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Immunology and Infection

乳癌の HER2 遺伝子増幅の不均一性を評価する高スループット スクリーニング プラットフォームを構築

doi: 10.3791/56686 Published: December 5, 2017

Summary

HER2 陽性細胞の不均質分布は、乳癌のサブセットに観察することができ、臨床のジレンマを生成します。信頼性が高く、コスト効率の高いプロトコルを定義し、定量化、HER2 内腫瘍遺伝的異質加工乳癌の大規模な一連の不均一性を比較を紹介します。

Abstract

ひと上皮成長因子受容体 2 (HER2) に対して目標とされた療法は HER2 陽性乳癌患者の結果根本的に変わった。ただし、少数の場合では、主要な臨床的課題を生成する HER2 陽性細胞の不均質分布が表示されます。日には、特性評価および大規模なコホートでHER2異種遺伝子増幅の定量化の信頼性と標準化されたプロトコルは提案されていません。複数の乳癌のさまざまな地形部分に HER2 状況を同時に把握する高スループット方法論を紹介します。特に、強化されたティッシュのマイクロ アレイ (TMAs) 腫瘍のターゲット マッピングを組み込むを作成する検査法を示します。TMA のすべてのパラメーターは、具体的には銀の in situハイブリダイゼーション (SISH) ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 乳房組織のために最適化されています。(すなわちER、PR、キ67、HER2) 予後と予測バイオ マーカーの免疫組織化学的解析自動化されたプロシージャを使用して実行してください。カスタマイズされた SISH プロトコルは、異なる固定、処理、および保管の手順を受けた複数の組織間で高品質の分子分析を許可するように実装されています。本研究では、証拠の原理特定の DNA シーケンスを効率的かつコスト効果の高い方法を使用して同時に複数の明瞭な地形区域のローカライズと異質加工乳癌できるを提供します。

Introduction

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HER2が過剰に発現して、すべての侵襲乳房癌1,2の 15-30% の増幅において。HER2 過剰発現の有無による推論は > 染色 (3 +)、遺伝子増幅遺伝子コピー数は ≥6、または HER2/セントロメア比は ≥2 が評価されることができます中にカウントで強い膜免疫組織化学 (IHC) と 10% セル少なくとも 20 細胞の in situハイブリダイゼーション (っぽい)3

内腫瘍の遺伝学的不均一性は、バイオ マーカーの評価と治療応答4潜在的有害寄稿している乳癌に広く記載されています。よると、大学のアメリカの病理学者 (CAP)、HER2 の不均一性が存在でHER2増幅される場合 > 5% と <5細胞の浸潤腫瘍の 50%。残念ながら、HER2 乳癌の空間的不均一性の実際の発生率は病理学者の間で論争の何人かの著者は、それを維持する極めてまれなイベントだし、40% の症例が他の人まで示唆HER2 異種1,5,6,7,8,9,10。にもかかわらず、この状態を支える生物学的メカニズムはまだ完全には明らかにできなかった内腫瘍 HER2 の不均一性の予後の臨床影響乳房癌患者11にとって重要であります。

最近、発色っぽい (CISH) とシルバーっぽい (SISH) など、明るいフィールド分子技術は、蛍光の ISH (魚)12と比較していくつかの利点を持つ FFPE 組織で HER2 の不均一性を検出するための信頼できる方法として浮上しています。残念ながら、単一症例のバルク分析の大規模コホート研究で非現実的なままです。いくつかのグループは、組織化学、IHC や ISH TMA 技術との組み合わせががん生物学13,14,15,16の研究で貴重な戦略を表すことができますを示唆しています。この広く採用されている方法で、異なる患者から組織サンプル分析できます同時に、組織・採用し、育成の場合14の大シリーズの一様解析試薬を最小限に抑えます。ただし、同時別処理試薬、固定時刻、および保全方法雇用などの面で、アーカイブを受けた複数の組織サンプルのハイスループット分子特性解析できるプロトコルがありません。ブロック。

乳癌の HER2 の空間的不均一性の予後および臨床的影響を与え、異質加工例の大シリーズに評価する分子統合プラットフォームを開発しました。ここでは、我々 は生成および SISH による高収率 TMAs 乳癌のHER2増幅の内腫瘍の不均一性を分析する研究所戦略を描きます。次のプロトコルを開発した腫瘍径 > 5 mm (> TNM 2017 に従って pT1b)17。小さい病変は、フルフェイスの連続切片の解析を実行することをお勧めします。私たちの手順は、ケースごとに 6 の領域 (範囲 4-8) の意味を包含まで 30 の乳癌の同時 IHC と SISH の分析のためことができます。全体で、500 μ m のコアとグリッドとエッジの間に 2 mm の間で、直径 1 mm の 180 のティッシュのコアは、TMA ブロックごとに生成されます。

