Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור חוקרים צורת בגירוי הכימית של wholemount חולדה הרשתיות במבחנה עם גלוטמט עצבי. בגירוי כימי הוא אלטרנטיבה מבטיחה בגירוי חשמלי המקובלת של הנוירונים ברשתית לטיפול עיוורון בלתי הפיך הנגרם על ידי מחלות ניווניות קולט אור.
Abstract
מחלות ניווניות קולט אור לגרום לעיוורון בלתי הפיך דרך אובדן הדרגתי של קולט אור תאים ברשתית. תותבות ברשתית הם טיפול המתעוררים עבור מחלות ניווניות קולט אור אשר מבקשים לשחזר את הראייה על ידי גירוי מלאכותי הנוירונים ברשתית ששרדו, בתקווה לקבל תפיסה ויזואלית מובנים בחולים. תותבות ברשתית הנוכחית הוכיחו הצלחה שיקום הראייה המוגבלת לחולים באמצעות מערך של אלקטרודות חשמלית לעורר הרשתית אך להתמודד עם מחסומים פיזיים ניכר שחזור חדות גבוהה, ראייה טבעית לחולים. בגירוי כימי באמצעות נוירוטרנסמיטורים מקורית גירוי אלטרנטיבה חשמל ביונים, נוכל לעקוף את המגבלות הבסיסיות הקשורות ברשתית תותבות שימוש בגירוי חשמלי. באופן ספציפי, בגירוי כימי יש פוטנציאל כדי לשחזר את חזון טבעי יותר עם acuities דומות או יותר של visual מטופלים בהזרקת כמויות קטנות מאוד של נוירוטרנסמיטרים, הסוכנים טבעי אותו לתקשורת המשמשת רשתית כימית synapses, ברזולוציה יותר עדינה יותר מאשר תותבות חשמל הנוכחי. עם זאת, כמו פרדיגמה גירוי נחקרו יחסית, אין שום פרוטוקול הוקמה להשגת גירוי כימי של ה רשתית במבחנה. מטרת עבודה זו היא לספק מסגרת מפורטת לביצוע גירוי כימי של הרשתית לחוקרים המבקשים ללמוד על פוטנציאל של neuromodulation כימי של הרשתית או דומה רקמות עצביות בתוך חוץ גופית. בעבודה זו, אנו מתארים את הגדרת הניסוי ואת מתודולוגיה העלאת גנגליון תא (מהרשות לשיקום האסיר) ספייק תגובות הדומה חזותית אור תגובות בפראי-סוג ומבוקר מנוון-קולט אור wholemount הרשתיות חולדה על ידי הזרקת כרכים של גלוטמט עצבי אל החלל subretinal באמצעות micropipettes זכוכית והתקן מותאם אישית microfluidic מרובה. מתודולוגיה זו ופרוטוקול הם כללי מספיק כדי להיות מותאם neuromodulation באמצעות עצביים אחרים או אפילו אחרים רקמות עצביות.
Introduction
מחלות ניווניות קולט אור, כגון רטיניטיס פיגמנטוזה, הקשורות לגיל ניוון מקולרי, מובילים גורם בירושה של אובדן ראייה, כיום חשוכת מרפא1,2. למרות מחלות אלו נובעים מגוון מוטציות גנטיות מסוימות, מחלות ניווניות קולט אור מאופיינים כקבוצה אובדן הדרגתי של תאי קולט אור ברשתית, הגורמת בסופו של דבר לעיוורון. האובדן של גורמים photoreceptors נפוצה שיפוץ לאורך הרשתית אבל לשרוד את הנוירונים ברשתית, כולל תאים דו-קוטביים, RGCs, נותרו ללא פגע ופונקציונליים יחסית אפילו בשלבים מתקדמים של קולט אור ניוון3 ,4,5,6,7.
מנגנונים של פתולוגיות המחלות האלה היה טוב מאופיין3,4,5,6,7 אך טיפול יעיל עודנו. בשלושת העשורים האחרונים, חוקרים ברחבי העולם יש חקר מגוון רחב של טיפולים רפואיים עבור שחזור חזון אלה מושפעים עם קולט אור מחלות ניווניות כולל טיפול גנטי8, טיפול בתאי גזע9, השתלת רשתית10ו-11,לגירוי מלאכותי12 של הנוירונים ברשתית ששרדו. אלה, זמינים ביותר קלינית הם פרותזה ברשתית, אשר הם התקנים מלאכותיים בגירוי באופן מסורתי נעזרו מערך אלקטרודות חשמלית לגרות את התאים הפרעה דו קוטבית או RGCs בתבניות ספציפיות עם המטרה של יצירת תפיסות חזותי מלאכותית לחולים11. פרותזה חשמל הדור הנוכחי, כגון ארגוס II13 ו אלפא-IMS14 מכשירים, השיגו אישור רפואי, מחקרים ראשוניים הראו כי הם יכולים לשפר את איכות החיים לחולים על-ידי שחזור מידת הראייה באמצעות על פני רישתית (קדמי של הרשתית) והן subretinal (מאחורי הרשתית) מושתלים מכשירי15,16. קבוצות מחקר ברחבי העולם פועלים לקידום תותבות ברשתית מעבר ההצלחות של אלה מכשירים דור ראשון17,18,19,20 אבל התמודדו קשיים בעיצוב של תותבת חשמלי מסוגל לשחזר גבוהה חדות הראייה מתחת לרמת עיוורון משפטי לחולים. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי השגת ברזולוציה מרחבית גבוהה יותר מאשר זה מופעל על ידי הדור הנוכחי תותבות מבוססות חשמל הוא מאתגר בגלל המגבלה הזרקת תשלום, אשר מחייבת את השימוש אלקטרודות גדול לעורר בבטחה הנוירונים ברשתית במחיר של רזולוציה מרחבית, קרי ראייה11,21. יתר על כן, גירוי חשמלי הוא יותר מוגבל כי היא בדרך כלל מעוררת את כל התאים הסמוכים, ולכן מעורר תפיסות לא טבעי ומבלבל בחולים, בעיקר בגלל שזה הפרדיגמה21גירוי טבעי מטבעו. ובכל זאת, ההצלחות מוקדם של גירוי חשמלי הדגימו שבגירוי המלאכותי הזה יכול להיות טיפול יעיל עבור מחלות ניווניות קולט אור. זה מוביל אחד משערים כי טיפול יעיל עוד יותר יהיה בר השגה על ידי גירוי הרשתית עם עצבי כימיקלים, הסוכנים הטבעי של הסנסור הסינפסות כימי. מטרת השיטה המובאת בעיתון הזה היא לבחון את הכדאיות טיפולית של גירוי כימי, אשר מבקש לחקות את המערכת הטבעית של סינפטית תקשורת בין הנוירונים ברשתית, כמו גירוי אלטרנטיבה חשמל ביונים עבור תותבת ברשתית.
תרגום של המושג טיפולית גירוי כימי תותבת ברשתית כימי מסתמך על כימית הפעלת המטרה הנוירונים ברשתית עם כמויות קטנות של נוירוטרנסמיטרים מקורי, כגון גלוטמט, באמצעות microfluidic התקן הכוללת מגוון רחב של microports בתגובה גירוי חזותי. בדרך זו, תותבת ברשתית כימי יהיה בעצם שכבה קולט אור מלאכותי ביונים המתרגמת פוטונים באופן טבעי להגיע הרשתית לאותות כימיים. מאז אותות כימיים אלה להשתמש את אותם מעבירים עצביים מנוצל איתות ברשתית נורמלי ולעורר את הנוירונים ברשתית ששרד הרשתית מנוונת דרך מסלולים סינפטית אותו בשימוש על ידי חזון נורמלי מסלולים, הדימוי שנוצר התפיסה מושגת באמצעות תותבת ברשתית כימי יכול להיות מובנת וטבעית יותר בהשוואה אחד ברמיזות על הפרוטזה חשמל. יתר על כן, מאז microports שדרכו משתחררות נוירוטרנסמיטורים יכולים להתבצע מאוד קטנים, ערוכים בצפיפות גבוהה, בניגוד האלקטרודות, חומר כימי פוטנציאלי תותב עשוי להיות מסוגל להשיג הרבה יותר. גירוי מוקד ומעלה מרחבית רזולוציה יותר תותבת חשמל. לפיכך, בהתבסס על יתרונות פוטנציאליים אלה, תותבת ברשתית כימי מציע אלטרנטיבה תותבות חשמל מאוד מבטיח.
