Summary
本议定书描述了一种新的方法, 研究一种形式的化学神经的 wholemount 大鼠视网膜体外与神经递质谷氨酸。化学神经是一种有前途的替代传统的电神经视网膜神经元治疗不可逆转性失明引起的感光变性疾病。
Abstract
感光变性疾病通过视网膜感光细胞的逐渐丧失而导致无法挽回的失明。视网膜假体是一种新兴的治疗感光退行性疾病, 寻求恢复视力的人为刺激幸存的视网膜神经元, 希望能获得可理解的视觉感知的病人。目前的视网膜假体已证明是成功的恢复有限的视力患者使用一系列电极电刺激视网膜, 但面临巨大的物理障碍, 恢复高视力, 自然视力的病人。使用天然神经递质的化学神经是一种仿生替代电刺激, 可以绕过与使用电神经的视网膜假肢相关的基本限制。具体而言, 化学神经有可能恢复更多的自然视力与可比或更好的视觉视力患者通过注射极少量的神经递质, 相同的自然药物的交流使用的视网膜化学突触, 比当前的电子假肢更精细的分辨率。然而, 作为一个相对未被探索的刺激范例, 没有建立的协议为实现视网膜的化学刺激在体外。这项工作的目的是提供一个详细的框架, 以完成化学刺激视网膜的研究者谁希望研究的潜在化学调节的视网膜或类似的神经组织体外。在这项工作中, 我们描述的实验设置和方法, 诱导视网膜神经节细胞 (王国) 穗反应类似于视觉光反应的野生型和感光 wholemount 大鼠视网膜的注射控制体积神经递质谷氨酸进入视网膜空间使用玻璃 micropipettes 和定制多端口微流控装置。这种方法和协议是通用的, 足以适应调节使用其他神经递质或甚至其他神经系统组织。
Introduction
感光性退行性疾病, 如视网膜色素变性和年龄相关的黄斑变性, 是导致视力丧失的可继承原因, 目前是无法治愈的1,2。尽管这些疾病是由各种特定的基因突变引起的, 但感光变性疾病是由视网膜感光细胞的逐渐丧失而引起的, 最终导致失明。光的丢失引发了整个视网膜的广泛重塑, 但存活的视网膜神经元, 包括双极细胞和视网膜, 仍然完好无损, 即使在感光变性的高级阶段也相对正常,3 ,4,5,6,7。
这些疾病的机制和病理特点已经很好的特征3,4,5,6,7 , 但有效的治疗仍然难以捉摸。在过去的三年中, 世界各地的研究人员已经研究了多种治疗方法, 以恢复视力的那些受影响的感光变性疾病, 包括基因治疗8, 干细胞治疗9,视网膜移植10, 人工刺激11,12存活的视网膜神经元。其中, 最有临床意义的是视网膜假体, 这是人工神经装置, 传统上使用了一系列电极, 以电刺激双极细胞或视网膜在特定模式的目标在患者中创建人工视觉感知11。当前世代电子假肢, 例如守卫 II13和阿尔法 IMS14设备, 获得了临床批准, 并且初步研究表明, 他们能改善患者的生活质量通过恢复测量视觉使用两个前 (视网膜的前面) 和视网膜 (视网膜的后面) 植入的设备15,16。世界各地的研究小组正在努力推进视网膜假肢超越这些 first-generation 设备的成功17,18,19,20 ,但已面临困难设计一个电子假肢能够恢复高视力视力低于法律失明水平的病人。最近的研究表明, 实现更高的空间分辨率比目前的代为主假肢是挑战, 因为电荷注入限制, 这就需要使用大的电极来安全地刺激视网膜神经元以空间分辨率为代价,即视觉灵敏度11,21。此外, 电刺激是进一步有限的, 因为它通常刺激所有附近的细胞, 从而引起病人的不自然和混淆的看法, 很大程度上是因为它是一个固有的非自然刺激范例21。然而, 早期的电刺激成功表明, 人工神经可以是一种有效的治疗感光变性疾病。这导致一个假设, 更有效的治疗可能是可以通过刺激视网膜与神经递质化学品, 在化学突触沟通的自然代理人。该方法的目的是探讨化学刺激的治疗可行性, 旨在模拟视网膜神经元之间的突触通信的自然系统, 作为电刺激的仿生替代品。用于视网膜假体
对化学性视网膜假体的治疗性化学刺激的概念的翻译依赖于化学活化的目标视网膜神经元, 少量的本地神经递质, 如谷氨酸, 通过微流控物释放一种装置, 包括大量的 microports 以响应视觉刺激。这样, 一个化学的视网膜假体将本质上是一个仿生的人工感光层, 把光子自然地到达视网膜的化学信号。由于这些化学信号在正常的视网膜信号中使用相同的神经递质, 并通过正常视觉通路所使用的相同突触通路刺激退化视网膜的存活的视网膜神经元, 由此产生的视觉通过一个化学的视网膜假体的知觉可以更自然和可理解相比, 通过一个电动假肢诱发。此外, 由于神经递质被释放的 microports 可以非常小, 并排列在高密度, 不像电极, 一个潜在的化学假体可能能够获得更多的焦点刺激和更高的空间分辨率比电子假肢。因此, 基于这些潜在的优势, 化学性视网膜假体提供了一个非常有前途的替代电气假肢。
