस के साथ संबंधित जब आक्रामक एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं सह थे डीक्यू में U937 monocytes-कोलेजन IV संस्कृतियों युक्त के साथ संस्कृति । नोट की, हमारे सह संस्कृतियों धारणा है कि सेल सेल संपर्क तंत्र कोलेजन क्षरण के लिए आवश्यक है का समर्थन नहीं किया । यह नहीं बल्कि सुझाव दिया है कि दो कोशिका वंश के बीच संचार गुप्त अणुओं द्वारा मध्यस्थता की थी । इसके अलावा, इन सह संस्कृति परख से काटा supernatants घुलनशील कारकों निहित है कि ग्रंथियों गैर द्वारा गठित acini-बदल MCF-10A कोशिकाओं को13। यह पाया गया कि आक्रामक और प्राथमिक BrC कोशिकाओं monocyte chemotactic अणुओं एमसीपी-1, जीएम-सीएसएफ, और rants के ऊंचा स्तर स्रावित । इस प्रकार, हम कक्ष-कक्ष सहभागिता को रोकने के लिए कक्ष संस्कृति आवेषण में कक्षों को अलग किया गया था, जिसमें एक 3d संस्कृति रेखांकित । इन संस्कृतियों BrC कोशिकाओं और monocytes के बीच अप्रत्यक्ष संचार का पता करने के लिए इस्तेमाल किया गया । इन परख के लिए, गैर आक्रामक और आक्रामक वाणिज्यिक BrC सेल लाइनों और प्राथमिक BrC कोशिकाओं, और मानव monocytes के तीन विभिंन प्रकार: वाणिज्यिक U937 और THP-1 कोशिकाओं, और प्राथमिक monocytes (पीएमएस) स्वस्थ दाताओं के परिधीय रक्त से पृथक (सभी monocytes एक गैर सक्रिय राज्य में इस्तेमाल किया गया) इस्तेमाल किया गया । भड़काऊ साइटोकिंस il-1β और il-8 की वृद्धि की सांद्रता सह संस्कृति में समृद्ध किया जा करने के लिए मनाया गया । इसी प्रकार, यह पाया गया कि एमएमपी-1, एमएमपी-2, और एमएमपी-10 भी BrC कोशिकाओं में वृद्धि हुई-monocyte सह संस्कृतियों, और इस तरह पिछले निष्कर्षों को मजबूत14. इस पांडुलिपि में, प्राथमिक BrC कोशिकाओं के अलगाव और 3 डी संस्कृतियों में परीक्षण के एक बिंदु-दर-बिंदु कार्यप्रवाह प्रतिनिधि परिणामों के साथ प्रस्तुत किया है । इस काम में महान क्षमता का एक अच्छा उदाहरण है कि इन विट्रो 3 डी सेल सिस्टम ट्यूमर जीव विज्ञान के विशिष्ट पहलुओं से पूछताछ करने के लिए प्रदान का गठन किया ।

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Protocol

BrC रोगियों से नमूने Unidad de Investigación en Virología y Cáncer, अस्पताल Infantil de México Federico Gómez के टिशू बैंक से प्राप्त किया गया । इस अध्ययन के वैज्ञानिक, नैतिक, और अस्पताल Infantil de México Federico Gómez: Comité de Investigación, Comité de Ética en Investigación और Comité de Bioseguridad के सुरक्षा समीक्षा बोर्डों द्वारा अनुमोदित किया गया था । सभी रोगियों को भावी भर्ती किया गया और अध्ययन की प्रकृति के बारे में सूचित किया गया: उन भाग लेने के लिए तैयार नमूना संग्रह करने से पहले एक लिखित सूचित सहमति हस्ताक्षरित और नैतिक दिशा निर्देशों और सबसे अच्छा नैदानिक अभ्यास के अनुसार इलाज किया गया संस्था आहे. प्रतिभागियों की पहचान की पढ़ाई की अवधि के लिए गुमनामी थी । रोगियों को शामिल इनवेसिव डक्टर कार्सिनोमा, ऊतकीय ग्रेड 2 और नैदानिक चरण द्वितीय के साथ का निदान किया गया, ऊतक लकीर से पहले कोई पिछले neoadjuvant चिकित्सा के साथ. मरीजों को औसत ५६.८ वर्ष की आयु (रेंज ४२ से ७५)14पर सभी महिला वृद्ध थे ।

1.3d सेल संस्कृतियों

  1. बीज ०.१ x 106 MCF-10A कोशिकाओं या प्राथमिक BrC कोशिकाओं में 25 सेमी2 संस्कृति कुप्पी के साथ DMEM/F12 संस्कृति माध्यम के साथ पूरक 5% हार्स सीरम, १०० यू/एमएल पेनिसिलिन, १०० µ g/एमएल streptomycin, १०० एनजी/एमएल हैजा विष, ०.५ µ जी/एमएल hydrocortisone, 10 µ जी/ इंसुलिन, और 20 एपिडर्मल वृद्धि कारक (EGF) के एनजी/ बीज ०.१ x 106 वाणिज्यिक BrC कोशिकाओं, MCF-7 कोशिकाओं, और एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं में ७५ सेमी2 संस्कृति कुप्पी के साथ DMEM/F12 संस्कृति मध्यम के साथ पूरक 10% FBS, १०० U/एमएल पेनिसिलिन, और १०० µ g/एमएल streptomycin । एक humidified 5% CO2 वातावरण में ३७ ° c पर मशीन ।
  2. ४८ ज के बाद, कुल्ला के 10 मिलीलीटर बाँझ 1x फॉस्फेट के साथ monolayer खारा (पंजाब) । ३७ ° c पर 5-10 मिनट के लिए ०.०५% trypsin और ०.४८ mM ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के 3 मिलीलीटर सॉल्यूशन के साथ सेल monolayer को Trypsinize करें । trypsinization और पूरक के बिना मध्यम के 7 मिलीलीटर रोकने के लिए इसी सीरम के २०० µ एल जोड़ें । pipetting द्वारा कोशिकाओं reसस्पेंड और एक Neubauer कक्ष में कोशिकाओं की गणना करने के लिए 10 µ एल के एक aliquot निकालें.
  3. एक 8 अच्छी तरह से चैंबर स्लाइड प्रणाली की एक अच्छी तरह से, शुद्ध ECME के एक ४० µ एल आधार फैला, ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट की एक मशीन द्वारा पीछा किया ।
  4. प्रत्येक अच्छी तरह से, जगह ८०० कोशिकाओं में reसस्पैंड ४०० µ l के DMEM/F12 (बिना phenol लाल) पूरक के रूप में चरण १.१ में लेकिन निम्नलिखित परिवर्तनों के साथ: प्राथमिक BrC कोशिकाओं और MCF-10A कोशिकाओं के लिए, जोड़ें 4 एनजी/EGF के और 2% ECME; MCF-7 और एमडीए-एमबी-२३१ के लिए, केवल 2% ECME जोड़ें ।
  5. ३७ ° c में एक humidified 5% CO2 वातावरण में संस्कृतियों की मशीन । बदलें संस्कृति मीडिया हर ४८ ज ।
  6. रिकॉर्ड रूपात्मक कोशिकाओं के परिवर्तन हर 24 एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ 15 दिनों के लिए एच । प्राथमिक BrC कोशिकाओं की आकृति विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए, MCF-10A और एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं को आदेश दिया कोष्ठकी गठन के उदाहरण के लिए अच्छा संदर्भ सेल लाइनों और आक्रामक कैंसर की तरह संरचनाओं, क्रमशः परिक्रमा कर रहे हैं ।
  7. 100X और आवर्धन के 200X पर चमकीले क्षेत्र माइक्रोस्कोपी में कोशिकाओं की छवियों को प्राप्त करने और संदर्भ MCF-10A और एमडीए-एमबी-२३१ सेल लाइनों (चित्रा 1) के साथ सेल आकृति विज्ञान की तुलना.

2. ट्यूमर ऊतक से प्राथमिक कैंसर कोशिकाओं को प्राप्त करने

नोट: ट्यूमर उपकला कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए कोई पिछले neoadjuvant चिकित्सा के साथ BrC रोगियों से प्रतिच्छेदित प्राथमिक ट्यूमर से ऊतक का उपयोग करें; बचें क्षेत्रों और ट्यूमर ऊतक के ०.५ cm3 की एक ंयूनतम के साथ काम करते हैं ।

  1. बाँझ 1x पंजाबियों के साथ कुल्ला ट्यूमर ऊतक और यांत्रिक रूप से यह 1-2 mm टुकड़ों में एक स्केलपेल के साथ समग्र ।
  2. एक बाँझ में ऊतक को पचाने में 20 एमएल के लिए टोपी के साथ ग्लास शीशी 2 घंटे के तापमान पर (RT) पालन समाधान के 2 मिलीलीटर के साथ: मिश्रण 1 मिलीग्राम/एमएल collagenase प्रकार मैं और १०० यू/एमएल hyaluronidase DMEM/F12 मध्यम जिसमें १०० u/ml पेनिसिलिन और १०० µ g/एमएल streptomycin , लगातार सरगर्मी के साथ ।
  3. अपच ऊतक के बड़े टुकड़े को खत्म करने के लिए tulle के निष्फल टुकड़े के माध्यम से परिणामी निलंबन फ़िल्टर । फिर एक निष्फल १०० µm-ताकना झिल्ली के माध्यम से सेल निलंबन फिल्टर ।
  4. आरटी पर 5 मिनट के लिए ४३० x g पर कोशिकाओं गोली और उंहें दो बार बाँझ 1x पंजाबियों के साथ धो लो । DMEM/F12 मध्यम में संस्कृति प्राथमिक कक्ष 5% हार्स सीरम, १०० U/एमएल पेनिसिलिन, १०० µ g/एमएल streptomycin, १०० एनजी/एमएल हैजा विष, ०.५ µ जी/एमएल hydrocortisone, 10 µ जी/एमएल इंसुलिन, और EGF के 20 एनजी/एमएल के साथ पूरक । एक humidified 5% CO2 वातावरण में ३७ ° c में संस्कृतियों को बनाए रखने के माध्यम से हर ४८ एच. बदलें ।
  5. सुनिश्चित करें कि अलग कोशिकाओं immunocytochemistry14के एक मानक प्रोटोकॉल के साथ उपकला कोशिकाओं रहे हैं । तीन उपकला मार्करों का परीक्षण: cytokeratins के एक पैनल (PanCK), mucin-1 (Muc-1), और उपकला कोशिका आसंजन अणु (EpCAM).