גירוי כימי של הרשתית, עם זאת, יש יחסית מעט נחקרו עד לאחרונה. בזמן גירוי חשמלי של הרשתית מאפיין טוב במשך עשרות שנים של עבודה דרך חוץ גופית ב22,23 ויוו23,24, מחקרים קליניים13 ,14, מחקרים על גירוי כימי היה מוגבל אך ורק כמה במבחנה עבודות25,26,27,28. Iezzi ו- Finlayson26 ואברהם זילברשלג. et al. 27 הפגינו על פני רישתית גירוי כימי של ה רשתית במבחנה באמצעות אלקטרודה אחת של מערך multielectrode (מאה), בהתאמה, כדי להקליט את התגובות גלוטמט עורר של הנוירונים ברשתית. לאחרונה, Rountree. et al. 28 הפגינו גירוי דיפרנציאלית של המסלולים ברשתית לסירוגין באמצעות גלוטמט מן הצד subretinal MEA להקליט את התגובות עצביים מאתרים מרובים על הרשתית.למרות עבודות אלו preliminarily הקימו את הכדאיות של גירוי כימי, יותר מחקרים הם חיוניים כדי לחקור רבים מההיבטים של גישה זו מעבר לאלה התייחס כה26,25,27 , 28, והגדר את הפרמטרים גירוי טיפולית במודלים של בעלי חיים גם במבחנה וגם ויוו לפני לתרגם את המושג הזה כדי תותבת ברשתית כימי כמתואר לעיל. עם זאת, כיום יש אין מתודולוגיה הוקמה לביצוע גירוי כימי של הרשתית בספרות, האמצעים שננקטו בעבודות קודמות לא תוארו בפירוט כזה יהיה חיוני ללימודים replicative. לכן, הרציונל שבבסיס מאמר שיטות היא לספק מסגרת מוגדרים היטב עבור ניצוח במבחנה גירוי כימי של הרשתית לחוקרים הללו מעוניינים או שכפול שלנו הקודם מחקרים27, 28 או נוסף לקידום רעיון nascent בגירוי כימי.
כאן נדגים שיטה עבור ניצוח במבחנה גירוי כימי של הנוירונים ברשתית ב wholemount הרשתיות של חולדות פראי-סוג ודגם קולט אור עכברוש מנוונת כי מקרוב מחקה את ההתקדמות של קולט אור ניוונית מחלות בבני אדם. הרציונל מאחורי פיתוח שיטה זו גירוי במודלים במבחנה הוא להעריך את הטווחים טיפולית של פרמטרים גירוי שונים וללמוד מאפייני תגובה עצבית, זה יהיה בלתי אפשרי או קשה להתבונן ב- ב ויוו מודלים, במיוחד במהלך הלימודים הראשוני התמקדו להערכת הכדאיות של גישה זו. בהליך זה, אנו מראים גם יחיד-אתרים וגם בו זמנית אתר רב stimulations כימית של הרשתית על-ידי אספקת כמויות קטנות של 1 מ מ גלוטמט ליד היעד הנוירונים ברשתית דרך זכוכית אחת זמינים מסחרית micropipettes מותאמת אישית ההתקן microfluidic מרובת יציאות micromachined, בהתאמה. בעוד stimulations יחיד-אתרים וגם אתר רב להשיג את המטרה הבסיסית של חוקרים את הכדאיות טיפולית של neuromodulation כימי, אחד משרת מטרה ברורה עם יתרון ייחודי. גירוי בודד-אתרים, אשר יכול להתבצע עם זכוכית מראש משך זמינים מסחרית micropipettes, יכול לשמש כדי להזריק חומרים כימיים ישירות לתוך מהסבא של הרשתית באתר אחד ומגישה כדי לחקור אם מהרשות לשיקום האסיר הנצפה ספייק קצב תגובות דומות מבחינה ויזואלית עורר תגובות האור יכול להיות elicited focally תחת ההזרקה. מצד שני, ריבוי האתר גירוי, הדורש מכשיר מיוחד מפוברק microfluidic מרובה, יכול לשמש כדי להזריק חומרים כימיים במרחב באתרים מרובים על-פני הרשתית ומגישה לחקור כיצד גם עורר גלוטמט קבוצת ריינהולד כהן דפוסי תגובה תואמות התבניות להזרקת גלוטמט במחקרים גירוי דפוס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות המפורטות על ידי המדריך של המועצה הלאומית למחקר על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה. פרוטוקולי טיפול והמתת חסד בבעלי חיים היו נבדקו ואושר על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת אילינוי בשיקגו.
1. מודלים
- פראי-סוג רב-אוונס חולדות
- להשיג בת 24-32 יום פראי-סוג אוונס ארוך אפור עכבר של מין או הרים עם קצב יום/לילה סטנדרטי 12 שעות.
- כהה להתאים את החולדה על-ידי הצבתו בחדר חשוך לחלוטין עבור h 1 לפני תחילת הניסוי.
- S334ter-3 עכברים
- לחצות לבקן הטרנסגניים homozygous S334ter-3 החולדות (גם סקס), המבטאים את שני עותקים של הגן המוטנטי אופסין # רודופסין, עם עכברוש לונג-אוונס פראי-סוג פיגמנט לייצר פיגמנט חולדות S334ter-3 משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים כי התערוכה ניוון קולט אור דומה בהתקדמות האנושית רטיניטיס פיגמנטוזה29,30.
- לגדל צאצא משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים עם תקן 12 שעות יום/לילה קצב ולהשתמש חולדות של מין או לניסויים של הדורות הבאים המתאימים בשלבים הבאים של ניוון קולט אור: ניוון בשלב מוקדם: 14-20 ימים הישן; המזרח התיכון ניוון הבמה: 21-27 ימים הישן; ניוון בשלב מאוחר: בת; 28-35 ימים עיוור לחלוטין: > בן 50 ימים.
- כהה להתאים את החולדה על-ידי הצבתו בחדר חשוך לחלוטין עבור h 1 לפני תחילת הניסוי.
2. הכנת פתרון בינוני של איימס ומערכת זלוף
איור 1: סכימטי של הגדרת הניסוי. מפרטים טכניים של ההתקנה ניסיוני לגירוי כימי באמצעות micropipette של זכוכית (א) והתקן מותאם אישית microfluidic מרובה (B). הרשתית היא מונחת על pMEA, perfused ללא הרף עם טרי, מחומצן איימס בינוני פתרון הן מהחלק העליון והתחתון דרך החורים pMEA. אותות עצביים התגובה נאספות על ידי האלקטרודות של pMEA מוזנים דרך המגבר MEA למחשב רכישת נתונים. גירוי ויזואלי וכימיים מוכשרות באמצעות נורית LED ירוקה של מזרק לחץ 8 ערוצים, בהתאמה, שני גירויים מופעלות על ידי מחשב גירוי ייעודי, אשר משמש גם כדי למקם את פיפטה באמצעות 3-ציר דיוק micromanipulator. מיקרוסקופ הפוכה משמשת להתבוננות ברשתית במהלך ניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: הגדרת הניסוי. (א) תצלום של השלמת ההתקנה ניסיוני מראה היחסיים של כל הרכיבים. מערכת מגבר MEA מונחת על גבי מיקרוסקופ הפוכה, אשר משמש באופן חזותי הרשתית ולהתאמה דיגיטלית תמונה בממשק המכשיר-רשתית באמצעות המצלמה במהירות גבוהה צמוד במהלך הניסוי. זלוף העליון והתחתון נשלטים באופן עצמאי באמצעות מערכת זלוף שבשליטת ברז חשמלי. הזרקת עמדת שליטה, מדידות עכבה מוכשרות באמצעות מזרק לחץ, micromanipulator, תיקון קלאמפ מגבר (כתום תיבת; המוצגות באופן מפורט יותר B), בהתאמה. Micropipette או ההתקן מוכנס לתוך headstage מלחציים תיקון עבור מדידות עכבה ואת רכוב על גנטרי (שצוין על-ידי תיבת ירוק; מוצג בפירוט רב יותר בשפת C) כדי להקל על מיקום תוך שימוש של micromanipulator. (B) תקריב של מכשירי מדידה ובקרה המשמשים את הניסוי: מזרק של ערוץ 8 לחץ, מערכת בקרה micromanipulator, תיקון מגבר קלאמפ למדידה עכבה, כלי היניקה לחיסול זלוף. (ג) תקריב של מערכת הזרקת gantry מציג מכשיר רב-יציאות לממשק עם מחזיק פיפטה, תיקון קלאמפ headstage, micromanipulator. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: הגדרת זלוף. (א) תצלום של החלק העליון של המגבר MEA המציג את המיקום של זלוף העליון את, שאיבה, כמו גם ה-LED ירוק המשמש לצורך גירוי חזותי אור. (B) מקרוב לשכת זלוף pMEA הממחישות את מיקומי המדויק של זלוף העליון, שאיבה, pMEA את האלקטרודה הפניה המשמש למדידה עכבה. (ג) photomicrograph של צלחת זלוף התחתון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
הערה: ראה איור 1, איור 2ו- 3 איור
- למדוד את 900 מ ל מים מיוננים בטמפרטורת החדר (~ 21 ° C) ומניחים בתוך מיכל 1 ליטר.