然而, 直到最近, 对视网膜的化学刺激也相对较少。而电刺激的视网膜已经很好地表征了几十年的工作通过体外22,23,在体内23,24, 和临床研究13 ,14, 对化学刺激的研究仅限于少数体外工作25,26,27,28。耶齐和芬利森26和 Inayat et al.27分别使用单电极和多阵列 (前) 对视网膜的化学刺激进行了实验, 以记录视网膜神经元的谷氨酸诱发反应。最近, 朗特里et al.28显示了视网膜侧的谷氨酸和视网膜通路的差异刺激, 并记录了视网膜上多个部位的神经元反应。虽然这些工作已经初步确定了化学刺激的可行性, 但进一步的研究对于研究这种方法的许多方面是非常必要的, 除了这些方面, 到目前为止25,26,27,28, 并 fine-tune 的治疗刺激参数在两个体外和在体内动物模型之前, 把这个概念转化为化学视网膜假体如上所述。然而, 目前还没有确定的方法, 以完成化学刺激的视网膜在文献中使用的方法, 在以前的作品没有被描述的细节, 这将是必要的复制研究。因此, 本方法的基本原理是提供一个明确的框架来进行体外对视网膜的化学刺激, 对于那些有兴趣复制我们以前的研究的调查者27, 28或进一步推进这一新生的化学神经概念。
在这里, 我们演示了一种进行体外的方法, 对野生型大鼠 wholemount 视网膜神经元的化学刺激及感光变性大鼠模型的模拟疾病在人。在体外模型中开发这种刺激方法的基本原理是评估各种刺激参数的治疗范围, 并研究在中不可能或难以观察到的神经反应特性. 体内的模型, 特别是在最初的研究集中在评估这种方法的可行性。在这个过程中, 我们显示站点和同时多站点的视网膜的化学刺激通过提供少量的1毫米谷氨酸近靶视网膜神经元通过商业可用的单玻璃 micropipettes 和自定义多口微流控装置, 分别。虽然站点和多站点刺激完成了研究化学调节的治疗可行性的基本目标, 但它们都具有独特的优势。站点刺激, 这可能是完成与商业可用的 pre-pulled 玻璃 micropipettes, 可用于直接注入化学品的视网膜下在一个单一的地点, 并有助于调查, 如果可见的研资局穗率类似于视觉诱发光反应的反应可以在注射部位局部。另一方面, 多站点刺激, 需要专门制作的多端口微流控装置, 可以被用来在多个地点的视网膜表面上注入化学物质, 并有助于研究谷氨酸诱发 RCG反应模式对应于模式刺激研究中的谷氨酸注射模式。
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Protocol
所有动物实验都是按照国家研究委员会关于实验室动物护理和使用指南所概述的准则进行的。动物处理和安乐死协议的审查和批准的机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的伊利诺伊大学在芝加哥。
1. 动物模型
- 野生型长埃文斯鼠
- 获得一个 24-32 天老的野生型长埃文斯头戴头巾的大鼠, 无论是一个标准的12小时的昼夜节律提高。
- 黑鼠通过将它放在一个完全黑暗的房间1小时之前开始实验。
- S334ter-3 大鼠
- 杂交转基因白化合 S334ter-3 大鼠行 (无论是性别), 表达两个变种视基因, 与色素野生型长埃文斯大鼠生产色素杂 S334ter-3 大鼠表现感光变性类似于人类视网膜色素变性的进展29,30。
- 提高杂的后代与标准的12小时/夜节律和使用两个性别的大鼠, 以下年龄的实验相应的感光变性阶段: 早期阶段的退化:14-20 天老;中间阶段退化:21-27 天老;晚期变性:28-35 天的老;完全失明: #62, 50 天大。
- 黑鼠通过将它放在一个完全黑暗的房间1小时之前开始实验。
2. 艾姆斯培养基溶液和灌注系统的制备
图 1: 实验装置示意图.化学刺激实验装置示意图使用玻璃微(a)和自定义多端口微流控设备(B)。视网膜被放置在一个 pMEA 上, 并不断地用新鲜的、含氧的埃姆斯介质溶液从顶部和底部通过 pMEA 穿孔进行灌注。pMEA 电极所拾取的神经响应信号通过多边环境协定放大器送入数据采集计算机。视觉和化学刺激是用绿色 LED 和8通道压力注射器分别完成的, 这两种刺激都是由一台专用的刺激计算机触发的, 它也被用于将吸管通过精确的3轴定位微.在实验中, 用倒置显微镜观察视网膜。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 实验设置.(A) 完整实验装置的照片, 显示所有组件的相对位置。该系统被放置在倒置显微镜的顶部, 用于在实验过程中通过所附的高速摄像机直观地观察视网膜和数字图像的设备-视网膜界面。顶部和底部灌注是独立控制使用电磁控制的灌注系统。注射, 位置控制和阻抗测量是完成使用压力注射器, 微和膜片钳放大器 (橙色盒; 更详细地显示在 B), 分别。微或装置插入到膜片钳 headstage, 用于阻抗测量并安装在龙门上 (用绿色方框表示; 在 C 中更详细显示), 以方便使用微定位。(B)在实验中使用的测量和控制仪器的特写: 8 通道压力注射器、微控制系统、用于阻抗测量的膜片钳放大器和用于灌注消除的吸入容器。(C)一个特写的注塑系统龙门显示一个多端口设备接口与吸管持有人, 膜片钳 headstage, 和微。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 灌注设置.(A) 该放大器顶部的照片显示了顶部灌注和吸力的位置以及用于视觉光刺激的绿色 LED。(B) pMEA 灌注室的特写, 说明顶部灌注和吸力、pMEA 和用于阻抗测量的参考电极的精确位置。(C)底部灌注板的显微。请单击此处查看此图的较大版本.