3. परिधीय रक्त से अलग प्रधानमंत्री कोशिकाओं

  1. एक स्वस्थ स्वयंसेवक से परिधीय रक्त के लगभग ४० मिलीलीटर निकालें, बाँझ endotoxin मुक्त 1x पंजाबियों के साथ एक 1:3 अनुपात में खून पतला, और यह एक घनत्व ढाल जुदाई के अधीन ।
  2. एक शंकु ट्यूब में, एक polysucrose और सोडियम diatrizoate मध्यम के एक घनत्व के साथ 2 मिलीलीटर की जगह १.०७७ ग्राम/ ध्यान से और धीरे से पतला रक्त के 8 मिलीलीटर ओवरले । 30 मिनट, आर टी पर ७६५ x जी के लिए केंद्रापसारक के केंद्रापसारक का सबसे धीमी त्वरण-मंदी गति का प्रयोग करें ।
    नोट: इस केंद्रापसारक के बाद, चार परतों के नीचे से ऊपर का गठन किया जाएगा: लाल रक्त कोशिकाओं गोली, घनत्व ढाल मध्यम परत, mononuclear कोशिकाओं परत (यह एक ठीक सफेद अंगूठी के रूप में प्रकट होता है), और प्लाज्मा परत ।
  3. ध्यान से एक बाँझ पाश्चर पिपेट के साथ ढाल से mononuclear सेल परत पुनः प्राप्त करने और उंहें 1x पंजाबियों के साथ तीन बार धोने, हर बार धीमी गति के बाद (४३०, २७५, और १९१ एक्स जी) आरटी पर 10 मिनट के लिए ।
  4. कक्षों के सक्रियण से बचने के लिए ऋणात्मक चयन प्रोटोकॉल का उपयोग करें । इस तरह के एक प्रोटोकॉल का एक उदाहरण निंनलिखित है:
    1. धोने बफर समाधान (०.५% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन, 1x पंजाब में 2 मिमी EDTA) के साथ एक बार mononuclear कोशिकाओं को धो लें । एक Neubauer कक्ष में कोशिकाओं की गणना और एक घनत्व के लिए उन्हें समायोजित 1 एक्स 107 कोशिकाओं/30 µ l एक buffered समाधान की.
    2. हर 1 x 107 कोशिकाओं के लिए, एक FcR ब्लॉकिंग रिएजेंट और 10 µ एल के 10 µ एल जोड़ने के एक monocyte बायोटिन-एंटीबॉडी कॉकटेल कि विरोधी मानव CD3, CD7, CD16, CD19, CD56, CD123, और Glycophorin एक (वाणिज्यिक किट में शामिल हैं) ।
    3. कोशिकाओं को मिलाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए मशीन । धोने के अतिरिक्त 30 µ l जोड़ें बफ़र्ड समाधान प्लस 20 µ एल के विरोधी-बायोटिन microbeads (किट में शामिल); मिश्रण कोशिकाओं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए मशीन ।
    4. एक बार एक बफर समाधान के साथ कोशिकाओं को धोने, आरटी में 5 मिनट के लिए ४३० x g पर, और चुंबकीय जुदाई के लिए बफर समाधान के १.५ मिलीलीटर में reसस्पैंड ।
    5. एक पूर्व कुल्ला चुंबकीय जुदाई कॉलम पर सेल निलंबन लोड और बफर समाधान के 7 मिलीलीटर जोड़ें । 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में monocyte-समृद्ध अंश लीजिए, कोशिकाओं की गणना, और अगर तुरंत कल्चरल नहीं, 2 x 106 कोशिकाओं के घनत्व पर monocytes फ्रीज/DMEM/F12 मध्यम से ५०% FBS और 10% DMSO के साथ पूरक − ८० डिग्री सेल्सियस पर ।
      नोट: ठंड के 2 महीने से अधिक के बाद monocytes का उपयोग करने से बचें, के रूप में उनकी व्यवहार्यता समझौता किया जा सकता है ।
  5. DMEM/F12 मध्यम में पीएमएस की संस्कृतियों को बनाए रखने के 6% FBS, १०० U/एमएल पेनिसिलिन, और १०० µ g/एमएल streptomycin, ३७ ° c में एक humidified 5% CO2 वातावरण में ।
  6. विभिंन दाताओं से monocytes के रूप में monocyte सक्रियण में परिणाम कर सकते हैं, अलग अलग दानदाताओं से पीएमएस का उपयोग प्रयोग के प्रत्येक सेट प्रदर्शन करते हैं ।

