Este protocolo describe un método novedoso para la investigación de una forma de neuroestimulación química de wholemount rat retinas en vitro con el neurotransmisor glutamato. Química neuroestimulación es una alternativa prometedora a la neuroestimulación eléctrica convencional de retinales neuronas para tratar ceguera irreversible causada por enfermedades degenerativas fotorreceptor.
Enfermedades degenerativas fotorreceptor causan ceguera irreparable por la pérdida progresiva de células fotorreceptoras en la retina. Prótesis retinianas son un tratamiento emergente para enfermedades degenerativas fotorreceptor que buscan restaurar la visión estimulando artificialmente las neuronas retinianas sobrevivientes con la esperanza de suscitar comprensible percepción visual en los pacientes. Prótesis retinianas actuales han demostrado éxito en la restauración de la visión limitada a los pacientes mediante una matriz de electrodos para estimular la retina eléctricamente pero enfrentan importantes barreras físicas en la restauración de alta agudeza, visión natural a los pacientes. Neuroestimulación química utilizando neurotransmisores nativos es una estimulación alternativa eléctrica biomiméticos y podría eludir las limitaciones fundamentales asociadas con prótesis retinianas mediante neuroestimulación eléctrica. Específicamente, neuroestimulación química tiene el potencial para restaurar la visión más natural con agudezas visuales comparables o mejores a los pacientes mediante la inyección de cantidades muy pequeñas de los neurotransmisores, los mismos agentes naturales de comunicación utilizado por la retina sinapsis química, en una resolución mucho más fina que prótesis eléctricas actuales. Sin embargo, como un paradigma de estimulación relativamente inexplorada, hay ningún protocolo establecido para lograr la estimulación química de la retina en vitro. El propósito de este trabajo es proporcionar un marco detallado para lograr estimulación química de la retina para investigadores que deseen estudiar el potencial de la neuromodulación química de la retina o similar los tejidos neuronales in vitro. En este trabajo, describimos el montaje experimental y metodología para la obtención de ganglionares de la retina células (RGC) spike respuestas similares a visual luz respuestas de tipo salvaje y degenerado fotorreceptor wholemount retinas de rata mediante la inyección controlada volúmenes de el neurotransmisor glutamato en el espacio subretinal utilizando Micropipetas de vidrio y un dispositivo de microfluidos multipuerto personalizado. Esta metodología y protocolo son lo bastante generales como para ser adaptado para neuromodulación mediante otros neurotransmisores o incluso otros tejidos neuronales.
Fotorreceptor enfermedades degenerativas, tales como retinitis pigmentosa y degeneración macular relacionada con la edad, son principales a causas hereditarias de pérdida de la visión y son actualmente incurables1,2. Aunque estas enfermedades surgen de una variedad de mutaciones genéticas específicas, enfermedades degenerativas del fotorreceptor se caracterizan como un grupo por la pérdida progresiva de las células fotorreceptoras en la retina, que finalmente causa la ceguera. La pérdida de disparadores de fotorreceptores extensa remodelación a lo largo de la retina, pero sobrevivir a las neuronas retinianas, incluyendo las células bipolares y RGCs, permanece intacto y relativamente funcional incluso en etapas avanzadas de la degeneración de fotorreceptores3 ,4,5,6,7.