- Perfuse את המים עם 100% CO2 באמצעות מנגנון מבעבע.
- הוסף 8.8 גר' בינוני אבקת איימס למים במיכל 1 ליטר.
- שוטפים מיכל של איימס בינוני עם כמה מיליליטר מים מיוננים כדי להסיר כל עקבות של אבקת איימס בינוני ולהוסיף מיכל 1 ליטר.
- להוסיף 25.3 מיליליטר הפתרון סודיום ביקרבונט (w/v של 7.5%31) מיכל 1 ליטר.
- להוסיף מים נוספים כדי להביא את הפתרון הסופי נפח של 1 ל'
- המשך פרפוזיה המים עם CO2 כ 5 דקות.
- תפסיק CO2 זלוף ולהתחיל פרפוזיה פתרון עם תערובת דלק באיכות רפואית של 95% O2 ו- 5% CO2 במשך לפחות 30 דקות, או עד ה-pH מייצבת ב 7.4.
הערה: לצורך של פרוטוקול זה, המדיום איימס נשמרת בטמפרטורת החדר (~ 21 ° C) לאורך כל הניסוי כדי למנוע CO2 או O2 outgassing, אשר ניתן occlude את הקווים זלוף עם בועות אוויר. - לנקות את הצינורות זלוף תחתון ועליון על ידי מילוי עם אתנול 70% ולאחר מכן לשטוף שני קווי 3 פעמים עם מים מיוננים. למלא את השורה התחתונה עם הקו העליון עם אוויר ומים מיונן.
3. Wholemount רשתית הכנה
איור 4: הכנת רשתית ניתוח ו- wholemount. (א) תצלום של עיינית שלמים שנלקחו חיה מנוון-קולט אור. Photomicrograph (B) של הרשתית עם חתכים אורכיים כדי לרדד אותו. (ג) לאחר שיטוח הרשתית, זה מושם על גבי רשת רשת עם הצד קולט אור פנייה אל רשת השינוי, משוטחים באוויר (מחוץ זלוף בינוני) כדי להבטיח שם בלי קיפולים או קצוות מסולסל. (ד) רשת השינוי, רשתית העין במהירות להעביר את pMEA עם הצד תא גנגליון פנייה אל האלקטרודות, מיד perfused בינונית איימס מחומצן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: מחורר מערך multielectrode. (א) תצלום של המערך multielectrode מחורר בשימוש בפרוטוקול. הרשתית מושם על המערך אלקטרודה (שצוין על-ידי המלבן האדום, אשר מוצג בפירוט רב יותר ב') בתוך תא pMEA כדי לאפשר זלוף מתמיד בינונית איימס מחומצן. (B) photomicrograph של המערך אלקטרודה עצמה הממחישות את הסידור של נקבים בין האלקטרודות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
הערה: ראה איור 4 , איור 5
- באמצעות פנס LED אדום כף יד כדי לספק תאורה אדומה עמומה, המתת חסד חיה באמצעות פחמן דו-חמצני חנק ואחריו נקע בצוואר הרחם או בשיטה אחרת, על פי פרוטוקולים IACUC.
- Enucleate בשתי העיניים באמצעות המלקחיים #5 של צורף ולמקם עיניים enucleated בצלחת פטרי בקוטר 60 מ מ עם 3-4 מ"ל של טרי, מחומצן איימס בינוני פתרון.
- תוך התבוננות העין דרך stereomicroscope חיתוך עם העליון והתחתון illuminators כיסתה עם מסך מסנן אדום, עושים חתך קטן בפנים הקרנית בעזרת איזמל או זוג מספריים חדים.
- לחתוך מ חתך קטן כזה לקצה של הקרנית ואז להרחיב את החתך בקטע במבניו סביב קצה שלם של הקרנית. הסר את הקרנית עכשיו מנותקת יחד עם העדשה, ליחות מימית, בזגוגית שקוף.
- תוך החזקת בעדינות עיינית עם זוג מלקחיים, להפוך בזהירות שני חתכים קטנים משני צידי המתרס של עיינית. בשלב הבא, השתמש שני זוגות של מלקחיים כדי להפריד את עיינית בכל החתכים ובעדינות להפריד בין הרשתית לבין sclera. לאט הרימו הרשתית כולו בסקלרה, עיינית. חותכים את עצב הראייה, אם הוא עדיין מחובר.
- קיצוצים האורך ברשתית לקבל חצי או רבע למקטעים באמצעות מספריים, ופרש לאחר מכן בעדינות מקטע הרשתית אחד על גבי רשת ניילון (100 מיקרומטר חוט קוטר עם 350 מיקרומטר פתיחה) עם מול (קעורה בצד של הרשתית) תאי גנגליון מן הרשת.
- מניחים את רשת השינוי ואת הרשתית על מערך multielectrode מחורר (pMEA) עם תאי גנגליון במגע עם המשטח pMEA. ואז בעדינות להציב רשת משוקלל פרוסה על גבי רשת השינוי להחזיק הרשתית במקום.
4. MEA וההתקנה רכישת נתונים
איור 6: רעש רמות של pMEA. (א) הקלטה נציג של קבוצת משנה של אלקטרודות pMEA מפגין רעש גבוהה מתמיד. הרעש הזה הוא בדרך כלל בשל חוסר קשר תקין בין הידיות קשר pMEA את הסיכות של המגבר MEA כתוצאה ללבוש נורמלי של השכבה פוליאימיד מחורר דק מעל pMEA, במיוחד בזמן רפידות קשר. מקור אפשרי אחר של רעש הוא בדרך כלל פתרון הדליף על הידיות קשר של מגבר pMEA. רעש מתמשך עקב סיכה המסכן לפנות ו/או דלף פתרון על הקשר ניתן לתקן רפידות בדרך כלל על ידי העברת המיקום של pMEA בתוך המגבר להשיג קשר טוב יותר, ניקוי וייבוש של רפידות, בהתאמה. אם הרעש לא יכול לסלק על-ידי ניקוי או ומזיזה את המיקום pMEA, pMEA ייתכן שתצטרך להיות מוחלף לחלוטין. (B) הקלטה נציג של רמות רעש של תת-קבוצה של אלקטרודות pMEA מ pMEA נקי עם קשר טוב בין pMEA לבין מגבר. בדרך כלל, רמת הרעש הממוצע הוא ±16 µV. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
הערה: ראה איור 6
- בתאורה אדומה עמומה, למקם את pMEA לי מגבר וסגור מגבר בריחים.
- אם סימוני הפניה אינם קיימים על הטבעת תא pMEA כבר, לחרוט שני 'X'-סימני בצורת במרווחים כ 5 מ מ אחד מהשני באזור גלויים בקלות מלמעלה עם המיקרוסקופ הנטען בום-לעמוד.
- מיקום בשקע זלוף העליון בתוך תא pMEA, לפתוח את הברז זלוף העליון כדי להשיג שיעור זלוף של 3 מ ל לדקה. מקם לים היניקה העליון ברמת perfusate הרצוי (~ 5 מ מ עמוקה) וודא שזה עובד.
- לפתוח את התוכנה רכישת נתונים במחשב רכישת נתונים ולחץ על לחצן 'הפעל' כדי להתחיל לקבל נתונים. להבטיח כי כל הערוצים pMEA ללא רעש, הקלטה אותות עצביים.
- לפי תמונה דיגיטלית בשידור חי של הפוך מיקרוסקופ שדה הראייה על צג, להתבונן מהמשטח התחתון של pMEA ראיות כי הפתרון הוא זורם דרך צלחת זלוף התחתון.
