Summary
Den nuværende undersøgelse beskriver en simpel metode til påvisning af endogene niveauer af Rab10 fosforylering af leucin-rig gentage kinase 2.
Abstract
Mutationer i leucin-rig gentage kinase 2 (LRRK2) har vist sig at være forbundet med familiær Parkinsons sygdom (FPD). Da unormal aktivering af kinase aktiviteten af LRRK2 har været involveret i patogenesen af PD, er det vigtigt at fastlægge en metode til at evaluere de fysiologiske niveauer af kinase aktiviteten i LRRK2. Nylige undersøgelser afslørede, at LRRK2 phosphorylates Rab GTPase familiemedlemmer, herunder Rab10, fysiologiske betingelser. Selvom fosforylering af endogent Rab10 ved LRRK2 i kulturperler celler kunne påvises ved massespektrometri, har det været vanskeligt at påvise det ved immunoblotting på grund af den ringe følsomhed af foreliggende fosforylering-specifikke antistoffer for Rab10. Her, vi beskriver en simpel metode til påvisning af de endogene niveauer af Rab10 fosforylering af LRRK2 baseret på immunoblotting udnytte sodium dodecyl sulfat polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) kombineret med en fosfat-bindende tag (P-tag), som er N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl) -Nielsen,N',N'- tris (pyridin-2-yl-methyl) - 1,3 - diaminopropan-2-ol. Denne protokol ikke kun giver et eksempel på den metode, der udnytter P-tag, men giver også mulighed for at vurdere hvordan mutationer samt hæmmer behandling/administration eller nogen andre faktorer ændre downstream signalering af LRRK2 i celler og væv .
Introduction
PD er et af de mest almindelige neurodegenerative sygdomme, overvejende påvirker dopaminerge neuroner i midthjernen, der resulterer i dysfunktion af motoriske systemer i ældre1. Mens de fleste patienter udvikler PD i en sporadisk måde, er der familier arve sygdommen. Mutationer i flere gener er blevet fundet at være forbundet med FPD2. En af de sygdomsfremkaldende gener for FPD er LRRK2, hvor otte missense mutationer (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S og I2020T) knyttet til en overvejende nedarvede FPD kaldet PARK8 har hidtil været rapporteret3,4,5. Flere genome-wide association studier (GWAS) af sporadiske PD patienter har også identificeret genomisk variationer i LRRK2 locus som en risikofaktor for PD, tyder på, at abnormitet i funktionen af LRRK2 er en almindelig årsag til neurodegeneration i både sporadisk og PARK8 FPD6,7,8.
LRRK2 er et stort protein (2,527 aminosyrer) bestående af en leucin-rig gentage domæne, et GTP-bindende Ras af komplekse proteiner (ROC) domæne, en C-terminale ROC (COR) domæne, en Serin/Threonin protein kinase domæne og en WD40 gentage domæne9. De otte FPD mutationer finde i disse funktionelle domæner; N1437H og R1441C/G/H/S i domænet ROC, Y1699C i domænet ru, G2019S og I2020T i domænet kinase. Da G2019S mutationen, som er det hyppigst fundet mutation i PD patienter10,11,12, øger kinase aktivitet af LRRK2 af 2-3 fold in vitro-13, det er en hypotese at den unormale stigning i fosforylering af LRRK2 substrate(s) er giftigt for neuroner. Dog har det været umuligt at studere om fosforylering af fysiologisk relevante LRRK2 substrater er ændret i familiær/sporadisk PD patienter på grund af manglende metoder evaluerer det i afledte patientprøver.
Protein fosforylering er generelt fundet ved immunoblotting eller enzymmaerket assay (ELISA) ved hjælp af antistoffer specielt anerkende fosforyleres tilstand af proteiner eller af massespektrometriske analyse. Men den tidligere strategi sommetider ikke kan anvendes på grund af vanskeligheder med at skabe fosforylering-specifikke antistoffer. Metaboliske mærkning af celler med radioaktivt fosfat er en anden mulighed at undersøge fysiologiske niveauer af fosforylering når fosforylering-specifikke antistoffer ikke er let tilgængelige. Men det kræver en stor mængde af radioaktivt materiale og derfor involverer nogle specialiserede udstyr for strålingsbeskyttelse14. Massespektrometrisk analyse er mere følsomme i forhold til disse immunokemisk metoder og blev populær i at analysere protein fosforylering. Dog prøveforberedelsen er tidskrævende og dyre instrumenter er påkrævet til analysen.
Et undersæt af Rab GTPase familie, herunder Rab10 og Rab8 blev for nylig rapporteret som direkte fysiologiske substrater for LRRK2 baseret på resultatet af en storstilet phosphoproteomic analyse15. Vi viste så, at Rab10 fosforylering blev øget ved FPD mutationer i mus embryonale fibroblaster og i lungerne af knockin mus16. I denne rapport, valgte vi at ansætte en sodium dodecyl sulfat polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE)-baseret metode, hvor en P-tag molekyle er Co polymere i SDS-PAGE geler (P-tag SDS-PAGE) til påvisning af de endogene niveauer af Rab10 fosforylering, fordi en yderst følsom antistoffer specifikke for fosforyleres Rab10 manglede stadig. Vi har undladt at registrere fosforylering af endogene Rab8 på grund af dårlig selektivitet i øjeblikket tilgængelige antistoffer for total Rab8. Derfor besluttede vi at fokusere på Rab10 fosforylering. LRRK2 phosphorylates Rab10 på Thr73 at finde i midten af regionen meget bevaret "skifte II". Høj bevarelse af fosforylering sites blandt Rab proteiner kan være en af grundene til hvorfor phosphospecific antistoffer anerkende særskilte Rab proteiner er vanskelige at gøre.
Fosforylering af Rab8A af LRRK2 hæmmer bindingen af Rabin8, en guanin nukleotid udveksling faktor (GEF) som aktiverer Rab8A ved at udveksle de bundne BNP med GTP15. Fosforylering af Rab10 og Rab8A af LRRK2 hæmmer også binding af BNP-dissociation hæmmere (GDIs), som er nødvendige for aktivering af Rab proteiner ved at udtrække BNP-bundet Rab proteiner fra membraner15. Kollektivt, er det en hypotese at fosforylering af Rab proteiner af LRRK2 forhindrer dem i aktivering, selv om de præcise molekylære mekanisme og fysiologiske konsekvenser af fosforylering forbliver uklart.