注意: 请参见图 1、图 2和图 3
- 在室温 (〜21° c) 和 1 L 容器内测量出900毫升的去水。
- 使用冒泡机制灌注 100% CO2的水。
- 在1升容器中加入8.8 克的粉末埃姆斯培养基到水中。
- 用少量的去水冲洗埃姆斯培养基容器, 去除所有的艾姆斯培养基的痕迹, 添加到1升容器中。
- 将25.3 毫升碳酸氢钠溶液 (7.5% w/v31) 添加到 1 L 容器中。
- 添加额外的水, 使解决方案的最后一卷1升。
- 继续灌注的水与 CO2约5分钟。
- 停止 CO2灌注, 并开始灌注溶液与医疗级气体混合物 95% O2和 5% CO2为至少 30 min 或直到 pH 稳定在7.4。
注意: 为了本协议的目的, 在整个实验过程中, 埃姆斯培养基都保持室温 (~ 21 ° c), 以防止 CO2或 O2从出气中咬合, 从而使灌注线与气泡结合。 - 用70% 的乙醇清洗底部和顶部灌注管, 然后用去水洗两条线3次。用去水和空气顶线填充底部。
3. Wholemount 视网膜的制备
图 4: 视网膜解剖和 wholemount 的制备.(a)取自感光变性动物的完整眼罩的照片。(B)显微视网膜的纵向切口使其扁平化。(C)在将视网膜拼合后, 将其放置在网状网格上, 并将感光侧与滤网进行接触, 并在空气中 (在灌注介质外) 平展, 以确保没有褶皱或卷曲的边缘。(D)网状和视网膜迅速转移到 pMEA 与神经节细胞侧接触电极, 并立即灌入含氧的埃姆斯培养基。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 穿孔的多阵列.(A)协议中使用的穿孔多阵列的照片。视网膜被放置在电极阵列上 (由红色矩形表示, 在 B 中显示得更详细), pMEA 腔内允许持续灌注含氧的埃姆斯培养基。(B)电极阵列本身的显微, 说明电极间穿孔的排列方式。请单击此处查看此图的较大版本.
注意: 请参见图 4和图 5
- 根据 IACUC 协议, 使用手持红色 LED 手电筒, 提供暗淡的红色照明, 安乐动物通过二氧化碳窒息, 其次是颈椎脱位或另一种选择的方法。
- Enucleate 两只眼睛使用珠宝商的 #5 钳和地方核的眼睛在一个60毫米直径的培养皿约 3-4 毫升的新鲜, 含氧的埃姆斯培养基溶液。
- 当观察眼睛通过解剖显微镜与顶部和底部照明覆盖红色滤网, 做一个小切口在角膜面使用手术刀或一对锋利的剪刀。
- 从这个小切口切开到角膜的边缘然后延伸切口在一个圆周部分在角膜的整个边缘附近。将现在分离的角膜连同晶状体、半透明的水和玻璃体体液去除。
- 当用一副钳子轻轻握住眼罩时, 小心地在眼罩的两侧做两个小切口。接下来, 用两对镊子轻轻地将眼罩在每个切口处分开, 将视网膜与巩膜分开。 慢慢地从巩膜和眼罩中提起整个视网膜。如果它仍然附有, 切开视神经。
- 在视网膜上进行纵向切割, 以获得一半或四分之一的部分使用剪刀, 然后轻轻地传播一个视网膜部分到尼龙网 (100 µm 螺纹直径与350µm 开口) 与神经节细胞 (视网膜的凹边) 面对远离网格。
- 将网格和视网膜置于穿孔的多阵列 (pMEA) 上, 与 pMEA 表面接触的神经节细胞。然后轻轻地在网格顶部放置一个加权切片网格, 以保持视网膜到位。
4. 多边环境协定和数据获取设置
图 6: pMEA 的噪音级别.(a)具有高持久性噪声的 pMEA 电极子集的代表记录。这种噪音通常是由于 pMEA 上的薄穿孔聚酰亚胺层的正常磨损, 特别是在接触垫上, pMEA 接触垫和多边环境协定放大器的针脚之间缺乏适当的接触。其他可能的噪音来源通常是解决泄漏到 pMEA 放大器接触垫。由于接触垫上的针接触和/或泄漏的解决方案的持续噪音, 通常可以通过改变放大器内的 pMEA 的位置来获得更好的接触和清洁和干燥的垫, 分别进行纠正。如果不能通过清洗或移动 pMEA 位置来消除噪音, 则 pMEA 可能需要完全更换。(B)有代表性的记录从 pMEA 电极的一个子集的噪声水平从一个干净的 pMEA 与良好的接触之间的 pMEA 和放大器。通常, 平均噪音水平在±16µV.请单击此处查看此图的较大版本.