4.3 डी सह संस्कृतियों की स्थापना

  1. अप्रत्यक्ष बातचीत के साथ 3 डी सह संस्कृतियों
    नोट:     24 में इन परख प्रदर्शन अच्छी तरह से फ्लैट नीचे संस्कृति प्लेटें ०.४ µm ताकना आकार की झिल्ली के साथ पाली कार्बोनेट सेल संस्कृति आवेषण का उपयोग कर । इस परख में, दोनों supernatants और कोशिकाओं को प्रयोग के अंत में प्राप्त किया जा सकता है ।
    1. खेती 2 x 106 U937 और THP-1 monocytes के 10 मिलीलीटर में RPMI १६४० मध्यम 10% FBS के साथ पूरक, 1% एंटीबायोटिक/antimycotic, और पूरक DMEM/F12 मध्यम में ताजा पीएमएस खेती (के रूप में ३.५ कदम में पहले संकेत दिया), ३७ डिग्री सेल्सियस से कम एक humidified में 5% सह2 पर्यावरण.
    2. प्लेट 4 x 105 monocytes में 1 मिलीलीटर/उनके इसी माध्यम की अच्छी तरह से (2% ECME और U937 और THP के लिए 2% FBS के साथ पूरक-1 monocytes, या 2% ECME और पीएमएस के लिए 6% FBS) ।
    3. एक अच्छी तरह से एक डालने प्लेस और इसी माध्यम में 4 x 105 BrC सेल निलंबन के ०.९ मिलीलीटर जोड़ें (2% ECME और वाणिज्यिक सेल लाइनों या प्राथमिक BrC कोशिकाओं के लिए 5% हार्स सीरम के लिए 2% FBS के साथ पूरक) । कुल मीडिया के आधे से बदलें हर ४८ ज ।
    4. 5 दिनों के लिए एक humidified 5% सह2 वातावरण में ३७ ° c पर मशीन और supernatants की वसूली । अनुवर्ती विश्लेषण किया जाता है, तो trypsinization द्वारा कक्षों को पुनर्प्राप्त करें ।
    5. संबंधित मीडिया के साथ व्यक्तिगत सेल संस्कृतियों के नियंत्रण शामिल करें ।
  2. प्रत्यक्ष संपर्क के साथ 3 डी सह संस्कृतियों
    1. लेबल BrC कोशिकाओं और सेल संस्कृति से पहले अलग फ्लोरोसेंट रंगों के साथ monocytes mRNA और प्रोटीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए संस्कृति के बाद प्रत्येक कोशिका वंश की स्वतंत्र छंटाई की अनुमति है । अनंतमूलि और rhodamine के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डेरिवेटिव है कि स्वतंत्र रूप से जीवित कोशिकाओं की कोशिका झिल्ली के माध्यम से पारित का उपयोग करें । लेबलिंग के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल निम्न है:
      1. ब्याज की BrC कोशिकाओं के एक monolayer तैयार (2 × 106 कोशिकाओं को एक 25 सेमी2 संस्कृति कुप्पी में) और पर्याप्त पूर्व के साथ मानक माध्यम की जगह-गर्म फ्लोरोसेंट डाई का काम कर समाधान (1: फ्लोरोसेंट डाई के 2000 मानक आधार मध्यम में किसी भी पूरक के बिना) । एक humidified 5% CO2 वातावरण में ३७ ° c में 30 मिनट की मशीन । डाई समाधान महाप्राण और पर्याप्त 1x पंजाबियों के साथ धीरे कुल्ला । पंजाबियों को महाप्राण और मानक मध्यम जोड़ें ।
      2. Trypsinize ०.०५% trypsin और ०.४८ mM EDTA के समाधान के 2 मिलीलीटर के साथ सेल monolayer ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5-10 मिनट के लिए । FBS के २०० µ l को जोड़ने के लिए बंद trypsinization और 7 एमएल के संवाददाता मध्यम की खुराक के बिना. pipetting द्वारा कोशिकाओं reसस्पेंड । एक Neubauer कक्ष में कोशिकाओं की गणना करने के लिए 10 µ एल की एक aliquot ले लो । सेल गिनती के बाद सह संस्कृति प्रोटोकॉल के साथ जारी रखें ।
      3. आरटी पर 5 मिनट के लिए ४३० x g पर कोशिकाओं गोली (निलंबन में monocytes बढ़ने के बाद से इस पहले प्रदर्शन) । supernatant त्यागें और धीरे एक पूर्व के 3 मिलीलीटर-फ्लोरोसेंट डाई (1: की खुराक के बिना एक मानक आधार मध्यम में फ्लोरोसेंट डाई के 2000) के काम के समाधान गरम कोशिकाओं को पुनः स्थगित । एक humidified 5% CO2 वातावरण में ३७ ° c में 30 मिनट के लिए मशीन ।
      4. कोशिकाओं को फिर से गोली, डाई काम समाधान त्यागें, और धीरे 1x पंजाबियों की 5-7 मिलीलीटर के साथ पुनः निलंबित । गोली एक बार फिर, पंजाबियों को त्यागें, और मानक माध्यम के 5-7 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड । एक Neubauer कक्ष में कोशिकाओं की गणना करने के लिए सेल निलंबन के 10 µ एल की एक aliquot ले लो । सेल गिनती के बाद सह संस्कृति प्रोटोकॉल के साथ जारी रखें ।
    2. सह-संस्कृति निम्नानुसार सेट करें:: अच्छी तरह से एक 4-अच्छी तरह से चैंबर स्लाइड प्रणाली के प्रत्येक कुआं में एक भी परत फार्म के तल पर पर्याप्त ECME फैला. प्लेट 20 µ एल एक एकल सेल निलंबन 5 × 105 लेबल BrC कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से युक्त ।
    3. ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन के 15-20 मिनट के बाद, ८० µ एल परख माध्यम में २.५ x 105 लेबल monocytes का निलंबन जोड़ें (६०% ECME के साथ पूरक) ।
    4. ECME ३७ डिग्री सेल्सियस पर 15-20 मिनट के लिए जमना के लिए अनुमति दें ।
    5. BrC कोशिकाओं और monocyte संस्कृति मीडिया के एक 1:1 मिश्रण की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    6. ३७ ° c में एक humidified 5% सह2 वातावरण में 24 घंटे के लिए सह-संस्कृतियों की मशीन, ४८ ज, या 5 दिनों के विभिंन समय बिंदुओं पर परिवर्तन ट्रैक करने के लिए ।
    7. संस्कृतियों से कोशिकाओं को ठीक करने के लिए नीचा ECM प्रोटीन । महाप्राण और मध्यम त्याग, ०.१% trypsin और ०.२५% EDTA के साथ 1x पंजाबियों के ०.५ मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए मशीन । गर्मी के बाद, trypsin बेअसर करने के लिए 10% FBS के साथ 1x पंजाबियों के ०.५ मिलीलीटर जोड़ने, और एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए जोरदार pipetting द्वारा कोशिकाओं reसस्पैंड ।
    8. आरटी पर 5 मिनट के लिए ७६५ x जी में गोली कोशिकाओं, supernatant त्यागें, और 10% FBS के साथ 1x पंजाबियों के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं reसस्पेंड । इस चरण को एक बार दोहराएं ।
    9. कक्ष निलंबन प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) के लिए उपयुक्त उपकरण के साथ विषय । सुनिश्चित करें कि अंतिम आबादी है कम से ९५% शुद्ध) ।
    10. छंटाई के बाद, के साथ कोशिकाओं को धो बाँझ 1x पंजाबियों, गोली (आरटी में 5 मिनट के लिए ४३० x जी), और बाँझ 1x पंजाब में reसस्पैंड । कोशिकाओं आरएनए अलगाव या प्रोटीन विश्लेषण के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल के अनुसार संसाधित किया जा सकता है ।
    11. प्रत्येक परख तीन बार दोहराएं, नियंत्रण के रूप में प्रत्येक व्यक्ति के सेल वंश के 3 डी संस्कृतियों सहित ।
  3. 3 डी सह संस्कृतियों के प्रत्यक्ष संपर्क कोलेजन क्षरण का आकलन करने के लिए
    1. 3 डी सेल सह संस्कृतियों की स्थापना के रूप में ४.२ कदम में वर्णित है, जोड़ने के अतिरिक्त कदम के साथ ३२.५ µ g/एमएल के प्रकार IV कोलेजन ECME को fluorescein isothiocyanate के साथ लेबल । अंतिम ECME में कोलेजन चतुर्थ की एकाग्रता ०.५% है । एक ३५ में संस्कृतियों बढ़ती-mm coverslip एक पेट्री व्यंजन में रखा ।
    2. पेट्री डिश के नीचे में ECME के ४० µ l की एक परत फैलाएं । ECME को ३७ डिग्री सेल्सियस पर जमना की अनुमति दें ।
    3. मध्यम के 10 µ l में २.५ x 105 BrC कक्ष जोड़ें और कक्षों को व्यवस्थित करने की अनुमति दें ।
    4. ४० µ एल परख मध्यम में १.२५ x 105 U937 monocytes के निलंबन जोड़ें (डीक्यू-कोलेजन IV लेबल-ECME के ६०% के साथ पूरक) ।
    5. ECME ३७ डिग्री सेल्सियस पर 15-20 मिनट के लिए जमना के लिए अनुमति दें ।
    6. BrC कोशिकाओं और monocyte संस्कृति मीडिया के एक 1:1 मिश्रण के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
    7. एक humidified 5% co2 वातावरण में ३७ ° c में 5 दिनों के लिए सह-संस्कृतियों की मशीन । बदलें संस्कृति मीडिया हर ४८ ज ।
    8. एक फोकल स्कैनिंग माइक्रोस्कोप में प्रतिदीप्ति उत्सर्जन का विश्लेषण और संस्कृति के ५० µm2 प्रति एकीकृत ऑप्टिकल घनत्व (IOD) को मापने । व्यक्तिगत संस्कृतियों और समय शूंय पर संस्कृति के खिलाफ IODs की तुलना करें (चित्रा 2) ।

5. अप्रत्यक्ष संपर्क के साथ 3 डी सह संस्कृतियों से Supernatants का विश्लेषण

  1. सह संस्कृति के 5 दिनों के बाद, दोनों ऊपरी और 3 डी सह संस्कृतियों के निचले डिब्बों से supernatants की वसूली, और व्यक्तिगत 3 डी संस्कृति नियंत्रण से । pipetting द्वारा प्रत्येक supernatant को अच्छी तरह मिला लें । Aliquot, और supernatant की दुकान पर − 20 ° c उपयोग तक (एक माह तक) ।
    नोट: − 80 ° c पर supernatants रखें यदि संग्रहण एक महीने से अधिक लंबा होगा ।
  2. निर्माता की सिफारिश की प्रक्रियाओं के बाद division परख प्लेटफार्मों, एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा), या मनका-आधारित immunoassays के साथ supernatants विश्लेषण ।
    नोट: Supernatants भी पश्चिमी दाग से विश्लेषण किया जा सकता है या विशिष्ट ताकना फिल्टर के माध्यम से ध्यान केंद्रित करने के लिए आकार प्राप्त करने के लिए प्रोटीन अंशों को समृद्ध zymography विश्लेषण प्रदर्शन16,17। वैकल्पिक रूप से, नीचे बताए अनुसार अंय प्रयोगों के लिए supernatants का उपयोग वातानुकूलित मीडिया के रूप में करें । वातानुकूलित मीडिया आमतौर पर एक 5 दिन की संस्कृति से प्राप्त होता है (चित्र 3) ।

6. Acini गठन और Acini संरचना पर प्राथमिक BrC कोशिकाओं से Supernatants के प्रभाव का लक्षण वर्णन

  1. एक 8-अच्छी तरह से चैंबर स्लाइड प्रणाली के प्रत्येक अच्छी तरह से ECME का एक ४० µ l आधार फैला है और इसे ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए जमना ।
  2. बीज ८०० MCF-10A कोशिकाओं/४०० µ एल में पूरक DMEM/F12 संस्कृति माध्यम, चरण १.२ में वर्णित के रूप में ।
  3. मानव संयोजक इल-1β के 20 एनजी/एमएल के साथ वातानुकूलित मीडिया के ४०० µ एल जोड़ें या पूरक DMEM/
  4. एक ग्लास पेट्री डिश जिसमें ३५ mm पेट्री डिश है जिसमें पंजाब के 2 मिलीलीटर से भरी नमी वाला वातावरण बनाने के लिए चैंबर स्लाइड रखें ।
  5. बदलें मीडिया/supernatant हर ४८ ज ।
  6. रिकार्ड ग्रंथियों acini गठन हर 24 एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ 14 दिनों के लिए एच ।
  7. संस्कृति के 14 दिनों के बाद, १०० µ एल के साथ दाग acini 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 1x पंजाब में १०० एनएम की एकाग्रता में सेल नाभिक का निरीक्षण करने के लिए । लगातार सरगर्मी में आरटी पर 25 मिनट के लिए मशीन । 5 मिनट के लिए 1x पंजाबियों के साथ तीन बार कुल्ला, आरटी पर लगातार सरगर्मी में हर बार एक बढ़ते फ्लोरोसेंट धुंधला के लिए विशिष्ट माध्यम के साथ तैयारियों माउंट । पारदर्शी पॉलिश के साथ सील और 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से संरक्षित बनाए रखने के ।
  8. acini (चित्रा 4ए, बी, सी) के विभिन्न गहराई पर आड़ा के ढेर की छवियों को लेने के लिए एक फोकल माइक्रोस्कोप के साथ acini का विश्लेषण.
  9. उचित दाग प्रोटोकॉल के साथ acini में अलग सेलुलर प्रोटीन कल्पना । उदाहरण के लिए, ई-cadherin सेल-टू-सेल आसंजन, सेल ध्रुवीकरण, और/या लुमेन गठन18 (चित्रा 4डी) का आकलन करने के लिए दाग था ।