5. גלוטמט גירוי הכנה
איור 7: זכוכית micropipette והתקן מרובה microfluidic. (א) בעל פיפטה לפני הכנסת של micropipette או התקן. האלקטרודה כסף/כסף כלוריד (קוטר 50 מיקרומטר) חשמלית רתומה למתאם בקצה ממשק עם headstage מהדק תיקון (B) תמונה של micropipette זכוכית לממשק עם המחזיק פיפטה המציג את המיקום של הנמל לחץ להשתמש כדי ליזום זריקות פנאומטיים. (ג) התקן מותאם אישית microfluidic מרובה (1 ס מ 1 ס מ ס מ 0.134) מחובר אביזר מותאם אישית מודפס 3D ו לממשק עם המחזיק פיפטה דרך צינור פלדה אל חלד. ההתקן, אשר היה מפוברק בשתי שכבות, יש שמונה microports (קוטר 14 מיקרומטר) השכבה התחתונה (340 מיקרומטר עבה), שמונה מאגרים על שבב (בקוטר 1.6 מ מ) לאחסון גלוטמט בשכבה העליונה (בעובי 1 מ"מ). כל אחד microports שמונה בשכבה התחתונה של המכשיר מחובר באופן עצמאי המאגר על שבב בשכבה העליונה דרך microchannel בתוך המטוס ולאחר כל המאגר על שבב בתורו מחובר ליציאת הלחץ של מזרק ערוץ 8 לחץ דרך צינור גמיש כדי לאפשר הופעה עצמאית של microports לזריקות בדוגמת ריבוי האתרים. (ד) תקריב של המכשיר מרובה מוחזק על ידי פינצטה לפני שתצרף הנורה ממשק אבובים מציג את הסידור של שמונה מאגרים על שבב למיעון באופן עצמאי, אבובים אינלטס. (ה) photomicrograph של המשטח התחתון של המכשיר מציג את microports 14 8 מיקרומטר קוטר המסודרים בתצורת 3 x 3 עם מרווח מיקרומטר 200 כדי להתיישר עם האלקטרודות של pMEA. השמונה מחוץ microports מנוצלים לזריקות ריבוי האתרים, ואילו הנמל המרכזי שימש אך ורק עבור יישור במהלך ייצור של המכשיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
הערה: ראה איור 7.
- הכן גלוטמט פתרון על ידי ערבוב עם. החומר חמצן גלוטמט מניות איימס פתרון בינוני כדי להשיג דגימה 0.5 mL-ריכוז העבודה של 1 מ מ גלוטמט.
- להוסיף בזהירות micropipette מראש משך 10 מיקרומטר בקוטר של או פלדת אל-חלד המוט מחובר למכשיר microfluidic מרובה לתוך בעל פיפטה רגיל המכיל אלקטרודות 50 מיקרומטר בקוטר של כסף/כסף כלוריד.
הערה: אם זיהוי עכבה אינה זמינה, האלקטרודה חוטי כסף/כסף כלוריד יכול להיות מושמט. - ממשק המחזיק פיפטה עם headstage תיקון-קלאמפ, להתחבר לחץ היציאה סכינים סטריליים החיבור של בעל פיפטה על ערוץ 1 של מערכת הזרקה בלחץ, אם ניצול של micropipette זכוכית, או להתחבר החיבורים סכינים סטריליים לחץ היציאה של כל אחד הזרקת 8 היציאות עם ערוצים 1-8 של מערכת הזרקה בלחץ, אם משתמש בהתקן מרובה.
- באופן ידני להפעיל מערכת הזרקה בלחץ ולהפוך על ערוץ 1 (או ערוצים 1-8, לפי הצורך). ודא כי המערכת פרקו לאווירה, הגדר את הלחץ הזרקת 0.1 psi.
- הפעל micromanipulator ולאחר לכייל אותו על ידי לחיצה על לחצן 'כיול' בבקר מניפולטור. מקם את micromanipulator כך הקצה micropipette (או החלק התחתון של המכשיר, לפי הצורך) הוא כ- 30 מ מ מעל המגבר MEA.
- למלא צלחת פטרי קטן עם פתרון גלוטמט (1 מ מ גלוטמט במדיום איימס סטנדרטי) ולמקם אותו מתחת micromanipulator. להוריד micropipette עצה (או המכשיר) לתוך פתרון למילוי על-ידי לחיצה על הלחצן 'מילוי' על מערכת הזרקה בלחץ (לחץ היניקה של-13 H2O) עד כ 20 מ מ של פתרון גלוי micropipette זכוכית או התקן מרובה אבובים.
- אם משתמש המכשיר רב-יציאות, להפעיל ערוץ 1 של מזרק לחץ ביטול וחזור הפרוטוקול עבור ערוצים 2-8. להרים את micropipette עצה או התקן מתוך פתרון, להסיר את צלחת פטרי, ומקמו את micromanipulator מעל תא pMEA.
- באמצעות stereomicroscope בום-דוכן-רכוב, ליישר את קצה micropipette או בפינות של המכשיר עם סימוני ההפניה חרוט הטבעת תא pMEA. לאחסן את העמדות מניפולטור לתוך התוכנה שליטה באמצעות הלחצנים 'חנות הפניית A' ו- 'חנות הפניה B' (או פשוט הערה הקואורדינטות מניפולטור ידנית) כדי למפות את מערכת קואורדינטות של manipulator עם האלקטרודות pMEA.
- באמצעות תוכנת שליטה מניפולטור, בחר אלקטרודה pMEA של היעד עם פעילות ספונטנית חזקים ולחץ על הלחצן 'העבר ערוץ' כדי ליישר את micropipettewith זכוכית האלקטרודה היעד.
6. ממשק עם הרשתית
- אם מדידות עכבה זמין, הפעל תיקון קלאמפ מגבר וליזום את תוכנת ויזואליזציה עכבה על-ידי לחיצה על לחצן 'התחל' כדי להמחיש את אימפדנס של האלקטרודה כסף/כסף כלוריד בתוך המחזיק פיפטה. תוך כדי התבוננות הסימנים עכבה בזמן אמת, הורידו לאט את micropipette או את המכשיר עד זה יוצר קשר על פני הרשתית כמצוין על-ידי עלייה מהירה עכבה האות (ראה איור 8). לשמור או רשום של העמדה של פני השטח ברשתית.
- אם מדידות עכבה אינה זמינה, לזהות מגע עם משטח הרשתית דרך התצפית הויזואלית, אבל זה יהיה פחות מדויק. להנמיך את פיפטה או התקן עד זה קשר בעליל המשטח העליון של הפתרון בינוני איימס בבית הבליעה MEA.
- לאחר מכן, תוך התבוננות על החלק העליון של הרשתית עם מיקרוסקופ הפוכה, הורידו לאט את פיפטה או התקן עד המשטח העליון של הרשתית בעליל תסולף, אשר מציין כי הקשר הפך עם משטח הרשתית. לשמור או רשום של העמדה של פני השטח ברשתית.
- לגירוי מהסבא, הנמך את פיפטה נוספים 40 µm (עבור הרשתיות S334ter-3) או 70 מיקרומטר (עבור הרשתיות פראי-סוג).
- לבצע כמה זריקות זמן קצר (10-30 ms) באמצעות מערכת הזרקה (0.1 psi) לחץ כדי לקבוע אם התאים ליד הקצה micropipette או התקן microports פתוחים גלוטמט גירוי על ידי התבוננות את האותות העצביים עם רכישת נתונים תוכנה.
הערה: זריקות מוצלח להפיק את ספייק בבירור קצב פרץ או ספייק עיכוב (ראה איור 9). אם אין תגובה נצפית, למקם מחדש את micropipette או את ההתקן ב אלקטרודה שונים.
