Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Methode zur Untersuchung einer Form der chemischen Neurostimulation Wholemount Ratte Netzhäute in Vitro mit dem Neurotransmitter Glutamat. Chemischen Neurostimulation ist eine vielversprechende Alternative zu herkömmlichen elektrischen Neurostimulation der Netzhaut Neuronen für die Behandlung von irreversible Blindheit durch Photorezeptor degenerativen Erkrankungen verursacht.
Photorezeptor degenerative Krankheiten verursachen irreparable Erblindung durch den fortschreitenden Verlust der Sehzellen in der Netzhaut. Netzhaut Prothesen sind eine neue Behandlung für Photorezeptor degenerativen Krankheiten, die darauf abzielen, Vision wiederherzustellen indem künstlich stimuliert die Überlebenden Netzhaut Neuronen in der Hoffnung auf verständlicheren visuellen Wahrnehmung bei Patienten zu entlocken. Aktuelle retinale Prothesen haben gezeigt, dass Erfolg bei der Wiederherstellung der begrenzten Sicht für Patienten verwenden eine Reihe von Elektroden elektrisch stimulieren die Netzhaut aber ehrlich physischen Barrieren bei der Wiederherstellung der hohe Schärfe, natürliche Vision für die Patienten. Chemische Neurostimulation mit native Neurotransmitter ist eine biomimetische alternative zu elektrischen Stimulation und könnte die grundlegende Einschränkungen verbunden mit retinalen Prothesen mit elektrischen Neurostimulation umgehen. Insbesondere hat chemische Neurostimulation das Potenzial, mehr natürliche Vision mit vergleichbaren oder besseren visuellen Untiefen Patienten wiederherzustellen, durch die Injektion von Kleinstmengen von Neurotransmittern, die gleichen natürlichen Mittel der Kommunikation durch Netzhaut chemische Synapsen mit viel feinere Auflösung als aktuelle elektrische Prothesen. Als relativ unerforschten Stimulation Paradigma ist jedoch keine etablierte Protokoll für chemische Stimulation der Netzhaut in Vitrozu erreichen. Der Zweck dieser Arbeit ist es, bieten einen detaillierten Rahmen für die Durchführung der chemischen Stimulation der Netzhaut für die Ermittler, die das Potenzial der chemischen Neuromodulation der Netzhaut oder ähnliches studieren neurale Gewebe in Vitro. In dieser Arbeit beschreiben wir den Versuchsaufbau und Methodik für die retinalen Ganglienzellen Zelle (RGC) Spike Reaktionen ähnlich wie visuelle leichte Reaktionen in Wildtyp zu entlocken und Photorezeptor degenerierte Wholemount Ratte Netzhaut durch die Injektion kontrolliert Datenmengen der Neurotransmitter Glutamat in den subretinalen Raum mit Glas Mikropipetten und eine benutzerdefinierte multiport mikrofluidischen Gerät. Diese Methodik und Protokoll sind allgemein genug, um für Neuromodulation mit anderen Neurotransmittern oder auch andere neuronale Gewebe angepasst werden.
Photorezeptor degenerative Krankheiten wie Retinitis Pigmentosa und altersbedingte Makula-Degeneration, vererbbare Ursachen der Verlust der Sehkraft führen und sind derzeit unheilbare1,2. Obwohl diese Krankheiten aus einer Vielzahl von spezifischen genetischen Mutationen entstehen, Photorezeptor degenerativen Erkrankungen als Gruppe der fortschreitende Verlust der Sehzellen in der Netzhaut, zeichnen sich durch die schließlich Blindheit verursacht. Der Verlust der Photorezeptoren Trigger weit verbreitet in der Netzhaut Umbau aber überleben Netzhaut Neuronen, einschließlich der Bipolarzellen und Routinggruppenconnectors, bleiben intakt und relativ funktional auch in fortgeschrittenen Stadien der Photorezeptor-Degeneration3 ,4,5,6,7.