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Protocol

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本研究は IRCCS Ca から制度上の審査委員会によって承認された ' グランダ財団、ポリクリニコ病院、ミラノ、イタリア。

1. 患者や組織標本の選択

  1. すべての利用可能なヘマトキシリンとエオシン (H & E) とオリジナルの診断から IHC スライドを含む、分析するすべてのケースのアーカイブのスライドを取得し、1 つ H & E が非腫瘍性乳房組織 (例えば、手術マージン) を一致する場合は、.
  2. ケースのレビューを行います。
    注: このタスクでは、乳腺病理の経験を持つ、少なくとも 2 つの病理学者べき診断のスライドを話し合うし、collegially 意見の相違を解決します。従来の顕微鏡または (多中心性の研究では、後者を支持) テレパソロジーのツールのいずれかを使用します。ある場合は、すべての耳障りな場合を除外します。
    1. 18胸の腫瘍の世界保健機関 (WHO) 分類の最新版によると全症例の組織学的再分類を実行します。
    2. アーカイブの臨床サンプルに存在する場合、各ケースの正常組織が少なくとも 1 つ非腫瘍性端末機乳管小葉で構成されてことを確認します。
    3. 異機種混在環境を示すすべての腫瘍領域を識別する細胞学的, 建築, または (共同病理医と TMAs をつくる technician(s) によって実行される) に明視野顕微鏡を用いた IHC 機能。
  3. デジタル スライド ソフトウェア (図 1 a) の適切なツール、スライド ガラス上のマーカーで別々 の地形の領域を強調表示します。
  4. 選択したスライドを基に、アーカイブから対応する FFPE ブロックを取得します。
    注: TMA を最適化する構造、組織の枯渇を避けるために、TMA を維持するためにパンチ構造健全性、症例 < 1 mm 厚残存組織を除外する必要があります。