注意: 请参见图 6
- 在暗淡的红光照射下, 将 pMEA 放在放大器和闭合放大器锁闩上。
- 如果参考标记在 pMEA 房间圆环不已经存在, 蚀刻二 ' X ' 形状的标记间隔大约5毫米分开在一个区域容易地可看见从上述与景气立场被安装的显微镜。
- 将顶部灌注口放在 pMEA 室内, 打开顶部灌注阀, 以达到每分钟约3毫升的灌注率。将顶部吸入口放在所需的液水平 (〜5毫米深), 并确保其工作。
- 在数据采集计算机上打开数据获取软件, 然后单击 "播放" 按钮开始接收数据。确保所有 pMEA 通道无噪音, 并记录神经信号。
- 通过观察显示器上倒置显微镜视场的实时数字图像, 观测 pMEA 的底部表面, 以找到溶液流经底部灌注板的证据。
5. 谷氨酸刺激制剂
图 7: 玻璃微和多端口微流控装置.(a)插入微或设备之前的吸管支架。银/银氯化物电极 (50 µm 直径) 是电耦合到适配器在年底与补丁钳 headstage 接口。(B)一张玻璃微与吸管架接口的照片, 显示用于启动气动注射的压力端口的位置。(C)一种定制的多端口微流控设备 (1 cm 1 cm 0.134 cm), 连接到自定义的 3 d 打印夹具, 并通过不锈钢管与吸管支架接口。该装置在两层中制作, 在底层 (340 µm 厚) 和八片状储层 (直径 1.6 mm) 中有八 microports (直径14µm), 用于在顶层 (1 毫米厚) 中储存谷氨酸。该设备底层的八 microports 中的每一个都通过一个平面微通道独立连接到顶层的片上油藏, 而每个片上的储油层依次通过一个8通道压力注射器的压力端口连接到柔性管允许独立驱动的 microports 的图案多站点注射。(D)在连接导管接口夹具之前, 用镊子握住的多端口装置的特写, 以显示八个独立寻址的片上油藏和油管入口的排列。(E)设备下表面的显微, 显示八14µm 直径 microports, 在 3 x 3 配置中设置为200µm 间距, 以与 pMEA 电极对齐。八外部 microports 用于多站点注入, 而中央端口在设备制造过程中被严格用于对准。请单击此处查看此图的较大版本.
注意: 请参见图 7。
- 通过混合谷氨酸 solutionwith 氧埃姆斯培养基溶液制备谷氨酸溶液, 在工作浓度为 1 mM 的谷氨酸中获得0.5 毫升的样品。
- 小心地将 pre-pulled 10 µm 直径的微或连接到多端口微流控装置的不锈钢棒插入一个标准的吸管支架, 其中含有50µm 直径的银/银氯化物线电极。
注: 如果不具备阻抗检测功能, 可省略银/银氯化线电极。 - 将吸管架与膜片钳 headstage 接口, 并将吸管架的压力端口口连接连接到压力注入系统的通道 1, 如果使用玻璃微, 或连接每个压力端口的口连接8注入口与通道 1-8 的压力喷射系统, 如果使用多孔设备。
- 手动打开压力注入系统并打开通道 1 (或通道 1-8, 如适用)。确保系统向大气通风, 并将注入压力设置为 0.1 psi。
- 打开微, 按下机械手控制器上的 "校准" 按钮进行校准。定位微, 使微尖端 (或设备的底部, 如适用) 约30毫米以上的多边环境协定放大器。
- 用谷氨酸溶液填充一个小的培养皿 (在标准埃姆斯培养基中为1毫米谷氨酸), 并将其置于微。将微尖端 (或设备) 放入溶液中, 然后按压力喷射系统上的 "填充" 按钮 (在 H2O) 中按下 "吸入压力" (-13), 直到有大约20毫米的溶液可见于玻璃微或多端口装置油管。
- 如果使用多端口设备, 请关闭压力注射器的通道 1, 然后重复通道 2-8 的协议。从溶液中提起微尖端或装置, 取出培养皿, 并将微置于 pMEA 室的上方。
- 使用一个繁荣-立场安装显微镜, 对准微尖端或设备的角落与参考标记蚀刻到 pMEA 室环。使用 "存储参考 a" 和 "存储参考 B" 按钮 (或简单地记下机械手坐标) 将机械手位置存储到控制软件中, 以 pMEA 电极映射机械手的坐标系。
- 使用机械手控制软件, 选择一个具有稳健自发活动的目标 pMEA 电极, 并单击 "移动到通道" 按钮, 使玻璃 micropipettewith 对准目标电极。
6. 与视网膜交界
- 如果有阻抗测量, 打开膜片钳放大器, 并启动阻抗可视化软件, 点击 ' 开始 ' 按钮, 以显示银/银氯化物电极的阻抗在吸管持有人。当观察 real-time 阻抗信号时, 慢慢地降低微或装置直到它接触到视网膜表面, 就像阻抗信号的快速增加所表明的那样 (参见图 8)。保存或记下视网膜表面的位置。
- 如果阻抗测量是不可用的, 通过视觉观察发现与视网膜表面接触, 虽然这将是不精确的。降低吸管或装置, 直到它明显地接触到在多边环境协定腔室中的埃姆斯介质溶液的顶面。
- 然后, 当用倒置显微镜观察视网膜顶部时, 慢慢地降低吸管或装置直到视网膜顶部表面被明显扭曲, 这表明与视网膜表面接触。保存或记下视网膜表面的位置。
- 对于地下刺激, 降低吸管进一步40µm (为 S334ter-3 视网膜) 或70µm (为野生型视网膜)。
- 使用压力注入 (0.1 psi) 系统执行短时间 (10-30 毫秒) 注射, 以确定微尖端或设备 microports 附近的细胞是否接受谷氨酸刺激, 通过观察神经信号进行数据采集软件.