P-tag SDS-PAGE blev opfundet af Kinoshita et al. i 2006: I denne metode, acrylamid var kovalent kombineret med P-tag, et molekyle, indfange fosfater med høj affinitet, som copolymeriseret i SDS-PAGE geler17. Fordi P-tag molekyler i en SDS-PAGE gel retard selektivt elektroforese mobilitet af fosforyleres proteiner, P-tag SDS-PAGE kan adskille fosforyleres proteiner fra ikke-fosforyleret dem (figur 1). Hvis protein af interesse er fosforyleret på flere restprodukter, vil en stige af bands svarende til varierende fosforyleres formularer observeres. I forbindelse med Rab10 observere vi kun én skiftede bandet, der angiver, at Rab10 er fosforyleret kun på Thr73. Den største fordel ved P-tag SDS-PAGE over immunoblotting med fosforylering-specifikke antistoffer er at fosforyleres Rab10 kan påvises ved immunoblotting med ikke-fosforylering-specifikke antistoffer (dvs., erkender samlede Rab10) efter at være overført på membraner, er der generelt mere specifikke, følsomme og tilgængelig fra kommercielle/akademiske kilder. En anden fordel ved at bruge P-tag SDS-PAGE er at man kan få omtrentlige estimering af støkiometrisk af fosforylering, hvilket er umuligt ved immunoblotting med fosforylering-specifikke antistoffer eller metaboliske mærkning af celler med radioaktivt fosfater.
Ud over brugen af billig P-tag acrylamid og nogle mindre ændringer relateret til det, følger den nuværende metode til påvisning af Rab10 fosforylering af LRRK2 en generel protokol af immunoblotting.Derfor bør det være ligetil og nemt eksekverbare i alle laboratorier, hvor immunoblotting er en sædvanlig praksis, med alle typer af prøver herunder renset proteiner, cellelysater og væv homogeniseret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Prøvetilberedning for P-tag SDS-PAGE
- Fjern og kassér medier fra 10 cm retter hvor celler dyrkes ved hjælp af en suge og vaske cellerne med 5 mL Dulbecco fosfatbufferet saltopløsning (DPBS) af første tilføjer DPBS til siden af retter at undgå at forstyrre cellelag og manuelt rock retter tilbage og tilbage flere gange.
- Fjerne og kassere DPBS ved hjælp af en suge og der tilsættes 2 mL 0,25% (w/v) trypsin fortyndet i DPBS, og forsigtigt rock retter for at dække cellelag. Sætte retterne i en CO2 inkubator (37 ° C, befugtet luft, 5% CO2) i 5 min.
- Efter pipettering op og ned ved hjælp af en engangs pipette til at bryde op fritliggende celler, indsamle cellesuspension ind i en 15 mL rør og måle celle tætheden ved hjælp af en hematocytometer under et mikroskop18.
- Fortynd celler til 2,5 × 105 celler/mL med Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) suppleret med 10% (v/v) føtal bovint serum (FBS), 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin. Tilsættes 2 mL (5 × 105 celler) i en fortyndet cellesuspension til hver brønd af 6-godt plader.
- Vokse celler natten over i en CO2 inkubator (37 ° C, befugtet luft, 5% CO2).
- Transfektion i HEK293 celler
Bemærk: Hvis fosforylering af endogene Rab10 undersøges, gå videre til trin 1.7. Plasmider bruges i denne protokol kan fås fra forfattere efter anmodning. Se Tabel af materialer til korte oplysninger og Figur S1 for deres DNA sekvenser.- Alikvot 200 µL af DMEM til 1,5 mL rør.
- Hver tube, tilføje begge 0.266 µg (endelig koncentration af 1,33 µg/mL) af et plasmid kodning HA-Rab10 og 1.066 µg (endelig koncentration af 5,33 µg/mL) af et plasmid kodning 3 × FLAG-LRRK2 fra 500 µg/mL plasmid bestande. Derefter tilsættes 4 µL af 1 mg/mL opløsning af polyethyleneimine (opløst i 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,0) og straks blandes løsningen af vortexing for 5 s.
- Lad rør stå ved stuetemperatur i 10 min og tilføje indholdet af et rør dråbevis til en brønd med en mikropipette. Forsigtigt og manuelt rock kultur plader frem og tilbage flere gange for at lade Transfektion blandingen diffuse jævnt i hele brønden.
- Lad celler vokse i en anden 24-36 timer i en CO2 inkubator (37 ° C, befugtet luft, 5% CO2).
- Hvis fosforylering af endogene Rab10 er at undersøge, behandle celler med og uden LRRK2 hæmmere for 1 h før lysing celler.
- Forberede stamopløsninger af LRRK2 hæmmere ved at opløse hæmmere i dimethylsulfoxid (DMSO) på 10 mM. Vi anbefaler at bruge MLi-2 og GSK2578215A, som er meget specifikke og potent LRRK2 hæmmere. Gemme stamopløsninger ved-80 ° C.
- Forberede arbejder bestande af inhibitorer ved fortynding af stamopløsninger med DMSO: For MLi-2, forberede 10 µM og 30 µM til endogen og overexpressed LRRK2, henholdsvis. For GSK2578215A, forberede 1 mM og 3 mM endogene og overexpressed LRRK2, henholdsvis.
- Tilføj 2 µL af der arbejder bestandene af enten MLi-2 eller GSK2578215A til midten af en brønd med en mikropipette og forsigtigt rock pladen manuelt frem og tilbage flere gange for at lade hæmmere diffuse jævnt i hele brønden.
- Tilføj 2 µL af DMSO til en anden brønd som en negativ kontrol på en lignende måde at hæmmer taktfast 1.8.3.
- Læg pladerne tilbage til rugemaskine og kultur celler for 1 h.
- Lyse celler.
- Sætte kultur plader på is. Fjern og kassér medierne. Cellerne vaskes ved første tilføje 2 mL DPBS til siden af retter at undgå at forstyrre cellen lag og manuelt rock retter frem og tilbage flere gange.
- Fjern og kassér DPBS og føje til celler 100 µL af lysisbuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1% (v/v) polyoxyethylene(10) octylphenyl ether, 1 mM EGTA (ethylenglycol-bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N'-tetraacetic syre), 1 mM natrium orthovanadate, 50 mM natriumfluorid, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM natrium pyrofosfat, 0,1 µg/mL microcystin-LR, 270 mM saccharose, protease hæmmer cocktail).