2. 設計施工、Kononen 法に基づく TMAs

  1. 作成し各場合の個別の領域のレコードを組み込む新しいスプレッドシート ファイルを開きます。表 1 に代表されるようにそれぞれ別の列に次のデータを含める: ケース ID、ブロック ID、領域 ID、組織型 (例えば、正常組織、侵襲的なコンポーネント histotype、コンポーネント histotype上皮内)、地形 (例えば、腫瘍コア、侵襲的なフロント)、形態 (例えば、核異型度、アーキテクチャ、有糸分裂、細胞診)、バイオ マーカーの状態 (すなわち、エストロゲン受容体 (ER)、プロゲステロン受容体(PR)、キ67 と HER2)、およびすべての他の IHC 機能の利用。
    1. ドキュメントを保存します。
  2. TMA のプロジェクトを作成します。
    1. インストールし、TMA デザイナー ソフトウェアを開きます。
    2. TMA 受信者ブロックを定義: ファイル] メニューを介してアクセス > 新しい > ブロックまたは CTRL + B の方法で
    3. 入力、Tab キーを押してまたはパラフィン ブロックの寸法を入力して最初の欄をクリックして: 幅 35 (mm) 高さ (mm) 20。「マージン」値 (すなわち、パラフィンで mm のエッジからの距離) とタイプ「2」(図 1 b).データを保存するには、適切なボタンをクリックします。受信者のブロックの新しいテンプレートが保存され、新しい組織アレイ ・ テンプレートで使用する準備ができています。
    4. 組織アレイ プロジェクトを作成: メニュー ファイルへのアクセス > 新しい > 組織配列または CTRL + t. を使用して
    5. 組織アレイ、コメント、および著者の名前を入力し、「次へ」をクリックしてください「インポート」アイコンをクリックして、以前に作成した、受信者のブロックのテンプレート ファイルを選択、「次へ」をクリックしてください
    6. スポット サイズとして 1 mm を選択するには、円形のボタンをクリックします。近隣スポットの 2 つのセンターの間のスペースであるスポットの間隔として 500 μ m を選択します。231 をする必要があります作成すると、スポットの合計数を計算する電卓のアイコンをクリックします。「次へ」をクリック
    7. それをクリックするとスポットの番号設定モードを定義します。ボタンをクリックする「定義」グリッドとサブ グリッドを作成します。中央線 (6 番線) を削除と 8 と 15 列。方向の行 1 の 3 つのスポットを維持します。最終的なマップは図 2で表される 183 点の合計数を網羅する必要があります。
    8. 組織の種類の一覧を定義: ファイル] メニューを介してアクセス > 新しい > CTRL + l. を使用して組織の種類のリスト
    9. 以前に定義された組織の説明を挿入します。下矢印キーを押してまたはをクリックして、行を追加ボタンを +。
    10. プロジェクトの定義: ファイル] メニューを介してアクセス > 新しい > ブースター プロジェクトまたは CTRL + P を使用して
    11. 組織アレイ、コメント、および著者の名前を入力し、「次へ」をクリックしてくださいスプレッドシート ファイル、組織の種類のリスト、適切なアイコンをクリックして以前に作成した組織配列モデルをインポートします。
    12. 「すべて選択」をクリックし、各組織型のスポットの数を定義設定を適用するには、「一致する」ボタンをクリックします。サンプリングおよびこのプロジェクトの受信者のブロックに転送されるコアの合計数の一覧が表示されます。プロジェクトを保存し、プログラムを閉じます。
  3. 受容体ブロック (図 1 b) を準備します。
    1. 65 ° C で伸縮性のあるパラフィンとクレンジングされた金型を埋める
    2. 金型の中に一晩室温で冷却するためパラフィン ブロックを残します。
    3. 金型からパラフィン ブロックを抽出します。クラックが発生する場合は、ブロックを破棄、手順 2.3.1-2.3.3 を繰り返します。
  4. 自動または半自動 arrayer19を使用して TMA を構築します。
    1. 選択したすべての FFPE ブロックと対応する H & E セクションの注釈を取得します。
    2. オン、arrayer、arrayer カルーセルの受容体ブロックを挿入します。
    3. Arrayer control station ソフトウェアを開き「新しい組織配列」をクリック (図 1) 以前に作成したプロジェクトをロードします。
    4. 「続行」をクリックし、、メニューからドナー ブロック位置を選択します。
    5. 各受信者のブロック上に開始位置を定義する: 矢印キーを使用してレーザ光を移動し、受信者のブロックのパラフィンの左上端に合わせます。
    6. 「次へ」をクリックしてし、垂直方向の配置を繰り返します。
    7. 受信者 (アクセプタ) ブロックの以前に定義された座標で穴を自動的に作成する「次へ」をクリックしてします。
    8. パンチを空にします。
    9. サンプリングのドナー ブロックを置き、関心の以前の注釈の領域から組織のコアを削除します。
    10. ドナー組織のコアを受信者 (受容体) のブロックの穴に挿入します。
    11. Arrayer からドナー ブロックを削除します。
    12. TMA を完了するまでは、手順 2.4.5-2.4.11 を繰り返します。
  5. 滅菌空白のスライドに新しく生成された TMA ブロックの組織側を置いて 5 分の 45 ° c ラボ オーブンでそれらを置きます。
  6. 5 のスライドを軽く押して、ブロックの織芯を平らにします。一度 (合計 2 回) の手順を繰り返します。
  7. スライドと共に TMA ブロックをオーブンから削除、それらを反転およびスライドからブロックを注意深く取り外します。
  8. 65 ° C で伸縮性のあるパラフィンの薄層で TMA 組織表面を覆う
  9. 2 時間室温で TMA ブロックを残してください。
  10. 24 h の 4 ° C で TMA ブロックを転送します。
    注: TMA ブロックは 4 ° C で疲労困憊まで格納できます。