注: 成功注射会引起明显的穗速爆裂或穗抑制 (参见图 9)。如果未观察到响应, 请在不同的电极上重新定位微或设备。
图 8: 阻抗测量.(a)阻抗测量技术示意图。使用膜片钳放大器, 微的阻抗是不断监测, 因为它是缓慢降低到视网膜表面。当微在视网膜上方时, 艾姆斯培养基相对较高的离子电导率导致低阻抗读数。当微与视网膜表面接触时, 通过银/银氯化丝的离子电导率降低, 从而导致测量阻抗的迅速增加。(B)一个图形, 显示在与视网膜表面的吸管尖端接触之前和之后记录的阻抗变化。当微尖端在接触前的溶液中 (由左边的橙色区域指示) 时, 测量的阻抗相对较低。一旦接触到 (由红色箭头和右边的绿色区域表示), 阻抗迅速增加, 由于离子电导率降低后, 与视网膜组织接触。在实践中, 视网膜表面被登记为高度对应的开始急剧上升的测量阻抗 (红色箭头的位置)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 9: 在视觉、自发和谷氨酸注入记录过程中, 神经活动的电极记录.(A)有代表性的录音从九 pMEA 电极显示高通滤波电极数据在视觉光刺激与绿色 LED, 其中每个矩形显示的神经数据从一个独特的电极。每个电极记录都显示了在打开绿色 LED (每个图中显示橙色箭头的定时) 后第一秒收集的数据, 并显示在左 y-axes 中的共同电压刻度。尖峰被确定使用的阈电压为-18 µV (水平红线在每个电极图) 和代表的黑色痕迹的绿色电极数据。视觉刺激引起了所有电极上的尖峰 (励磁), 除了顶部的中心之一, 它具有抑制对光的反应。(B)类似的图形, 用于显示自发神经活动而不进行视觉或注射刺激的相同电极。虽然出现了较小的爆发, 但峰值的模式与那些对视觉刺激的反应非常不同。(C)在中心电极上进行谷氨酸注入后立即记录的同一电极子集的代表录音 (每个图中橙色箭头表示的定时)。注入的谷氨酸诱发了中央电极上的尖峰, 与视觉诱发的棘突爆发非常相似。所有其他电极都不受谷氨酸注射液的影响, 这表明了化学刺激技术的精细空间分辨率。请单击此处查看此图的较大版本.
7. 启动视网膜记录和刺激计划
- 将绿色 LED 朝向视网膜的顶面。通过键入文件名并单击 "记录" 按钮, 开始使用专用记录计算机上的数据采集软件进行录制。
- 一旦录制开始, 打开刺激控制程序, 并通过点击 "读取刺激文件" 按钮加载默认刺激文件。接下来, 点击 "运行刺激文件" 按钮, 启动默认的刺激文件, 包括刺激和数据获取协议中描述的下面的说明。
注: (i) 使用绿色指示灯 (5 lm/m2强度) 对 2 s 和 2 s 的30次试验。(二) 120s 的数据不使用绿色 LED 记录视网膜的自发活动在类似的时间尺度。(iii) 1 或更多套谷氨酸注射液, 包括30个谷氨酸注射液在 0.1 psi, 10-30 毫秒注射次数 (约 100-300 pL 每注射) 和 3 s 间持续时间。在多站点注射的情况下, 选择2或更多端口同时注入。
图 10: 视觉、自发和谷氨酸反应的 Peristimulus 直方图.(A)代表性的 peristimulus 直方图 (30 ms binwidth) 的穗数据从电极的子集, 在图 9A, 平均横跨20试验的视觉光刺激。在所有电极上都使用了一个共同的穗率刻度, 并显示在左 y-axes。每个电极图中的黑线代表在打开绿色指示灯后第一秒记录的所有峰值的平均峰值速率。可见, 视觉刺激引起了在所有电极上的瞬态兴奋性穗率反应, 除了顶部中心电极, 这对光有瞬态抑制反应。(B)在没有任何视觉或化学刺激的情况下, 在同一电极上记录的平均自发峰值速率响应。没有刺激, 每个电极的钉率是相对地恒定的。(C)在中心电极上方的某个位置对谷氨酸注射液的反应, 在同一电极上记录的平均峰值速率响应。唯一的瞬态反应明显是兴奋反应在电极直接在注射部位。请单击此处查看此图的较大版本.