- Vippe plader på is og skrabe celler ved hjælp af en celle skraber til at samle så meget lysate som muligt celle. Indsamle de lysates ved hjælp af en mikropipette til 1,5 mL rør (pre kølet på is).
Forsigtig: Microcystin-LR kan være dødelig, hvis indtagelse eller ved hudkontakt.
- Lad rør står i isbad i 10 min for komplet lysering. Afklare cellelysater ved centrifugering (20.000 × g i 10 min. ved 4 ° C) og overføre analysere nye 1,5 mL rør pre kølet på is.
- Måle proteinkoncentration (µg/µL) af den ryddet lysates af Bradford assay.
- Forberede bovint serumalbumin (BSA) standarder (0,2, 0,4, 0,6, 0,8 og 1 mg/mL) ved fortynding af stamopløsningen med destilleret vand. Fortynd ryddet cellelysater ved 20-fold med destilleret vand.
- Sætte 5 µL/brønd af BSA standarder, tom (destilleret vand), og hver fortyndet celle lysate i en 96-brønd plade i tre eksemplarer.
- Tilsæt 150 µL/brønd af Bradford assay reagens ved hjælp af 12-kanals mikropipette og lad pladen stå ved stuetemperatur i 5 min.
- Absorbansen måles på 595 nm på en Pladelæser og Sammenlign med BSA standarder.
- Forberede SDS-PAGE 100 µL af prøver. Proteinkoncentration af prøverne er 1 µg/µL til overexpressed HA-Rab10 og 2 µg/µL til endogen Rab10.
- Brug de kvantitative koncentrationer fra trin 1.11.4, beregne volumen (µL) cellelysater svarende til 100 µg (overexpressed HA-Rab10) eller 200 µg (endogene Rab10) ved at dividere den protein (100 µg eller 200 µg) af proteinkoncentration af lysates (µ g/µL).
- Tilføje 25 µL af 4 × Laemmli SDS-PAGE prøvebuffer (62.5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 8% (w/v) SDS, 40% (v/v) glycerol, 0,02% (w/v) bromophenol blå, 4% (v/v) β-mercaptoethanol) til nye 1,5 mL rør opbevares ved stuetemperatur.
- Tilføje celle lysates til hver tube og mix af vortexing for 5 beregnet mængde s ved stuetemperatur.
- Bringe den samlede mængde til 100 µL med lysisbuffer og bland ved vortexing for 5 s ved stuetemperatur.
- Supplere med 10 mM frihedsbevægelse2 slukke chelatdanner. Tilføj 1 µL af 500 mM frihedsbevægelse2. Blanding af vortexing for 5 s ved stuetemperatur.
Bemærk: Prøver indeholdende frihedsbevægelse2 kan ikke være egnet til normal SDS-PAGE.
2. støbning geler til P-tag SDS-PAGE
Bemærk: Geler bør foretages på samme dag som kører geler. Gels kan gøres under omgivende lysforhold.
- Forberede 5 mM P-tag acrylamid stamopløsning af første opløse 10 mg pulver/solid P-tag acrylamid helt med 100 µL af methanol og derefter bringe til 3,3 mL ved at tilføje dobbeltdestilleret vand.
Bemærk: P-tag acrylamid er lysfølsomt. Den tilberedte opløsning skal opbevares i mørke ved 4 ° C indtil brug. - Ren både almindeligt og indskåret plader af sprøjtning 70% ethanol og aftørring med en køkkenrulle. Samle gel plader. Dimensioner af gel plader anvendes i denne særlige protokol er 80 eller 100 mm længde 100 mm bred. Ren silicium spacere er sat mellem almindelig og indskåret plader og de forsamlede plader er fastspændt med bindemiddel klip.
Bemærk: Enhver form for gel plader, der arbejder for almindelige SDS-PAGE kan bruges. - Sætte en kam der skal anvendes (17-godt plastic kam) til de forsamlede gel plader og mærke på gelpladen placeringen af bunden af brøndene med en permanent markør.
- Forberede 10 mL 10% acrylamid gel blanding (10% (w/v) acrylamid (acrylamide:bis-acrylamid = 29: 1), 375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 0,1% (w/v) SDS) i en 15 mL tube.
Bemærk: Den optimale koncentration af acrylamid kan variere afhængigt af de reagenser, der anvendes. Tetramethylethylenediamine (TEMED) og ammonium persulfat (APS) bør ikke tilføjes på nuværende tidspunkt. - Tilsæt 100 µL af 5 mM P-tag acrylamid og 10 µL 1 M frihedsbevægelse2 løsninger i endelige koncentrationer på 50 µM og 100 µM.
Bemærk: De optimale koncentrationer af P-tag acrylamid og frihedsbevægelse2 kan også variere afhængigt af de reagenser, der anvendes. - Tilføj 15 µL af TEMED til gel blandingen i en endelig koncentration på 0,15% (v/v) og derefter 50 µL af 10% (w/v) APS i en endelig koncentration på 0,05% (w/v). Bland godt ved forsigtigt hvirvlende rør for 5 s og hæld i de forsamlede plader umiddelbart op til en højde der er 2 mm nedenfor position markeret i trin 2.3.
- Forsigtigt layer 2-propanol på gelopløsning at flade toppen af adskille geler.
- Lad geler henstår i 30 min. ved stuetemperatur. Det er ikke nødvendigt at beskytte geler fra lys.
Bemærk: Det kan tage længere tid for gel til at sætte under kolde stuetemperatur. Afgasning gel blandingen før du tilføjer TEMED og APS hjælper fremskynde dette skridt. Til dette formål, kan gel blandingen tilberedes i en 100-200 mL Erlenmeyerkolbe tilsluttet en suge. Afgasses i 10 min. - Fjerne den lagdelte 2-propanol ved at absorbere med et stykke køkkenrulle.
- Vask den øverste plads i gels ved at fylde rummet op med destilleret vand fra en vaskeflaske og kassér vandet ved at hælde ned i bækkenet. Gentag vask 3 gange.
- Fjerne resterende vand tilbage i det øverste rum af gels ved at absorbere med et stykke køkkenrulle.
- Forbered 3 mL 4% acrylamid gel blanding (4% (w/v) acrylamid (a: crylamide:bis-acrylamid = 29: 1), 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 0,1% (w/v) SDS) i en 15 mL tube.