Die Mechanismen und Pathologien dieser Krankheiten wurden gut charakterisierten3,4,5,6,7 , aber eine wirksame Behandlung bleibt schwer. In den letzten drei Jahrzehnten haben Forscher weltweit eine Vielzahl von therapeutischen Behandlungen zur Wiederherstellung der Vision für die betroffenen mit Photorezeptor degenerativen Erkrankungen einschließlich Gen-Therapie8, Stammzellen Behandlung9untersucht, Netzhaut Transplantation10und künstliche Stimulation11,12 der Überlebenden Netzhaut Neuronen. Von diesen sind die klinisch verfügbaren retinalen Prothesen, künstliche Neurostimulatoren, die traditionell eine Reihe von Elektroden elektrisch stimulieren die Bipolarzellen oder Routinggruppenconnectors in bestimmten Mustern mit dem Ziel eingesetzt haben Erstellen von künstlichen visuellen Wahrnehmungen in Patienten11. Aktuelle Generation elektrische Prothesen, wie z. B. die Argus II13 und Alpha-IMS14 Geräte, haben klinische Zulassung erreicht und Vorstudien haben gezeigt, dass sie durch die Wiederherstellung der Lebensqualität der Patienten verbessern können ein Maß für die Vision mit Epiretinal (vor der Netzhaut) und subretinalen (Rückseite der Netzhaut) implantierte Geräte15,16. Forschergruppen auf der ganzen Welt arbeiten an der Weiterentwicklung der Netzhaut Prothesen über die Erfolge dieser ersten Generation Geräte17,18,19,20 aber konfrontiert gewesen Schwierigkeiten, die Gestaltung einer elektrischen Prothese in der Lage hohe Schärfe Vision unterhalb der gesetzlichen Blindheit für die Patienten. Jüngste Studien haben gezeigt, dass höheren räumlichen Auflösung als die durch die aktuelle Generation ermöglicht Elektro-basierte Prothesen ist schwierig aufgrund der Ladung-Injektion-Grenze zu erreichen, erfordert die Verwendung von großen Elektroden sicher stimulieren Netzhaut Neuronen auf Kosten der räumlichen Auflösung, d. h. Sehschärfe11,21. Darüber hinaus ist die elektrischer Stimulation weiter begrenzt, da es in der Regel alle benachbarten Zellen stimuliert und daher unnatürliche und verwirrende Wahrnehmungen bei Patienten löst, vor allem, weil es eine inhärent unnatürliche Stimulation Paradigma21. Dennoch haben die frühen Erfolge der elektrischen Stimulation demonstrierte, dass künstliche Neurostimulation eine wirksame Behandlung für Photorezeptor degenerativen Erkrankungen sein kann. Dies führt zu vermuten, dass eine noch effektivere Behandlung durch die Stimulierung der Netzhaut mit der natürlichen Mittel der Kommunikation an chemischen Synapsen Neurotransmitter Chemikalien erreichbar sein könnte. In diesem Whitepaper vorgestellten Methode soll die therapeutische Machbarkeit der chemischen Stimulation zu erforschen, die versucht, das natürliche System der synaptische Kommunikation zwischen Netzhaut Neuronen, als eine alternative zur elektrischen Stimulation biomimetische imitieren für eine Netzhautprothese.
Übersetzung des Begriffs der therapeutischen chemischen Stimulation zu einer chemischen Netzhautprothese stützt sich auf chemisch Ziel Netzhaut Neuronen mit kleinen Mengen von native Neurotransmitter wie Glutamat, veröffentlicht durch einen mikrofluidischen aktivieren Gerät, bestehend aus einer großen Auswahl an Abtauzyklusses in Reaktion auf die visuelle Stimulation. Auf diese Weise wäre eine chemische Netzhautprothese im Wesentlichen eine biomimetische künstliche Photorezeptor-Schicht, die Photonen, die natürlich erreicht die Netzhaut auf chemische Signale übersetzt. Da diese chemischen Signale die gleichen Neurotransmitter verwenden in normale Netzhaut Signalisierung genutzt und die Überlebenden Netzhaut Neuronen der degenerierten Netzhaut durch die gleichen synaptischen Wege von normalem Sehvermögen Wege, die sich daraus ergebenden visuelle verwendet stimulieren Wahrnehmung durch eine chemische Netzhautprothese erreicht könnte im Vergleich zu einem hervorgerufen durch eine elektrische Prothese natürlich und verständlich. Außerdem, da die Abtauzyklusses durch die Neurotransmitter freigesetzt sind extrem klein und angeordneten in hoher Dichte im Gegensatz zu den Elektroden erfolgen kann eine mögliche chemische prothetische möglicherweise mehr Brennweite Stimulation zu erzielen und höhere räumliche höhere Auflösung als eine elektrische Prothese. Auf der Grundlage dieser potenziellen Vorteile bietet eine chemische Netzhautprothese eine vielversprechende Alternative zu elektrischen Prothesen.