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Representative Results
该协议可用于化学刺激正常, 野生类型的视网膜和感光变性视网膜, 尽管大量的细胞重塑造成的损失的光。在开始实验, 无论是感光器退化或野生类型的视网膜, 记录和刺激设备 (图 1和图 2) 需要准备好, pMEA (图 5) 应该被清除, 以最小化每个电极通道上的噪音 (图 6)。虽然感光变性视网膜比野生型视网膜更薄, 因此更细腻, 但同样的解剖过程 (图 4) 也被用于两者。解剖后, 视网膜被小心地放在 pMEA 与神经节细胞侧面对电极, 和 pMEA 的保护内的多边环境协定放大器 (图 3A), 在那里它可以不断灌入新鲜, 含氧的埃姆斯介质从顶部 (图 3B) 和底部 (图 3C) 两侧。在确保视网膜已从外科创伤中稳定下来后, 玻璃微或多端口装置安装在吸管架上 (图 7A-E), 并与膜片钳 headstage 接口, 其位置由3轴控制精密微创 (s) 的吸管或设备, 然后应与目标电极和小心降低, 直到接触可以检测到使用阻抗方法, 如图 8或通过显微镜视觉确认。一旦注入传递端口位于视网膜表面或地下的适当位置, 就可以启动刺激程序。
在 pMEA 电极的子集上有代表性的一组神经活动记录显示在图 9中, 用于可视化 (图 9A)、自发 (图 9B) 和外部注入的谷氨酸 (图 9C) 刺激。成功的视觉和化学刺激通常是可以观察到的, 如爆发的王国峰值或暂时停止峰值活动, 如在图 9中的示例中所示。如果附近的细胞对化学刺激反应迟钝, 由此产生的穗状数据将与自发的扣球行为相似。在提取了王国尖峰并将其组织成试验后, 可以使用平均 peristimulus 时间直方图 (PSTH) 来说明每个电极上的神经反应, 如图 10所示, 它与原始电极数据在图 9中。
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Discussion
这里介绍的方法展示了一个独特的神经刺激模式, 其中视网膜神经元的化学刺激, 注射当地神经递质化学物质进入视网膜的地下体外。这种化学刺激技术在传统的电刺激技术中提供了一些好处, 包括选择性和靶神经元的高聚焦特异性。上面的协议详细说明了如何小体积的神经递质谷氨酸注射在目标视网膜神经元附近使用单玻璃微或自定义微流控流体设备引出在生理学上重要的研资反应。虽然这个协议已经证明只有谷氨酸, 该协议仍然是有用的研究化学刺激视网膜与其他类型的神经递质。此外, 虽然最好使用 pMEA 的电生理记录32 , 如本议定书所述, 其他多边环境协定的设计, 包括 non-perforated 类型, 可用于取得类似的结果, 作为 pMEA。在下面的段落中, 我们将讨论我们的协议中最关键的步骤, 解决常见问题的方法, 以及这一刺激技术的局限性和未来的应用。
为了获得安全可靠的化学刺激, 必须在本议定书中完成若干关键步骤。其中一个关键步骤是通过仔细地提取视网膜来获得成功的视网膜准备, 并将其保存在含氧埃姆斯培养基外的时间减少,即, 当在网状网格上拼合刚解剖过的视网膜时然后再把它转移到 pMEA 灌注的培养基上视网膜的初步解剖需要尖锐的解剖工具和实践, 因为鼠眼是相对较小的。此外, 光受体退化视网膜的提取可能特别困难, 因为它们比已经脆弱的正常视网膜更脆弱, 因此容易撕裂。整个解剖过程, 从最初的摘除到把视网膜放置在 pMEA 上, 应尽快完成, 以防止过早的细胞死亡, 因为缺乏氧气或其他营养素。在解剖过程中传授给组织的机械损伤应尽量减少, 避免对组织进行切割或损伤, 因为这也会导致非自然的神经反应和细胞死亡。
将视网膜放置在 pMEA 上后, 应注意启动顶部和底部的灌注和吸力线, 因为这是实验失败的一个常见点。所有的灌注和吸力线必须在开始试验之前检查, 并在整个实验中定期检查, 以确保气泡不会阻碍通过线的流动。特别是, 在底部灌注线内形成气泡可以完全阻碍灌注的流动, 因为它的直径较小, 从而导致实验过早结束, 剥夺了视网膜的氧气和养分。由于气泡的危险性, 上述协议是在室温下进行的, 而不是在更理想的生理温度下进行的, 以避免从埃姆斯培养基溶液中释放溶解氧或二氧化碳。如果气泡在实验过程中咬合其中一个灌注线, 它们通常可以通过在灌注线上轻轻敲击而分散到较小的 non-occluding 气泡中。