Bemærk: Tilføj ikke P-tag acrylamid eller frihedsbevægelse2 løsning til stabling gel blandingen. - Tilføje 7,5 µL af TEMED og 24 µL af 10% (w/v) APS i endelige koncentrationer på 0,25% (v/v) og 0,08% (w/v), henholdsvis. Bland godt ved forsigtigt hvirvlende rør for 5 s og hæld blandingen på toppen af adskillelse gel. Straks sætte passende kamme (17-godt plastic kamme, der rumme op til 25 µL af prøverne, for eksempel).
- Lad geler henstår i 30 min. ved stuetemperatur. Det er ikke nødvendigt at beskytte geler fra lys. Når de stabling geler, køre dem uden yderligere lagring.
3. SDS-PAGE og Immunoblotting
- Fjern kamme fra geler. Derefter fjerne silicium spacere og derefter klip fra geler.
- Sætte de støbt geler til gel tanke og løs gelen tanken ved fastspænding med bindemiddel klip.
- Hæld den kørende buffer (25 mM Tris, 192 mM glycin, 0,1% (w/v) SDS) i bunden og toppen af gels. Ren brønde ved gennemskylning kører bufferen ved hjælp af en 5 mL sprøjte og en 21G nål til at fjerne gel stykker.
- Fjerne luftbobler fra bunden rum af geler ved hjælp af et bøjet nål knyttet til en sprøjte. For at gøre en bøjet nål, bøje manuelt en 21G nål i midten af nålen, således at vinklen mellem toppen og bunden af nålen bliver 30-45 °.
- Spin ned bundfald forårsaget af tilsætning af frihedsbevægelse2 på 20.000 × g i 1 minut ved stuetemperatur for at få klart prøver.
- Indlæse 10 µg proteiner til påvisning af fosforylering af overexpressed Rab10 og 30 µg proteiner for endogene Rab10.
Bemærk: Det er afgørende at indlæse lige saa stort volumen af prøver i alle brønde. Tom baner skal være belastet med 1 × Laemmli SDS-PAGE prøvebuffer. Hvis prøverne indeholder frihedsbevægelse2, tilføje den samme koncentration af frihedsbevægelse2 til dummy prøverne. - Den godt læsset med en molekylevægt markør (MWM) bør også suppleres med 1 × Laemmli SDS-PAGE prøvebuffer så prøver indlæst er den samme i alle brønde.
Bemærk: Igen, hvis prøverne indeholder frihedsbevægelse2, tilføje den samme koncentration af frihedsbevægelse2 til MWM. Alternativt, et EDTA-fri MWM kan bruges. - Køre geler på 50 V for stabling (ca. 30 min.) indtil farvestof foran krydser ind adskillelse gel.
- Efter prøverne stack, ændre spændingen til 120 V for adskillelse, indtil farvestof foran når bunden af gels (ca 50 og 80 min. 80 og 100 mm lang geler, henholdsvis).
Bemærk: Migration mønster af MWM forventes at blive anderledes end på normale SDS-PAGE geler. Det bør ikke anvendes til estimering molekylvægt af proteiner på P-tag SDS-PAGE geler men kan bruges til at kontrollere reproducerbarhed af P-tag geler. Henvise til diskussion for detaljer. - Vaske gel for at fjerne frihedsbevægelse2 fra geler.
- Hæld overførsel buffer (48 mM Tris, 39 mM glycin, 20% (v/v) metanol) med 10 mM EDTA og 0,05% (w/v) SDS i en beholder (f.eks.store vejer både).
Bemærk: Brug friske buffer for hver vask.
- Placere et filtrerpapir (10 x 7 cm) på en svampen pad for overførsel. Sted gel på filtrerpapir. Sørg for der er ingen luftbobler mellem filtrerpapir og gel.
- Sætte en membran (10 x 7 cm) på gelen og sørge for der er ingen luftbobler mellem gel og membranen.
- Sætte en anden filtrerpapir (10 x 7 cm) på membranen og, igen, sørge for der er ingen luftbobler mellem membranen og filtrerpapir.
- Sætte en anden svampen pad på filtrerpapir. Sætte stakken af membranfilter/papirer i en kassette til overførsel.
- Sæt kassetten i en overførsel tank, og sørg for, at membranen er beliggende mellem gel og positivt ladede anoden.
- Tilsluttes en strømforsyning tanken og sætte tanken i en styren skum kasse fyldt med iskoldt vand. Starte overførsel på 100 V til 180 min.
Bemærk: Langvarig videregivelsen er nødvendig, da overførsel af proteiner fra P-tag SDS-PAGE geler ikke er så effektiv som den fra normale SDS-PAGE geler. Effektiv køling er afgørende for at undgå smeltende geler under overførslen.
- Fjern membraner fra geler med pincet og blød membraner i en Ponceau S løsning (0,1% (w/v) Ponceau S, 5% (v/v) eddikesyre) at plette overførte proteiner på membraner i en plastikbeholder. Volumen af løsningen bør være tilstrækkelig til at dække en membran.
- Inkuber membraner i 1 minut ved stuetemperatur af vuggende manuelt.
Bemærk: En stige af bands bør blive synlige i hver bane. - Vælge membranen Farvningsopløsningen med pincet og se, om stigen af bands har ensartet mønster og intensitet i hver lane, hvor prøverne er blevet indlæst.
- Efter at have kontrolleret farvning, fjerne Farvningsopløsningen og tilføje TBST buffer (20 mM Tris-HCl pH 7,4, af 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) polyoxyethylenesorbitan monolaurate). Mængden af bufferen skal være tilstrækkelig til at dække en membran.
Bemærk: Ponceau S løsning kan indsamles og genbruges flere gange. - Rock membraner i TBST på en vuggende shaker (~ 60 rpm) ved stuetemperatur indtil ingen synlige bands forbliver på membraner.
- Gentag trinnet vask med friske TBST i 5 min.
Bemærk: Eksponeringstiden kan variere afhængigt af ECL løsning og anvendes til påvisning af kemiluminescens-systemet.
- Tænd en imager, udstyret med en afgift - sammen enhed (CCD) kamera og en computer tilsluttet imager. Opstart control-software til imager. Vent, indtil temperaturen i CCD kamera har nået-25 ° C.
- Sætte 1 mL af ECL løsning for en membran på en plast wrap spredes på en bænk.
- Sætte en membran gel-side-up på ECL løsning og derefter hurtigt vende det om så at begge sider af membranen er belagt med løsningen.
- Afhente membranen og afløb det ved at lade den ene side af membranen røre et stykke køkkenrulle for 5 s.
- Sætte membran mellem klar film (fx, klart papir lommer).