Chemischen Stimulation der Netzhaut, ist jedoch relativ wenig bis vor kurzem untersucht worden. Während elektrischer Stimulation der Netzhaut in jahrzehntelanger Arbeit durch in-vitro-22,23, in Vivo23,24und klinische Studien13 gut charakterisiert worden ist ,14, Studien zur chemischen Stimulation wurden beschränkt sich ausschließlich auf einige in-vitro- arbeiten25,26,27,28. Iezzi und Finlayson26 und Inayat Et al. 27 zeigt Epiretinal chemischen Stimulation der Netzhaut in Vitro mit einer einzigen Elektrode und ein multielectrode Array (MEA), bzw. die Glutamat hervorgerufen Antworten der Netzhaut Neuronen aufnehmen. In jüngerer Zeit, Rountree Et al. 28 demonstriert die differenzielle Stimulation der ein-und Netzhaut Bahnen mit Glutamat aus der subretinalen Seite und ein MEA die neuronalen Antworten von mehreren Standorten auf der Netzhaut zu erfassen.Obwohl diese Arbeiten vorläufig die Machbarkeit der chemischen Stimulation hergestellt haben, weitere Studien sind notwendig zu untersuchen, viele Aspekte dieses Ansatzes hinausgehen behandelt bisher25,26,27 , 28, und optimieren Sie die therapeutische Stimulationsparameter in in Vitro und in Vivo Tiermodellen vor der Übersetzung dieses Konzepts zu einem chemischen Netzhautprothese wie oben beschrieben. Aber derzeit gibt es keine etablierte Methode für die Durchführung der chemischen Stimulation der Netzhaut in der Literatur und Methoden in den früheren Werken haben nicht so ausführlich beschrieben worden, wie essentiell für replikativen Studien wäre. Daher ist die Begründung für diese Methoden-Papier um einen klar definierten Rahmen für die Durchführung von in-vitro- chemischen Stimulation der Netzhaut für die Ermittler interessiert entweder Replikation unserer früheren Studien27, 28 oder Weiterentwicklung dieses im Entstehen begriffene Konzept der chemischen Neurostimulation.
Hier zeigen wir eine Methode für die Durchführung von in-vitro- chemischen Stimulation der Netzhaut Neuronen im Wholemount Netzhaut von Wildtyp Ratten und einem Photorezeptor degenerierten Rattenmodell, die das Fortschreiten der degenerativen Photorezeptor eng imitiert Erkrankungen des Menschen. Die Beweggründe für die Entwicklung dieser Stimulation Methode in in-vitro- Modelle ist die therapeutischen Bereiche der verschiedenen Stimulationsparameter bewerten und studieren neurale Ansprechverhalten, die wäre unmöglich oder schwierig zu beobachten in in Vivo Modelle, vor allem während der ersten Studien konzentriert sich auf die Bewertung der Machbarkeit dieses Ansatzes. In diesem Verfahren zeigen wir Single-Site und gleichzeitige Multi-Site chemische Stimulationen der Netzhaut durch die Bereitstellung von kleiner Mengen von 1 mM Glutamat in der Nähe von Ziel Netzhaut Neuronen über kommerziell erhältliche Single-Port-Glas Mikropipetten und ein custom Industrieanforderungen Multiport mikrofluidischen Gerät, beziehungsweise. Während einer Site und der Multisite Stimulationen das grundlegende Ziel der Untersuchung der therapeutischen Machbarkeit der chemischen Neuromodulation erreichen, bietet jeweils einen speziellen Zweck einen einzigartigen Vorteil. Die Single-Site-Stimulation, die mit im Handel erhältlichen Pre gezogenem Glas Mikropipetten erreicht werden kann, kann verwendet werden, um die Chemikalien direkt in den Untergrund der Netzhaut an einem einzigen Standort zu injizieren und dient zu untersuchen, ob beobachtbaren RGC Rate spike Antworten, die visuell evozierten leichte Reaktionen ähneln können fokal unter der Injektionsstelle ausgelöst werden. Auf der anderen Seite kann Multisite-Stimulation, die ein speziell gefertigte multiport mikrofluidischen Gerät erfordert, Chemikalien räumlich an mehreren Standorten über die Oberfläche der Netzhaut zu injizieren und dient zu untersuchen, wie gut Glutamat-evozierten RCG Antwort-Muster entsprechen die Glutamat-Injektion-Muster in Muster Stimulation Studien.