איור 8: מדידות עכבה. (א) סכימטי של הטכניקה מדידות עכבה. באמצעות המגבר מלחציים תיקון, עכבה של micropipette ברציפות להשגחה כפי היא לאט לאט יורדת לכיוון פני השטח ברשתית. כאשר micropipette מעל הרשתית, מוליכות יונית גבוה יחסית בינוני איימס תוצאות קריאה עכבה נמוכה. Micropipette עושה קשר עם פני השטח ברשתית, מוליכות יונית דרך הכבל כסף/כסף כלוריד מופחת, גורמת לעלייה מהירה עכבה נמדד. (B) מגרש הצגת השינוי עכבה הקליט רק לפני ואחרי הקשר של קצה פיפטה עם משטח הרשתית. עכבה נמדד הוא נמוך יחסית כאשר הקצה micropipette הוא פתרון בדיוק לפני מגע (שצוין על-ידי האזור הכתום בצד השמאל). כאשר הקשר הוא עשה (שצוין על-ידי החץ האדום והסביבה הירוקה בצד ימין), עכבה מגדיל במהירות בשל מוליכות יונית מופחתת לאחר יצירת קשר עם רקמת רשתית. בפועל, פני הרשתית רשומה את הגובה המתאים תחילתה של העלייה תלולה של עכבה נמדד (המיקום ראש החץ האדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 9: אלקטרודה הקלטות של פעילות עצבית במהלך חזותית, ספונטנית, והקלטות הזרקת גלוטמט. הקלטות נציג (א) 9 אלקטרודות pMEA מציג הרכבת לסנן נתונים אלקטרודה במהלך גירוי חזותי אור עם נורית LED ירוקה שבו כל מלבן מראה הנתונים עצבית אלקטרודה ייחודי. כל הקלטה אלקטרודה ממחישה את הנתונים שנאספו בפעם הראשונה או השנייה לאחר הפעלת הנורה הירוקה (תזמון מוצג עם ראשי חץ כתום בכל מגרש) עם קנה מידה מתח נפוצה שמוצג את y-axes השמאלי. קוצים זוהו באמצעות מתח הסף של µV: תרכיזי (אופקי הקו האדום בכל מגרש אלקטרודה), מיוצגים על-ידי עקבות שחור בנתונים של אלקטרודה ירוק. גירוי חזותי גרם פרץ של קוצים (עירור) כל אלקטרודות מלבד מרכז בראש אחד, ייחסו מענה מעכבות אור. (B) מגרש דומה עבור האלקטרודות באותו מראה פעילות עצבית ספונטנית ללא גירוי חזותי או הזרקה. למרות צרורות קטנים היו נוכחים, הדפוסים של קוצים היו שונות מאלה שנרשם בתגובה גירוי חזותי. (ג) הקלטות נציג המשנה זהה של אלקטרודות הקליט מיד לאחר זריקה גלוטמט על האלקטרודה המרכזית (בתזמון המצוין על-ידי ראשי חץ כתום בכל מגרש). גלוטמט מוזרק elicited פרץ של קוצים בתוך האלקטרודה מרכזי זה היה דומה מאוד התפרצויות ספייק עורר חזותית. כל כימיקלים אחרים לא הושפעו על ידי הזרקת גלוטמט, אשר מדגים את הרזולוציה המרחבית בסדר של הטכניקה גירוי כימי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
7. ליזום ברשתית הקלטה של תוכנית הגירוי
- אוריינט הנורית הירוקה לעבר המשטח העליון של הרשתית. . מתחיל להקליט באמצעות התוכנה רכישת נתונים במחשב ייעודי הקלטה על-ידי הקלדת שם הקובץ ולחיצה על הכפתור "שיא"
- לאחר ההקלטה החלה, פתח את התוכנית שליטה גירוי וטענו את קובץ גירוי ברירת המחדל על-ידי לחיצה על לחצן "גירוי ' קריאת קובץ. בשלב הבא, לחץ על לחצן "הפעל קובץ גירוי" ליזום קובץ גירוי המהווה ברירת מחדל המורכב של פרוטוקול רכישה גירויים ונתונים שתואר בהערה שלהלן.
הערה: (i) 30 ניסויים של 2 s ON ופלאש 2 s פעיל מלא (בעוצמה2 lm/ז 5) באמצעות ה-LED ירוק. (ii) 120 s של נתונים ללא שימוש הנורית הירוקה כדי להקליט את פעילות ספונטנית של הרשתית על פני ציר זמן דומה. (iii) 1 או יותר קבוצות של זריקות גלוטמט בהיקף של 30 ניסויים של גלוטמט זריקות-0.1 psi עם הזרקת ms 10-30 פעמים (כ 100-300 pL לכל זריקה) ומשכי 3 s interpulse. במקרה של זריקות אתרים מרובים, בחר יציאות 2 או יותר להחדיר בו זמנית.
איור 10: Peristimulus היסטוגרמות חזותית, ספונטנית, ומענים גלוטמט. (א) היסטוגרמות נציג peristimulus (30 ms binwidth) של ספייק הנתונים קבוצת המשנה של אלקטרודות ב איור 9A, בממוצע על פני 20 ניסויים של גירוי אור חזותי. מידה משותף של קצב ספייק היה מוחל על כל אלקטרודות, מוצג בצד y-axes השמאלי. הקו השחור בכל מגרש אלקטרודה מייצג את קצב ספייק הממוצע עבור כל קוצים הקליט במהלך בפעם הראשונה או השנייה לאחר הפעלת הנורה הירוקה. כפי שניתן לראות, גירוי חזותי גרם לתגובה קצב ספייק מעוררות חולף-אלקטרודות כל פרט האלקטרודה העליון המרכזי, אשר היה בתגובה מעכבות ארעי אור. (ב') התגובות קצב ממוצע ספייק ספונטנית להקליט האלקטרודות אותו ללא כל גירוי חזותי או כימי. ללא גירוי, ספייק במחירים כל אלקטרודה הם קבועים יחסית. (ג) ספייק ממוצע שיעור התגובות להקליט האלקטרודות באותו בתגובה זריקה גלוטמט במיקום מעל האלקטרודה המרכזית. התגובה רק ארעי ניכר הוא התגובות סינאפסות האלקטרודה ישירות מתחת ההזרקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לעורר כימי הן הרשתיות נורמלי, פראי-סוג, כמו גם קולט אור מנוון באדמומיות, למרות משמעותי הסלולר שיפוץ הנגרמת על ידי אובדן photoreceptors. לפני תחילת הניסויים עם קולט אור או מנוון או פראי-סוג באדמומיות, הקלטה של גירוי ציוד (איור 1 ו- 2 איור) בצורך להיות הרב-שימושי, את pMEA (איור 5) שצריך לנקות כדי למזער רעש על כל ערוץ אלקטרודה (איור 6). למרות קולט אור מנוון הרשתיות הן רזה ולכן עדין יותר מאשר הרשתיות פראי-סוג, ההליך לנתיחה (איור 4) משמש עבור שניהם. דיסקציה הבאים, הרשתית בקפידה מושם על גבי את pMEA עם תא גנגליון בצד הפונה האלקטרודות, את pMEA מאובטח בתוך המגבר MEA (איור 3 א), איפה זה יכול להיות ללא הרף perfused טריים, מחומצן בינונית-איימס מ העליון (איור 3B) והן הצדדים התחתון (איור 3C). לאחר הבטחת שהרשתית התייצב מטראומה כירורגי, זכוכית micropipette או התקן מרובה יציאות מצויד לתוך בעל פיפטה (איור 7 א-י) ואת לממשק עם headstage תיקון-קלאמפ עמדה אשר נשלטת על ידי 3-ציר דיוק micromanipulator. Microport(s) של פיפטה או התקן להיות ואז מיושר עם אלקטרודה היעד ' ואת ' בזהירות הורדה עד מגע ניתן להבחין באמצעות השיטה עכבה שמוצג באיור 8 או אישר באופן חזותי באמצעות מיקרוסקופ. לאחר הזרקת מסירה ביציאות בהן ממוקם במיקום הנכון משטח או מהסבא של הרשתית, יכול להיות יזם התוכנית גירוי.