Bemærk: Plastikfolie anbefales ikke til indpakning af membraner. De klare film bruges til indpakning af membranen skal være så fladt som muligt uden synlige rynker til at undgå ujævne baggrund. - Sted membran på en sort bakke. Sæt bakken i imager og lukke døren.
- Klik på knappen "Fokusering" i vinduet control software. Kontroller, at membranen er korrekt placeret. Klik på knappen "Tilbage".
- Vælg "Præcision" for "Eksponering Type". Vælg "Manual" for "Eksponeringstid" og indstille eksponering til 1 s.
- Vælg "Høj" til "Følsomhed/opløsning". Lad "Tilføje digitalisering billede" umarkeret. Klik på knappen "Start" for at tage et billede.
- Gemme det billede, som dukkede op på displayet i computeren som en TIFF-fil.
- Gentag tager billeder med eksponeringstiden fra 1, 3, 10, 30, 60, 90, 120, 150 s og op til 180 s. Når du tager det sidste billede, kontrollere "Tilføje digitalisering billede" så det digitale billede, ikke kemiluminescens af membranen kan tages samtidig.
- Vælg det bedste billede med den største dynamikområde og uden nogen mætte pixels (vist med rødt) i bands af interesse.
Bemærk: Konventionelle X-ray film kan også bruges til registrering af19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Overekspression System: Fosforylering af HA-Rab10 af 3 × FLAG-LRRK2 i HEK293 celler:
HEK293 celler blev transfekteret med 0.266 µg af HA-Rab10 wild-type og 1.066 µg af 3 × FLAG-LRRK2 (wild-type, kinase-inaktive mutant (K1906M), eller FPD mutanter). Rab10 fosforylering blev undersøgt af P-tag SDS-PAGE efterfulgt af immunoblotting ved hjælp af en anti-HA antistof (figur 2). 10 µg af proteiner blev kørt på en 10% gel (80 x 100 x 1 mm) indeholdende 50 µM P-tag acrylamid og 100 µM frihedsbevægelse2. Eksponeringstid for P-tag gel (toppanelet) var 10 s ved hjælp af en standard ECL løsning. Co-overekspression af LRRK2 med Rab10 forårsaget band skift på P-tag gel (markeret med en åben cirkel i toppanelet; Sammenlign baner 2 og 4). Derimod Co udtryk med en kinase-inaktive mutant (K1906M) LRRK2 undladt at ændre mobilitet af Rab10 (Sammenlign baner 4 og 5), der angiver, at bandet Skift skyldes LRRK2 kinase aktivitet. Bandet Skift blev forhøjet med alle FPD mutationer (Sammenlign baner 4 og 6-13) efter aftale med den foregående betænkning15.
Endogene System: Fosforylering af Rab10 af LRRK2 i kulturperler celler:
Musen 3T3-schweiziske albino embryonale fibroblastceller blev behandlet med eller uden en LRRK2-hæmmer (GSK2578215A)20 i en endelig koncentration på 1 µM i 1 time (figur 3A). Menneskeligt carcinom A549 Lungeceller blev behandlet med eller uden en anden LRRK2 hæmmer (MLi-2)21 i en endelig koncentration på 10 nM for 1 h (figur 3B). Endogene Rab10 fosforylering af endogene LRRK2 blev undersøgt af P-tag SDS-PAGE efterfulgt af immunoblotting med en anti-Rab10 antistoffer. 30 µg af proteiner blev kørt på en 10% gel (100 x 100 x 1 mm for 3T3-schweiziske albino celler) og 80 mm for A549 celler indeholdende 50 µM P-tag acrylamid og 100 µM frihedsbevægelse2. Eksponering for P-tag gel (toppanelet) i figur 3A og figur 3B var 3 min og 90 s, henholdsvis. Bandet Skift svarende til fosforyleres endogene Rab10 blev observeret på P-tag gelen (markeret med en åben cirkel i toppanelet; Sammenlign baner 1-2 og 3-4), som forsvandt efter behandling af celler med GSK2578215A eller MLi-2. Effekten af LRRK2-hæmmere blev valideret af immunoblotting ved hjælp af anti-pSer935 LRRK2 antistof (den tredje panel fra bunden), som er en veletableret udlæsning af LRRK2 hæmning i celler22.
Figur 1. Skematisk visning af P-tag SDS-PAGE. Når en blanding af fosforyleres (røde cirkler) og ikke-fosforyleret (blå cirkler) proteiner (f.eks.Rab10) løber gennem en gel, hvor P-tag acrylamid er Co polymere, hæmmer mobilitet af eneste fosforyleres proteiner på grund af den stærke samspillet mellem fosforyleres proteiner med P-tag molekyler (brudt pile). Da Rab10 er fosforyleret af LRRK2 på en enkelt rest Thr73, Rab10 kører som to bands: det øverste bandet repræsenterer fosforyleres Rab10 og bunden bandet repræsenterer ikke-fosforyleret Rab10. Når celler er behandlet med LRRK2 hæmmere, forsvinder det øverste bandet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Repræsentativt resultat af P-tag skamplet: overekspression system. Det øverste panel viser den P-tag blot ved hjælp af en anti-HA antistof, hvor fosforyleres og ikke-fosforyleret Rab10 er markeret med åbne (○) og lukket (●) cirkler, henholdsvis. Panelerne vist nedenfor P-tag blot er immunoblots på normale SDS-PAGE geler ved hjælp af en anti-HA, anti-FLAG, anti-α-tubulin og anti-GAPDH antistoffer. HA skamplet og FLAG skamplet er vist for at sikre overekspression af HA-Rab10 og 3xFLAG-LRRK2, henholdsvis. Α-tubulin og GAPDH blotting er vist for at sikre lige lastning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Repræsentativt resultat af P-tag skamplet: endogene system. To cellelinjer, nemlig (A) 3T3-schweiziske albino celler og (B) A549 celler, blev anvendt. I begge tal viser top paneler, P-tag blotting ved hjælp af et anti-Rab10 antistof, hvor fosforyleres og ikke-fosforyleret endogene Rab10 er markeret med åben (○) og lukket (●) cirkler, henholdsvis. Panelerne vist nedenfor P-tag klatter er immunoblots på normale SDS-PAGE geler ved hjælp af en anti-Rab10, anti-pSer935 LRRK2, anti-LRRK2 og anti-α-tubulin antistoffer. Rab10 og LRRK2 er vist for at sikre den tilsvarende udtryk af endogene Rab10 og LRRK2 mellem prøverne, henholdsvis. PSer935 LRRK2 skamplet er vist for at sikre, at GSK2578215A (A) og MLi-2 (B) fungeret som forventet. Α-tubulin skamplet er vist for at sikre lige lastning. Billeder af P-tag blotting overlejret med molekylvægt markør er vist i Figur S4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur S1. DNA-sekvenser af plasmider. DNA-sekvenser af plasmid kodning HA-Rab10/pcDNA5 FRT til og med 3 × FLAG-LRRK2/p3 × FLAG-CMV-10. Alle plasmider bruges i denne protokol er ledige fra forfattere efter anmodning. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Figur S2. Et eksempel på optimering af P-tag SDS-PAGE. Det samme sæt af prøver som bruges i figur 3A blev brugt til at optimere P-tag SDS-PAGE. Fire forskellige betingelser blev testet som vist i figur. Bånd svarende til fosforyleres og ikke-fosforyleret Rab10 er fremhævet med solid og stiplede linje rektangler, henholdsvis.Baseret på dette eksperiment, gav tilstand med 10% acrylamid, 50 µM P-tag acrylamid og 100 µM frihedsbevægelse2 den bedste adskillelse af de to bands, både at finde i midten af gelen. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Figur S3. Sammenligning af migration mønster af en molekylvægt markør. Molekylær vægt markør (MWM) blev kørt på en regelmæssig SDS-PAGE gel (venstre panel) eller på en P-tag SDS-PAGE gel (midterste panel), og geler blev plettet af Coomassie farvning. Højre panel viser en immunblot af de prøver, der indgår i figur 2 (lane 4 og 5) på den samme P-tag SDS-PAGE gel som den midterste panel til at vise positioner af fosforyleres og ikke-fosforyleret Rab10. Pilespids på højre side af immunblot angiver placeringen af en af MWM på P-tag SDS-PAGE gel. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Figur S4. Placeringen af en molekylvægt markør på P-tag SDS-PAGE geler. Digitaliserede billeder af membraner bruges til figur 3A og figur 3B er vist som (A) og(B), henholdsvis. Immunoblots vist i figur 3 er overlejret for at vise den relative placering af molekylvægt markør (MWM). MWM gjorde ikke overføre godt til membraner men markør (pilespids) i Figur S3 var svagt men konsekvent overholdes. Placeringen af MWM er markeret med stiplede linjer. Bemærk, at baner irrelevant tal mellem MWM og baner af interesse er overstreget. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her, beskriver vi en letkøbt og robust metode til påvisning af Rab10 fosforylering af LRRK2 på endogene niveauer baseret på metoden P-tag. Fordi den foreliggende antistof mod fosforyleres Rab10 virker kun med overexpressed proteiner15, er den nuværende metode udnytter P-tag SDS-PAGE den eneste måde at vurdere endogene niveauer af Rab10 fosforylering. Desuden, den nuværende metode giver mulighed for vurdering af støkiometrisk af Rab10 fosforylering i celler. Fordi metoden P-tag er generisk gældende at phospho-proteiner, kan denne protokol et "prototype" for at etablere lignende metoder for andre phospho-proteiner.
Kritiske trin i protokollen er casting geler og forberedelse af prøverne. P-tag acrylamid er et relativt foto-labil reagens og evnen til at forsinke fosforyleres proteiner elektroforese mobilitet er undertiden tabt efter lang sigt opbevaring ved 4 ° C. Forskere skal tage hver omhu for at undgå at udsætte P-tag acrylamid til lys. Desuden, P-tag molekyle skal danne et kompleks sammen med Mn2 + ioner til at fange fosfater. Prøver bør således ikke indeholde chelatdannere som EDTA, som er sædvanlige komponenter af kommercielt tilgængelige SDS-PAGE prøve buffere. Vi anbefaler at bruge den klassiske Laemmli prøvebuffer for at forberede prøverne for P-tag SDS-PAGE.
Et andet kritisk punkt er grundigt optimere koncentrationer af acrylamid, P-tag acrylamid og frihedsbevægelse2 adskillelse gel blanding (Figur S2). Migration afstande af fosforyleres og ikke-fosforyleret bands vil variere afhængigt af de reagenser, der anvendes (lot, renhed, etc.), og optimering af de rette koncentrationer ved at teste flere forskellige koncentrationer i kombination er obligatoriske (f.eks. P-tag acrylamid (25, 50, 75 µM), frihedsbevægelse2 (1:2 eller 1:3 molære forhold til P-tag acrylamid) og acrylamid (7,5, 10 og 12,5%)). De fosforyleres og ikke-fosforyleret bands skal vises i midten af geler og adskilt godt fra hinanden. For optimeringsprocessen anbefales det at bruge overexpressed Rab10 fordi skiftede bandet er let påviselige. Forfatterne kan give kontrolprøver for denne protokol.
En af de største forvirring, som denne protokol kan forårsage vil skyldes migrationsmønstre af MWM forskellen mellem almindelige og P-tag SDS-PAGE geler. Som vist i Figur S3, migrationsmønstre af MWM på regelmæssig og P-tag SDS-PAGE geler (begge 10%) er meget forskellige og man kan ikke bruge MWM til estimering molekylvægt af proteiner på P-tag SDS-PAGE geler. Men, på P-tag SDS-PAGE geler, en af MWM skiller sig ud ved at overflytte til midten af gel (pilespids i Figur S3), som er konsekvent observeret blandt geler (Se Figur S4). Denne MWM trækker altid mellem bands af fosforyleres og ikke-fosforyleret Rab10. Derfor, denne markør er nyttigt ikke kun for at sikre, at P-tag SDS-PAGE virker før overførsel, men også som et vartegn for at have en ru fornemmelse af hvor bands af fosforyleres og ikke-fosforyleret Rab10 vil ses.
Til påvisning af bands på immunoblots, vi har brugt en imager, udstyret med en afkølet CCD kamera (Se Tabel af materialer) såvel som en konventionel X-ray film system, der udvikles, og fandt, at begge systemer fungerer godt. Til påvisning af endogene niveauer af Rab10 fosforylering i kulturperler celler er det nødvendigt at bruge cellelinjer, som har høj udtryk niveauer af endogent LRRK2, såsom mus embryonale fibroblaster (enten primære kulturperler eller udødeliggjort celle linjer ( 3T3-schweiziske albino, etc.)) og menneskeligt carcinom-afledte A549 Lungeceller. Til påvisning af endogene niveauer af Rab10 fosforylering i mus væv anbefales det at bruge lunge16.
