Summary
在这里, 我们描述了一个三维的培养方法来分析原发性乳腺癌细胞的形态学, 以及研究他们的直接/间接相互作用的单核和结果, 如胶原降解, 免疫细胞招募, 细胞侵袭和促进癌症相关的炎症。
Abstract
嵌入细胞外基质 (ECM), 正常和肿瘤上皮细胞密切沟通与造血和造血细胞, 从而大大影响正常的组织稳态和疾病的结果。在乳腺癌中, 肿瘤相关巨噬细胞 (tam) 在疾病进展、转移和复发中起关键作用;因此, 了解单核细胞 chemoattraction 对肿瘤微环境的机制及其与肿瘤的相互作用对控制该病具有重要意义。在这里, 我们提供了一个三维 (3D) 的人乳腺癌 (细胞) 共培养系统的详细描述和人单核。在与单核细胞共培养时, 在活化、正常 T 细胞表达和分泌 (RANTES)、单核蛋白趋化 protein-1 (MCP-1) 和粒细胞-巨噬群刺激因子 (g-csf) 的基础上, 有较高的基底水平,炎细胞因子白细胞介素 (IL)-1 β (IL-1β) 和 IL-8 是丰富的结合基质金属蛋白酶 ()-1, MMP-2, 和 MMP-10。这种肿瘤基质微环境促进了 MCF-10A 3D 腺样结构、单核细胞 chemoattraction 和侵袭性的亡的抗性。这里提出的协议提供了一个负担得起的替代研究内通信, 是一个巨大的潜力的例子,在体外3D 细胞系统提供来审问肿瘤生物学的特定特征与肿瘤有关侵略.
Introduction
肿瘤生物学比以前想象的要复杂得多。越来越多的证据表明, 肿瘤细胞不仅仅是大量失控的增殖细胞;相反, 不同的肿瘤细胞似乎执行不同的功能, 显示高组织和层次结构内的肿块1。肿瘤细胞与 non-transformed 细胞也有密切的联系: 巨噬细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、脂肪细胞、内皮干细胞等都被浸润在构成 ECM 的支架蛋白和多糖中。许多直接和间接相互作用建立在被变换的和 non-transformed 细胞之间和与 ECM, 施加对疾病结果的一个强有力的影响2,3。在特定的情况下, 这是特别重要的解剖与 tam 的沟通, 考虑到 tam 已被发现发挥关键作用的肿瘤的演变, 增加转移和疾病复发的风险4 ,5。
为了分析 intra-tumoral 的相互作用及其可能的结果, 新的 3D体外方法是基于 ECM 提取物的使用而开发的, 它提供了更复杂的微环境, 更接近于肿瘤生物学的现实, 相比之下,细胞生长附着在塑料上的传统单层细胞培养。彼得森和比6提供了在层粘连蛋白基底膜上培养的恶性和恶性乳腺上皮细胞的第一个模型, 并首次描述了区分恶性人的3D 器官结构乳腺上皮细胞从他们的恶性对应。十年后, 由 Debnath、Muthuswamy 和布鲁日7、8、9所开发的模型提供了一个有价值的工具来阐明在腺腺的恶性转化过程中受损的生物通路, 如由于大的腺形成由于不受控制的增殖, 域紧密连接蛋白作为损伤细胞极化的证据, 并失去腺腔由于细胞抵抗亡, 一种程序性细胞死亡发生在当与周围的 ECM 分离时, 依赖于锚固的细胞。Sameni、Jedeszko 和斯隆的模型主要关注细胞的蛋白水解活动, 这与侵袭性密切相关, 肿瘤恶性肿瘤的另一个重要特征10,11,12。这些模型依赖于不同的荧光猝灭蛋白基质 (dq-明胶, dq-胶原蛋白 I 和 dq-胶原 IV) 混合的蛋白质基质, 其中荧光信号是胶原蛋白水解降解的指示。3D 模型也用于研究 non-transformed 和肿瘤细胞的干细胞特性, 其中细胞聚集物, 也被称为椭球, 可以被培养悬浮或在 ECM 样蛋白中的细胞分化机制, 不对称细胞分裂, 细胞黏附, 并且细胞运动13,14。入侵检测允许测试肿瘤的内在侵略性和在侵入过程中作为化的分子的鉴定15。总体而言, 3D 模型代表了一种经济实惠的多样化的体外细胞培养, 更密切地反映正常和致癌组织形态发生。
我们设计了一个3D 细胞共培养系统的基础上上述的模型7,10,11, 使用了人类商业零售商的已知侵略性的潜力 (腔和三重阴性类型) 细胞线和主要细胞说明的患者。我们首先开发了一个模型, 无论是非 (MCF-7) 或侵略性 (MDA-MB-231) 的细胞, 共与 U937 单核分子在一个细胞外基质提取物 (ECME) 的基础3D 系统, 允许直接细胞间的相互作用。这些 co-cultures 被用来确定这两个细胞谱系之间的交流如何影响了一系列与癌症侵袭性行为相关的基因的转录。cyclooxygenase-2 (COX-2) 成绩单的显著增加, 与其产品之一, 前列腺素 E2 (PGE2) 的产量增加相吻合, 这一发现凸显了炎症在癌症进展中的作用。还观察到, 当侵袭性 MDA-MB-231 细胞在 DQ-IV 型胶原蛋白中 U937 单核共时, 与更大的胶原蛋白水解相关。值得注意的是, 我们的 co-cultures 不支持假定细胞细胞相互作用机制是胶原蛋白降解所必需的。它更认为, 两个细胞谱系之间的沟通是由分泌分子介导的。此外, 从这些共培养试验中收获的清含有的可溶性因素, 紊乱的腺腺形成的 non-transformed MCF-10A 细胞13。研究发现, 侵袭性的和初级的趋细胞分泌出高水平的单核分子的 MCP-1, GM-脑脊液, 和 RANTES。因此, 我们概述了一个3D 的文化, 其中细胞分离细胞培养插入, 以防止细胞间的相互作用。这些文化被用来解决的间接沟通之间的细胞和单核。对于这些化验, 非和侵略性商业的细胞系和主要的细胞, 和三种不同类型的人单核: 商业 U937 和 THP-1 细胞, 和主要单核 (PMs) 分离的外周血的健康献血者 (所有单核细胞用于激活状态) 被使用。IL-1β和 IL-8 的炎性细胞因子浓度增加, 在共培养中得到了丰富的观察。同样, 发现 MMP-1、MMP-2 和 MMP-10 也增加了在细胞-单核 co-cultures, 从而加强以前的研究结果14。在这份手稿中, 提出了一个点对点的工作流程在3D 文化中的主要的细胞分离和测试, 并具有代表性的结果。这项工作是一个很好的例子的巨大潜力,体外3D 细胞系统提供审问的具体方面的肿瘤生物学。
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Protocol