ערכה הנציג של פעילות עצבית הקלטות משנה של האלקטרודות pMEA מוצג באיור 9 חזותי (איור 9 א), ספונטנית (איור 9B) של גירויים exogenously מוזרק גלוטמט (איור 9C). Stimulations חזותית וכימיים מוצלחת בדרך כלל נצפות התפרצויות של קוצים מהרשות לשיקום האסיר או הפסקת זמנית spiking פעילות, כפי שניתן לראות בדוגמאות באיור9. אם התאים הסמוכים להגיב לגירוי כימי, הנתונים המתקבלים ספייק ייראה דומה להתנהגות spiking ספונטנית. לאחר חילוץ קוצים מהרשות לשיקום האסיר, ארגונם ניסויים, התגובות עצבית על כל אלקטרודה ניתן לתיאור באמצעות היסטוגרמה הזמן הממוצע peristimulus (PSTH) של קצב spiking, כמו אלה המוצגים איור 10, אשר תואמות את החומר גלם אלקטרודה נתונים באיור9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המוצגת כאן מדגים פרדיגמה גירוי עצבי ייחודי, שבו הנוירונים ברשתית הם גירוי כימי על ידי הזרקת כימיקלים עצבי יליד לתוך מהסבא של הרשתית חוץ גופית בתוך. טכניקה זו גירוי כימי מציעה מספר יתרונות הטכניקה המקובלת גירוי חשמלי, כולל סלקטיביות וספציפיות מוקד גבוהה של נוירונים היעד. בפרוטוקול לעיל פרטים כמה קטן נפח זריקות פנאומטיים של גלוטמט עצבי נמסרות ליד הנוירונים ברשתית היעד באמצעות micropipette זכוכית עם יציאה אחת או מכשיר microfluidic מרובה micromachined מותאם אישית להפיק תגובות פיזיולוגית משמעותית מהרשות לשיקום האסיר. למרות פרוטוקול זה הוכח עם רק גלוטמט, הפרוטוקול נשאר שימושי עבור הלומדים גירוי כימי של הרשתית עם סוגים אחרים של נוירוטרנסמיטורים. יתר על כן, אמנם זה עדיף להשתמש pMEA עבור הקלטה אלקטרופיזיולוגיות32 כפי שמתואר בספר פרוטוקול זה, עיצובים MEA אחרים, כולל הסוג שאינו מחורר, יכול לשמש כדי להשיג תוצאות דומות pMEA. בפיסקאות הבאות, נדון השלבים הקריטיים ביותר של הפרוטוקול שלנו שיטות לפתרון בעיות נפוצות, ומגבלות ויישומים עתידיים של טכניקה זו גירוי.
כדי לקבל גירוי כימי בטוחה ואמינה, מספר שלבים קריטיים חייב להתבצע ב פרוטוקול זה. אחד הצעדים הקריטיים הוא קבלת הכנה ברשתית מוצלחת חילוץ הרשתית ובזהירות למזער את כמות הזמן שנשמר מחוץ מחומצן איימס בינוני, דהיינובשעת שיטוח הרשתית טרי ביתור ברשת רשת לפני העברת אותו על גבי pMEA perfused איימס בינונית. ניתוח ראשוני של הרשתית דורש ניתוח חד כלים ותרגול מאז העין עכברוש הוא קטן יחסית. יתר על כן, מיצוי של קולט אור מנוון הרשתיות יכול להיות קשה במיוחד, שכן הם שבירות יותר retinae נורמלי הכבר, ולכן הם נוטים קורע. תהליך ניתוח כולו, מן העקירה הראשונית כדי הצבת הרשתית pMEA, צריך להתבצע במהירות האפשרית למנוע מוות של תאים מוקדמת מחוסר חמצן או חומרים מזינים אחרים. צריך להיות ממוזער טראומה מכנית הנחילה הרקמה בזמן על ידי הימנעות של קיצור דרך דרך או נזק לרקמות, כמו זה יכול גם להוביל לא טבעי תגובות עצביות, מוות של תאים.
לאחר הצבת הרשתית על pMEA, להקפיד בעת אתחול זלוף העליון והתחתון וקווים היניקה, כמו זו היא נקודת נפוצות של כישלון הניסוי. כל הקווים זלוף, שאיבה חייב להיות בדקו אישור לפני תחילת הניסוי ובחן מעת לעת לאורך כל הניסוי כדי להבטיח כי בועות אוויר אל תסכל את הזרימה דרך הקווים. בפרט, היווצרות בועות אוויר בתוך השורה התחתונה זלוף יכול לחלוטין לעכב את הזרימה של זלוף בגלל קוטר קטן שלה, ובכך לגרום שהקצה מוקדמת הניסוי על-ידי לשלול הרשתית של חמצן וחומרים מזינים. בגלל הסכנה של בועות אוויר, הפרוטוקול הנ ל מבוצע בטמפרטורת החדר ולא בטמפרטורה פיזיולוגית יותר אידיאלי כדי למנוע את outgassing של חמצן מומס או פחמן דו חמצני מן הפתרון בינוני איימס. אם בועות אוויר occlude אחת השורות זלוף במהלך ניסוי, הם יכולים בדרך כלל להיות מפוזרים לתוך בועות קטנות יותר, שאינם occluding על-ידי הקשה בקלילות על הקו זלוף.
עוד בעיה נפוצה הקשורים למערכת זלוף הוא התאמת משובח לחץ היניקה התחתון כך מחזיקה הרשתית בחוזקה עם האלקטרודות אך ללא נזק. אם הלחץ יניקה גבוהה מדי, הוא יכול למצוץ חתיכות קטנות של הרשתית דרך החורים של pMEA, להוביל בסופו של דבר הפסקת כל התגובות עצבית. מצד שני, אם הלחץ הוא נמוך מדי, הרשתית לצוף מן האלקטרודות, לכן לשבש את ההקלטה עצבית. התאמת הלחץ יניקה בין שתי רמות קיצוניות אלה דורש תרגול, הינם קלים יותר אם pMEA שימוש במיקרוסקופ הפוכה, אשר מאפשר התבוננות החורים של pMEA קרוב. על ידי התבוננות ניקובים אלה תוך התאמת היניקה, אפשר למצוא את האיזון הנכון זה מקיים קשר ללא פגיעה ברשתית. כדי למזער האפשרות של photobleaching את photoreceptors כשהיא מגרה הרשתיות פראי-סוג, המאיר מיקרוסקופ הפוכה לסנן לפלוט אור אדום בלבד, תצפיות חזותיות אמור להסתיים מהר ככל האפשר.
לאחר הבטחת התנאים זלוף נכונה, השלב הקריטי הבא הוא הפניה ההתקן או פיפטה עם נראה נעוצות נקודה או סמן pMEA כך הזרקת ביציאות בהן ניתן ליישר בדיוק עם האלקטרודות של pMEA. בדרך כלל, פעולה זו מושגת באמצעות טריאנגולציה שבו שני סימוני הפניה להציב על גבי השפה של התא pMEA גס מיושרים עם זכוכית micropipette עצה או ציוני התקן מרובה יציאות באמצעות התבוננות חזותי מלמעלה באמצעות בום-דוכן מיקרוסקופ הנטען. יישור עדינה יותר של הזרקת ביציאות בהן עם אלקטרודות המטרה מושגת ואז על ידי בדיקה ויזואלית מבעד למיקרוסקופ הפוכה. ברגע מיושר כראוי, כדאי לשים לב כאשר אתם ניגשים הרשתית עם פיפטה או התקן microfluidic, מאז כל מניפולטור להתעצבן או להיסחף יכול לרסק את הרשתית או נזק של pMEA. הדרך הטובה ביותר כדי למנוע נזק בטעות הרשתית היא לפקח באופן רציף על עכבה של האלקטרודה פיפטה בדיוק לזהות במגע עם המשטח העליון ברשתית. מדידות עכבה יכול לשמש גם לבדוק במהירות אם העצה micropipette מוכנס לתוך מהסבא של הרשתית חסומה, אשר שציין של עכבה גבוהה באופן חריג (בדרך כלל בטווח ג'יגה אוהם). אם ניתן הטיפ micropipette בדרך כלל לפנות על ידי ייזום דופק בלחץ גבוה עם קצה שלה ממוקם הרחק הרשתית כדי למנוע פגיעה לא מכוונת. במקרים נדירים, פיפטות חסומים ייתכן שתצטרך להיות מוחלף לחלוטין אם פולסים בלחץ גבוה לא תנקה את הסתימה. ניתן גם להקליט ערך חריג או גבוהה עכבה כאשר האלקטרודה הפניה לא כראוי ממשק בין הפתרון בבית הבליעה pMEA המגבר מלחציים תיקון.