Los mecanismos y patologías de estas enfermedades han sido bien caracterizado3,4,5,6,7 pero un tratamiento eficaz sigue siendo elusivo. En las últimas tres décadas, los investigadores en todo el mundo han estudiado una variedad de tratamientos terapéuticos para restaurar la visión a las personas afectadas con enfermedades degenerativas del fotorreceptor incluyendo gene terapia8, células madre tratamiento9, trasplante de retina10y estimulación artificial11,12 de las neuronas retinianas sobrevivientes. De éstos, el más clínicamente disponible es prótesis retinianas, que son dispositivos de neuroestimulación artificiales que tradicionalmente han utilizado una gran variedad de electrodos para estimular eléctricamente las células bipolares o RGCs en patrones específicos con el objetivo de la creación de percepciones visuales artificiales en pacientes11. Prótesis eléctrica de generación actual, como el Argus II13 y alfa-IMS14 dispositivos, han logrado la aprobación clínica y estudios preliminares han indicado que puede mejorar la calidad de vida para los pacientes mediante la restauración de un medida de la visión usando epiretinal (frente de la retina) y subretinal (parte posterior de la retina) implantados dispositivos15,16. Grupos de investigación alrededor del mundo están trabajando en el avance de las prótesis retinianas más allá de los éxitos de estos dispositivos de primera generación17,18,19,20 pero se han enfrentado a dificultades de diseñar una prótesis eléctrica capaz de restaurar la visión de alta acuidad por debajo del nivel de ceguera legal a los pacientes. Estudios recientes han demostrado que lograr mayor resolución espacial que el permitido por la actual generación eléctrica basado en prótesis es difícil debido al límite de inyección de carga, que hace necesario el uso de grandes electrodos para estimular de forma segura neuronas retinianas a costa de resolución espacial, es decir, la agudeza visual de11,21. Por otra parte, la estimulación eléctrica es más limitado ya que normalmente estimula todas las células cercanas y por lo tanto provoca percepciones confusas y antinaturales en pacientes, en gran parte debido a que es un paradigma de estimulación intrínsecamente antinatural21. Sin embargo, los primeros éxitos de la estimulación eléctrica han demostrado que eso neuroestimulación artificial puede ser un tratamiento eficaz para enfermedades degenerativas fotorreceptor. Esto nos lleva a la hipótesis de que un tratamiento aún más eficaz podría ser realizable mediante la estimulación de la retina con los químicos neurotransmisores, los agentes naturales de la comunicación en las sinapsis químicas. El propósito del método presentado en este trabajo es explorar la viabilidad terapéutica de la estimulación química, que trata de imitar el sistema natural de la comunicación sináptica entre neuronas retinianas, como un estímulo alternativo a eléctrica biomiméticos para una prótesis de retina.
Traducción del concepto de estimulación química terapéutica a una prótesis de retina química se basa en activar químicamente las neuronas retinianas blanco con pequeñas cantidades de neurotransmisores nativas, como el glutamato, a través de un microfluídicos dispositivo que comprende una gran variedad de funciones en respuesta a la estimulación visual. De esta manera, una prótesis de retina química sería esencialmente una capa de fotorreceptores artificiales biomiméticos que traduce fotones llegar naturalmente a la retina a señales químicas. Ya que estas señales químicas utilizan los mismos neurotransmisores utilizados en la señalización normal de la retina y estimulan las neuronas retinianas sobrevivientes de una retina degenerado a través de las vías sinápticas mismo utilizado por vías de la visión normal, el resultado visual percepción mediante una prótesis retiniana química podría ser más natural y comprensible en comparación con uno evocado a través de una prótesis eléctrica. Por otra parte, puesto que las funciones a través del cual se liberan neurotransmisores pueden hacerse extremadamente pequeño y vestida en alta densidad, a diferencia de los electrodos un potencial químico prótesis podría ser capaz de lograr más estímulo focal y mayor espacial resolución que una prótesis eléctrica. Así, partiendo de estas ventajas potenciales, una prótesis de retina química ofrece una alternativa altamente prometedora para prótesis eléctricas.