从研究 Virología y Cáncer, 医院婴儿 de 墨西哥费德里克二世 g ó mez 的组织银行获得的样本来自。这项研究是由医院的科学、伦理和生物安全审查委员会批准的, 婴儿 de 墨西哥费德里克二世 g ó mez: 研究、Ética、研究和 Bioseguridad。所有患者都有前瞻性的登记, 并被告知研究的性质: 那些愿意参加标本收集之前签署书面知情同意, 并按照道德准则和最佳临床实践的治疗该机构。在研究期间, 参与者的身份是匿名的。患者包括被诊断为浸润性导管癌, 组织学等级2和临床阶段 II, 没有早先新辅助疗法在组织切除之前。患者均为女性, 平均年龄在56.8 岁 (范围42到 75),14。
1. 3D 细胞培养
- 种子 0.1 x 106 MCF-10A 单元格或主要的在25厘米2培养烧瓶中的 DMEM/F12 培养基补充5% 马血清, 100 U/毫升青霉素, 100 µg/毫升链霉素, 100 ng/毫升霍乱毒素, 0.5 µg/毫升可的松, 10 µg/毫升胰岛素, 20 ng/毫升表皮生长因子 (EGF)。种子 0.1 x 106商业 MCF-7 细胞, 75 厘米2培养皿中的 MDA-MB-231 细胞, DMEM/F12 培养基补充 10% FBS, 100 U/毫升青霉素, 100 µg/毫升链霉素。在37° c 的湿润 5% CO2环境中孵育。
- 48小时后, 用10毫升无菌1x 磷酸缓冲盐水 (PBS) 冲洗细胞单层。处理在37° c 的情况下, 用0.05% 的胰蛋白酶和0.48 毫米乙酸酸 (EDTA) 的3毫升溶液进行细胞单层化。添加200µL 的相应血清, 以停止 trypsinization 和7毫升的培养基没有补充剂。通过移重细胞, 取出分10µL, 在 Neubauer 室中计数细胞。
- 在一个8井室滑动系统的每一个井, 传播40µL 基地纯 ECME, 其次是孵化30分钟在37° c。
- 在每个井, 安置800细胞悬浮在400µL DMEM/F12 (没有酚红色) 补充如在步骤 1.1, 但与以下变动: 为主要的细胞和 MCF-10A 细胞, 增加 4 ng/毫升 EGF 和 2% ECME;对于 MCF-7 和 MDA-MB-231, 只添加 2% ECME。
- 在湿润的 5% CO2环境中孵育37° c 的区域性。每48小时替换一次区域性媒体。
- 用光学显微镜记录每24小时15天细胞的形态学变化。为了分析主要的细胞形态学, MCF-10A 和 MDA-MB-231 细胞分别是有序腺泡形成和侵袭性癌样结构的好的参考细胞系。
- 在100X 和200X 的放大率下获得明亮场显微镜下的细胞图像, 并将细胞形态学与参考 MCF-10A 和 MDA-MB-231 细胞系进行比较 (图 1)。
2. 从肿瘤组织中获取原癌细胞
注意:获得肿瘤上皮细胞的组织从切除原发肿瘤的患者没有以前新辅助疗法;避免坏死区域, 并至少使用 0.5 cm3的肿瘤组织。
- 用无菌 1x PBS 冲洗肿瘤组织, 并用手术刀将其机械地分解成1-2 毫米的碎片。
- 在室温 (RT) 2 毫升的无菌20毫升玻璃小瓶中, 用以下溶液消化组织: 1 毫克/毫升胶原酶 I 和 100 u/毫升透明质酸 DMEM/F12 培养基中含有 100 u/毫升青霉素和100µg/毫升链霉素, 不断搅拌。
- 通过经消毒的薄纱片过滤产生的悬浮液, 消除大块的未消化组织。然后通过灭菌的100µm 孔膜过滤细胞悬浮液。
- 将 430 x g 的细胞颗粒在 RT 5 分钟, 用无菌 1x PBS 冲洗两次。DMEM/F12 培养基中的培养初级细胞, 辅以5% 匹马血清、100种 U/毫升青霉素、100µg/毫升链霉素、100 ng/毫升霍乱毒素、0.5 µg/毫升氢化可的松、10µg/毫升胰岛素和 EGF 的 20 ng/毫升。每48小时将培养基更换为37° c, 在湿润的 5% CO2环境中保持培养。
- 确保分离的细胞是上皮细胞与一个标准的免疫组织化学的协议14。测试三上皮标志物: 蛋白 (PanCK)、mucin-1 (Muc-1) 和上皮细胞黏附分子 (EpCAM) 的面板。
3. 从外周血中分离 PM 细胞
- 提取大约40毫升的外周血从一个健康的志愿者, 稀释的血液在1:3 的比例无菌内毒素-免费 1x PBS, 并服从它的密度梯度分离。
- 在锥形管中, 放置2毫升的聚和钠影培养基, 密度为1.077 克/毫升。小心, 慢慢地覆盖8毫升的稀释血液。离心机为30分钟, 765 x g 在 RT. 使用离心机最慢的加速减速速度。
注意:离心后, 四层将形成自下而上: 红血球颗粒, 密度梯度介质层, 单核细胞层 (它看起来像一个优良的白色环), 和等离子体层。 - 用不育的巴斯德吸管小心翼翼地从渐变中检索单个核细胞层, 然后用 1x PBS 洗涤三次, 每次在 RT 时依次进行较慢的离心 (430、275和 191 x g)。
- 使用负选择协议避免激活单元格。此类协议的一个示例如下:
- 一次用洗涤缓冲液 (0.5% 牛血清白蛋白, 2 毫米 EDTA 在 1x PBS) 清洗单个核细胞。计算 Neubauer 腔室中的单元格, 并将它们调整为 1 x 107 cells/30 µL 的密度。
- 对于每 1 x 107单元格, 添加10µL FcR 阻断试剂和10µL 单核生物素抗体鸡尾酒, 其中包含人 CD3、CD7、CD16、CD19、CD56、CD123 和血型 a (包括在商业套件中)。
- 混合细胞, 孵育15分钟, 在4° c。添加一个额外的30µL 洗涤缓冲液加20µL 的 anti-biotin 微 (包括在套件);混合细胞, 孵育20分钟, 在4° c。
- 用缓冲溶液冲洗细胞一次, 在 RT 时离心 430 x g, 在1.5 毫升的磁分离溶液中重。
- 在 pre-rinsed 磁分离柱上加载单元悬浮, 并添加7毫升缓冲溶液。在一个15毫升的锥形管中收集单核细胞浓缩的分数, 计数的单元格, 如果没有立即培养, 冻结在密度为 2 x 106 cells/1 毫升的 DMEM/F12 培养基补充 50% FBS 和10% 亚砜在−80° c。