ברגע ממוקם במיקום היעד, נפח הזרקה של גלוטמט צריך להיות הדוק נשלט על ידי המגביל את הלחץ, זמן ההזרקה, וריכוז עצבי כדי למנוע overstimulation של הנוירונים, אשר הוכח לגרום נזק excitotoxic.הפרמטרים הזרקת גלוטמט המפורט בעלון זה מייצגים פרוטוקול משטר זה טוב מתחת לסף ידוע גורם excitotoxicity גלוטמט33 אבל בעת ניסיון פרוטוקול זה עם סוגים אחרים של נוירוטרנסמיטורים, המתאים יש לקחת בחשבון את רמות סף לאפקטים excitotoxicity לגירוי בטוח. בנוסף, הלחץ הזרקת 0.1 psi שנקבעו בפרוטוקול לעיל נגזר מן הלחץ הנמוך אפשרי הגדרת הזמינים מזרק לחץ 8-ערוץ השתמשו במחקר זה, אך הפיק תוצאות מוצלחות באופן עקבי. לכן, psi 0.1 על הזריקות הנוירוטרנסמיטר הוא רק רמיזות מיניות, אך לא מגבילים, להשיג stimulations כימי מוצלחת. אם התחתון לחצים הופעה אפשריים עם מזרק לחץ שונים, ניתן לבצע זריקות-לחצים נמוכים יותר 0.1 psi.
מגבלה אחת של פרוטוקול זה מעורבים במבחנה wholemount ברשתית ההכנות היא חלון זמן הניסוי קצר, אשר מוגבל המשכים של 8 שעות או פחות, אפילו עם מטופל קיצוניים לאורך כל הניסוי כולו. חלון זמן מוגבל ניסיוני זה אינו מאפשר בחינה של כל ההשפעות לטווח ארוך של גירוי כימי כגון excitotoxicity. הגבלה נוספת של פרוטוקול ספציפי זה הוא הבחירה להקליט בטמפרטורת החדר בניגוד טמפרטורה פיזיולוגיים, אשר משפיע על הסבירות הן חזותית - ו כימית-עורר ספייק קצב התגובות, כיוון שמחקרים קודמים הראו את התחתון הקלטה הטמפרטורות יכול לשנות את קצב עולה תגובה מוחבאת, שיעור ספיגת גלוטמט בקרב מספר אחר מאפייני34,35,36,37,38. מגבלה זו שניתן למנוע באמצעות MEA שאינו מחורר עם צלחת התחתון מחומם, בניגוד pMEA, אשר מנצל צלחת זלוף התחתון שתוכנן במיוחד ללא צלחת מחוממת ו/או של debubbler תרמי יעיל עבור העליונים והתחתונים זלוף.
לבסוף, הכנת במבחנה מוגבל על ידי הצורך זלוף פעילים של חמצן בינוני איימס כדי לשמור על בריאות הרשתית. נוזל הנגרם על ידי מערכת זלוף זרמי אוויר בדרך כלל הרבה יותר מהר. מאשר המנגנונים הטבעיים זלוף נמצא עין ויוו39, ואת עלולה להפריע זריקות כימי על ידי ציור נוירוטרנסמיטורים מוזרק להתרחק ממנו הרשתית. זריקות המבוסס על פני השטח, כגון אלה עם המכשיר רב-יציאות, כנראה תהיה חשופה יותר זלוף הפרעות הנוכחי לעומת זריקות מהסבא למרות הנוכחות של זלוף מהחלק התחתון של pMEA עלול לגרום השפעה דומה לאורך הרשתית כולו. מסיבה זו, כימיקלים גלוטמט בפרוטוקול הנוכחי נמסרו עם לחץ פנאומטי, אבל הלחץ הזרקה הדרושים להשגת גירוי מוצלחת vivo ב יכול להיות נמוך באופן משמעותי מזה מנוצל עבור במבחנה מחקרים.
גירוי כימי, המבקשת להפעיל את הנוירונים עם גירויים עצבי טבעי יותר, מציע חלופה יעילה גירוי חשמלי רגיל אבל יש לא ובכל זאת ברצינות נחקרו. כתוצאה מכך, יש קצת ספרות המתארת את פרוטוקול או המומלצות להשגת אמין גירוי כימי subretinal של הנוירונים ברשתית. מחקרים אחרונים28 באמצעות פרוטוקול זה הוכיחו כי subretinal גירוי כימי של הנוירונים ברשתית יכולה להפיק באופן אמין מהרשות לשיקום האסיר תגובות עם מרחבי החלטות דומות או יותר גירוי חשמלי של הרשתית, יש ראיות subretinally להחיל אקסוגני גלוטמט יכול לעורר דו-קוטבי תאים ישירות, ומאפשר בשיטה זו כדי לנצל את המעגלים הגלום עיבוד ויזואלי של הרשתית, ככל הנראה, לעורר תפיסות דומה יותר אור טבעי גירוי.
נדרשים מחקרים נוספים כדי לאמת את הממצאים האלה במערכות דגם מאתר ולחקור בעיות שאינן מטופלות על ידי מחקרים קודמים, כולל השפעות ארוכות טווח, ההיבטים המעשיים הקשורים ויוו יישום של זה אסטרטגיה. לכן, כיוונים לעתיד של גישה זו בבירור לשקר לתרגם את המושג הזה אין ויוו מודלים בבעלי חיים על ידי פיתוח טכנולוגיה מתאימה כדי להשיג גירוי עם microfluidic מושתלת אור המופעל והספקת כימי לטווח ארוך התקן המשמש כתחליף עבור השכבה קולט אור מנוונת. פרדיגמה גירוי understudied יחסית, היישומים רחבה יותר של גירוי כימי טרם התגלו, אך מאז הרשתית היא חלק של מערכת העצבים המרכזית40, אסטרטגיה זו גירוי פוטנציאלי יכול לחול ב אחרים גירוי עצבי בהקשרים שונים, דוגמת הטיפול של חוט בקליפת המוח, עמוד השדרה, או הפרעות neuromuscular כאלה באמצעות נוירוטרנסמיטרים שונים. יתר על כן, הפרוטוקול הציג שיוכלו לאמץ באופן כללי יותר עבור מחקרים חוקרת את ההשפעות של משלוח מבוקר של תרופה או חומרים כימיים אחרים לתוך רקמות עצביות ברזולוצית ייתכן משובחים באווירה במבחנה .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
העבודה הציגה בעיתון נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע, המתעוררים גבולות במחקר ולהעניק חדשנות (NSF-EFRI) תוכנית מספר 0938072. תוכן המאמר אינם מייצגים בהכרח התצוגות הרשמי של ה-NSF הינם אך ורק באחריות של המחברים. המחברים גם רוצים להודות ד ר Samsoon אברהם זילברשלג על עבודתו בעיצוב ובדיקה ההגדרה הראשונית ניסיוני לגירוי כימי מר Ashwin Raghunathan עבור עבודתו בעיצוב, בדיית, הערכת המכשיר microfluidic מרובה בשימוש מחקר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microelectrode array, perforated layout | Multi Channel Systems, GmbH | 60pMEA200/30iR-Ti-pr | http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti |
| MEA amplifier | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv |
| Bottom perfusion groundplate for pMEA | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv-(BC)-PGP | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp |
| 3-axis Motorized Micromanipulator | Sutter Instruments, Novato, CA | MP-285 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html |
| Micromanipulator Control System | Sutter Instruments, Novato, CA | MPC-200 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html |
| Gantry style micromanipulator stand with linear slide | Sutter Instruments, Novato, CA | MT-75/LS | https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html |
| 8-channel Programmable Multichannel Pressure Injector | OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ Vendor: Harvard Apparatus UK |
PM-8000 or PM-8 | OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm Vendor: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1 _HAUK_ProductDetail |
| Axopatch 200A Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200A | Axopatch 200A has been replaced with a newer model Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier |
| Patch clamp headstage | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV 201A | http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage |
| Vacuum waste kit | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VMK | http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/ |
| Pipette holder | Warner Instruments, Hamden, CT | QSW-A10P | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915 |
| Pre-pulled 10 μm tip diameter glass micropipettes | World Precision Instruments, Sarasota, FL | TIP10TW1 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/ |
| Zoom stereomicroscope | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-745T | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745 |
| Microscope boom stand with dual linear ball bearing arm | Old School Industries, Inc., Dacono, CO | OS1010H-16BB | http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm |
| Zoom Stereo Microscope with C-LEDS Hybrid LED Stand | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-445 | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445 |
| Inverted microscope system | Nikon, Tokyo, Japan | Eclipse Ti-E | https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E |
| Ames medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1420 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420 |
| L-Glutamic Acid (Glutamate) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291 |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S8761 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761 |
| 60 mm Petri dish (10 mm tall) | Fischer Scientific, Waltham, MA | FB0875713A | 60 mm clear petri dish; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a |
| Jewelers #5 Forceps | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 555227F | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/ |
| Standard Scalpel Blad #24 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500247 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/ |
| Scalpel Handle #4 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500237 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/ |
| Vannas Tubingen Dissection Scissors | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 503378 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/ |
| Nylon mesh kit | Warner Instruments, Hamden, CT | NYL/MESH | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173 |
| Harp slice grid | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | HSG-5AD | http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/ |
| Ag/AgCl reference electrode pellet | Multi Channel Systems, GmbH | P1060 | http://www.multichannelsystems.com/products/p1060 |
| 4 Channel Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VC3-4xG | http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/ |
| Zyla 5.5 sCMOS microscope camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla 5.5 sCMOS | http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos |
| Silver wire (50 μm diameter) | Fischer Scientific, Waltham, MA | AA44461G5 | https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5 |
| Tygon microbore tubing (1.6 mm diameter) | Cole Parmer, Vernon Hills , IL | EW-06419-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901 |
| Tilting Tool Holder with Steel Cannula | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | TILTPORT | One each of these were utilized for top perfusion and suction; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/ |
| Roscolux #26 Light Red Filter Sheet | Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT | R2611 | Manufacturer: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux Vendor: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html |
| Smith & Wesson Galaxy Red Flashlight | Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA | 4588 | Manufacturer: https://www.smith-wesson.com/ Vendor: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588 |
| MC_Rack Software | Multi Channel Systems, GmbH | MC_Rack | http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack |
| Labview Software | National Instruments, Austin, TX | LabVIEW | http://www.ni.com/labview/ |
| NIS-Elements: Basic Research Software | Nikon, Tokyo, Japan | NIS-Elements BR | https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research |
References
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. , (2011).