Kvantitering af Rab10 fosforylering er ikke videre end den sædvanlige immunoblotting. Hvis støkiometrisk af Rab10 fosforylering er meget lav (som vist i figur 3), intensiteten af ikke-fosforyleret band (markeret med en lukket cirkel) tendens til at være langt over mætningsniveauet gør det præcis bestemmelse af støkiometrisk umuligt. Ikke desto mindre er kvalitativt skøn stadig muligt under alle omstændigheder, som ikke fås uden brug af den nuværende metode. Da påvisning af fosforylering af endogene Rab10 kræver langvarig eksponering, der har tendens til at være nogle uspecifikke bands optræder på P-tag blot selv om anti-Rab10 antistoffer bruges i denne protokol giver nogenlunde rent immunoblots til normal brug . For at skelne fosforyleres proteiner fra uspecifik bands, er det kritisk at bruge en inhibitor-behandling kontrol, hvor fosforyleres bands, men ikke uspecifik bands, bør forsvinde. LRRK2 phosphorylates Rab8 udover Rab1015, og vi har med succes anvendt denne protokol på Rab8A samt (data ikke vist). Denne protokol kan potentielt bruges til at undersøge fosforylering af alle proteiner, selv om der kan være tekniske vanskeligheder, hvis proteinet er stor (> 100 kDa) eller formere fosforyleres. Fordi Rab10 er en lille protein (25 kDa) og enkeltvis fosforyleret på Thr73 af LRRK2, er resultatet af P-tag SDS-PAGE enkel, hvor kun én skiftede bandet er observeret.
I den nærmeste fremtid, vil det være afgørende at fastlægge metoden til kvantitativt påvisning kinase aktivitet af LRRK2 i patient-afledte prøver i en høj overførselshastighed måde at vurdere ændringen af kinase aktiviteten i LRRK2 i PD patienter samt at evaluere virkningen af lægemidler på LRRK2 i kliniske forsøg. Siden humant perifert blod mononukleære celler (PBMC) express relativt høje niveauer af endogent LRRK223, PBMC eller yderligere isoleret blodlegemer vil være værd prøvning for endogene Rab10 fosforylering. Den nuværende metode vil ikke kun være nyttige i at undersøge LRRK2 grundlæggende biologi, signalering pathway, men også støtte i at opnå en grundlæggende proof-of-concept for at beslutte hvilken prøve i patient-afledte prøver er analyseres i sådanne store undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo, Japan) venligst give plasmider kodning af 3xFLAG-LRRK2 WT og mutanter. Vi takker også Dr. Dario Alessi (universitetet i Dundee, UK) venligst give MLi-2 og plasmid kodning HA-Rab10. Dette arbejde blev støttet af Japan-samfund til fremme af videnskab (JSP'ER) KAKENHI tilskud antal JP17K08265 (G.I.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | homemade | 150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4 in MilliQ water and sterilized by autoclaving | |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque | 31320-34 | |
| Sodium Disodium Hydrogenphosphate 12-Water | Wako | 196-02835 | |
| Potassium chloride | Wako | 163-03545 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Wako | 169-04245 | |
| 2.5% Trypsin (10X) | Sigma-Aldrich | T4549 | Dilute 10-fold with sterile DPBS for preparing working solution |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) |
Wako | 044-29765 | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1560 | Heat-inactivated at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Wako | 168-23191 | |
| HEPES | Wako | 342-01375 | |
| Sodium hydroxide | Wako | 198-13765 | |
| Polyethylenimine HCl MAX, Linear, Mw 40,000 (PEI MAX 40000) | PolySciences, Inc. | 24765-1 | Stock solution was prepared in 20 mM HEPES-NaOH pH 7.0 at 1 mg/mL and the pH was then adjusted to 7.0 with NaOH |
| Dimethyl sulfoxide | Wako | 045-28335 | |
| Tris | STAR | RSP-THA500G | |
| Hydrochloric acid | Wako | 080-01066 | |
| Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether | Wako | 160-24751 | Equivalent to Triton X-100 |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Wako | 346-01312 | |
| Sodium orthovanadate(V) | Wako | 198-09752 | |
| Sodium fluoride | Kanto Chemical | 37174-20 | |
| β-Glycerophosphoric Acid Disodium Salt Pentahydrate | Nacalai Tesque | 17103-82 | |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Kokusan Chemical | 2113899 | |
| Microcystin-LR | Wako | 136-12241 | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Dissolve one tablet in 1 mL water, which can be stored at -20 °C for a month. Use it at 1:50 dilution for cell lysis |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23200 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31607-65 | |
| Glycerol | Wako | 075-00616 | |
| Bromophenol blue | Wako | 021-02911 | |
| β-mercaptoethanol | Kanto Chemical | 25099-00 | |
| Ethanol | Wako | 056-06967 | |
| Methanol | Wako | 136-01837 | |
| Phosphate-binding tag acrylamide | Wako | AAL-107 | P-tag acrylamide |
| 40% (w/v) acrylamide solution | Nacalai Tesque | 06119-45 | Acrylamide:Bis = 29:1 |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai Tesque | 33401-72 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Wako | 016-08021 | 10% (w/v) solution was prepared by dissolving the powder of ammonium persulfate in MilliQ water |
| 2-propanol | Wako | 166-04831 | |
| Manganese chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M3634 | |
| Precision Plus Protein Prestained Standard | Bio-Rad | 1610374, 1610373, 1610377 | Molecular weight marker used in the protocol |
| WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III | Wako | 230-02461 | |
| Glycine | Nacalai Tesque | 17109-64 | |
| Amersham Protran NC 0.45 | GE Healthcare | 10600007 | Nitrocellulose membrane |
| Durapore Membrane Filter | EMD Millipore | GVHP00010 | PVDF membrane |
| Filter Papers No.1 | Advantec | 00013600 | |
| Ponceau S | Nacalai Tesque | 28322-72 | |
| Acetic acid | Wako | 017-00251 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | polyoxyethylenesorbitan monolaurate |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Wako | 345-01865 | |
| Skim milk powder | Difco Laboratories | 232100 | |
| Immunostar | Wako | 291-55203 | ECL solution (Normal sensitivity) |
| Immunostar LD | Wako | 290-69904 | ECL solution (High sensitivity) |
| CBB staining solution | homemade | 1 g CBB R-250, 50% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid in 1 L of MilliQ water | |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | |
| CBB destaining solution | homemade | 12% (v/v) methanol, 7% (v/v) acetic acid in 1 L MilliQ water | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | 11583816001 | Used at 0.2 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-Rab10 antibody | Cell Signaling Technology | #8127 | Used at 1:1000 for immunoblotting. Specificity was confirmed by CRISPR KO in Ito et al., Biochem J, 2016. |