注意:避免在超过2月的冷冻后使用单核细胞, 因为它们的生存能力可能受到损害。
- 在 DMEM/F12 培养基中, 以 6% FBS、100 U/毫升青霉素和100µg/毫升链霉素为补充, 在37° c 的湿润 5% CO2环境中维持 PMs 的培养。
- 从至少两个不同的捐赠者那里独立地执行每组实验, 因为来自不同捐献者的单核细胞会导致单核细胞活化。
4. 建立3D 共同文化
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3D co-cultures 与间接交互
注:使用0.4 µm 孔径膜的聚碳酸酯细胞培养板, 在24井底培养基中进行这些检测。在这个试验中, 清和细胞都可以在实验结束时被检索到。- 培养 2 x 106 U937 和 THP-1 单核细胞10毫升的 RPMI 1640 培养基补充 10% FBS, 1% 抗生素/抗, 并培养新的 PMs 补充 DMEM/F12 培养基 (如前所示, 在步骤 3.5), 在37° c 在湿化 5% CO2环境.
- 板 4 x 105单核细胞在1毫升/其相应的培养基 (补充与 2% ECME 和 2% FBS U937 和 THP-1 单核细胞, 或 2% ECME 和 6% FBS 的 PMs)。
- 在每个井中放置一个插入物, 并在相应的培养基中添加0.9 毫升的 4 x 105的细胞悬浮液 (辅以 2% ECME 和 2% FBS, 用于商业细胞系或5% 匹马血清用于初级的细胞介素)。将总介质的一半替换为每48小时。
- 在37° c 的湿润 5% CO2环境中孵育5天, 并恢复清。如果执行后续分析, 则按 trypsinization 检索单元格。
- 将单个单元格区域性的控件包含在各自的媒体中。
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3D co-cultures 与直接互动
- 在细胞培养前对不同荧光染料的细胞和单核蛋白进行标记, 以便在培养后对每个细胞谱系进行独立分类, 以分析 mRNA 和蛋白质的表达。使用可自由通过活细胞细胞膜的香豆素和罗丹明的商用衍生物。标签的一般协议如下:
- 准备一单层的权益细胞 (2 x 106细胞在 25 cm2培养烧瓶中), 用足够的5ml 工作溶液取代标准介质 (1:2, 000 的荧光染料在标准基质中没有任何补充)。在37° c 的湿润 5% CO2环境中孵育30分钟。抽出染料溶液, 用足够的 1x PBS 轻轻冲洗。吸入 PBS 并添加标准介质。
- 处理在37° c 的情况下, 用0.05% 的胰蛋白酶和0.48 毫米 EDTA 的2毫升溶液进行细胞单层化。添加200µL FBS, 以停止 trypsinization 和7毫升的通讯员媒体没有补充。重细胞移。取一分10µL, 在 Neubauer 室中计数细胞。在细胞计数后继续与共培养协议。
- 在 RT 中, 在 430 x g 处对5分钟的细胞进行颗粒 (这首先是因为在悬浮液中单核生长)。用3毫升的荧光染料的5ml 工作溶液 (1:2, 000 的荧光染料在不加补充的标准基质介质中) 丢弃上清和轻度重细胞。在37° c 的湿润 5% CO2环境中孵育30分钟。
- 再次颗粒细胞, 丢弃染料工作溶液, 轻轻重5-7 毫升的 1x PBS。再一次, 丢弃 PBS, 在5-7 毫升的标准培养基中重细胞。以分10µL 细胞悬液计数细胞在 Neubauer 室。在细胞计数后继续与共培养协议。
- 设置共培养如下:: 在4井室滑动系统的每个井中, 在井底铺上足够的 ECME, 形成均匀的层。板20µL 的一个单一的细胞悬浮包含 5 x 105标记的每井细胞。
- 在37° c 的孵育15-20 分钟后, 在5µL 试验培养基中加入 2.5 x 1080的悬浮液, 并附上 60% ECME。
- 允许 ECME 在37° c 固化15-20 分钟。
- 加入1毫升的1:1 混合的细胞和单核培养培养基。
- 在37° c 的湿润 5% co2环境中孵育 co-cultures, 用于24小时、48小时或5天来跟踪不同时间点的变化。
- 降解 ECM 蛋白, 从培养基中回收细胞。吸气并丢弃培养基, 加入0.5 毫升的 1x PBS, 0.1% 胰蛋白酶和 0.25% EDTA, 在37° c 下孵育3小时。孵育后, 加入0.5 毫升的 1x PBS 与 10% FBS 中和胰蛋白酶, 并重细胞移大力获得一个单细胞悬浮。
- 颗粒细胞在 765 x g, 5 分钟在 RT, 丢弃上清, 并重5毫升的 1x PBS 与 10% FBS 细胞。重复此步骤一次。
- 用适当的仪器将细胞悬浮到荧光活化的细胞分类 (外地)。确保最后的种群至少有95% 的纯度)。
- 分拣后, 用无菌 1x pbs、颗粒 (RT 5 分钟 430 x g) 冲洗细胞, 在无菌 1x pbs 中重。细胞可以根据特定的协议进行 RNA 分离或蛋白质分析。
- 重复每个化验三次, 包括每个细胞谱系的3D 文化作为控制。
- 在细胞培养前对不同荧光染料的细胞和单核蛋白进行标记, 以便在培养后对每个细胞谱系进行独立分类, 以分析 mRNA 和蛋白质的表达。使用可自由通过活细胞细胞膜的香豆素和罗丹明的商用衍生物。标签的一般协议如下:
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3D co-cultures 对胶原降解的直接交互作用
- 建立3D 细胞 co-cultures, 如步骤4.2 所述, 附加步骤添加32.5 µg/毫升的 IV 型胶原标记荧光素异硫氰酸 ECME。ECME 中 IV. 型胶原的最终浓度为0.5%。在培养皿中种植35毫米的片。
- 在培养皿的底部散布一层40µL 的 ECME。允许 ECME 在37° c 固化。
- 在介质的10µL 中添加 2.5 x 105的单元格, 并允许单元格安定下来。
- 在40µL 测定培养基中加入 1.25 x 105 U937 单核细胞悬浮液 (补充60% 的 DQ-胶原蛋白 IV 标记-ECME)。
- 允许 ECME 在37° c 固化15-20 分钟。