3. 組織化学的および免疫組織化学的解析

  1. TMA のセクションをカットします。
    1. パラフィンを寒さに 10 分-10 ° C の表面にパラフィン側とともに TMA 受容体ブロックを置きなさい。
    2. 純水と浮遊風呂、38 ° c の熱の設定
    3. 回転式ミクロトームに新しいブレードを配置、ワックスのブロック刃に直面している垂直面に配置してブロックをミクロトーム チャックに挿入します。
    4. ブレードとブロックを慎重に近づくし、位置が正しいことを確認するいくつかの薄い部分をカット必要に応じて調整します。
    5. 3 μ m 厚のセクションをカットします。
    6. ピンセットを使用してセクションをピックアップし、お風呂の水面に浮きます。
    7. 正規と IHC/っぽいガラス スライドに水アウトバスのセクションを選択します。
    8. スライドをラックに置き、一晩 45 ° C のオーブンで保管します。
      注: の準備、TMA のセクションは 24 h 内染色する必要があります。
  2. (H & E) 染色を実行、オスミウムを使用します。
    1. オスミウムのラックにスライドを挿入し、10 分の 60 ° C で配置します。
    2. オスミウムの外側に直面している標準的な H & E クリップで、tma ラック スライド ロード ステーション挿入荷重ドロワーを開きます。
    3. 引き出しを閉じたクリップはシステムによって自動的に認識され、次のプロトコルが開始されます: 37 ° C (6 分)、キシレン (2 分)、キシレン (2 分)、エタノール 100% (2 分)、エタノール 100% (2 分)、エタノール 95% (2 分)、エタノール 95% (2 分) オーブン駅、水 (4 分)、Carazzi のヘマトキシリン (9 分)、低圧流水 (2 分)、エオシン 1% (1 分)、低圧流水 (2 分)、95% のエタノールを蒸留 (20 s)、エタノール 95% (20 s)、エタノール 95% (20 s)、エタノール 95% (20 s)、エタノール 100% (15 秒)、エタノール 100% (15 秒)、キシレン (30 s)、キシレン (30 秒)。
    4. 引き出しからラックをアンロードし、カバー スリップのスライドをマウントします。
      1. ピペットとマウントのドロップを収集し、カバーのスライドの外側のエッジの上に置いた。
      2. スライド カバー スリップのウェット側を配置し、マウント 30 分乾燥をさせます。
  3. ER、PR、キ67、HER2 に染色を行う自動化された immunostainer を使用しています。
    注: 染色の実行を開始する前に、システムを起動すると消耗品試薬ボトル (材料表) のチェックから容器を廃棄物します。
    1. 10 分の 60 ° c を分析する TMA スライドを配置します。
    2. Immunostainer 計測器とソフトウェアを起動します。
    3. ホーム ビューでプロトコルをクリックし、プロトコル作成/編集をクリックします。
    4. 標準的な軽打を選択 (3, 3'-ジアミノベンジジン) IHC プロシージャは基本的なテンプレートを変更します。
    5. ボックスの一覧で"Deparaffinization"をフラグし、72 ° C で中の温度を設定
    6. Cc1 マスキング ソリューションをフラグ、95 ° C で培養時間 36 分媒体温度を設定します。
    7. 一次抗体ボックスのフラグを設定、(計測器ソフトウェアは試薬カルーセル上ディスペンサーを認識) ER インライン ディスペンサーの ID を挿入し、16 分インキュベーション時間を設定します。
    8. Counterstaining ボックスのフラグ、ヘマトキシリンを選択・ セット 12 分インキュベーション時間。
    9. 「名前を付けて保存」ボタンをクリックし、、プロトコルの名前。
    10. 次の一次抗体インキュベーション時間を使用して残りの抗体の手順 3.3.3-3.3.9 を繰り返します: PR 16 分、キ67 16 分および HER2 12 分希釈に使える (RTU) 抗体を使用します。
    11. ホーム ビューでラベルを作成] ボタンをクリックします。
    12. プロトコルをクリックし、ごとに分析する TMA の ER、PR、キ67、HER2 のプロトコルを追加します。
    13. 閉じる/Print] ボタンをクリックします。
    14. ラベル ・ テンプレートが表示されたら、ラベルの TMA の Id を入力します。
    15. ラベルを印刷し、TMA のスライドでそれらを適用するには、印刷をクリックします。
    16. 楽器のアイコンをクリックし、「準備完了」として楽器のスタートアップ モードを設定します。
    17. 試薬カルーセルをカバーしてボンネットを開ける、検出システムを配置し、一次抗体は、フードを閉じます。
    18. 開き、TMA スライドをロードし、同じボタンをクリックして引き出しを閉じるに引き出しに正面のボタンをクリックします。
    19. として"Running"楽器のスタートアップ モードを設定し、指示に従います。
    20. TMA スライド楽器スライド コントロールの完成品スライド ボタンとリンスで開いているすべての引き出しを押すことによって実行、アンロードの終わりにそれらはせっけん水に任意の残りの試薬を削除を温めます。
    21. 低圧の冷たい流水スライドを洗って脱水 TMA スライド ガラス基板を各スライドに適用。
  4. ER、PR、および HER2 の IHC 分析を実行次のアメリカ臨床腫瘍学会 (ASCO)/キャップ、ガイドラインと乳癌ワーキング ・ グループ (表 2) の国際キ67 の勧告に従ってキ67。
    注: この分析する必要があります個別に実行する離散組織スポットで乳腺病理の経験を持つ病理学者によって。
    1. 腫瘍細胞核の ≥ 1% が陽性20,21,22,23場合正の値として ER 式を評価します。
    2. 腫瘍細胞核の ≥ 1% が陽性20,21,22,23場合肯定的な PR の式を評価します。
    3. HER2 式として評価:) スコア 3 + 周膜染色、完全かつ強烈な b) 場合はスコア 2 + 不完全なまたは弱い/穏健派は、周膜染色場合、侵襲性の腫瘍のセルのまたは完全な > 10% 以内と周膜染色は激しいと侵襲性の腫瘍細胞、c ≤ 10% 以内) スコア 1 + かすか/ほとんど知覚が不完全な膜染色場合、侵襲性の腫瘍細胞は、d の > 10% 以内) 否定的な汚損が存在しない場合、または細胞膜不完全で弱い人/ほとんど知覚は、染色と細胞3,24の ≤ 内侵襲性の腫瘍の 10%。
    4. ランダムに少なくとも 1,000 の腫瘍細胞の核染色と細胞の割合は、以上 10 ハイパワー フィールド (400 X の倍率) を選択、キ67 インデックスを評価25

