Summary

乳癌の HER2 遺伝子増幅の不均一性を評価する高スループット スクリーニング プラットフォームを構築

Published: December 05, 2017
doi:

Summary

HER2 陽性細胞の不均質分布は、乳癌のサブセットに観察することができ、臨床のジレンマを生成します。信頼性が高く、コスト効率の高いプロトコルを定義し、定量化、HER2 内腫瘍遺伝的異質加工乳癌の大規模な一連の不均一性を比較を紹介します。

Abstract

ひと上皮成長因子受容体 2 (HER2) に対して目標とされた療法は HER2 陽性乳癌患者の結果根本的に変わった。ただし、少数の場合では、主要な臨床的課題を生成する HER2 陽性細胞の不均質分布が表示されます。日には、特性評価および大規模なコホートでHER2異種遺伝子増幅の定量化の信頼性と標準化されたプロトコルは提案されていません。複数の乳癌のさまざまな地形部分に HER2 状況を同時に把握する高スループット方法論を紹介します。特に、強化されたティッシュのマイクロ アレイ (TMAs) 腫瘍のターゲット マッピングを組み込むを作成する検査法を示します。TMA のすべてのパラメーターは、具体的には銀の in situハイブリダイゼーション (SISH) ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 乳房組織のために最適化されています。(すなわちER、PR、キ67、HER2) 予後と予測バイオ マーカーの免疫組織化学的解析自動化されたプロシージャを使用して実行してください。カスタマイズされた SISH プロトコルは、異なる固定、処理、および保管の手順を受けた複数の組織間で高品質の分子分析を許可するように実装されています。本研究では、証拠の原理特定の DNA シーケンスを効率的かつコスト効果の高い方法を使用して同時に複数の明瞭な地形区域のローカライズと異質加工乳癌できるを提供します。

Introduction

HER2が過剰に発現して、すべての侵襲乳房癌1,2の 15-30% の増幅において。HER2 過剰発現の有無による推論は > 染色 (3 +)、遺伝子増幅遺伝子コピー数は ≥6、または HER2/セントロメア比は ≥2 が評価されることができます中にカウントで強い膜免疫組織化学 (IHC) と 10% セル少なくとも 20 細胞の in situハイブリダイゼーション (っぽい)3

内腫瘍の遺伝学的不均一性は、バイオ マーカーの評価と治療応答4潜在的有害寄稿している乳癌に広く記載されています。よると、大学のアメリカの病理学者 (CAP)、HER2 の不均一性が存在でHER2増幅される場合 > 5% と <5細胞の浸潤腫瘍の 50%。残念ながら、HER2 乳癌の空間的不均一性の実際の発生率は病理学者の間で論争の何人かの著者は、それを維持する極めてまれなイベントだし、40% の症例が他の人まで示唆HER2 異種1,5,6,7,8,9,10。にもかかわらず、この状態を支える生物学的メカニズムはまだ完全には明らかにできなかった内腫瘍 HER2 の不均一性の予後の臨床影響乳房癌患者11にとって重要であります。

最近、発色っぽい (CISH) とシルバーっぽい (SISH) など、明るいフィールド分子技術は、蛍光の ISH (魚)12と比較していくつかの利点を持つ FFPE 組織で HER2 の不均一性を検出するための信頼できる方法として浮上しています。残念ながら、単一症例のバルク分析の大規模コホート研究で非現実的なままです。いくつかのグループは、組織化学、IHC や ISH TMA 技術との組み合わせががん生物学13,14,15,16の研究で貴重な戦略を表すことができますを示唆しています。この広く採用されている方法で、異なる患者から組織サンプル分析できます同時に、組織・採用し、育成の場合14の大シリーズの一様解析試薬を最小限に抑えます。ただし、同時別処理試薬、固定時刻、および保全方法雇用などの面で、アーカイブを受けた複数の組織サンプルのハイスループット分子特性解析できるプロトコルがありません。ブロック。

乳癌の HER2 の空間的不均一性の予後および臨床的影響を与え、異質加工例の大シリーズに評価する分子統合プラットフォームを開発しました。ここでは、我々 は生成および SISH による高収率 TMAs 乳癌のHER2増幅の内腫瘍の不均一性を分析する研究所戦略を描きます。次のプロトコルを開発した腫瘍径 > 5 mm (> TNM 2017 に従って pT1b)17。小さい病変は、フルフェイスの連続切片の解析を実行することをお勧めします。私たちの手順は、ケースごとに 6 の領域 (範囲 4-8) の意味を包含まで 30 の乳癌の同時 IHC と SISH の分析のためことができます。全体で、500 μ m のコアとグリッドとエッジの間に 2 mm の間で、直径 1 mm の 180 のティッシュのコアは、TMA ブロックごとに生成されます。