- 加入2毫升的1:1 混合的细胞和单核培养培养基。
- 在37° c 的湿润 5% co2环境中孵育 co-cultures 5 天。每48小时替换一次区域性媒体。
- 分析了共焦扫描显微镜中的荧光发射, 并测量了每50µm2的集成光学密度 (IOD)。将 IODs 与单个区域性和区域性进行比较, 时间为零 (图 2)。
5. 与间接相互作用的3D 共文化中的清分析
- 经过5天的共培养, 恢复清从上部和下部车厢的 3D co-cultures, 并从单独的3D 文化控制。用移把每一上清液拌匀。分, 并储存在−20°C 上清, 直到使用 (最多一个月)。
注意:如果存储时间超过一个月, 请将清保留在−80°C。 - 分析清与复用化验平台, 酶联免疫吸附试验 (ELISA), 或 bead-based 免疫按照制造商的推荐程序。
注意:清也可以用印迹或通过特定的孔隙过滤器进行浓缩, 以获得大小丰富的蛋白质组分来进行酶分析16,17。另外, 如下所述, 使用清作为条件介质进行其他实验。条件媒体通常是从5天的区域性 (图 3) 中获得的。
6. 清原细胞对腺形成和腺结构影响的表征
- 在一个8井室滑动系统的每个井传播一个40µL 基地 ECME 并且让它凝固为30分钟在37° c。
- 种子 800 MCF-10A 细胞/井在400µL 补充 DMEM/F12 培养基, 如步骤1.2 所述。
- 增加400µL 的条件培养基或补充 DMEM/F12 培养基与 20 ng/毫升的人类重组 IL-1β。
- 将房间滑入一个玻璃培养皿中, 其中含有35毫米的 petri 皿, 里面装满2毫升的 PBS, 以创造一个湿度环境。
- 每48小时更换一次介质/上清液。
- 用光学显微镜记录每24小时14天的腺腺形成。
- 经过14天的培养, 染色腺与100µL 4 ', 6-diamidino-2-吲 (DAPI) 在 1x PBS 浓度 100 nM 观察细胞核。在恒定搅拌的 RT 中孵育25分钟。冲洗三次与 1x PBS 5 分钟, 每次在不断搅拌在 RT. 安装的准备与安装的介质专门用于荧光染色。用透明的抛光剂密封, 在4° c 下保持免受光线的保护。
- 用共焦显微镜对腺进行分析, 在不同深度的腺 (图 4a、B、C) 中拍摄横向堆栈的图像。
- 在腺中使用适当的染色协议来可视化不同的细胞蛋白。例如, e-钙黏蛋白被染色, 以评估细胞粘附, 细胞极性, 和/或流明形成18 (图 4D)。
7. 迁移化验
注意:使用8µm 孔径膜的聚碳酸酯细胞培养材料, 在24层底培养板上进行 U937、THP-1 和新鲜 PMs 的迁移测定。这是先前证明的趋化因子 GM-CSF, MCP-1, 和 RANTES 被发现在高浓度的个体3D 文化的积极的细胞系。有人建议, 这些细胞因子是关键的吸引单核瘤的部位的原发肿瘤;这是测试的迁移化验使用细胞因子作为化。
- 文化 U937, THP-1, 或新的 PMs, 如步骤4.1.1 所述。
- 每次用200µL RPMI 1640, 无血清即可冲洗膜。
- 用50µL 的冷 ECME, 将插入物放在24井底培养板上, 并允许 ECME 在37° c 时聚合1小时。
- 添加180µL RPMI 无 FBS 在板的上部车厢。添加在较低的会议厅没有起泡800µL 的 RPMI 补充 100 ng/毫升的 GM CSF, MCP-1, 或 RANTES 作为趋化因子。使用不含细胞因子的培养基作为阴性对照。孵育30分钟, 在37° c 建立一个趋化因子梯度。
- 在无菌管中放置每种单核细胞的 1.5 x 105 , 用1毫升的 1x PBS 冲洗两次, 在 RT 上为430分钟离心 5 x g. 重单核细胞在20µL RPMI 没有 FBS, 安置他们在插入物, 并且非常仔细地质细胞悬浮 (上部房间的最后的容量是200µL)。
- 允许在湿润的 5% CO2环境中的单元迁移在37° c 时进行24小时的移动。
注意:由于单核细胞是换药的, 因此迁徙的单元通常会在下层的介质中。 - 使用 Neubauer 腔或流式细胞仪移除插入物、检索介质以及在2、4、6和 24 h 处计数单元格;或者, 特别是如果在介质中找不到单元格, 则使用数码相机获取插入物下部的图像。3随机字段中的平均单元格计数 (在100X 放大倍数) 用于分析 (图 5)。
8. 入侵化验
注意:利用8µm 孔径膜的聚碳酸酯细胞培养材料, 对24层底培养皿中的细胞进行入侵检测。在我们最初的研究中, IL-8 是一个细胞因子丰富的清的细胞/单核 3D co-cultures。这种细胞因子是否参与了对细胞系侵入的检测。
- 在 75 cm2烧瓶中展开 "零售商" 单元格。MCF-7、T47D、HS578T 和 MDA-MB-231, 如步骤1.2 所述 (但不含 ECME) 和步骤2.4 中所述的主要的 "细胞"。
- 一次洗涤每一次聚碳酸酯8µm-孔膜细胞培养插入与200µL 培养基没有血清 (使用的媒介取决于被测试的细胞线) 水合膜。
- 用50µL 的冷 ECME (1:4 稀释 ECME: 无 FBS 的冷介质) 填充插入物, 在24井底培养板上放置刀片, 并允许 ECME 在37° c 处1小时内聚合。
- 一旦 ECME 有聚合, 添加180µL 各自的细胞介质没有 FBS。添加800µL 的媒体不 FBS 通过插入的狭缝。孵育30分钟, 在37° c, 建立一个 IL-8 梯度。
注意:避免在媒体中创建气泡。使用的媒体是没有 FBS, 但补充 100 ng/毫升的 IL-8 作为一个趋化, 或纯媒体没有 FBS, 作为负控制。 - 获取每个单元格行的总计 6 x 105单元格, 如下所示:
- 丢弃清, 冲洗一次与10毫升的 1x PBS, 并添加2毫升0.05% 胰蛋白酶/0.48 毫米 EDTA 2 分钟在37° c 分离的细胞。添加4毫升补充培养基, 以停止胰蛋白酶反应和重大力移。
- 采取10µL 分细胞悬浮计数细胞在一个 Neubauer 室。取一卷包含 6 x 105单元的单元格挂起。离心机在 430 x g 为5分钟, 在 RT, 丢弃上清, 并冲洗1毫升的 1x PBS 细胞。再重复一次冲洗。