| anti-pSer935 antibody | Abcam | ab133450 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-LRRK2 antibody | Abcam | ab133518 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T9026 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-GAPDH antibody | Santa-Cruz | sc-32233 | Used at 0.02 μg/mL for immunoblotting. |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 | Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting. |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inhibitors | |||
| GSK2578215A | MedChem Express | HY-13237 | Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C |
| MLi-2 | Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee) | Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| Rab10/pcDNA5 FRT TO HA | Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee) |
This plasmid expresses amino-terminally HA-tagged human Rab10. | |
| LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged wild-type human LRRK2. | |
| LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged K1906M kinase-inactive mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10 | This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged N1437H FPD mutant of human LRRK2. | ||
| LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441C FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441G FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441H FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10 | This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441S FPD mutant of human LRRK2. | ||
| LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged Y1699C FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged G2019S FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged I2020T FPD mutant of human LRRK2. | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Forma Series II 3110 Water-Jacketed | |
| Auto Pipette | Drummond | Pipet-Aid PA-400 | |
| Micropipette P10 | Nichiryo | 00-NPX2-10 | 0.5–10 μL |
| Micropipette P200 | Nichiryo | 00-NPX2-200 | 20–200 μL |
| Micropipette P1000 | Nichiryo | 00-NPX2-1000 | 100–1000 μL |
| Tips for micropipette P10 | STAR | RST-481LCRST | Sterile |
| Tips for micropipette P200 | FUKAEKASEI | 1201-705YS | Sterile |
| Tips for micropipette P1000 | STAR | RST-4810BRST | Sterile |
| 5 mL disporsable pipette | Greiner | 606180 | Sterile |
| 10 mL disporsable pipette | Greiner | 607180 | Sterile |
| 25 mL disporsable pipette | Falcon | 357535 | Sterile |
| Hematocytometer | Sunlead Glass | A126 | Improved Neubeuer |
| Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 10 cm dishes | Falcon | 353003 | For tissue culture |
| 6-well plates | AGC Techno Glass | 3810-006 | For tissue culture |
| Vortex mixer | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| Cell scrapers | Sumitomo Bakelite | MS-93100 | |
| 1.5 mL tubes | STAR | RSV-MTT1.5 | |
| 15 mL tubes | AGC Techno Glass | 2323-015 | |
| 50 mL tubes | AGC Techno Glass | 2343-050 | |
| Centrifuges | TOMY | MX-307 | |
| 96-well plates | Greiner | 655061 | Not for tissue culture |
| Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M2e | |
| SDS–PAGE tanks | Nihon Eido | NA-1010 | |
| Transfer tanks | Nihon Eido | NA-1510B | |
| Gel plates (notched) | Nihon Eido | NA-1000-1 | |
| Gel plates (plain) | Nihon Eido | NA-1000-2 | |
| Silicon spacers | Nihon Eido | NA-1000-16 | |
| 17-well combs | Nihon Eido | Custom made | |
| Binder clips | Nihon Eido | NA-1000-15 | |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| 21G | Terumo | NN-2138R | |
| Power Station 1000 VC | ATTO | AE-8450 | Power supply for SDS–PAGE and transfer |
| Large weighing boats | Ina Optika | AS-DL | |
| Plastic containers | AS ONE | PS CASE No.4 | 10 x 80 x 50 mm |
| Rocking shaker | Titech | NR-10 | |
| Styrene foam box | generic | The internal dimensions should fit one transfer tank (200 x 250 x 250 mm). | |
| ImageQuant LAS-4000 | GE Healthcare | An imager equipped with a cooled CCD camera for detection of ECL |
References
- Sveinbjornsdottir, S. The clinical symptoms of Parkinson's disease. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 318-324 (2016).
- Hernandez, D. G., Reed, X., Singleton, A. B. Genetics in Parkinson disease: Mendelian versus non-Mendelian inheritance. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 59-74 (2016).
- Paisán-Ruíz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
- Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
- Gilks, W. P., et al. A common LRRK2 mutation in idiopathic Parkinson's disease. Lancet. 365 (9457), 415-416 (2005).
- Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).
- Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).
- Klein, C., Ziegler, A. Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson's disease: a meta-analysis of genome-wide association studies. Lancet. 377 (9766), 641-649 (2011).
- Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease. Nat. Rev. Neurosci. 11 (12), 791-797 (2010).
- Ozelius, L. J., et al. LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in Ashkenazi Jews. N. Engl. J. Med. 354 (4), 424-425 (2006).
- Lesage, S., et al. LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in North African Arabs. N. Engl. J. Med. 354 (4), 422-423 (2006).
- Bouhouche, A., et al. LRRK2 G2019S Mutation: Prevalence and Clinical Features in Moroccans with Parkinson's Disease. Parkinsons. Dis. , 1-7 (2017).
- West, A. B., et al. Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (46), 16842-16847 (2005).
- Ito, G., et al. GTP binding is essential to the protein kinase activity of LRRK2, a causative gene product for familial Parkinson's disease. Biochemistry. 46 (5), 1380-1388 (2007).
- Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
- Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochem. J. 473, 2671-2685 (2016).
- Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins. Mol. Cell. Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).
- Database, J. S. E. Using a Hemacytometer to Count Cells. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2017).
- Ni, D., Xu, P., Gallagher, S. Immunoblotting and Immunodetection. Curr. Protoc. Mol. Biol. (114), 10.8.1-10.8.37 (2016).
- Reith, A. D., et al. GSK2578215A; a potent and highly selective 2-arylmethyloxy-5-substitutent-N-arylbenzamide LRRK2 kinase inhibitor. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22 (17), 5625-5629 (2012).
- Fell, M. J., et al. MLi-2, a potent, selective and centrally active compound for exploring the therapeutic potential and safety of LRRK2 kinase inhibition. J. Pharmacol. Exp. Ther. 355, 397-409 (2015).
- Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem. J. 430 (3), 405-413 (2010).
- Thévenet, J., Pescini Gobert, R., Hooft van Huijsduijnen , R., Wiessner, C., Sagot, Y. J. Regulation of LRRK2 expression points to a functional role in human monocyte maturation. PLoS One. 6 (6), e21519 (2011).