另一个与灌注系统有关的常见问题是对底部吸力进行微调, 使其保持视网膜与电极接触牢固, 但不损伤。如果吸入压力太高, 它可以通过 pMEA 的穿孔吸收小块视网膜, 最终导致停止所有的神经反应。另一方面, 如果压力过低, 视网膜就会从电极上飘离, 从而扰乱神经的记录。调整这两个极端水平之间的吸力要求实践, 并使更容易, 如果 pMEA 是使用在倒置显微镜, 这使得密切观察的穿孔的 pMEA。通过观察这些穿孔, 同时调整吸力, 你可以找到正确的平衡, 保持接触, 而不损害视网膜。为了尽量减少漂白光在刺激野生型视网膜时的可能性, 应将倒置显微镜光源过滤, 只发出红光, 并尽快完成视觉观察。
在确保适当的灌注条件后, 下一个关键步骤是参照 pMEA 上的可见固定点或标记的设备或吸管, 使注入端口能够精确地与 pMEA 的电极对齐。通常, 这是通过三角法完成的, 其中两个参考标记放置在 pMEA 室的边缘, 与玻璃微尖端或在多端口装置上的地标, 通过视觉观察从上面使用臂架式显微镜。然后通过倒置显微镜进行目视检查, 使注入口与靶电极的对准更加精确。一旦正确对准, 当用吸管或微流体设备接近视网膜时应注意, 因为任何机械手抖动或漂移都可能粉碎视网膜或破坏 pMEA。避免意外损害视网膜的最佳方法是不断监测吸管电极的阻抗, 以精确检测与视网膜顶部表面的接触。阻抗测量也可以用来快速检查插入到视网膜的微尖端是否被堵塞, 这是由异常高 (通常在 gigaohm 范围) 阻抗指示。如果阻断, 微提示通常可以通过启动一个高压脉冲, 其尖端远离视网膜, 以避免无意的损害。在极少数情况下, 如果高压脉冲不清除堵塞, 则可能需要完全替换堵塞的管。当参考电极在 pMEA 腔内的溶液和膜片钳放大器之间没有适当的接口时, 也可以记录异常或高阻抗值。
一旦定位在目标位置, 谷氨酸的注射量应严格控制的压力, 注射时间和神经递质浓度, 以防止刺激的神经元, 这已被证明导致兴奋损坏。本协议中详细介绍的谷氨酸注射液参数表示一种制度, 其范围远远低于引起谷氨酸兴奋的已知阈值33 , 但是, 当尝试使用其他类型的神经递质时, 相应的兴奋效应的阈值水平必须考虑安全刺激。此外, 上述协议中规定的 0.1 psi 注射压力来自于本研究中所使用的8通道压力注射器上的最低可能压力设置, 但始终取得了成功的结果。因此, 0.1 psi 的神经递质注射只是暗示, 但不是限制性的, 以取得成功的化学刺激。如果使用不同的压力注射器可以降低驱动压力, 则可以在低于 0.1 psi 的压力下进行注射。
此协议的一个限制, 涉及体外wholemount 视网膜准备是短暂的实验时间窗口, 这是限制为8小时或更少, 即使在整个实验中采取极端护理。这个有限的实验时间窗口不允许检查任何化学刺激的长期影响, 如兴奋。这一特定协议的另一个限制是选择在室温下记录, 而不是生理温度, 这可能会影响视觉和化学诱发的穗率反应, 因为以前的研究表明, 较低记录温度可以改变其他几个属性34、35、36、37、38中的峰值速率、响应滞后时间和谷氨酸吸收率。这一限制可以避免使用一个加热的底部板 non-perforated, 而不是 pMEA, 这是利用专门设计的底部灌注板没有加热板和/或有效的热 debubbler 的顶部和底部灌注.
最后,体外的制备受氧性埃姆斯培养基活性灌注对保持视网膜健康的必要性的限制。由灌注系统引起的液体电流通常比在体内的眼睛内的自然灌注机制快得多39, 并且可能会干扰化学注射, 将注射的神经递质抽离视网膜.表面注射, 如那些与多端口设备, 可能会更容易受灌注电流干扰与地下注射, 虽然存在的灌注从底部的 pMEA 可能会导致类似的效果整个视网膜。由于这个原因, 目前的协议中的谷氨酸化学物质是用气压来传递的, 但是在体内进行成功刺激所需的注射压力可能会大大低于对体外的使用。研究。
化学刺激, 寻求激活更多的自然神经递质刺激的神经元, 提供了一个有效的替代传统的电刺激, 但尚未认真探索。因此, 几乎没有文献可描述的协议或最佳做法, 以实现可靠的视网膜化学刺激视网膜神经元。最近的研究28使用该协议表明, 视网膜化学刺激的视网膜神经元可以可靠地获得与空间分辨率相比, 或优于电刺激视网膜, 并有下应用外源性谷氨酸的证据可以直接刺激双极性细胞, 从而使这种方法能够利用视网膜固有的视觉处理电路, 并推测出更类似于自然光的感知刺激.