Die hier vorgestellte Methode zeigt eine einzigartige neuronale Stimulation Paradigma, wobei die Netzhaut Neuronen chemisch stimuliert werden, durch die Injektion von native Neurotransmitter Chemikalien in den Untergrund der Netzhaut in Vitro. Diese chemischen Stimulationstechnik bietet mehrere Vorteile über die konventionelle elektrische Stimulationstechnik, einschließlich Selektivität und hoher Brennweite Spezifität Ziel Neuronen. Das Protokoll über Details wie kleine Volumen pneumatische Injektionen Neur…
The authors have nothing to disclose.
Die Arbeit, die in der Zeitung wurde von der National Science Foundation, neue Grenzen in der Forschung unterstützt und Innovationsprogramm (NSF-Emergency) Anzahl 0938072 gewähren. Der Inhalt dieses Papiers sind ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und repräsentieren nicht unbedingt die offizielle Meinung der NSF. Die Autoren wünschen auch Dr. Samsoon Inayat danken für seine Arbeit entwerfen und Testen der erste Versuchsaufbau für chemische Stimulation und Herr Ashwin Raghunathan für seine Arbeit, Gestaltung, Herstellung und Auswertung der multiport mikrofluidischen Vorrichtung benutzt in Diese Studie.
Microelectrode array, perforated layout | Multi Channel Systems, GmbH | 60pMEA200/30iR-Ti-pr | http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti |
MEA amplifier | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv |
Bottom perfusion groundplate for pMEA | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv-(BC)-PGP | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp |
3-axis Motorized Micromanipulator | Sutter Instruments, Novato, CA | MP-285 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html |
Micromanipulator Control System | Sutter Instruments, Novato, CA | MPC-200 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html |
Gantry style micromanipulator stand with linear slide | Sutter Instruments, Novato, CA | MT-75/LS | https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html |
8-channel Programmable Multichannel Pressure Injector | OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ Vendor: Harvard Apparatus UK |
PM-8000 or PM-8 | OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm Vendor: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1_HAUK_ProductDetail |
Axopatch 200A Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200A | Axopatch 200A has been replaced with a newer model Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier |
Patch clamp headstage | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV 201A | http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage |
Vacuum waste kit | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VMK | http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/ |
Pipette holder | Warner Instruments, Hamden, CT | QSW-A10P | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915 |
Pre-pulled 10 μm tip diameter glass micropipettes | World Precision Instruments, Sarasota, FL | TIP10TW1 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/ |
Zoom stereomicroscope | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-745T | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745 |
Microscope boom stand with dual linear ball bearing arm | Old School Industries, Inc., Dacono, CO | OS1010H-16BB | http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm |
Zoom Stereo Microscope with C-LEDS Hybrid LED Stand | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-445 | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445 |
Inverted microscope system | Nikon, Tokyo, Japan | Eclipse Ti-E | https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E |
Ames medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1420 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420 |
L-Glutamic Acid (Glutamate) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291 |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S8761 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761 |
60 mm Petri dish (10 mm tall) | Fischer Scientific, Waltham, MA | FB0875713A | 60 mm clear petri dish; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a |
Jewelers #5 Forceps | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 555227F | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/ |
Standard Scalpel Blad #24 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500247 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/ |
Scalpel Handle #4 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500237 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/ |
Vannas Tubingen Dissection Scissors | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 503378 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/ |
Nylon mesh kit | Warner Instruments, Hamden, CT | NYL/MESH | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173 |
Harp slice grid | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | HSG-5AD | http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/ |
Ag/AgCl reference electrode pellet | Multi Channel Systems, GmbH | P1060 | http://www.multichannelsystems.com/products/p1060 |
4 Channel Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VC3-4xG | http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/ |
Zyla 5.5 sCMOS microscope camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla 5.5 sCMOS | http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos |
Silver wire (50 μm diameter) | Fischer Scientific, Waltham, MA | AA44461G5 | https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5 |
Tygon microbore tubing (1.6 mm diameter) | Cole Parmer, Vernon Hills , IL | EW-06419-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901 |
Tilting Tool Holder with Steel Cannula | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | TILTPORT | One each of these were utilized for top perfusion and suction; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/ |
Roscolux #26 Light Red Filter Sheet | Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT | R2611 | Manufacturer: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux Vendor: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html |
Smith & Wesson Galaxy Red Flashlight | Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA | 4588 | Manufacturer: https://www.smith-wesson.com/ Vendor: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588 |
MC_Rack Software | Multi Channel Systems, GmbH | MC_Rack | http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack |
Labview Software | National Instruments, Austin, TX | LabVIEW | http://www.ni.com/labview/ |
NIS-Elements: Basic Research Software | Nikon, Tokyo, Japan | NIS-Elements BR | https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research |