Summary
이 연구에서 우리 신생아 쥐에 있는 내가 유전자 납품에 대 한 신뢰할 수 있는 방법으로 후부 반원의 운하 접근 방식을 설명합니다. 우리 후부 반원의 운하를 통해 유전자 배달 전체 내가 perfuse 수 보여줍니다.
Abstract
내가 유전자 치료는 난청과 현기증에 대 한 잠재적인 치료로 큰 약속을 제공합니다. 내가 유전자 치료의 성공의 중요 한 결정 요인의 한 청력 손실을 최소화 하면서 타겟된 세포 유형의 일관 변환 효율 귀착되는 전달 방법을 찾는 것입니다. 이 연구에서 우리 신생아 쥐에 내가 유전자 납품을 위한 실행 가능한 방법으로 후부 반원의 운하 접근 방식을 설명합니다. 우리 후부 반원의 운하를 통해 유전자 배달 전체 내가 perfuse 수 보여줍니다. 후부 반원의 운하의 쉬운 해부학 식별 뿐만 아니라 필요한 측 뼈의 최소한의 조작, 게가 외과 접근 내가 유전자 납품을 위한 매력적인 선택권.
Introduction
내가 유전자 치료의 급속 하 게 발전 분야 이다. 그것은 다양 한 동물 모델에서 전투 ototoxicity, 소음 외상, 그리고 유전 청력 손실1에 적용 되었습니다. 여러 최근 연구의 청각과 균형 기능 기능 복구 돌연변이 생쥐에서 내가 유전자 치료 배달2,3,,45,6, 후 7. 핵심 중 하나는 내가 유전자 치료의 성공을 내가 액세스 하는 데 사용 하는 외과 접근은 결정 요인. 이상적으로, 외과 접근은 실행 하기 쉬운 것, 해부학 랜드마크 일관 되 고 쉽게 식별, 것 및 타겟된 세포 유형의 결과 변환 높은 것입니다.
최근 연구에서 우리는 바이러스 성 유전자 치료는 whirler 돌연변이 마우스 (청력 손실과 vestibular 부전의 모델)의 후부 반원의 운하를 통해 주입 했다 때 감각 머리 세포의 효율적인 변환 보였다는 vestibular에 보였다 달팽이 관5에서 기관 뿐만 아니라. 감각 머리 세포 변환의 높은 효율 결과 이러한 돌연변이 생쥐에서 청각과 vestibular 기능 개선.
이 문서에서는, 우리가 자세히 설명 신생아 마우스 내가 액세스 하려면 후부 반원의 운하 접근.
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Protocol
모든 동물 절차 동물 관리 및 사용 위원회 귀 먹음과 다른 커뮤니케이션 무질서 (NIDCD ASP1378-15)에 국가 학회에 의해 승인 되었다.
1. 절차 설치 및 준비
- 모든 악기는 실험의 시작 부분에서 에틸렌 산화에 의해 소독. 동물, 사이 악기 비드 살 균을 사용 하 여 청소.
- 마이크로-인젝터에 micropipette에 바이러스 성 유전자 치료를 포함 하는 솔루션을 로드 합니다. 이 연구에 사용 되는 바이러스 성 벡터는 AAV2/8-whirlin (1 x 10 밀리 리터, 당13 게놈 사본 자료의 표 참조).
참고: 일반적으로, 1.1 µ L 총 볼륨은 micropipette에 로드 됩니다.
2입니다. 마 취
참고:이 연구에 사용 된 마우스 스트레인은 whirler 마우스. Homozygous 돌연변이 (Whrnwi/wi)와 heterozygous littermates (Whrn+ wi) 사용 되었다.
- 장소 (쓰레기 별도) 별도 새 장에 어머니.
- 쥐를 따뜻하게 유지 하는 반복 열 패드 (37.5 ° C에서 집합)에 쓰레기 (P0-P5 새끼)를 포함 하는 홈 케이지를 놓습니다.
- 라텍스 장갑의 손가락 부분을 잘라내어 그것에 강아지를 놓습니다.
- ~ 2 분 동안 얼음 양동이에 라텍스 장갑 엄지에 강아지를 놓습니다.
- 강아지와 팩의 표면 사이 4 "x4" 거 즈로 큰 광장 상업 플라스틱 고정 팩에 마 취 강아지를 놓습니다.
- 짓 눌린 얼음, 중장비 라텍스 장갑을 강아지 주위 얼음 장갑 장소.
- 강아지 (를 포함 하 여 회사 발가락 핀치) 다양 한 자극에 응답의 완전 한 부족에 의해 적절 하 게 취 경우 확인 합니다. 수술 (대략 5-10 분) 동안 얼음 팩에 강아지를 둡니다.
참고: 수술 하는 동안 더 이상 15 분 동안 얼음 팩에 새끼를 떠나는 것이 좋습니다.