- Fritsche, L. G., Fariss, R. N., Stambolian, D., Abecasis, G. R., Curcio, C. A., Swaroop, A. Age-Related Macular Degeneration: Genetics and Biology Coming Together. Annu Rev Genomics Hum Genet. 15, 151-171 (2014).
- Marc, R. E., et al. Neural reprogramming in retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 3364-3371 (2007).
- Jones, B. W., Kondo, M., Terasaki, H., Lin, Y., McCall, M., Marc, R. E. Retinal remodeling. Jpn J Ophthalmol. 56, 289-306 (2012).
- Soto, F., Kerschensteiner, D. Synaptic remodeling of neuronal circuits in early retinal degeneration. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
- Trenholm, S., Awatramani, G. B. Origins of spontaneous activity in the degenerating retina. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
- Euler, T., Schubert, T. Multiple Independent Oscillatory Networks in the Degenerating Retina. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
- Boye, S. E., Boye, S. L., Lewin, A. S., Hauswirth, W. W. A Comprehensive Review of Retinal Gene Therapy. Mol Ther. 21, 509-519 (2013).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. The Lancet. 385, 509-516 (2015).
- Reh, T. A. Photoreceptor Transplantation in Late Stage Retinal Degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57, (2016).
- Zrenner, E. Fighting blindness with microelectronics. Sci Transl Med. 5, (2013).
- Humayun, M. S., de Juan, E. Jr, Dagnelie, G. The Bionic Eye: A Quarter Century of Retinal Prosthesis Research and Development. Ophthalmol. 123, S89-S97 (2016).
- Cruz, L., et al. The Argus II epiretinal prosthesis system allows letter and word reading and long-term function in patients with profound vision loss. Br J Ophthalmol. 97, 632-636 (2013).
- Zrenner, E., et al. Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words. P R Soc B. 278, 1489-1497 (2011).
- Stronks, H. C., Dagnelie, G. The functional performance of the Argus II retinal prosthesis. Expert Rev Med Devices. 11, 23-30 (2014).
- Stingl, K., et al. Artificial vision with wirelessly powered subretinal electronic implant alpha-IMS. P R Soc B. 280, (2013).
- Rizzo, J. F. Update on retinal prosthetic research: the Boston Retinal Implant Project. J Neuroophthalmol. 31, 160-168 (2011).
- Ayton, L. N., et al. First-in-Human Trial of a Novel Suprachoroidal Retinal Prosthesis. PLoS ONE. 9, e115239 (2014).
- Chuang, A. T., Margo, C. E., Greenberg, P. B. Retinal implants: a systematic review. Br J Ophthalmol. 98, 852-856 (2014).
- Cai, C., Twyford, P., Fried, S. The response of retinal neurons to high-frequency stimulation. J Neural Eng. 10, 036009 (2013).
- Eiber, C. D., Lovell, N. H., Suaning, G. J. Attaining higher resolution visual prosthetics: a review of the factors and limitations. J Neural Eng. 10, 011002 (2013).
- Humayun, M., Propst, R., de Juan, E., McCormick, K., Hickingbotham, D. Bipolar surface electrical stimulation of the vertebrate retina. Arch Ophthalmol. 112, 110-116 (1994).
- Zrenner, E., et al. Can subretinal microphotodiodes successfully replace degenerated photoreceptors? Vision Res. 39, 2555-2567 (1999).
- Majji, A. B., Humayun, M. S., Weiland, J. D., Suzuki, S., D'Anna, S. A., de Juan, E. Long-Term Histological and Electrophysiological Results of an Inactive Epiretinal Electrode Array Implantation in Dogs. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2073-2081 (1999).
- Peterman, M. C., Noolandi, J., Blumenkranz, M. S., Fishman, H. A. Localized chemical release from an artificial synapse chip. PNAS. 101, 9951-9954 (2004).
- Finlayson, P. G., Iezzi, R. Glutamate stimulation of retinal ganglion cells in normal and s334ter-4 rat retinas: a candidate for a neurotransmitter-based retinal prosthesis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 3619-3628 (2010).
- Inayat, S., Rountree, C. M., Troy, J. B., Saggere, L. Chemical stimulation of rat retinal neurons: feasibility of an epiretinal neurotransmitter-based prosthesis. J Neural Eng. 12, 016010 (2015).
- Rountree, C. M., Inayat, S., Troy, J. B., Saggere, L. Differential stimulation of the retina with subretinally injected exogenous neurotransmitter: A biomimetic alternative to electrical stimulation. Sci Rep. 6, 38505 (2016).
- Ray, A., Sun, G. J., Chan, L., Grzywacz, N. M., Weiland, J., Lee, E. -J. Morphological alterations in retinal neurons in the S334ter-line3 transgenic rat. Cell Tissue Res. 339, 481-491 (2010).
- Martinez-Navarrete, G., Seiler, M. J., Aramant, R. B., Fernandez-Sanchez, L., Pinilla, I., Cuenca, N. Retinal degeneration in two lines of transgenic S334ter rats. Exp Eye Res. 92, 227-237 (2011).
- Sigma Aldrich. Sigma Aldrich Ames Medium Product Information Sheet. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/1/a1420pis.pdf (2017).
- Reinhard, K., et al. Step-By-Step instructions for retina recordings with perforated multi electrode arrays. PLoS ONE. 9, e106148 (2014).
- Izumi, Y., Kirby, C. O., Benz, A. M., Olney, J. W., Zorumski, C. F. Müller cell swelling, glutamate uptake, and excitotoxic neurodegeneration in the isolated rat retina. Glia. 25, 379-389 (1999).
- Tunnicliff, G. Glutamate uptake by chick retina. Biochem J. 150, 297-299 (1975).
- Schwartz, E. A., Tachibana, M. Electrophysiology of glutamate and sodium co-transport in a glial cell of the salamander retina. J Physiol (Lond). 426, 43-80 (1990).
- Muller, A., Maurin, L., Bonne, C. Free radicals and glutamate uptake in the retina. Gen Pharmacol- Vasc S. 30, 315-318 (1998).
- Dhingra, N. K., Kao, Y. -H., Sterling, P., Smith, R. G. Contrast threshold of a brisk-transient ganglion cell in vitro. J of Neurophysiol. 89, 2360-2369 (2003).
- Ahlers, M. T., Ammermüller, J. A system for precise temperature control of isolated nervous tissue under optical access: Application to multi-electrode recordings. J of Neurosci Methods. 219, 83-91 (2013).
- Feke, G. T., Tagawa, H., Deupree, D. M., Goger, D. G., Sebag, J., Weiter, J. J. Blood flow in the normal human retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30, 58-65 (1989).
- The Retina. Neuroscience. Purves, D., et al. , 2nd edition, Sinauer Associates. (2001).