Protocol

本研究は IRCCS Ca から制度上の審査委員会によって承認された ‘ グランダ財団、ポリクリニコ病院、ミラノ、イタリア。 1. 患者や組織標本の選択 すべての利用可能なヘマトキシリンとエオシン (H & E) とオリジナルの診断から IHC スライドを含む、分析するすべてのケースのアーカイブのスライドを取得し、1 つ H & E が非腫瘍性乳房組織 (例えば、手術マージ?…

Representative Results

全体的に、444 侵襲乳房癌っぽい分析用に最適化された 15 TMAs に組み込まれていた。サンプリング 2,664 スポット、2,651 (99.5%) 以前に選択したエリアの代表、以降の解析に従うと考え。内腫瘍の不均一性は腫瘍の異なる地形エリアの HER2 陽性クローンの不均質分布の特定のフォーカスを持つ IHC と SIH、により決定しました。表 3は、異なる histotypes 内 ER、PR、…

Discussion

ここでは、異質加工乳癌の高収率 TMAs のHER2遺伝子およびその対応するセントロメアの SISH 解析を実行する研究所戦略の詳細しています。このメソッドは、コスト効果の高い、乳房癌取得フォーム病理アーカイブの大規模コホートであるHER2遺伝子増幅の不均一性の研究のためのほとんどの実験室で実施することができます。

臨床的重要性のため HER2 の乳がん…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

なし。

Materials

Surgipath Paraplast Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 39601006 Tissue embedding medium, 56 °C melting point
Eosin Y  1% water solution Bio Optica, Milan, Italy, EU 510002 Eosin yellowish, water-soluble
Carazzi’s hematoxylin Bio Optica, Milan, Italy, EU 506012 Alum hematoxylin ripened using potassium iodate
Diamond quality Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU 33533 26×76 mm microscope slides
Leica CV Mount Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 14046430011 Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene
FLEX IHC microscope slides Agilent Technologies (Dako),  Santa Clara, CA, USA K8020 Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC
BenchMark ULTRA Ventana medical system, Tucson, AZ, USA N750-BMKU-FS Slide staining system
CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4324 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2223 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4286 Primary antibody, ready-to-use
PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4493 Primary antibody, ready-to-use
ultraView Universal DAB Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-500 Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4422 INFORM HER2 Dual ISH assay – Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients 
ultraView Silver ISH DNP Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-098
ultraView Red ISH DIG Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-505
ISH Protease 3 Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4149 Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest
Hematoxylin Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2021 Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent
Hematoxylin II Counterstaining Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2208 Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent
Bluing reagent Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2037 Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides
HybReady Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4409 Formamide-based buffer for ISH assays
EZ Prep (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-102 Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10.
SSC Buffer (10X) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-110 Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5.
ULTRA LCS Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 650-210 Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions
Reaction Buffer (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-300 Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-223 Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-224
ultraView Silver Wash II Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-003 Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps
Microtome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU RM 2255 Automated rotary microtome
Multistainer Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU ST 5020 Workstation for automated staining and coverslipping
Minicore 1 Alphelys, Plaisir, France, EU 00-MICO-1 Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software
Aperio ScanScope CS2 Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU K080254 Image capture device – digital pathology scanner
Tissue-Tek III Uni-Cassette Sakura Finetek Europe B.V 4135 Cassette
Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold Sakura Finetek Europe B.V 7055 Stainless-Steel base metal mold