3. 수술 방법 (그림 1)
- 일단 동물 마 취는 요오드 지우기와 알코올 닦아 귀 뒤 피부를 청소.
- Postauricular 절 개 마이크로-가 위를 사용 하 여 뒤에 ~ 2 mm를 만들고 마이크로 위 sternocleidomastoid 근육을 나눕니다.
- 안 면 신경와는 물집 식별 합니다. 물집 및 반투명 연골이 나이에 이며 그것은 거짓말 안 면 신경에 중간. Stapedial 동맥 유용한 랜드마크이 나이에 물집을 통해 볼 수 있습니다.
- 머리 뒤로 안 면 신경에 따라 후부 반원의 운하 (PSCC)을 찾을. 근육 섬유와 부드러운 조직 overlying 후부 반원의 운하 마이크로-가 위를 사용 하 여 제거 합니다.
참고:에서 PSCC는이 나이에 연골. - PSCC 유리 제 micropipette (~ 10 μ m 직경에서)를 사용 하 여 마이크로-인젝터에 침투.
- 내가 바이러스 성 유전자 치료 주사.
참고: 일반적으로, 49의 20 주사의 총 유전자 치료의 nL는 배달 후부 반원의 운하 ~ 40에 s (전체 볼륨 ~ 1 µ L). 사용 하는 바이러스 titer mL 당 1 x 1013 게놈 복사본을 했다. - 5-0 polyglactin 봉합 사를 사용 하 여 피부 절 개를 닫습니다.
4. 수술 후 관리
- 정상 체온으로 지속적인 수동 자극/낀된 인간의 손가락으로 마 취에서 복구 하는 동안 복원 하 온난 패드에 강아지를 두십시오.
- 일단 강아지 깨어, 가정 그것의 감 금에 다시 놓습니다.
- 홈 케이지 침구에 노출은 면봉으로 각 강아지를 애 무.
참고:이 목적으로 그들은 다시 그녀의 쓰레기 후 수술을 수락 하는 어머니의 가능성을 증가, 수술 전에 냄새 쥐를 것입니다. 만약에 가능 하다 면, 어머니 로부터 소변 수집 하 고 거부의 가능성을 더 감소를 면봉을 사용 하 여 강아지에 문질러 서 될 수 있습니다. - 그녀의8, 감도를 어머니의 코에 광 유를 적용 하 고 집으로 어머니를 다시.
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Representative Results
주입 후부 반원의 운하를 통해 신생아 whirler 쥐로 AAV8 whirlin 유전자 치료의 결과 utricular 세포 (그림 2)에서 식 (그린) whirlin 53.1%의 전반적인 감염 효율 (SD 38.1, n = 28)5 . 머리 세포 transduced stereocilia (레드) contralateral 비 주입 귀에서 머리 세포에 비해 길쭉한 했다 (3.20 ± 0.34 µ m와 5.35 ± 2.11 µ m 각각)5.
AAV8 whirlin의 후부 반원의 운하 주사도 whirler 쥐 (그림 3)에 있는 달팽이 관 세포의 변환 결과. 평균 내 면 머리 세포 감염 효율성은 77.1% (SD 12.7, n = 8)5. 머리 세포 transduced stereocilia 팁 whirlin (녹색) 표현과 stereocilia (레드) contralateral 비 주입 귀에서 머리 세포에 비해 길쭉한 했다 (5.04 ± 0.72 µ m 인공 정점에 1.01 ± 0.08 µ m 대 각각)5.
그림 1 : 자가 이미지.
자가 이미지 P0 마우스에 수술에 대 한 액세스 후부 반원의 운하 (PSCC)을 보여주는. 왼쪽된 귀에 표시 됩니다. PSCC 검정 파선 요약. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : Vestibular 세포 PSCC 유전자 납품을 사용 하 여 불리고 있다.
PSCC 통해 전달 AAV8 whirlin 접근 utricular 머리 세포 감염의 높은 수준의 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 인공 세포 PSCC 유전자 납품을 사용 하 여 불리고 있다.
PSCC 통해 전달 AAV8 whirlin 접근 달팽이 머리 세포 감염의 높은 수준의 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
몇 가지 수술 방법은 설치류 내 귀에 액세스 하려면 설명 있다. Cochleostomy 및 둥근 창 접근 가장 일반적으로 사용 됩니다 달팽이 관에 액세스 하려면 반면 후부 반원의 운하 endolymphatic sac 접근은 일반적으로 사용 되는 및 vestibular 장기1에 액세스 하. 최근 연구에서 우리는 바이러스 성 유전자 치료의 고효율 vestibular 기관과 달팽이 관5에 머리 세포 변환의 결과 후부 반원의 운하를 보였다. 사실, 달팽이 머리 세포 변환 때 후부 반원의 운하 주사를 통해 더 높은 유전 청력 손실과 vestibular 부전5,9같은 마우스 모델에서 둥근 창 주사와 비교. 둥근 창과 달팽이 관 사이 해부학 근접을 감안할 때, 그것은 역설적 둥근 창 주사 후부 반원의 운하 주사에 비해 낮은 달팽이 머리 세포 변환 발생할 수 있습니다 보인다. 이 둥근 창 인공 수로 인접해 있다는 사실에 의해 설명 될 수 있습니다. 따라서, 바이러스 성 유전자 치료 라운드 창을 통해 주입 때 인공 수로10에서 오는 중추에 의해 그것의 농도 희석 수 있습니다.