4 HER2の SISH 解析

  1. TMA のセクション (繰り返し手順 3.1) をカットします。
  2. SISH HER2 の自動化された immunostainer を使用してを実行します。
    1. 10 分の 60 ° c を分析する TMA スライドを配置します。
    2. Immunostainer 計測器とソフトウェアを起動します。
    3. ホーム ビューでプロトコルをクリックし、プロトコル作成/編集をクリックします。
    4. 基本テンプレートを変更する「U デュアルっぽいウシ初乳」プロシージャを選択します。
    5. ボックスの一覧で「乾燥」をフラグし、設定温度 63 ° C、20 分。
    6. ボックス、し、「細胞調節 CC2」、「細胞調節"フラグを設定し、4 分で 86 ° C および潜伏時に温度設定します。
    7. それぞれ CC2 軽度 (1 サイクル)、標準 (サイクル 2)、および拡張 (サイクル 3) を 8 分、12 分、8 分のフラグです。
    8. ボックスの一覧で「っぽいプロテアーゼ 3」フラグを設定し、16 分でインキュベーション時間を設定します。
    9. HER2DNP と CHR17DIG プローブを選択し、6 時間インキュベーション時間を設定します。
    10. 76 ° C、8 分で洗濯物を設定します。
    11. 32 分で SISH 多量体 (SIL っぽい DNP HRP) インキュベーション時間を設定します。
    12. 銀発色 (SIL っぽい DNP CHRC) インキュベーション時間を 4 分で設定します。
    13. 24 分で赤い多量体 (赤っぽい掘る AP) インキュベーション時間を設定します。
    14. 8 分で赤い発色 (赤っぽい掘る FR) インキュベーション時間を設定します。
    15. フラグ"Counterstaining"ボックスの一覧には"ヘマトキシリン II"を選択し、インキュベーション時間を 8 分に設定します。
    16. ボックスの一覧で"後 Counterstaining"フラグを設定「ブルーイング試薬」を選択し、インキュベーション時間を 4 分に設定。
    17. 3.3.11-3.3.15 からの手順を繰り返します (選択変更 U ウシ初乳っぽいデュアル プロトコル)。
    18. 試薬カルーセルをカバーするフード、洗濯および ISH 検知システムを配置し、フードを閉じる開いています。
    19. 3.3.18-3.3.21 からの手順を繰り返します。
  3. HER2の SISH 分析を実行: HER2/CEP17 比が ≥2.0、平均HER2コピー番号 ≥4.0 信号、セル当たりの場合陽性HER2遺伝子増幅を評価、 HER2/CEP17 比が負 < 2.0平均HER2コピー数 < 4.0 信号/セル3,24
    注: IHC と同様に、この分析の実行すべき個別に離散組織スポット乳腺病理の経験を持つ病理学者によって。

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Representative Results

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全体的に、444 侵襲乳房癌っぽい分析用に最適化された 15 TMAs に組み込まれていた。サンプリング 2,664 スポット、2,651 (99.5%) 以前に選択したエリアの代表、以降の解析に従うと考え。内腫瘍の不均一性は腫瘍の異なる地形エリアの HER2 陽性クローンの不均質分布の特定のフォーカスを持つ IHC と SIH、により決定しました。表 3は、異なる histotypes 内 ER、PR、キ67、HER2 の状態に焦点を当てて、分析例の生物学的特徴を示しています。特に、例の 18% が HER2 陽性細胞を表示する発見された > 腫瘍細胞の 10% したがって HER2 陽性評価特性と照合し、。興味深いことに、この値は、報告率の範囲の HER2 陽性乳癌の低い方の端に近いです。その一方で、HER2 の状態だった HER2 陽性、HER2 陰性乳がん (図 3表 4)、乳癌が非常に異質の病気である概念を提供するさらなる信憑性の別々 の領域に変数ゲノムのレベルでは。SISH 解析の故障率、ジニトロフェノール タグ付きプローブがターゲット シーケンスにバインドされて 2,629/2,651 スポットの合計数の 0.8% であった。