- 重的细胞在20µL 各自媒介没有 FBS 和地方在插入物包含180µL 各自媒介没有 FBS。仔细质移的细胞悬浮。
- 在湿润的 5% CO2环境中, 允许细胞侵入在37° c 的48小时内进行。
- 48小时后, 取出插入物, 丢弃上清液, 用200µL 1x PBS 仔细冲洗一次。用棉签除去 PBS 的过量。
注意:侵入细胞通常附着在插入物的另一侧, 在这种情况下细胞是附着的。 - 通过将插入物放置在一个24井底培养板的井中, 在 RT 中放入1毫升的4% 甲醛. 之后, 用 1x PBS 冲洗一次刀片。
- 将插入物放在一个24井底培养板的井中, 在 RT 中放置1毫升的 1x PBS, 0.2% 结晶紫, 将其染色. 小心, 用棉签将所有的 ECME 从膜上取下, 其中含有不迁移的细胞, 用蒸馏水仔细冲洗, 以避免清除固定的侵入细胞。
- 通过观察倒置显微镜下插入物的下侧来计数侵入细胞。使用3随机场 (100X 放大倍数) 的平均单元数。在细胞侵入成簇且难以单独计数的情况下, 用数码相机从3随机场 (100X 放大倍数) 中获取图像。用软件对图像进行分析, 并使用 IOD 来量化细胞入侵 (图 6)。
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Representative Results
3D 文化中的细胞形态学分析:
在5天的时间内, 研究了低密度和高密度3D 培养的初生细胞生长的形态学变化。在前48小时, 细胞坚持 ECME 和保持低密度。在这个时间点, 它可以清楚地看到, 细胞呈现出一个细长的纺锤样的形状, 一些有两个或更多的长细胞质预测和不显示明显的细胞细胞接触。经过5天的培养, 细胞增殖, 同时保持其初始形态。此外, 它们形成了类似网状结构, 没有特定的结构组织, 并出现堆积, 没有接触抑制。与 non-transformed MCF-10A 细胞进行了比较, 形成了类似于腺腺的球形结构。这些细胞显示一个特征形态的圆形 well-delimited 和组织结构的均匀大小 (约50µm)。相反, 主要的细胞与积极的 MDA-MB-231 细胞有更密切的相似性 (图 1)。
细胞直接相互作用和胶原降解的分析:
我们设计了一个3D 的共培养模型, 以评估以下内容: 细胞形态学, 胶原降解, 细胞迁移, 以及是否有直接相互作用之间的细胞介乎和单核。5天后, MCF-7 和 MDA-MB-231 的商业细胞在3D 文化中形成了无序的聚合体, 但它们的形态不同。侵略性细胞 MDA-MB-231 形成聚合与拉长的形式与有些细胞倾向于分开从其余, 而非 MCF-7 细胞形成聚集体在细胞维护圆的形状和他们似乎更加密集地被压缩 (图2 a, B)。DQ 胶原 IV 被纳入, 以可视化蛋白降解 (绿色), 两者都具有荧光活动的零售商文化。为了定量评估蛋白水解活性, 绿色荧光测量为 IOD 六50µm2字段。比较了 MDA-MB-231 细胞的个体3D 培养与 U937 单核 co-cultures。在共培养 (图 2C) 中, 观察到的蛋白水解量有统计学意义的增加。同时, 对 MDA-MB-231 和 U937 单核细胞共培养的每10µm 的连续横向叠加进行了聚焦显微镜分析 (图 2D)。这一分析显示, U937 单核细胞迁移到侵略性的 MDA-MB-231 与少数单核细胞到达了一层的的在的一个。然而, 很明显, 细胞间直接相互作用的部位不一定与较高的蛋白水解活性区相符: 相反, 胶原降解的区域在培养中均匀传播, 从而推断胶原蛋白退化是由分泌因子介导的间接传播的结果。因此, 将3D 共培养模型改变为以多孔膜分离的不同隔室中的细胞, 以分泌因子为基础进行细胞间的通讯, 避免了细胞的标记和分选。
3D 文化背景下清 IL-1β的分析:
与间接互动的3D 文化, 清从个人主要的零售商文化和他们的5天 co-cultures 与 PM 收获。这些清受18细胞因子和5种基质金属蛋白酶的同时分析, 使用商用试剂盒和专门为这种分析设计的仪器。在所有的分析测试, 显着增加的水平 IL-1β和 IL-8 在主要的细胞-单核 co-cultures, 两个重要的炎症细胞因子, 以前与恶性进展相关的,15,18,19,20 (图 3; 结果为 IL-1β)。这个例子是另一种类型的分析, 3D 文化允许模仿的通信网络, 形状的肿瘤微环境。
清和腺结构的表征:
根据 Debnath、Muthuswamy 和布鲁日7开发的3D 实验系统, 其中 MCF-10A 建立了与发生相关的机制模型, 评价了主要的细胞的分泌因子是否清影响了 MCF-10A 3D 腺样结构的形成, 类似于病毒和细胞癌基因转导后观察到的活动7,21已执行。MCF-10A 细胞的培养与两个不同的清从两个主要的细胞线, 以观察流明的形成 (作为一种抗亡) 的措施。在14天, 椭球通过共焦显微镜横向切口在0、25、50、75和100% 深度进行了评估, 在这两种情况下, 都发现 MCF-10A 细胞躲避亡 (通过计算腺中的中央 (腔) 细胞数 (图4 B, C)。因此, MCF-10A 细胞腺, 形成与条件的媒体从零售商的细胞, 缺乏一个格式良好的空心腔, 不像 MCF-10A 的标准培养基生长 (如步骤1.2 所述) (如图 4a)。在3D 共培养体系中, IL-1β高度分泌;因此, MCF-10A 细胞也培养与人类重组 IL-1β18。图 4D显示了在 IL-1β (下部面板) 的情况下在腺的50% 深度上的共焦显微镜横向切割, 并揭示了这种细胞因子也赋予了抗亡。因此, 由主要的 IL-1β细胞分泌的可溶性因子, 如 non-transformed, 促进了失去 ECM 相互作用的 MCF-10A 细胞的存活, 这是侵袭性癌症的特征。
3D 联合培养促进了与单核细胞迁移和癌细胞浸润有关的炎症反应:
我们以前证明, 在3D 文化中的主要的炎细胞分泌高的基底水平的已知的, 吸引单核的趋化因子14。因此, 我们分析了单核细胞的迁移能力, 以反应中的趋化因子, 发现丰富的条件培养基中的 "的"。针对三种不同的趋化因子: GM-CSF、MCP-1 和 RANTES, 对商业单核细胞 U937、THP-1 和新鲜 PMs 的迁移能力进行了评价。U937 和 THP-1 单核细胞能够迁移的反应, 以 GM CSF 和 MCP-1, U937 作为最敏感的, 而两个单核有一个空的回应 RANTES。重要的是, PMs 显示了一个高的基础迁移活动和对 MCP-1 的最有力的响应 (图 5)。IL-8 也丰富后, 3D 共培养的主要细胞和单核。因此, 我们分析了 IL-8 是否改变了商业和初级细胞系的入侵能力。商业侵略性的 HS578T 和 MDA-MB-231 入侵, 以响应 IL-8, 而非 (MCF-7 和 T47D) 没有入侵。令人惊讶的是, 在响应 IL-8 (图 6A, 右面板) 时, 主要的 "零售商" 细胞比商业攻击性的细胞系更有侵入。在某些情况下, 细胞侵入成簇, 因此 IOD 分析是必要的 (图 6B)。
图 1: 3D 文化中的代表图像.从左至右: 控制 non-transformed MCF-10A 细胞形成特征的腺腺, 具圆形的形态学, well-delimited 细胞接触, 和组织结构的均匀大小 (约50µm 平均, 光学放大200X)。中间板显示在低密度 (2 天) 和高密度 (5 天) 培养的主要的细胞。细胞黏附在 ECME 并且保持低密度在早期的时间点。很明显, 细胞呈现出一个细长的纺锤状形状, 有些具有两个或更多的长胞质投射, 没有明显的细胞黏附。另一方面, 高密度细胞在以后的点形成了结构象网没有一个具体结构组织。这些细胞出现堆积显示没有接触抑制。在3D 文化中显示了5天后商业 MDA-MB-231 细胞的控制;这些积极的细胞与主要的零售商文化有着更密切的相似性 (光学放大率为 100X)。刻度线代表50µm 800 细胞在实验开始时被播种。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: ECM 降解分析.非侵袭性 MCF-7 细胞染色的黄色荧光 (a) 和侵略性的 MDA-MB-231 细胞染色的红色荧光 (B) 培养5天3D 条件;0.5% 的绿色荧光标记的胶原 IV 被纳入可视化 ECM 降解。在A和B中, 左上角的图片代表了胶原蛋白降解的水平, 右上角的面板代表了光学图片, 左下角代表了该细胞, 右下角的面板显示了荧光和光学的合并图像.对于A和B, 介绍了100µm 的200X 和缩放条的光学放大倍数。(C) 具有代表性的图像 ecm 蛋白水解 (绿色) 在3D 培养的单个 MDA-MB-231 细胞作为对照, 与 ecm 蛋白水解蛋白共 MDA-MB-231 与 U937 单核。刻度线代表10µm。IOD (集成光学密度) 的六50µm2字段从每个条件被测量。给出了 quantifications 的平均值和标准误差 (SEM);两个星号表示与p < 0.01 (曼-惠特尼测试) 的统计学意义上的差异。(D) 与荧光染色的 U937 单核细胞 (橙色) 的直接相互作用 (灰色阴影质量 MDA-MB-231);绿色荧光对应于蛋白质水解。连续切片是每10µm 通过共聚焦显微镜来解决两个细胞系之间的定位和直接相互作用。200X 光学放大倍数;刻度线代表100µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: IL-1β浓度在 3D co-cultures 中增加.一个代表性的结果 IL-1β水平 (pg/毫升) 在清从八 (PC1-8) 主要的细胞, 培养单独在 3D (3D), 并与他们的 3D co-cultures 与 PM (CC)。在单独的3D 文化中, pm 的控制包括在比较 (pm)。结果是从一个更大的复用分析, 其中几个细胞因子同时检测到的每一个样本的手段, immunodetection-based 技术可作为一个商业套件。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 主要的亡细胞分泌因子诱导 non-transformed MCF-10A 细胞的抗性.MCF-10A 细胞生长在3D 条件下与标准培养基 (柱 A 和上部面板的 D), 其中可以观察到, 腺目前典型的空心流明 (25-75% 深度突出与红色正方形);当 MCF-10A 细胞的两个不同的清从两个主要的零售商文化 (列 B 和 C), 流明不是空心的, 但充满细胞, 表示抵抗亡。同样地, 当 MCF-10A 细胞在3D 条件下被培养, 加入人类重组 IL-1β (20 ng/毫升), 在50% 深度共焦显微镜切片的腺 (D 的下部板) 中, 没有空心腔可以被欣赏。右椭圆形漫画代表共焦显微镜部分, 是在 0, 25, 50, 75 和100% 深度的腺。图像显示细胞核染色的 DAPI (蓝色) 和 e-钙黏附素在绿色。光学放大倍率为 200X, 刻度条代表10µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 单核细胞的迁移能力.U937、THP-1 和 PM 对 GM-CSF、MCP-1 和 RANTES 的迁移能力的代表性图像。不含趋化因子的控制包括 (从左到右的第一列)。图像下面的数字表示每个条件下的迁移细胞的数量;U937 和 THP-1 单核细胞主要反应为 GM-CSF 和 MCP-1, 而 PM 表现出高迁移能力本身, 是最敏感的 MCP-1。100X 光学放大倍数;刻度线代表100µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 攻击性和主要的 IL-8 细胞侵入响应. A.入侵检测与两个非 (MCF-7 和 T47D), 两个高度侵略性 (HS578T 和 MDA-MB-231) 的零售商的细胞线和一个主要的零售商文化响应 IL-8 使用的趋化。上部面板对应的控制没有趋化因子显示没有入侵, 较低的面板显示对 IL-8 的反应, 具有高度侵略性的细胞和主要的细胞, 侵入细胞膜的细胞文化插入。B.入侵群集的单元格示例;在这些情况下, 对入侵的测量是通过一个图像分析程序来确定每个区域的 IOD (综合光学密度) 入侵。图像下的数字表示每个条件下入侵细胞的数量。100X 光学放大倍数;刻度线代表100µm.请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