7. प्रवास परख

नोट: U937, THP-1 के प्रवास परख प्रदर्शन, और 24 में ताजा पीएमएस-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे संस्कृति प्लेटें 8 µm ताकना आकार की झिल्ली के साथ पाली कार्बोनेट सेल संस्कृति आवेषण का उपयोग कर । यह पहले से प्रदर्शित किया गया है कि chemokines जीएम सीएसएफ, एमसीपी-1, और rants आक्रामक BrC सेल लाइनों के व्यक्तिगत 3d संस्कृतियों में उच्च सांद्रता पर स्रावित पाया गया । यह प्रस्ताव किया गया था कि इन साइटोकिंस प्राथमिक ट्यूमर की साइट के लिए monocytes आकर्षित करने के लिए महत्वपूर्ण थे; इस प्रवास में परीक्षण किया गया था परख chemoattractants के रूप में साइटोकिंस का उपयोग ।

  1. कल्चर U937, THP-1, या फ्रेश पीएमएस जैसा कदम शुू में बताया गया है ।
  2. एक बार कुल्ला RPMI १६४० के २०० µ एल के साथ हर डालने सीरा के लिए झिल्ली हाइड्रेट के बिना ।
  3. ठंडा ECME के ५० µ एल के साथ भरें, एक 24 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे संस्कृति की थाली में आवेषण जगह है, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए polymerize के लिए ECME अनुमति देते हैं ।
  4. थाली के ऊपरी डिब्बे में FBS बिना RPMI के १८० µ l को जोड़ें । chemoattractant के रूप में या तो जीएम-सीएसएफ, एमसीपी-1, या rants के १०० एनजी/एमएल के साथ पूरक RPMI के ८०० µ एल bubbling बिना निचले चैंबर में जोड़ें । साइटोकिंस बिना एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में मध्यम का उपयोग करें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन एक chemokine ढाल स्थापित करने के लिए ।
  5. प्लेस १.५ x 10 एक बाँझ ट्यूब में monocyte के प्रत्येक प्रकार के5 , 1x पंजाबियों के 1 मिलीलीटर के साथ दो बार धो, और आरटी पर 5 मिनट के लिए ४३० x g पर केंद्रापसारक । FBS के बिना RPMI के 20 µ l में monocytes को फिर से सस्पेंड करें, इन्हें आवेषण में रखें , और बहुत ध्यान से सेल निलंबन homogenize (ऊपरी चैंबर के अंतिम खंड २०० µ एल है) ।
  6. humidified 5% सह2 वातावरण में ३७ ° c में 24 ज के लिए सेल माइग्रेशन की प्रगति की अनुमति दें ।
    नोट: जैसे-जैसे monocytes गैर-अनुयाई हैं, प्रवासी कोशिकाएँ सामान्यतः निचले डिब्बे की मीडिया में होंगी.
  7. संमिलित करता है निकालें, मीडिया पुनर्प्राप्त करें, और 2, 4, 6, और 24 h पर एक Neubauer कक्ष या एक प्रवाह cytometer का उपयोग कर कक्षों की गणना; वैकल्पिक रूप से, विशेष रूप से अगर कोई सेल मीडिया में पाए जाते हैं, एक डिजिटल कैमरा के साथ आवेषण के निचले हिस्से की छवियों को प्राप्त । माध्य (100X आवर्धन पर) 3 रैंडम फ़ील्ड्स से कक्ष गणना विश्लेषण (चित्र 5) के लिए उपयोग किया जाता है ।

8. आक्रमण परख

नोट: 24 में BrC कोशिकाओं के आक्रमण परख-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे संस्कृति प्लेटें 8 µm ताकना आकार की झिल्ली के साथ पाली कार्बोनेट सेल संस्कृति आवेषण का उपयोग कर प्रदर्शन । हमारे मूल अध्ययन में, IL-8 BrC सेल के supernatants में समृद्ध साइटोकिंस में से एक था/monocyte 3 डी सह संस्कृतियों । क्या इस cytokine आक्रमण में भाग ले रहा था BrC सेल लाइनों का परीक्षण किया गया था ।

  1. ७५ सेमी2 कुप्पी में BrC कोशिकाओं का विस्तार करें । MCF-7, T47D, HS578T, और एमडीए-MB-२३१ चरण १.२ (लेकिन बिना ECME) और चरण २.४ में वर्णित के रूप में प्राथमिक BrC कक्षों में वर्णित के रूप में ।
  2. एक बार धो प्रत्येक पाली कार्बोनेट 8 µm-ताकना झिल्ली सेल संस्कृति २०० µ एल के साथ मध्यम के बिना सीरा (मध्यम इस्तेमाल किया कोशिका लाइन पर निर्भर करता है परीक्षण) झिल्ली हाइड्रेट ।
  3. शीत ECME (1:4 कमजोर पड़ने ECME: FBS के बिना शीत मध्यम) के ५० µ एल के साथ डालने भरें, एक 24 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे संस्कृति की थाली में आवेषण प्लेस, और ECME के लिए 1 ज ३७ डिग्री सेल्सियस पर polymerize के लिए अनुमति देते हैं ।
  4. एक बार ECME बहुलक है, FBS के बिना संबंधित सेल मीडिया के १८० µ एल जोड़ें । जोड़ के slits के माध्यम से FBS के बिना ८०० µ एल मीडिया जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन एक आईएल-8 ढाल स्थापित करने के लिए ।
    नोट: मीडिया में बुलबुले पैदा करने से बचें । मीडिया का इस्तेमाल किया FBS के बिना है, लेकिन एक chemoattractant, या FBS बिना शुद्ध मीडिया के रूप में IL-8 के १०० एनजी के साथ पूरक, नकारात्मक नियंत्रण के रूप में ।
  5. प्रत्येक कक्ष पंक्ति के 6 x 105 कक्षों की कुल प्राप्तियां निंनानुसार हैं:
    1. supernatants त्यागें, 1x पंजाबियों के 10 मिलीलीटर के साथ एक बार कुल्ला, और ०.०५% trypsin/0.48 mM EDTA के 2 मिलीलीटर जोड़ें ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए कोशिकाओं को अलग करने के लिए । trypsin प्रतिक्रिया को रोकने के लिए और pipetting द्वारा सख्ती से स्थगित करने के लिए पूरक माध्यम से 4 मिलीलीटर जोड़ें ।
  6. एक Neubauer चैंबर में कोशिकाओं को गिनने के लिए सेल सस्पेंशन के 10 µ l aliquot लें । सेल 6 एक्स 105 कोशिकाओं से युक्त निलंबन की मात्रा ले लो । आरटी में 5 मिनट के लिए ४३० x g पर केंद्रापसारक, supernatant त्यागें, और कुल्ला कोशिकाओं 1x पंजाबियों के 1 मिलीलीटर में । एक बार फिर कुल्ला दोहराएं ।
  7. FBS के बिना संबंधित मीडिया के 20 µ एल में कोशिकाओं को reसस्पेंड और FBS बिना संबंधित मीडिया के १८० µ एल युक्त आवेषण में जगह है । pipetting द्वारा सेल सस्पेंशन को सावधानीपूर्वक homogenize ।
  8. एक humidified 5% CO2 वातावरण में ३७ ° c पर ४८ h के लिए सेल आक्रमण की प्रगति की अनुमति दें ।
  9. ४८ ज के बाद, डालने निकालें, supernatant त्यागें और एक बार बहुत ध्यान से डाल कुल्ला २०० µ एल पंजाबियों के l के साथ । एक कपास के साथ-साथ पंजाबियों की ज्यादतियों applicator हटा दें ।
    नोट: आक्रामक कोशिकाओं को आमतौर पर इस मामले में जहां कोशिकाओं अनुयाई है के रूप में डालने के दूसरे पक्ष से जुड़े रहे हैं ।
  10. एक 24-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे संस्कृति प्लेट की एक अच्छी तरह से में डालने के द्वारा कोशिकाओं को ठीक 1 एमएल के लिए 4% paraformaldehyde के 15 मिनट के लिए RT. बाद में, कुल्ला आवेषण 1x पंजाबियों के साथ एक बार ।
  11. एक 24-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे संस्कृति 1 मिलीलीटर की एक अच्छी तरह से में डालने के द्वारा कोशिकाओं दाग और ०.२% क्रिस्टल वायलेट के लिए आरटी में ४५ मिनट के साथ 1x पंजाबियों की अच्छी तरह से । ध्यान से, एक रूई के साथ-साथ झिल्ली के ऊपर से सभी ECME को applicator निकाल , जो कि कोशिकाओं को स्थानांतरित नहीं किया है, और आसुत जल के साथ बहुत ध्यान से कुल्ला करने के लिए तय इनवेसिव कोशिकाओं को नष्ट करने से बचने शामिल हैं ।
  12. उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत डालने के निचले पक्ष को देख कर हमलावर कोशिकाओं की गणना. मतलब 3 यादृच्छिक क्षेत्रों से सेल गिनती (100X आवर्धन पर) का उपयोग किया जाता है । मामलों में जहां कोशिकाओं समूहों के रूप में हमला किया है और व्यक्तिगत रूप से गिनती करने के लिए मुश्किल हैं, एक डिजिटल कैमरे के साथ 3 यादृच्छिक क्षेत्रों (100X आवर्धन पर) से छवियों को प्राप्त । छवि विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर के साथ छवियों का विश्लेषण और सेल आक्रमण (चित्रा 6) यों तो IOD का उपयोग करें ।

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Representative Results

3 डी संस्कृतियों में BrC कोशिकाओं का रूपात्मक विश्लेषण:

कम और उच्च घनत्व पर 3 डी संस्कृतियों में बढ़ रही प्राथमिक BrC कोशिकाओं की आकृति विज्ञान 5 दिनों में अध्ययन किया गया था । पहले ४८ ज के दौरान, कोशिकाओं ECME का पालन करें और एक कम घनत्व को बनाए रखने । इस समय बिंदु पर, यह स्पष्ट रूप से सराहना की जा सकता है कि कोशिकाओं के आकार की तरह एक लंबी धुरी मौजूद, दो या अधिक लंबे समय cytoplasmic अनुमानों के साथ कुछ और स्पष्ट सेल-सेल संपर्कों को दिखाने के बिना । संस्कृति के 5 दिनों के बाद, अपने प्रारंभिक आकृति विज्ञान को बनाए रखते हुए कोशिकाओं proliferated. इसके अलावा, वे एक विशिष्ट संरचनात्मक संगठन के बिना जाल जैसी संरचनाओं का गठन, और कोई संपर्क संकोच के साथ ढेर दिखाई देते हैं । गैर के साथ एक तुलना-रूपांतरित MCF-10A कोशिकाओं बनाया गया था, जो ग्रंथियों acini जैसी गोलाकार संरचनाओं फार्म । इन कोशिकाओं समरूप आकार (लगभग ५० µm) में गोलाकार अच्छी तरह से सीमांकित और संगठित संरचनाओं की एक विशेषता आकृति विज्ञान प्रदर्शित करते हैं । इसके विपरीत, प्राथमिक BrC कोशिकाओं को आक्रामक BrC कोशिकाओं एमडीए-एमबी-२३१ (चित्रा 1) के साथ एक बहुत करीब समानता का हिस्सा है ।

सेल का विश्लेषण करने वाली सेल प्रत्यक्ष बातचीत और कोलेजन गिरावट:

हम निंनलिखित का आकलन करने के लिए एक 3 डी सह संस्कृति मॉडल तैयार: कक्ष आकृति विज्ञान, कोलेजन क्षरण, सेल प्रवास, और क्या वहां सह संस्कृति में BrC कोशिकाओं और monocytes के बीच एक सीधा संपर्क है । 5 दिनों के बाद, दोनों MCF-7 और एमडीए-एमबी-२३१ वाणिज्यिक BrC कोशिकाओं 3 डी संस्कृतियों में बेतरतीब समुच्चय के रूप में, हालांकि, वे अपनी आकृति विज्ञान में अलग. आक्रामक कोशिकाओं एमडीए-एमबी-२३१ शेष से अलग करने के लिए कुछ कोशिकाओं के साथ विस्तृत रूपों के साथ फार्म समुच्चय, जबकि गैर आक्रामक MCF-7 कोशिकाओं के फार्म का समुच्चय जहां कोशिकाओं को गोल आकार बनाए रखने और वे अधिक घनी संकुचित होना दिखाई देते हैं (चित्र 2 ए, बी). डीक्यू कोलेजन IV proteolytic गिरावट कल्पना को शामिल किया गया था (हरा), दोनों BrC फ्लोरोसेंट गतिविधि का प्रदर्शन संस्कृतियों के साथ । proteolytic गतिविधि को मात्रात्मक रूप से मूल्यांकन करने के लिए, ग्रीन प्रतिदीप्ति को ६ ५० µm 2 फ़ील्ड के IOD के रूप में मापा गया । एक तुलना एमडीए के व्यक्तिगत 3d संस्कृतियों-एमबी-२३१ कोशिकाओं और U937 monocytes के साथ सह संस्कृतियों के बीच किया गया था । सांख्यिकी सह-संस्कृति में प्रोटियोलिसिस की उल्लेखनीय वृद्धि (चित्रा 2सी) मनाया गया । इसके अलावा, सीरियल आड़ा स्टैक्स के एक फोकल माइक्रोस्कोपी विश्लेषण एमडीए-एमबी-२३१ और U937 monocytes सह संस्कृति के हर 10 µm (चित्रा 2डी) प्रदर्शन किया गया था । इस विश्लेषण से पता चला कि U937 monocytes आक्रामक कोशिकाओं एमडीए-एमबी-२३१ की ओर चले गए कुछ monocytes BrC कोशिकाओं की परत तक पहुंचने के साथ । हालांकि, यह स्पष्ट है कि सेल-सेल प्रत्यक्ष संपर्क साइटों जरूरी उच्च proteolytic गतिविधि के क्षेत्रों के साथ मेल नहीं थे: इसके बजाय, कोलेजन क्षरण के क्षेत्रों समान रूप से संस्कृति में फैले थे, निष्कर्ष के लिए अग्रणी है कि कोलेजन क्षरण अप्रत्यक्ष रूप से स्रावित कारकों द्वारा मध्यस्थता संचार का परिणाम था । इसलिए, 3 डी सह संस्कृति मॉडल एक छिद्रित झिल्ली से अलग अलग डिब्बों में कोशिकाओं जगह बदल गया था सेल सेल गुप्त कारकों पर आधारित संचार की अनुमति है, और सेल लेबलिंग और संस्कृति के बाद छंटाई से बचें ।

3 डी संस्कृतियों से Supernatants में IL-1β का विश्लेषण:

अप्रत्यक्ष संपर्क 3 डी संस्कृतियों के साथ कार्य करना, व्यक्तिगत प्राथमिक BrC संस्कृतियों और उनके 5 दिनों के सह-संस्कृतियों से supernatants को काटा गया । इन supernatants 18 साइटोकिंस और 5 MMPs वाणिज्यिक किट और एक विशेष रूप से इस विश्लेषण के लिए डिजाइन उपकरण का उपयोग कर के एक साथ विश्लेषण के अधीन थे । सभी analytes का परीक्षण किया, काफी il-1β और il-8 के स्तर में वृद्धि प्राथमिक BrC सेल में मनाया गया-monocyte सह संस्कृतियों, दोनों महत्वपूर्ण भड़काऊ साइटोकिंस कि पहले घातक प्रगति के साथ संबद्ध किया गया है15, 18 , 19 , 20 (चित्रा 3; IL-1β के लिए परिणाम) । इस उदाहरण के विश्लेषण का एक और प्रकार है कि 3 डी संस्कृतियों संचार नेटवर्क है कि आकार ट्यूमर microenvironment नकल की अनुमति है ।

Supernatants और Acini संरचना का लक्षण वर्णन:

Debnath, Muthuswamy, और Brugge7द्वारा विकसित 3d प्रायोगिक प्रणाली के आधार पर जहां MCF-10A को oncogenesis से संबद्ध तंत्र के एक मॉडल के रूप में स्थापित किया गया था, क्या प्राथमिक BrC कक्ष से स्रावित कारकों का मूल्यांकन supernatants MCF-10A 3d acini-संरचनाओं, वायरल और सेलुलर transduction के oncogenes के बाद मनाया गतिविधि के समान के गठन की तरह प्रभावित7,21 प्रदर्शन किया गया था । MCF-10A कोशिकाओं दो प्राथमिक BrC सेल लाइनों से दो अलग supernatants के साथ खेती के लिए लुमेन गठन का निरीक्षण किया गया (anoikis प्रतिरोध का एक उपाय के रूप में) । 14 दिन में, spheroids 0 पर फोकल माइक्रोस्कोपी आड़ा कटौती द्वारा मूल्यांकन किया गया, 25, ५०, ७५, और १००% गहराई, और दोनों ही मामलों में, यह पाया गया कि MCF-10A कोशिकाओं चोरी anoikis (acini में केंद्रीय (चमकदार) कोशिकाओं की संख्या की गिनती से मापा (चित्रा 4 B, C)). इस प्रकार, MCF-10A कोशिका acini कि BrC कोशिकाओं से वातानुकूलित मीडिया के साथ गठन कर रहे हैं, एक अच्छी तरह से गठित खोखले लुमेन के विपरीत, MCF-10A कि इसके मानक संस्कृति माध्यम के साथ बड़े हो रहे हैं (जैसा कि चरण १.२ में वर्णित) (चित्रा 4ए) । 3 डी सह संस्कृति प्रणाली में, IL-1β अत्यधिक स्रावित किया गया था; इसलिए मानव संयोजक इल-1β18के साथ MCF-10A कोशिकाओं की भी खेती की गई । चित्र 4 डी IL-1β (कम पैनलों) की उपस्थिति में acini की ५०% गहराई में एक फोकल माइक्रोस्कोपी आड़ा कटौती से पता चलता है, और पता चलता है कि इस cytokine भी anoikis प्रतिरोध प्रदान । इस प्रकार, घुलनशील कारकों जैसे IL-1β प्राथमिक BrC कोशिकाओं द्वारा स्रावित, गैर के अस्तित्व को बढ़ावा देने के MCF-10A कोशिकाओं है कि ECM बातचीत, इनवेसिव कैंसर की एक विशेषता खो बदल ।

3 डी सह संस्कृतियों एक भड़काऊ प्रतिक्रिया Monocytes और कैंसर कोशिकाओं के आक्रमण के प्रवास के साथ जुड़े को बढ़ावा देने:

हम पहले से पता चला है कि 3 डी संस्कृति में प्राथमिक BrC कोशिकाओं समर्थक भड़काऊ chemokines के उच्च बेसल स्तर स्रावित monocytes14को आकर्षित करने के लिए जाना जाता है । इस प्रकार, हम BrC कोशिकाओं के वातानुकूलित मीडिया में समृद्ध पाया chemokines के जवाब में monocytes की प्रवासी क्षमताओं का विश्लेषण किया । वाणिज्यिक monocytes U937 और THP-1 और ताजा पीएमएस की प्रवासी क्षमता तीन अलग chemokines के जवाब में मूल्यांकन किया गया था: जीएम-सीएसएफ, एमसीपी-1, और rants । U937 और THP-1 monocytes जीएम सीएसएफ और एमसीपी-1 के जवाब में पलायन करने में सक्षम थे, U937 के साथ सबसे अधिक उत्तरदायी के रूप में, जबकि दोनों monocytes rants के लिए एक नल प्रतिक्रिया थी. महत्वपूर्ण बात, पीएमएस एक उच्च बेसल प्रवासी गतिविधि और एमसीपी के लिए सबसे शक्तिशाली प्रतिक्रिया-1 (चित्रा 5) दिखाया । आईएल-8 भी प्राथमिक BrC कोशिकाओं और monocytes की 3 डी सह संस्कृति के बाद समृद्ध किया गया था । इस प्रकार, हम विश्लेषण किया कि क्या IL-8 वाणिज्यिक और प्राथमिक BrC सेल लाइनों के आक्रमण की क्षमता को संशोधित करता है । वाणिज्यिक आक्रामक BrC सेल लाइनों (HS578T और एमडीए-एमबी-२३१) IL-8 के जवाब में आक्रमण किया, जबकि गैर आक्रामक (MCF-7 और T47D) आक्रमण नहीं हुआ । हैरानी की बात है, प्राथमिक BrC कोशिकाओं IL-8 (चित्रा 6एक, सही पैनलों) के जवाब में वाणिज्यिक आक्रामक BrC सेल लाइनों की तुलना में अधिक आक्रामक थे । कुछ मामलों में, कक्ष क्लस्टर के रूप में आक्रमण और इसलिए IOD विश्लेषण आवश्यक था (चित्र 6B) ।

Figure 1
चित्र 1 : 3 डी संस्कृतियों में BrC कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियाँ. बाएँ से दाएँ: गैर-रूपांतरित MCF-10A कोशिकाओं के नियंत्रण विशेषता ग्रंथियों acini बनाने, गोल आकृति विज्ञान, अच्छी तरह से सीमांकित सेल संपर्कों के साथ, और समरूप आकार के संगठित संरचनाओं (लगभग ५० µm औसत पर, ऑप्टिकल आवर्धन ऑफ 200X). मध्य पैनलों प्राथमिक BrC कम घनत्व (2 दिन) और उच्च घनत्व (5 दिन) में प्रसंस्कृत कोशिकाओं को दिखाते हैं । कोशिकाएं ECME का पालन करती हैं और शुरुआती समय बिंदुओं पर कम घनत्व बनाए रखती हैं । यह स्पष्ट है कि कोशिकाओं के आकार की तरह एक लंबी धुरी मौजूद, दो या अधिक लंबे cytoplasmic अनुमानों के साथ कुछ है, और कोई स्पष्ट सेल-सेल आसंजन के साथ । दूसरी ओर, बाद में अंक पर उच्च घनत्व कोशिकाओं एक विशिष्ट संरचनात्मक संगठन के बिना जाल जैसी संरचनाओं का गठन किया । इन कोशिकाओं को कोई संपर्क संकोच दिखा ढेर दिखाई दिया । 3 डी संस्कृति में 5 दिनों के बाद वाणिज्यिक एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं का नियंत्रण दिखाया गया है; इन आक्रामक BrC कोशिकाओं प्राथमिक BrC संस्कृतियों (100X के ऑप्टिकल इज़ाफ़ा) के साथ एक बहुत करीब सादृश्य का हिस्सा है । स्केल बार का प्रतिनिधित्व करता है ५० µm. ८०० कक्षों को प्रयोग की शुरुआत में वरीयता दी गई थी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : ECM क्षरण का विश्लेषण. गैर आक्रामक MCF-7 एक पीले रंग की fluorochrome (एक) और आक्रामक एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं के साथ सना हुआ एक लाल fluorochrome (बी) 3 डी की स्थिति में 5 दिनों के लिए खेती के साथ दाग; ग्रीन प्रतिदीप्ति का ०.५%-लेबल कोलेजन IV ECM क्षरण कल्पना को शामिल किया गया था । ए और बीमें, ऊपरी बाएं चित्र कोलेजन गिरावट के स्तर का प्रतिनिधित्व करते हैं, ऊपरी सही पैनलों ऑप्टिकल चित्रों का प्रतिनिधित्व करते हैं, नीचे छोड़ दिया BrC कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं, और नीचे सही पैनलों फ्लोरोसेंट और ऑप्टिकल की मर्जी दिखाओ छवियों. ए और बीके लिए १०० µm के 200X और स्केल बार के ऑप्टिकल आवर्धन प्रस्तुत किए गए हैं । (ग) व्यक्तिगत एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं के नियंत्रण के रूप में 3 डी संस्कृति में ECM प्रोटियोलिसिस (ग्रीन) के प्रतिनिधि छवियों, एमडीए के 3d सह संस्कृति के ECM प्रोटियोलिसिस के साथ तुलना-एमबी-२३१ U937 monocytes के साथ । स्केल पट्टियां 10 µm का प्रतिनिधित्व करती हैं । प्रत्येक शर्त से ६ ५० µm 2 फ़ील्ड का IOD (एकीकृत ऑप्टिकल घनत्व) मापा गया । मतलब और quantifications से मतलब (SEM) के मानक त्रुटि प्रस्तुत कर रहे हैं; दो तारांकन p < ०.०१ (मान-Whitney परीक्षण) के साथ सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं । (D) एमडीएस की सीधी बातचीत-एमबी-२३१ कोशिकाओं (ग्रे शेड मास) के साथ फ्लोरोसेंट दाग U937 monocytes (नारंगी); हरित प्रतिदीप्ति प्रोटियोलिसिस से मेल खाती है । धारावाहिक स्लाइसें फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा हर 10 µm के लिए स्थानीयकरण और दोनों सेल लाइनों के बीच सीधे बातचीत का पता उत्पन्न किया गया । 200X का ऑप्टिकल आवर्धन; स्केल बार्स १०० µm का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: IL-1β एकाग्रता 3 डी सह संस्कृतियों में वृद्धि हुई है । supernatants में आठ (PC1-8) प्राथमिक BrC कोशिकाओं से आईएल-1β स्तर (pg/एमएल) के एक प्रतिनिधि परिणाम, 3 डी (3 डी) में व्यक्तिगत रूप से संस्कृति, और प्रधानमंत्री के साथ अपने 3 डी सह संस्कृतियों के खिलाफ तुलना (सीसी) । व्यक्तिगत 3 डी संस्कृति में पीएम का नियंत्रण तुलना (पीएम) के लिए शामिल किया गया था । परिणाम एक बड़े मल्टीप्लेक्स विश्लेषण, जहां कई साइटोकिंस एक साथ एक immunodetection आधारित तकनीक एक वाणिज्यिक किट के रूप में उपलब्ध के माध्यम से प्रत्येक नमूने में पाया गया से निकाले गए थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : प्राथमिक BrC कक्षों से स्रावित कारक गैर-रूपांतरित MCF-10A कक्षों में anoikis के लिए प्रतिरोध को प्रेरित करते हैं. MCF-10A कोशिकाओं मानक संस्कृति मीडिया के साथ 3 डी की स्थिति में बड़े हो गए थे (कॉलम एक और डी के ऊपरी पैनलों), जिसमें यह देखा जा सकता है कि acini वर्तमान ठेठ खोखले लुमेन (25-75% गहराई एक लाल वर्ग के साथ प्रकाश डाला); जब MCF-10A कोशिकाओं दो प्राथमिक BrC संस्कृतियों से दो अलग supernatants के साथ बड़े हो गए थे (कॉलम बी और सी), लुमेन खोखले नहीं हैं, लेकिन anoikis के लिए प्रतिरोध टिप्पण कोशिकाओं के साथ भरा. इसी तरह, जब MCF-10A कोशिकाओं 3 डी मानव संयोजक IL-1β (एनजी/एमएल), कोई खोखले लुमेन ५०% गहराई में acini (डी के निचले पैनल) के फोकल माइक्रोस्कोपी वर्गों में सराहना की जा सकती जोड़ने की स्थिति में संस्कृति थे । सही अंडाकार कार्टून acini के 0, 25, ५०, ७५ और १००% गहराई पर किए गए थे कि फोकल माइक्रोस्कोपी वर्गों का प्रतिनिधित्व करता है. छवियां DAPI (नीला) और ई-cadherin के साथ हरे रंग में नाभिक दाग दिखाते हैं । 200X, स्केल बार्स के ऑप्टिकल आवर्धन 10 µm का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : monocytes की प्रवासी क्षमता । जीएम-सीएसएफ, एमसीपी-1 और rants के जवाब में U937, THP-1 और प्रधानमंत्री की प्रवासी क्षमता के प्रतिनिधि छवियां । chemokine के बिना नियंत्रण (बाएं से दाएं पहला कॉलम) शामिल हैं । छवियों के नीचे की संख्या प्रत्येक दशा में प्रवासी कोशिकाओं की संख्या का संकेत देती है; U937 और THP-1 monocytes मुख्य रूप से जीएम-सीएसएफ और एमसीपी-1 के प्रतिउत्तरदायी थे, जबकि पीएम ने उच्च प्रवासी क्षमता को दिखाया था, और एमसीपी-1 के लिए सबसे अधिक उत्तरदायी कोशिकाएं थीं । 100X का ऑप्टिकल आवर्धन; स्केल पट्टियां १०० µm का प्रतिनिधित्व करती हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6 : आक्रामक और प्राथमिक BrC कोशिकाओं IL-8 के जवाब में आक्रमण । दो गैर आक्रामक के साथ A. आक्रमण परख (MCF-7 और T47D), दो उच्च आक्रामक (HS578T और एमडीए-एमबी-२३१) BrC सेल लाइनों और BrC के रूप में इस्तेमाल किया IL-8 के जवाब में एक प्राथमिक chemoattractant संस्कृति । ऊपरी पैनलों chemokine बिना कोई आक्रमण दिखा नियंत्रण के अनुरूप, कम पैनलों IL-8 की प्रतिक्रिया, अत्यधिक आक्रामक BrC कोशिकाओं और प्राथमिक BrC सेल संस्कृति डालने की झिल्ली के माध्यम से हमला कोशिकाओं के साथ दिखाते हैं । B. समूहों में आक्रमण करने वाले कक्षों का उदाहरण; इन मामलों में, आक्रमण का मापन IOD के संदर्भ में आक्रमण निर्धारित करने के लिए एक छवि विश्लेषण कार्यक्रम के साथ किया जाता है (एकीकृत ऑप्टिकल घनत्व) प्रति क्षेत्र. छवियों के नीचे की संख्या प्रत्येक हालत में हमलावर कोशिकाओं की संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं । 100X का ऑप्टिकल आवर्धन; स्केल बार्स १०० µm का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें. 