Estimulación química de la retina, sin embargo, ha sido relativamente poco explorada hasta hace poco. Mientras que la estimulación eléctrica de la retina ha sido bien caracterizada en décadas de trabajo a través de vitro en22,23, en vivo23,24estudios clínicos13 ,14, estudios sobre estimulación química se han limitado exclusivamente a unos pocos en vitro obras25,26,27,28. Iezzi y Finlayson26 y Inayat et al. 27 demostró epiretinal estimulación química de la retina en vitro usando un solo electrodo y una matriz micropozo-microcanal (MEA), respectivamente, para registrar las respuestas de glutamato evocado de las neuronas retinianas. Más recientemente, Rountree et al. 28 demostró la estimulación diferencial de los caminos y retinales usando glutamato desde el lado del subretinal y un MEA para registrar las respuestas neuronales desde múltiples sitios en la retina.Aunque estos trabajos han establecido preliminarmente la viabilidad de la estimulación química, más estudios son esenciales para investigar muchos aspectos de este enfoque más allá de las dirigidas hasta ahora25,26,27 , 28y ajustar los parámetros de estimulación terapéutica en modelos animales tanto in vitro e in vivo antes de traducir este concepto a una prótesis de retina química según lo discutido arriba. Sin embargo, actualmente no hay ninguna metodología establecida para lograr la estimulación química de la retina en la literatura y los métodos utilizados en los trabajos anteriores no se han descrito tan detalladamente como sería esencial para estudios replicativos. Por lo tanto, la justificación de este trabajo de métodos es proporcionar un marco bien definido para llevar a cabo en vitro la estimulación química de la retina para aquellos investigadores interesados en la replicación de los estudios anteriores27, 28 o avanzar aún más este concepto naciente de neuroestimulación química.
Aquí se demuestra un método para llevar a cabo en vitro la estimulación química de neuronas retinianas en wholemount retinas de ratas de tipo salvaje y un modelo de ratas degeneradas de fotorreceptor que imita muy de cerca la progresión del fotorreceptor degenerativa enfermedades en los seres humanos. Es el fundamento de desarrollo de este método de estimulación en vitro modelos para evaluar los rangos terapéuticos de varios parámetros de estimulación y estudiar las características de la respuesta neural que serían imposibles o difíciles de observar en en vivo modelos, especialmente durante los estudios iniciales se centraron en evaluar la factibilidad de este enfoque. En este procedimiento, se muestran solo sitio y simultáneamente múltiples sitios estímulos químicos de retinas entregando cantidades pequeñas de 1 mM de glutamato cerca neuronas retinianas blanco mediante Micropipetas de vidrio un puerto disponible en el mercado y una costumbre dispositivo de microfluidos puertos múltiples micro, respectivamente. Mientras solo sitio y de sitios múltiples estímulos logran el objetivo fundamental de investigar la viabilidad terapéutica de la neuromodulación química, cada una sirve a un propósito distinto con una ventaja única. La estimulación del solo sitio, que puede ser lograda con Micropipetas de vidrio tirado previamente disponibles en el mercado, se puede utilizar para inyectar productos químicos directamente en la superficie de la retina en un solo lugar y sirve para investigar si grave observable spike tasa respuestas que son similares a las respuestas ligeras visualmente evocadas pueden sacadas focal en el sitio de inyección. Por otro lado, estimulación multisitio, que requiere un dispositivo de microfluidos multipuerto fabricado especialmente, puede ser utilizada para inyectar productos químicos espacial en varios sitios sobre la superficie de la retina y sirve para investigar cómo bien evocados por el glutamato RCG patrones de respuesta corresponden a los patrones de inyección de glutamato en los estudios de estimulación de patrón.
El método presentado aquí muestra un paradigma único de estimulación neural, en donde las neuronas retinianas son estimuladas químicamente inyectando productos químicos neurotransmisor natural en la superficie de la retina in vitro. Esta técnica de estimulación química ofrece varias ventajas sobre la técnica de estimulación eléctrica convencional, incluyendo la selectividad y especificidad focal de neuronas de destino. El Protocolo sobre detalles como pequeñas inyecciones neumática volumen de neuro…
The authors have nothing to disclose.