Figure 1
図 1: 乳癌の大規模コホートで HER2 の不均一性の分析のための高スループット プラットフォームの実現相の礎石の表現。(A) 選択範囲の領域のサンプルは、同定とすべてのエリアのハイライトを含める必要があります細胞学的, 建築, または IHC の不均一性。これの最も重要な手順の 1 つ (B) の手順、高品質受容体ブロックの作成も微細な亀裂が後続の in situハイブリダイゼーション解析の整合性を推測できることを考える。(C) Kononen 法を用いた高収率 TMA を構築する 1 mm 直径の針とデジタル導かれた arrayer を採用することが重要です。(D) TMA プロジェクトの作成は、ディメンションの定義と、TMA のボーダーから始めるべきです。(E) すべて IHC や ISH 解析 TMA 間をすばやく移動するためにデジタル病理ツールを使用して実行してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: このプロトコルの実現 TMA の平面表現します。直径 1 mm、500 μ m 離れて、180 点の合計数をその場で最適な交配のため許可します。高密度 TMAs はシングル スポット的に高い故障率で、すべてのスポットに全体的な品質と反応の均一性の点で非生産的な結果を提供します。「オリエンテーション」のスポットで、中央-左グリッドのに注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 銀を示す代表的な顕微鏡その場で異種 HER2 乳癌のハイブリダイゼーション解析します。このパラダイムの例でない特殊な型 (BR_121) の高品位な侵略的な乳癌の 2 つの個別の点はセントロメア列挙プローブ 17 に比べてHER2遺伝子 (黒) 増幅の面で異なる結果の (赤) を示した。特に、1 つの領域腫瘍のコアに属するとサイトケラチン 7 不規則なHER2増幅であった染色パターンを示す (A)、(すなわち腫瘍辺縁) 侵襲的な正面からの単一のスポット中表示野生型HER2パターン (B)。スケール バー = 50 μ m (インセット 20 μ m)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

ケース ID ブロック ID 領域 ID 組織 地形 形態 小胞体 PR キ67 HER2 IHC の他の機能
BR_121 A5 通常 切除断端
BR_121 A1 NST 腫瘍コア G2 CK7 +
BR_121 A1 b NST 腫瘍コア G3 +/-CK7
BR_121 A3 NST 腫瘍コア 粘液の質 90 100 12 2 +
BR_121 A3 b NST 侵襲的なフロント 鋼管 100 100 35 2 +
BR_121 A4 NST 侵襲的なフロント G3
BR_121 A3 c DCIS (EIC +) 侵襲的なフロントに隣接します。 高級です 100 100 45 2 +

表 1: 研究に含まれている 1 つのケースの代表的なレコード。この場合は (BR_121)、病変の周囲と CK7 immunoexpression の焦点-不規則な損失でマイナーな管状コンポーネントを示す焦点可及的に特別な種類はありません高品位侵襲癌であった.レポート、バイオ マーカーを含む免疫機能は、診断の時点で実行される分析を指します。NST、ない特別な型の浸潤性癌浸潤性膵管癌;EIC +、広範な乳管内成分;CK7、サイトケラチン 7。

マーカー クローン 会社 希釈 脱脂 抗原検索 抗体の孵化 スコアリング システム
小胞体 SP1 ベンタナ RTU 72 ° C で EZ 準備 36 分 95 ° C で cc1 16 分 キャップ/ASCO のガイドライン23
PR 1E2 ベンタナ RTU 72 ° C で EZ 準備 36 分 95 ° C で cc1 17 分 キャップ/ASCO のガイドライン23
HER2 4B5 ベンタナ RTU 72 ° C で EZ 準備 36 分 95 ° C で cc1 18 分 キャップ/ASCO のガイドライン3
キ67 30-9 ベンタナ RTU 72 ° C で EZ 準備 36 分 95 ° C で cc1 12 分 作業グループの推奨事項25乳癌における国際キ67

表 2: 抗体、クローン、希釈、抗原検索方法、スコアリング システムを免疫組織化学的解析の採用の一覧。ER、エストロゲン受容体;PR、プロゲステロン受容体;RTU、準備ができて使用します。

Histotype n (%) ER + (%) PR + (%) キ67-低 (%) キ-67-高 (%) HER2 + (%)
ない特殊なタイプの癌 344 (77.5) 301 (87.5) 257 (74.7) 85 (24.7) 259 (75.3) 71 (20.6)
浸潤性小葉癌 53 (11.9) 53 (100.0) 44 (83.0) 36 (67.9) 17 (32.0) 4 (7.5)
浸潤性癌、混合型 9 (2.0) 8 (88.9) 6 (66.7) 0 (0.0) 9 (100.0) 1 (11.1)
管状癌 8 (1.8) 8 (100.0) 8 (100.0) 8 (100.0) 0 (0.0) 0 (0.0)
粘液癌 11 (2.4) 11 (100.0) 9 (81.8) 7 (63.6) 4 (36.4) 0 (0.0)
Micropapullary 癌 7 (1.6) 7 (100.0) 7 (100.0) 5 (71.4) 2 (28.6) 2 (28.6)
アポクリン陳列侵襲性癌の 1 例 5 (1.1) 3 (60.0) 1 (20.0) 1 (20.0) 4 (80.0) 3 (60.0)
乳頭癌 1 (0.2) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (100.0) 0 (0.0)
髄様癌 4 (0.9) 0 (0.0) 1 (25.0) 0 (0.0) 4 (100.0) 0 (0.0)
化生癌 2 (0.5) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (100.0) 0 (0.0)
合計 444 391 (88.0) 333 (75.0) 142 (32.0) 302 (68.0) 81 (18.2)