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Discussion

उपकला कोशिकाओं को एक 3 डी स्थानिक अनुरूपता में बढ़ने और ECM प्रोटीन के साथ उनकी बातचीत ऊतक homeostasis के लिए निर्णायक है. कई कैंसर के अध्ययन monolayers में उगाई कोशिकाओं के आधार पर किया गया है (2d) और यद्यपि वे ट्यूमर गठन और प्रगति के कई पहलुओं को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, monolayers विशेषताओं है कि ECM कोशिकाओं पर लगाता है दोहराऊंगा नहीं है, के लिए उदाहरण: सीमित प्रसार, आसंजन पर निर्भर सेल अस्तित्व, शिखर-basolateral ध्रुवीकरण, ECM remodeling, सेल भेदभाव, आदि । महत्वपूर्ण बात, न केवल ट्यूमर कोशिकाओं और ECM के बीच संपर्क कैंसर की प्रगति के लिए आवश्यक हैं, लेकिन यह भी संचार जैसे प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में ट्यूमर और गैर ट्यूमर कोशिकाओं के बीच स्थापित । प्रोटोकॉल यहां प्रदान की प्रतिरक्षा कोशिकाओं और ECM द्वारा प्रदान की पर्यावरण के भीतर कैंसर की कोशिकाओं के बीच बातचीत की समझ की सुविधा, भड़काऊ प्रतिक्रिया इन बातचीत द्वारा पदोंनत, और कैसे इस भड़काऊ हालत बनाएं monocytes और कैंसर कोशिकाओं के अधिक आक्रमण के chemoattraction को बढ़ावा देने के सकारात्मक पाश ।

ECME का उपयोग कर के एक महान लाभ यह है कि यह एक जैविक पाड़ प्रयोगात्मक 3 डी मॉडल22की एक किस्म का प्रदर्शन करने के लिए उपयुक्त प्रदान करता है । यह laminin, कोलेजन IV, entactin, heparan सल्फेट proteoglycan, और विकास कारकों, जो vivo में उपकला कोशिकाओं के साथ बातचीत करेंगे के रूप में ECM प्रोटीन से समृद्ध है । एक नुकसान यह है कि क्योंकि यह murine sarcomas के lysates से आता है, उनके घटकों की एकाग्रता अलग बहुत के बीच बदलता है । इसलिए, यह अक्सर अधिक सजातीय डेटा प्राप्त करने के लिए कई बहुत विशेषताएं करने के लिए आवश्यक है । प्रयोगशाला में, प्रत्येक नए बहुत दो मायनों में परीक्षण किया जाता है: 1) MCF-10A कोशिकाओं के सही acini गठन का मूल्यांकन करके, और 2) अच्छी तरह से स्थापित इनवेसिव क्षमता की BrC कोशिका लाइनों की इनवेसिव का आकलन करके । एक अंय विकल्प है Hydrogel, जो एक सिंथेटिक nanofiber पेप्टाइड पाड़ के रूप में अंय मचान उत्पादों, के साथ काम करना है । 3 डी संस्कृति की कठोरता Hydrogel23,24की एकाग्रता को समायोजित करने से नियंत्रित किया जा सकता है । महत्वपूर्ण बात, इस प्रणाली को नवोत्पादित सेल और टेम या गैर टेम कोशिकाओं के किसी भी प्रकार के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है । यह भी अधिक जटिल दो अलग सेल वंश का उपयोग कर प्रणालियों डिजाइन संभव हो सकता है । 3d मॉडल का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि वे कक्ष आकृति विज्ञान और सेल संगठन के अध्ययन की अनुमति देते हैं, जिसके आकार में ECM इंटरैक्शन, oncogenic परिवर्तन के दौरान बदल दिया जाता है. इसी तरह, एक proteolytic क्षरण के रूप में oncogenic सुविधाओं का अध्ययन कर सकते हैं, और क्या कोशिकाओं को शुरू में एक दूसरे के लिए संस्कृति संकेत के विभिंन परतों में रखा प्रत्यक्ष संपर्क को बढ़ावा देने/ इसके अलावा, विभिंन कोशिका वंश अलग fluorochromes के साथ लेबल किया जा सकता है ताकि वे प्रयोग के बाद अलग किया जा सकता है प्रत्येक व्यक्ति के सेल प्रकार के लिए विशिष्ट प्रश्नों के पते का उपयोग कर, उदाहरण के लिए आरएनए और/ यहां, IL-1β प्राथमिक BrC कोशिकाओं में मध्यम को स्राव/सह संस्कृतियों दिखाया गया है, ट्यूमर कोशिकाओं और monocytes कि घातक प्रगति से चलाता है के बीच अप्रत्यक्ष संचार में इस cytokine की एक संभव निर्णायक भूमिका का समर्थन ।

प्रयोगशाला में एक अन्य आवश्यक प्रायोगिक प्रोटोकॉल गैर-रूपांतरित MCF-10A कोशिकाओं की 3d संस्कृतियों में acini गठन का विश्लेषण है. इस परख वायरल और सेलुलर oncogene गतिविधि के लिए परीक्षण किया गया था, और परीक्षण के लिए कैसे ट्यूमर microenvironment प्रभाव आक्रामक कैंसर से संबंधित सुविधा । उदाहरण के लिए, acini के सामांय विकास के दौरान, चमकदार केंद्रीय कोशिकाओं बेसल झिल्ली प्रोटीन के साथ संपर्क खो (ECME द्वारा प्रदान की) कोशिका मृत्यु के तंत्र को ट्रिगर, anoikis के रूप में जाना जाता है । यह देखा गया कि दोनों प्राथमिक BrC कोशिकाओं या संयोजक IL-1β से supernatants MCF के प्रतिरोध 10A-anoikis कोशिकाओं को बढ़ावा देने के । क्योंकि IL-1β के एक उच्च एकाग्रता BrC सेल-monocyte बातचीत पर पदोंनत किया है, इस अवलोकन का समर्थन करता है कि ट्यूमर स्ट्रोमा अत्यधिक आक्रामक चरणों के लिए ट्यूमर प्रगति का एक अभिंन घटक है ।

प्रवास और आक्रमण प्रोटोकॉल यहां वर्णित उपयोगी 3 डी पूरक परख जिसमें हम कोशिकाओं की क्षमता का समर्थन करने के लिए पलायन या ट्यूमर स्ट्रोमा से व्युत्पंन उत्तेजनाओं के जवाब में आक्रमण कर सकते है का गठन किया । यह दिखाया गया है कि chemokines (जीएम-सीएसएफ और एमसीपी-1) प्राथमिक BrC कोशिकाओं की 3 डी संस्कृतियों में ऊंचा सांद्रता में पाया U937, THP के प्रवास को बढ़ावा देने के कर सकते हैं-1, और पीएमएस, आक्रामक ट्यूमर कोशिकाओं की क्षमता का समर्थन करने के लिए एक समर्थक भड़काऊ microenvironment को बढ़ावा देने के. इसके अलावा, IL-8 यह भी सह से supernatants में वृद्धि की एकाग्रता में पाया जाता है BrC कोशिकाओं की संस्कृतियों/monocytes, दोनों वाणिज्यिक आक्रामक BrC कोशिकाओं (HS578T और एमडीए-एमबी-२३१) और प्राथमिक BrC कोशिकाओं के बढ़ते आक्रमण को बढ़ावा दिया ।

कोशिकाओं की स्थिति के बारे में, यह महत्वपूर्ण है प्राथमिक BrC कोशिकाओं के साथ काम करने से पहले वे दस मार्ग तक पहुंचने के लिए उनके प्रसार चोटी का लाभ लेने और संभावित बाद अलगाव आनुवंशिक और epigenetic परिवर्तन से बचने के इन विट्रो में से जिसके परिणामस्वरूप संस्कृति. एक अंय आवश्यक पहलू जब प्राथमिक कोशिकाओं के साथ काम करने के लिए अलगाव के बाद अपनी पहचान की पुष्टि है । हम अपने उपकला वंश की पहचान है, जो PanCK, Muc-1, और EpCAM भी शामिल है निर्धारित करने के लिए और (२.५ कदम में निर्दिष्ट) के लिए उपमार्क्स के एक पैनल का इस्तेमाल किया । इसी तरह, यह ताजा पीएमएस, जिनमें से प्रत्येक बैच है कि वे भेदभाव के एक ही चरण में है आश्वस्त परीक्षण किया है का उपयोग करने के लिए बेहतर है । प्रत्येक नए बैच का इस्तेमाल किया phenotype CD34नेग CD11bpos CD14पीओएस CD64पीओएस CD68नेग CD16नेग, जो गैर-सक्रिय अपरिपक्व monocytes के अनुरूप है । महत्वपूर्ण बात, हम अलग दाताओं से monocytes मिश्रण नहीं है, monocyte सक्रियण में परिणाम मिश्रण के रूप में । इसके बजाय, हम स्वतंत्र रूप से BrC सह का परीक्षण किया-संस्कृतियों का उपयोग कम से monocytes दो अलग दाताओं ।