찾는 후부 반원의 운하 주입 인공 와우 및 vestibular 머리 세포 변환 귀착되는 또한12다른 연구11,의해 보고 되었습니다. 오카다 외에의해 연구, AAV GFP 달팽이 관 및 vestibular 머리 셀의 변환으로 알려졌다. 그러나, 숫자 정량화는 수행 되지 않습니다. 스즈키 외.에 의해 연구 보고는 AAV-Anc80-GFP 성인 쥐에 후부 반원의 운하 접근을 사용 하 여 달팽이 관 및 vestibular 머리 세포 변환의 높은 수준. 성인 생쥐, 작은 카 테 터와 후부 반원의 운하 cannulation이 바람직합니다, 후부 반원의 운하 뼈 덮 음 이기 때문에 완전히 굳어진12. 성인 쥐에 후부 반원의 운하 catheterization 변환 효율성을 줄일 수 주입 역류를 최소화 시킬 수 있습니다. 이 단계 이후 후부 반원의 운하 뼈 덮 음 그 나이에 여전히 연골 신생아 쥐에 필요 하지 않습니다.
후부 반원의 운하 주사의 단점 중 하나는 하나 확신할 수 없습니다 perilymph 또는 endolymph에 주입 된 유전자 치료를 전달 하는 여부 사실 이다. 이 결손에도 불구 하 고 후부 반원의 운하 해부학 쉽게 찾을 고의 식별에 대 한 측의 최소한의 조작 필요 합니다. 이 수술 외상으로 인 한 내가 손상의 기회를 줄인다. 후부 반원의 운하 주입 내가 유전자 치료 납품을 위한 매력적인 옵션입니다.
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Disclosures
저자 아무 관련 공개 수 있도록 있다.
Acknowledgments
이 작품은 고급 이미징 코어는 NIDCD 사단의 교내 연구 /NIH (DC000082-02 W.W.C.,) 뿐만 아니라 DC000081에서에서 기금에 의해 지원 되었다. 우리는 동물에 대 한 배려를 위한 NIDCD 동물 시설 직원에 대 한 감사입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating microscope | Zeiss | OPMI Pico ENT microscope. Other dissection microscopes would also work. | |
| Micro-forcepts | Fine Science Tools | 11251-10, 11295-51 | #5 and #55 Dumont |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Nanoliter2000 microinjector | World Precision Instruments | ||
| Heating pad | Mastex | Model 500/600 | |
| 5-0 vicryl sutures | Ethicon | ||
| AAV8-whirlin | Vector Biolabs | ||
| Glass pipette | Sutter Instruments | B100-75-10 | Borosilicate glass |
References
- Chien, W. W., Monzack, E. L., McDougald, D. S., Cunningham, L. L. Gene therapy for sensorineural hearing loss. Ear Hear. 36, 1-7 (2015).
- Askew, C., et al. Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice. Sci Transl Med. 7, 295 (2015).
- Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75, 283-293 (2012).
- Pan, B., et al. Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c. Nat Biotechnol. 35, 264-272 (2017).
- Isgrig, K., et al. Gene Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome. Mol Ther. 25, 780-791 (2017).
- Lentz, J. J., et al. Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness. Nat Med. 19, 345-350 (2013).
- Shibata, S. B., et al. RNA Interference Prevents Autosomal-Dominant Hearing Loss. Am J Hum Genet. 98, 1101-1113 (2016).
- Van Sluyters, R. C., Obernier, J. A. Guidelines for the care and use of mammals in neuroscience and behavioral research. Contemp Top Lab Anim. 43, 48 (2004).
- Chien, W. W., et al. Gene Therapy Restores Hair Cell Stereocilia Morphology in Inner Ears of Deaf Whirler Mice. Mol Ther. 24, 17-25 (2016).
- Hirose, K., Hartsock, J. J., Johnson, S., Santi, P., Salt, A. N. Systemic lipopolysaccharide compromises the blood-labyrinth barrier and increases entry of serum fluorescein into the perilymph. J Assoc Res Otolaryngol. 15, 707-719 (2014).
- Okada, H., et al. Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors. Otol Neurotol. 33, 655-659 (2012).
- Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction. Sci Rep. 7, 45524 (2017).