テーブル 3: 乳房のがん histotypes、受容体の状態、および HER2 不均質状態。ER、エストロゲン受容体;PR、プロゲステロン受容体;キ67-低、キ67 インデックス < 18%;キ67 高、キ67 > 18%。

解釈腫瘍スポット HER2 陽性スポット (%) ホルモン受容体の状態 HER2 異機種混在の場合
6 5 (83) 肯定的です 10
6 5 (83) 否定的です 1
6 4 (67) 肯定的です 7
6 4 (67) 否定的です 1
6 2 (33) 否定的です 1
6 1 (17) 肯定的です 1
5 3 (60) 肯定的です 10
5 1 (20) 肯定的です 2
4 3 (75) 肯定的です 9
4 2 (50) 肯定的です 8
4 1 (25) 否定的です 1
3 2 (67) 肯定的です 5
3 1 (33) 肯定的です 2
46 25 (54) 53 (93) 57

表 4: HER2 式、ホルモン受容体の状態、および HER2 異種場合。57 HER2 異種例中 4 例 (7%) いた ER 陰性と PR 陰性、HER2 の不均一性を評価するための臨床的重要性を確認します。

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Discussion

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ここでは、異質加工乳癌の高収率 TMAs のHER2遺伝子およびその対応するセントロメアの SISH 解析を実行する研究所戦略の詳細しています。このメソッドは、コスト効果の高い、乳房癌取得フォーム病理アーカイブの大規模コホートであるHER2遺伝子増幅の不均一性の研究のためのほとんどの実験室で実施することができます。

臨床的重要性のため HER2 の乳がんとその異種の式によって生成された課題テスト、イントラ- と間-tumor HER2の遺伝学的不均一性を評価する高スループット テスト プロトコルを開発しました。分析エリアには、特定の細胞学的, 建築, と IHC 機能に基づいて、事前侵襲性と侵襲的なコンポーネントが含まれます。

このプロトコルでは慎重に管理する必要がありますいくつかの重要な段階があります。1 つの重要なステップは、関心領域の選択です。学際的なアプローチを通じてさまざまな地形領域の注釈が最終的な分子分析の品質を確保する重要なことを定めています。特に、病理学者によって実行される診断のスライドの共同のリビジョンと技術者非常に適切なスポット (すなわちスライド上の特定のエリアを反映してスポット) の数を増やすし、その後の故障率を低減シングル スポット分析。ただし、いくつかの腫瘍スポットが複数 IHC や ISH 解析の連続切片後失われます。組織の可用性に基づいてすべての可能な場合は、この不便を克服するため、重複または千九百六十八 TMAs の構築をお勧めします。さらに、我々 は TMAs のアクセプター FFPE ブロックの作成の厳密な実験室プロシージャの定義の重要性を強調します。確かに、TMA ブロックで最小限の亀裂がっぽい分析反応の明快さ、再現性、品質面で全体を推測可能性があります我々 が観察しています。クラックが発生した場合は、TMA 建設のためドナー ブロックが無視されるべき。それを肯定するは、ただし、IHC は次善 TMAs でも実行できるし、我々 の経験でこのような分析の中に技術的な問題の証拠は認められなかった。

このプロトコルは、高収率胸 TMAs のHER2 SISH 解析のために最適化されているにもかかわらず、それは前述14、として、いくつかの組織型では魚や IHC など、その他の解析確実に実行できることに注意してください。 19,26。ただし、スポットの理想的な数と乳がん組織標本におけるHER2遺伝子の SISH 解析を高品質で再現性を確保するため TMA の地形特性を本定義しました。もう一つの重要なポイントは、分析対象とする複数のサンプルの特異性に合わせて標準自動化 SISH プロトコルの再編によって表されます。確かに、メーカーのガイドラインは従来のフルフェイス セクションの分子解析が一般的ですが、したがってアーカイブ FFPE ブロックから TMAs のように異質加工組織サンプルで高い標準に達することができません。このため、これらの問題のサンプルの SISH 解析の信頼性の高いカスタマイズされたプロトコルの手順説明を実施しています。