3 डी संस्कृति प्रणालियों अभी भी सीमा है कि केवल ट्यूमर जीव विज्ञान के कुछ तत्वों मज़बूती से मॉडलिंग की जा सकती है । एक नया विकल्प organoids के और अधिक जटिल 3d मॉडल है, जो विस्तार और इन विट्रो में स्टेम सेल के भेदभाव पर आधारित हैं । Organoids भी अत्यधिक संगठित उपकला संरचनाओं का विकास । उदाहरण गैस्ट्रिक 25,26, जिगर 27, और गुर्दे organoids28शामिल हैं । हालांकि, हर मानव अंग के लिए organoid मॉडल के लिए प्राप्त किया जा रह; इसके अलावा, वे बहुत अधिक जटिल और महंगी प्रयोगात्मक शर्तों की आवश्यकता होती है ।

अंत में, यहां हम विस्तार से परख के एक कार्यप्रवाह का वर्णन: BrC रोगियों से ट्यूमर कोशिकाओं के अलगाव से शुरू, एक ECME में उनके भड़काऊ क्षमता परीक्षण आधारित 3 डी संस्कृति मॉडल, परीक्षण कैसे है कि भड़काऊ microenvironment उंहें भर्ती करने के लिए कार्य करता है इस तरह के monocytes के रूप में अतिरिक्त भड़काऊ कोशिकाओं, अंत में दोनों प्रकार की कोशिकाओं के बीच संचार का विश्लेषण करने के लिए, और कैसे है कि संचार आगे एक भड़काऊ microenvironment कि अधिक आक्रामक कैंसर के चरणों के लिए प्रगति को बढ़ावा देता है पालक । साथ ही, हम प्राथमिक BrC कक्षों की आकृति विज्ञान और phenotype का वर्णन करते हैं । भविष्य के अध्ययन में, यह अन्य भड़काऊ कोशिकाओं का परीक्षण या यहां तक कि BrC कोशिकाओं और कई कोशिकाओं के बीच संचार अक्सर ट्यूमर स्ट्रोमा में पाया परीक्षण करने के लिए दिलचस्प हो जाएगा । इन एकाधिक सेल 3d संस्कृतियों क्या vivo में कैंसर प्रगति के दौरान जैविक रूप से होता है की एक बड़ी तस्वीर प्रदान करेगा । इन विट्रो डेटा और रोगी नैदानिक परिणाम के बीच तुलना संभावित तंत्र है कि कैंसर बुद्धिमता पर एक उच्च प्रभाव है की पहचान करेगा ।

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Disclosures

लेखक यह घोषणा करते हैं कि उनके हित का कोई विरोध नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम CONACyT FONSEC SSA/IMSS/ISSSTE परियोजना सं २३३०६१ से Ezequiel M. Fuentes-Pananá और Fondo de Apoyo एक ला Investigación, अस्पताल Infantil de México Federico Gómez (परियोजना संख्या उसे-2014-053) द्वारा समर्थित किया गया था । Espinoza-Sánchez ना Programa डे Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (उणां) से डॉक्टरेट की छात्रा है और CONACYT से फैलोशिप २३१६६३ प्राप्त की । ई एस ना, यह भी वित्तीय मैक्सिकन सामाजिक सुरक्षा संस्थान (IMSS) द्वारा प्रदान की सहायता स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
U937 American Type Culture Collection ATCC  CRL-1593.2 Monocytic cell line/histiocytic lymphoma 
THP-1 American Type Culture Collection ATCC  TIB-202 Monocytic cell line/acute monocytic leukemia 
MCF-10A American Type Culture Collection ATCC  CRL-10317 Non-transformed breast cell line
MCF-7 American Type Culture Collection ATCC  HTB-22 Breast Cancer Cell line
T47D American Type Culture Collection ATCC  HTB-133 Breast Cancer Cell line
HS578T American Type Culture Collection ATCC  HTB-126 Breast Cancer Cell line
MDA-MB-231 American Type Culture Collection ATCC  HTB-26 Breast Cancer Cell line
RPMI 1640 medium GIBCO BRL Life Technologies 11875-093
DMEM High Glucose  GIBCO BRL Life Technologies 11964-092 4.5 g/L glucose
DMEM/F12 GIBCO BRL Life Technologies 11039-021
Antibiotic/Antimycotic GIBCO BRL Life Technologies 15240-062 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone
Fetal Bovine Serum GIBCO BRL Life Technologies 16000-044
Horse serum  GIBCO BRL Life Technologies 16050114
0.05% Trypsin-EDTA 1X GIBCO BRL Life Technologies 25300-062
PBS 1X (Phosphate Buffered Saline GIBCO BRL Life Technologies 20012-027
Epidermal Growth Factor (EGF) PeproTech AF-100-15 (1.00mg)
Insulin SIGMA-ALDRICH I1882-100MG
Hydrocortisone SIGMA-ALDRICH H088-5G
Cholera toxin Vibrio cholerae SIGMA-ALDRICH C8052-1MG
Matrigel  Corning Inc 356237 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C
GM-CSF PeproTech 300-03
MCP-1 PeproTech 300-04
RANTES PeproTech 300-06
IL-8 PeproTech 200-08
IL-1β PeproTech 200-01B
Crystal-violet Hycel México 541
Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH P6148
Transwell permeable supports (inserts) Corning Inc 3422 6.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates 
Transwell permeable supports (inserts) Thermofisher Scientific 140620 6.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates 
Monocyte Isolation Kit II Human  Miltenyi Biotec 130-091-153
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate Assay EMD Millipore HCYTOMAG-60K
Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation) Luminex Corporation 40-072
Lab-Tek chamber slide with cover (8 well) Nalge Nunc International 177402
Glass bottom microwell 35mm petri  dishes MatTek Corp. P35G-1.5-14-C

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References

  1. Rich, J. N. Cancer stem cells: understanding tumor hierarchy and heterogeneity. Medicine (Baltimore). 95 (1), Suppl 1 2-7 (2016).
  2. Wang, M., et al. Role of tumor microenvironment in tumorigenesis. J Cancer. 8 (5), 761-773 (2017).
  3. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  4. Sica, A., et al. Macrophage polarization in tumour progression. Semin Cancer Biol. 18 (5), 349-355 (2008).
  5. Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
  6. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  7. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  8. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111 (1), 29-40 (2002).
  9. Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nat Cell Biol. 3 (9), 785-792 (2001).
  10. Sameni, M., Dosescu, J., Moin, K., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol Imaging. 2 (3), 159-175 (2003).
  11. Sameni, M., et al. MAME models for 4D live-cell imaging of tumor: microenvironment interactions that impact malignant progression. J Vis Exp. (60), (2012).
  12. Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr Protoc Cell Biol. 4, Chapter 4 Unit 4 20 (2008).
  13. Chimal-Ramirez, G. K., et al. MMP1, MMP9, and COX2 expressions in promonocytes are induced by breast cancer cells and correlate with collagen degradation, transformation-like morphological changes in MCF-10A acini, and tumor aggressiveness. Biomed Res Int. 2013, 279505 (2013).
  14. Espinoza-Sanchez, N. A., Chimal-Ramirez, G. K., Mantilla, A., Fuentes-Panana, E. M. IL-1beta, IL-8, and Matrix Metalloproteinases-1, -2, and -10 Are Enriched upon Monocyte-Breast Cancer Cell Cocultivation in a Matrigel-Based Three-Dimensional System. Front Immunol. 8, 205 (2017).
  15. Li, Y., Wang, L., Pappan, L., Galliher-Beckley, A., Shi, J. IL-1beta promotes stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation. Mol Cancer. 11, 87 (2012).
  16. Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Curr Protoc Mol Biol. 10, Chapter 10 Unit 10 18 (2008).
  17. Troeberg, L., Nagase, H. Zymography of metalloproteinases. Curr Protoc Protein Sci. 21, Chapter 21 Unit 21 15 (2004).
  18. Arevalo-Romero, H., Meza, I., Vallejo-Flores, G., Fuentes-Panana, E. M. Helicobacter pylori CagA and IL-1beta Promote the Epithelial-to-Mesenchymal Transition in a Nontransformed Epithelial Cell Model. Gastroenterol Res Pract. 2016, 4969163 (2016).
  19. Reed, J. R., Leon, R. P., Hall, M. K., Schwertfeger, K. L. Interleukin-1beta and fibroblast growth factor receptor 1 cooperate to induce cyclooxygenase-2 during early mammary tumourigenesis. Breast Cancer Res. 11 (2), 21 (2009).
  20. Ma, L., et al. Epidermal growth factor (EGF) and interleukin (IL)-1beta synergistically promote ERK1/2-mediated invasive breast ductal cancer cell migration and invasion. Mol Cancer. 11, 79 (2012).
  21. Grande, S. M., Bannish, G., Fuentes-Panana, E. M., Katz, E., Monroe, J. G. Tonic B-cell and viral ITAM signaling: context is everything. Immunol Rev. 218, 214-234 (2007).
  22. Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev. 79-80, 3-18 (2014).
  23. Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
  24. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  25. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
  26. Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric Organoids: An Emerging Model System to Study Helicobacter pylori Pathogenesis. Curr Top Microbiol Immunol. 400, 149-168 (2017).
  27. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  28. Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nat Cell Biol. 16 (1), 118-126 (2014).

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कैंसर जीवविज्ञान १३१ अंक तीन आयामी (3 डी) संस्कृति extracellular मैट्रिक्स उद्धरण (ECME) सह संस्कृति प्रणाली ट्यूमर microenvironment संचार स्तन कैंसर (BrC) monocytes ट्यूमर द्रोह
एक Extracellular मैट्रिक्स निकालने में Monocytes और प्राथमिक स्तन कैंसर कोशिकाओं के बीच संचार का विश्लेषण (ECME)-तीन आयामी प्रणाली आधारित
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