需要进一步的研究来验证 non-murine 模型系统中的这些结果, 并调查以前的研究未解决的问题, 包括与在体内执行此战略.因此, 这一方法的未来方向显然在于将这一概念转化为体内动物模型, 开发合适的技术, 通过植入的 light-powered 微流控芯片实现长期的化学传递和刺激用作退化感光层的替代品的装置。作为一种相对理解的刺激模式, 化学刺激的广泛应用尚未被发现, 但由于视网膜是中枢神经系统的一部分40, 因此这种刺激策略有可能应用于其他神经刺激的情境, 如皮质, 脊髓, 或神经肌肉疾病, 使用不同的神经递质治疗。此外, 所提出的议定书可以更普遍地用于研究药物或其他化学品的受控交付的影响, 在一个良好的时空分辨率的神经组织在一个体外设置。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
论文中介绍的工作得到了国家科学基金会的支持, 研究和创新领域的新兴前沿 (NSF-EFRI) 方案赠款0938072。本文的内容完全是作者的责任, 不一定代表 NSF 的官方观点。作者还希望感谢 Dr. Samsoon Inayat 为他的工作设计和测试的初步实验设置的化学刺激和 Mr. 温 Raghunathan 为他的工作设计, 制作, 并评价了多端口微流控装置使用这项研究。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microelectrode array, perforated layout | Multi Channel Systems, GmbH | 60pMEA200/30iR-Ti-pr | http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti |
| MEA amplifier | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv |
| Bottom perfusion groundplate for pMEA | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv-(BC)-PGP | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp |
| 3-axis Motorized Micromanipulator | Sutter Instruments, Novato, CA | MP-285 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html |
| Micromanipulator Control System | Sutter Instruments, Novato, CA | MPC-200 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html |
| Gantry style micromanipulator stand with linear slide | Sutter Instruments, Novato, CA | MT-75/LS | https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html |
| 8-channel Programmable Multichannel Pressure Injector | OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ Vendor: Harvard Apparatus UK |
PM-8000 or PM-8 | OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm Vendor: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1 _HAUK_ProductDetail |
| Axopatch 200A Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200A | Axopatch 200A has been replaced with a newer model Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier |
| Patch clamp headstage | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV 201A | http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage |
| Vacuum waste kit | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VMK | http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/ |
| Pipette holder | Warner Instruments, Hamden, CT | QSW-A10P | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915 |
| Pre-pulled 10 μm tip diameter glass micropipettes | World Precision Instruments, Sarasota, FL | TIP10TW1 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/ |
| Zoom stereomicroscope | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-745T | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745 |
| Microscope boom stand with dual linear ball bearing arm | Old School Industries, Inc., Dacono, CO | OS1010H-16BB | http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm |
| Zoom Stereo Microscope with C-LEDS Hybrid LED Stand | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-445 | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445 |
| Inverted microscope system | Nikon, Tokyo, Japan | Eclipse Ti-E | https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E |
| Ames medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1420 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420 |
| L-Glutamic Acid (Glutamate) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291 |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S8761 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761 |
| 60 mm Petri dish (10 mm tall) | Fischer Scientific, Waltham, MA | FB0875713A | 60 mm clear petri dish; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a |
| Jewelers #5 Forceps | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 555227F | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/ |
| Standard Scalpel Blad #24 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500247 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/ |
| Scalpel Handle #4 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500237 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/ |
| Vannas Tubingen Dissection Scissors | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 503378 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/ |
| Nylon mesh kit | Warner Instruments, Hamden, CT | NYL/MESH | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173 |
| Harp slice grid | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | HSG-5AD | http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/ |
| Ag/AgCl reference electrode pellet | Multi Channel Systems, GmbH | P1060 | http://www.multichannelsystems.com/products/p1060 |
| 4 Channel Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VC3-4xG | http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/ |
| Zyla 5.5 sCMOS microscope camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla 5.5 sCMOS | http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos |
| Silver wire (50 μm diameter) | Fischer Scientific, Waltham, MA | AA44461G5 | https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5 |
| Tygon microbore tubing (1.6 mm diameter) | Cole Parmer, Vernon Hills , IL | EW-06419-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901 |
| Tilting Tool Holder with Steel Cannula | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | TILTPORT | One each of these were utilized for top perfusion and suction; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/ |
| Roscolux #26 Light Red Filter Sheet | Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT | R2611 | Manufacturer: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux Vendor: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html |
| Smith & Wesson Galaxy Red Flashlight | Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA | 4588 | Manufacturer: https://www.smith-wesson.com/ Vendor: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588 |
| MC_Rack Software | Multi Channel Systems, GmbH | MC_Rack | http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack |
| Labview Software | National Instruments, Austin, TX | LabVIEW | http://www.ni.com/labview/ |
| NIS-Elements: Basic Research Software | Nikon, Tokyo, Japan | NIS-Elements BR | https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research |
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