El trabajo presentado en el documento fue apoyado por la National Science Foundation, nuevas fronteras en la investigación y el programa de innovación (NSF-EFRI) número 0938072 de la concesión. El contenido de este documento es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial de la NSF. Los autores también desean agradecer al Dr. Samsoon Inayat su trabajo diseñando y probando la configuración experimental inicial para la estimulación química y Sr. Ashwin Raghunathan por su trabajo de diseño, fabricación y evaluación del dispositivo de microfluidos multipuerto utilizado en Este estudio.
Microelectrode array, perforated layout | Multi Channel Systems, GmbH | 60pMEA200/30iR-Ti-pr | http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti |
MEA amplifier | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv |
Bottom perfusion groundplate for pMEA | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv-(BC)-PGP | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp |
3-axis Motorized Micromanipulator | Sutter Instruments, Novato, CA | MP-285 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html |
Micromanipulator Control System | Sutter Instruments, Novato, CA | MPC-200 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html |
Gantry style micromanipulator stand with linear slide | Sutter Instruments, Novato, CA | MT-75/LS | https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html |
8-channel Programmable Multichannel Pressure Injector | OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ Vendor: Harvard Apparatus UK |
PM-8000 or PM-8 | OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm Vendor: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1_HAUK_ProductDetail |
Axopatch 200A Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200A | Axopatch 200A has been replaced with a newer model Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier |
Patch clamp headstage | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV 201A | http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage |
Vacuum waste kit | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VMK | http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/ |
Pipette holder | Warner Instruments, Hamden, CT | QSW-A10P | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915 |
Pre-pulled 10 μm tip diameter glass micropipettes | World Precision Instruments, Sarasota, FL | TIP10TW1 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/ |
Zoom stereomicroscope | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-745T | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745 |
Microscope boom stand with dual linear ball bearing arm | Old School Industries, Inc., Dacono, CO | OS1010H-16BB | http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm |
Zoom Stereo Microscope with C-LEDS Hybrid LED Stand | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-445 | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445 |
Inverted microscope system | Nikon, Tokyo, Japan | Eclipse Ti-E | https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E |
Ames medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1420 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420 |
L-Glutamic Acid (Glutamate) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291 |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S8761 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761 |
60 mm Petri dish (10 mm tall) | Fischer Scientific, Waltham, MA | FB0875713A | 60 mm clear petri dish; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a |
Jewelers #5 Forceps | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 555227F | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/ |
Standard Scalpel Blad #24 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500247 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/ |
Scalpel Handle #4 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500237 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/ |
Vannas Tubingen Dissection Scissors | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 503378 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/ |
Nylon mesh kit | Warner Instruments, Hamden, CT | NYL/MESH | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173 |
Harp slice grid | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | HSG-5AD | http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/ |
Ag/AgCl reference electrode pellet | Multi Channel Systems, GmbH | P1060 | http://www.multichannelsystems.com/products/p1060 |
4 Channel Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VC3-4xG | http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/ |
Zyla 5.5 sCMOS microscope camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla 5.5 sCMOS | http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos |
Silver wire (50 μm diameter) | Fischer Scientific, Waltham, MA | AA44461G5 | https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5 |
Tygon microbore tubing (1.6 mm diameter) | Cole Parmer, Vernon Hills , IL | EW-06419-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901 |
Tilting Tool Holder with Steel Cannula | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | TILTPORT | One each of these were utilized for top perfusion and suction; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/ |
Roscolux #26 Light Red Filter Sheet | Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT | R2611 | Manufacturer: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux Vendor: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html |
Smith & Wesson Galaxy Red Flashlight | Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA | 4588 | Manufacturer: https://www.smith-wesson.com/ Vendor: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588 |
MC_Rack Software | Multi Channel Systems, GmbH | MC_Rack | http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack |
Labview Software | National Instruments, Austin, TX | LabVIEW | http://www.ni.com/labview/ |
NIS-Elements: Basic Research Software | Nikon, Tokyo, Japan | NIS-Elements BR | https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research |