上皮细胞生长在3D 空间构象, 它们与 ECM 蛋白的相互作用是组织稳态的关键。许多癌症研究都是以单分子膜 (2D) 的细胞为基础的, 尽管它们对于了解肿瘤形成和进展的许多方面都是至关重要的, 但单分子膜并没有重述 ECM 强加于细胞的特性,例如: 限制增殖, 黏附依赖细胞生存, 顶端侧极性, ECM 重塑, 细胞分化,等重要的是, 不仅肿瘤细胞和 ECM 之间的相互作用对癌症的进展是必不可少的, 而且在肿瘤和肿瘤细胞之间建立的沟通, 如免疫细胞。此处提供的协议有助于了解 ECM 提供的环境中免疫细胞和癌细胞之间的相互作用, 这些相互作用促进的炎症反应, 以及这种炎症状态如何产生良性循环培养 chemoattraction 单核细胞和更多的癌细胞侵袭。
使用 ECME 的一个很大的优点是它提供了一个适合于执行各种实验的3D 模型22的生物支架。它富含 ECM 蛋白质, 如层粘连蛋白, IV 型胶原, entactin, 素硫酸多糖, 和生长因子, 其中在体内将与上皮细胞相互作用。缺点是, 因为它来自裂解的小鼠肉瘤, 他们的组分的集中在不同的地段之间变化。因此, 经常需要对多个批次进行定性, 以获得更均匀的数据。在实验室中, 每一个新的批次通过两种方法来测试: 1) 通过评估 MCF-10A 细胞的正确腺形成, 和 2), 通过对成熟侵入能力的细胞系的侵袭性进行评价。另一个选择是与其他脚手架产品, 如水凝胶, 这是一个合成纳米肽支架。3D 文化的刚度可以通过调节水凝胶的浓度来控制23,24。重要的是, 该系统可用于研究任何类型的肿瘤细胞与造血或造血细胞之间的相互作用。甚至可以使用两个以上不同的细胞谱系来设计更复杂的系统。3D 模型的一个重要优点是, 它们允许对 ECM 相互作用形成的细胞形态和细胞组织进行研究, 这在致癌转变过程中被改变。同样, 你可以研究致癌功能, 如蛋白水解降解, 以及细胞最初放置在不同层次的文化信号, 以促进直接的互动/沟通。此外, 不同的细胞谱系可以标记不同的荧光, 使他们可以被孤立的实验后, 以解决特定的问题, 每一个单独的细胞类型, 使用, 例如 RNA 和/或蛋白质表达分析13。在这里, IL-1β分泌到培养基中的主要细胞/PM co-cultures 显示, 支持一个可能的关键作用, 这种细胞因子的间接沟通之间的肿瘤细胞和单核, 引发恶性进展。
实验室的另一项基本实验方案是对 non-transformed MCF-10A 细胞的3D 培养中的腺形成进行分析。该方法用于检测病毒和细胞癌基因活性, 并测试肿瘤微环境如何影响与侵袭性癌症相关的特征。例如, 在腺的正常发育过程中, 腔中央细胞与基底膜蛋白失去联系 (由 ECME) 触发细胞死亡的机制, 称为亡。据观察, 两个清从主要的细胞或重组 IL-1β促进 MCF-10A 细胞抵抗亡。由于高浓度的 IL-1β是促进后的细胞-单核相互作用, 这一观察支持肿瘤基质是一个不可分割的组成部分, 肿瘤进展到高度侵犯阶段。
这里描述的迁移和入侵协议构成了有用的3D 互补分析, 我们可以支持细胞迁移或侵入的能力, 以响应来自肿瘤基质的刺激。结果表明, 在3D 培养的初级细胞中发现的趋化因子 (GM-CSF 和 MCP-1) 可以促进 U937、THP-1 和 PMs 的迁移, 支持侵袭性肿瘤细胞促进炎微环境的能力。此外, IL-8, 也发现在清从 co-cultures 的细胞/单核的增加浓度, 促进入侵的商业侵略性的零售商细胞 (HS578T 和 MDA-MB-231) 和主要的细胞。
关于细胞的状况, 重要的是要与主要的细胞, 在他们达到十通道, 以利用其增殖高峰期, 并避免潜在的 post-isolation 遗传和后生变化产生的体外文化.在处理主单元格时, 另一个重要的方面是在隔离后确认其身份。我们使用了一组生物标志物来确定他们的上皮血统的身份, 其中包括 PanCK, Muc-1 和 EpCAM (在步骤2.5 中指定)。同样, 最好使用新鲜的 PMs, 其中每一批被测试, 确保他们处于相同的分化阶段。每个新批次使用呈现表型 CD34阴性CD11bpos CD14pos CD64pos CD68阴性CD16阴性, 对应于激活未成熟的单核细胞。重要的是, 我们不把不同的捐献者的单核细胞混合, 因为混合导致单核细胞活化。相反, 我们用至少两个不同的捐赠者的单核细胞来独立测试 co-cultures。
3D 文化系统仍然有局限性, 只有少数肿瘤生物学的元素可以可靠地建模。一个新的选择是更复杂的3D 模型的 organoids, 这是基于扩展和分化的干细胞在体外.Organoids 也开发高度有组织的上皮结构。例子包括胃25,26, 肝脏27, 肾脏 organoids28。然而, 每个人体器官的化模型仍有待实现;此外, 它们需要更复杂和昂贵的实验条件。
最后, 我们在这里详细地描述了一个分析的工作流程: 从来自于 ECME-based 的患者的肿瘤细胞分离开始, 测试他们的炎症能力在一个3D 的文化模型, 测试如何炎症微环境服务他们招募额外的炎症细胞, 如单核细胞, 以最终分析两种类型之间的沟通, 以及该通讯如何进一步促进炎症微环境, 促进进展到更积极的癌症阶段。此外, 我们还描述了初级细胞的形态学和表型。在未来的研究中, 它将是有趣的测试其他炎症细胞, 甚至测试的联系之间的细胞和多细胞经常发现在肿瘤基质。这些多细胞的3D 文化将提供一个更大的图片, 什么发生在生物在体内在癌症进展。对体外数据和患者临床结果的比较将确定对癌症侵袭性有更高影响的潜在机制。
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Disclosures
作者声明他们没有任何利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了委员会 FONSEC SSA/社会保障/ISSSTE 项目 No. 233061 至拉维奇-恩特斯-Pananá和基金 de 支持、医院研究 de 婴儿墨西哥 g ó mez (项目编号费德里克二世) 的支持。埃斯皮诺萨-桑切斯是一名博士生, 来自方案 de Doctorado Ciencias Biomédicas, 国立国立 de 墨西哥 (大学), 并获得了奖学金231663从委员会。也感谢墨西哥社会保障研究所 (社会保障) 提供的财政支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U937 | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1593.2 | Monocytic cell line/histiocytic lymphoma |