HER2 の発現と乳癌における他の臨床的に実用的な分子生物学的マーカーの不均質分布に関して遺伝子増幅の不均一性を探索する非常に有益ででしょう。このため、さらにトランスレーショナルリサーチ研究マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析イメージング (MALDI MSI)27などの他の臨床的に関連する分子解析手法の妥当性を検証する必要があります。最近、挑戦にもかかわらず FFPE 組織 MALDI MSI 分析のための管理を実現可能になっています。この場でプロテオーム技術タンパク質及びペプチドの病理組織切片、乳がんなどの空間分布の可視化ことができます。

このプロトコルには、最終的な分析を妨げる可能性のあるいくつかの重要な手順があります。最初に、特定の注意は、 HER2増幅の異なるメカニズムへ支払われる必要があります。たとえば、染色体正常 17 は乳房がん11HER2コピー数の増加のためのよく知られている代替メカニズムを表すで発生する遺伝的異常です。この条件にもかかわらず頻繁ではないが、癌の生物学的特徴と患者管理だけでなく、イッシュ解析も影響があります。第二に、それは単一セルのレベルで、さまざまな腫瘍分野だけでなく、内腫瘍遺伝的異質性もに発生することが記載されています。このプロトコルは、フルフェイスのセクションと比較してこの特定の条件の検出力を高めることができません。さらに、TMA に基づく空間的不均一性の研究は、セクション全体の包括的な分析の欠如を含む、いくつかの本質的な制限を持っていることを強調することが重要です。本研究では、ただし、必要があります原則を考慮する証拠-の-標準的な実験装置を使用して高スループット ・ パフォーマンスに優れたプラットフォームによるHER2遺伝子増幅の不均一性を評価すること。さらなる研究は、HER2 異機種混在の場合、最先端の分子生物学研究と患者の臨床データと結合部のシリアル フルフェイスを分析は、このプロトコルを検証する必要があります。

結論としては、HER2 陰性のコンポーネントの潜在的なドライバーの遺伝的変異を調査し異種 HER2 乳がん組織標本における HER2 の包括的なマッピングは、複数の腫瘍領域の解析に頼るべき。この分析には、耐え難いコストと標準的な診断設備を使用しての努力を必要があります。このメソッドは、複数の大規模なセットおよび異質加工乳癌のHER2遺伝的多様性の同時解析のための信頼性の高いツールを表します。

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Disclosures

著者は、利害の衝突があります。

Acknowledgments

なし。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgipath Paraplast Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 39601006 Tissue embedding medium, 56 °C melting point
Eosin Y  1% water solution Bio Optica, Milan, Italy, EU 510002 Eosin yellowish, water-soluble
Carazzi’s hematoxylin Bio Optica, Milan, Italy, EU 506012 Alum hematoxylin ripened using potassium iodate
Diamond quality Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU 33533 26x76 mm microscope slides
Leica CV Mount Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 14046430011 Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene
FLEX IHC microscope slides Agilent Technologies (Dako),  Santa Clara, CA, USA K8020 Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC
BenchMark ULTRA Ventana medical system, Tucson, AZ, USA N750-BMKU-FS Slide staining system
CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4324 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2223 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4286 Primary antibody, ready-to-use
PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4493 Primary antibody, ready-to-use
ultraView Universal DAB Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-500 Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4422 INFORM HER2 Dual ISH assay - Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients 
ultraView Silver ISH DNP Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-098
ultraView Red ISH DIG Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-505
ISH Protease 3 Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4149 Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest
Hematoxylin Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2021 Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent
Hematoxylin II Counterstaining Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2208 Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent
Bluing reagent Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2037 Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides
HybReady Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4409 Formamide-based buffer for ISH assays
EZ Prep (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-102 Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10.
SSC Buffer (10X) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-110 Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5.
ULTRA LCS Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 650-210 Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions
Reaction Buffer (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-300 Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-223 Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-224
ultraView Silver Wash II Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-003 Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps
Microtome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU RM 2255 Automated rotary microtome
Multistainer Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU ST 5020 Workstation for automated staining and coverslipping
Minicore 1 Alphelys, Plaisir, France, EU 00-MICO-1 Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software
Aperio ScanScope CS2 Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU K080254 Image capture device - digital pathology scanner
Tissue-Tek III Uni-Cassette Sakura Finetek Europe B.V 4135 Cassette
Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold Sakura Finetek Europe B.V 7055 Stainless-Steel base metal mold

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References

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乳癌の HER2 遺伝子増幅の不均一性を評価する高スループット スクリーニング プラットフォームを構築
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Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).More

Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).

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