References

  1. Allison, K. H., Dintzis, S. M., Schmidt, R. A. Frequency of HER2 heterogeneity by fluorescence in situ hybridization according to CAP expert panel recommendations: time for a new look at how to report heterogeneity. Am J Clin Pathol. 136 (6), 864-871 (2011).
  2. Montemurro, F., Scaltriti, M. Biomarkers of drugs targeting HER-family signalling in cancer. J Pathol. 232 (2), 219-229 (2014).
  3. Wolff, A. C., et al. Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 31 (31), 3997-4013 (2013).
  4. Ng, C. K., Pemberton, H. N., Reis-Filho, J. S. Breast cancer intratumor genetic heterogeneity: causes and implications. Expert Rev Anticancer Ther. 12 (8), 1021-1032 (2012).
  5. Vance, G. H., et al. Genetic heterogeneity in HER2 testing in breast cancer: panel summary and guidelines. Arch Pathol Lab Med. 133 (4), 611-612 (2009).
  6. Murthy, S. S., et al. Assessment of HER2/Neu status by fluorescence in situ hybridization in immunohistochemistry-equivocal cases of invasive ductal carcinoma and aberrant signal patterns: a study at a tertiary cancer center. Indian J Pathol Microbiol. 54 (3), 532-538 (2011).
  7. Ohlschlegel, C., Zahel, K., Kradolfer, D., Hell, M., Jochum, W. HER2 genetic heterogeneity in breast carcinoma. J Clin Pathol. 64 (12), 1112-1116 (2011).
  8. Chang, M. C., Malowany, J. I., Mazurkiewicz, J., Wood, M. ‘Genetic heterogeneity’ in HER2/neu testing by fluorescence in situ hybridization: a study of 2,522 cases. Mod Pathol. 25 (5), 683-688 (2012).
  9. Bartlett, A. I., et al. Heterogeneous HER2 gene amplification: impact on patient outcome and a clinically relevant definition. Am J Clin Pathol. 136 (2), 266-274 (2011).
  10. Seol, H., et al. Intratumoral heterogeneity of HER2 gene amplification in breast cancer: its clinicopathological significance. Mod Pathol. 25 (7), 938-948 (2012).
  11. Hanna, W. M., et al. HER2 in situ hybridization in breast cancer: clinical implications of polysomy 17 and genetic heterogeneity. Mod Pathol. 27 (1), 4-18 (2014).
  12. Sanguedolce, F., Bufo, P. HER2 assessment by silver in situ hybridization: where are we now?. Expert Rev Mol Diagn. 15 (3), 385-398 (2015).
  13. Fusco, N., et al. The Contrasting Role of p16Ink4A Patterns of Expression in Neuroendocrine and Non-Neuroendocrine Lung Tumors: A Comprehensive Analysis with Clinicopathologic and Molecular Correlations. PLoS One. 10 (12), e0144923 (2015).
  14. Albanghali, M., et al. Construction of tissue microarrays from core needle biopsies – a systematic literature review. Histopathology. 68 (3), 323-332 (2016).
  15. Navani, S. Manual evaluation of tissue microarrays in a high-throughput research project: The contribution of Indian surgical pathology to the Human Protein Atlas (HPA) project. Proteomics. 16 (8), 1266-1270 (2016).
  16. Fusco, N., et al. HER2 in gastric cancer: a digital image analysis in pre-neoplastic, primary and metastatic lesions. Mod Pathol. 26 (6), 816-824 (2013).
  17. Amin, M. B., et al. . AJCC Cancer Staging Manual. , (2017).
  18. Lakhani, S. R., Ellis, I. O., Schnitt, S. J., Tan, P. H., van de Vijver, M. J. . WHO Classification of Tumours of the Breast. , (2012).
  19. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).
  20. Fusco, N., et al. Resolving quandaries: basaloid adenoid cystic carcinoma or breast cylindroma? The role of massively parallel sequencing. Histopathology. 68 (2), 262-271 (2016).
  21. Fusco, N., et al. Genetic events in the progression of adenoid cystic carcinoma of the breast to high-grade triple-negative breast cancer. Mod Pathol. 29 (11), 1292-1305 (2016).
  22. Fusco, N., et al. Recurrent NAB2-STAT6 gene fusions and oestrogen receptor-α expression in pulmonary adenofibromas. Histopathology. 70 (6), 906-917 (2017).
  23. Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College Of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. J Clin Oncol. 28 (16), 2784-2795 (2010).
  24. Fusco, N., Bosari, S. HER2 aberrations and heterogeneity in cancers of the digestive system: Implications for pathologists and gastroenterologists. World J Gastroenterol. 22 (35), 7926-7937 (2016).
  25. Dowsett, M., et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer working group. J Natl Cancer Inst. 103 (22), 1656-1664 (2011).
  26. Dekker, T. J., et al. Determining sensitivity and specificity of HER2 testing in breast cancer using a tissue micro-array approach. Breast Cancer Res. 14 (3), R93 (2012).
  27. De Sio, G., et al. A MALDI-Mass Spectrometry Imaging method applicable to different formalin-fixed paraffin-embedded human tissues. Mol Biosyst. 11 (6), 1507-1514 (2015).

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Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).

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