| THP-1 | American Type Culture Collection ATCC | TIB-202 | Monocytic cell line/acute monocytic leukemia |
| MCF-10A | American Type Culture Collection ATCC | CRL-10317 | Non-transformed breast cell line |
| MCF-7 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-22 | Breast Cancer Cell line |
| T47D | American Type Culture Collection ATCC | HTB-133 | Breast Cancer Cell line |
| HS578T | American Type Culture Collection ATCC | HTB-126 | Breast Cancer Cell line |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-26 | Breast Cancer Cell line |
| RPMI 1640 medium | GIBCO BRL Life Technologies | 11875-093 | |
| DMEM High Glucose | GIBCO BRL Life Technologies | 11964-092 | 4.5 g/L glucose |
| DMEM/F12 | GIBCO BRL Life Technologies | 11039-021 | |
| Antibiotic/Antimycotic | GIBCO BRL Life Technologies | 15240-062 | 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16000-044 | |
| Horse serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16050114 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA 1X | GIBCO BRL Life Technologies | 25300-062 | |
| PBS 1X (Phosphate Buffered Saline | GIBCO BRL Life Technologies | 20012-027 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 (1.00mg) | |
| Insulin | SIGMA-ALDRICH | I1882-100MG | |
| Hydrocortisone | SIGMA-ALDRICH | H088-5G | |
| Cholera toxin Vibrio cholerae | SIGMA-ALDRICH | C8052-1MG | |
| Matrigel | Corning Inc | 356237 | Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| MCP-1 | PeproTech | 300-04 | |
| RANTES | PeproTech | 300-06 | |
| IL-8 | PeproTech | 200-08 | |
| IL-1β | PeproTech | 200-01B | |
| Crystal-violet | Hycel México | 541 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P6148 | |
| Transwell permeable supports (inserts) | Corning Inc | 3422 | 6.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates |
| Transwell permeable supports (inserts) | Thermofisher Scientific | 140620 | 6.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates |
| Monocyte Isolation Kit II Human | Miltenyi Biotec | 130-091-153 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate Assay | EMD Millipore | HCYTOMAG-60K | |
| Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation) | Luminex Corporation | 40-072 | |
| Lab-Tek chamber slide with cover (8 well) | Nalge Nunc International | 177402 | |
| Glass bottom microwell 35mm petri dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
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