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Medicine

पश्चात संज्ञानात्मक रोग और ऊतक पुनर्जनन अध्ययन करने के लिए आर्थोपेडिक सर्जरी के एक माउस मॉडल

Published: February 27, 2018 doi: 10.3791/56701
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 1,4
1Department of Anesthesiology, Duke University Medical Center, 2Department of Orthopaedic Surgery, Duke University Medical Center, 3Duke Molecular Physiology Institute, 4Center for Translational Pain Medicine, Duke University Medical Center

Summary

इस प्रोटोकॉल आर्थोपेडिक सर्जरी कि पश्चात neuroinflammation और व्यवहार परिवर्तन के तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है की एक माउस मॉडल का वर्णन है, और जब parabiosis के साथ संयुक्त, उंर बढ़ने के दौरान ऊतक पुनर्जनन के अध्ययन के लिए ।

Abstract

सर्जरी सामांयतः जीवन की गुणवत्ता में सुधार लाने और बनाए रखने के लिए किया जाता है । दुर्भाग्य से, इस तरह के बुजुर्ग के रूप में कमजोर रोगियों में, जटिलताओं हो सकता है और काफी परिणाम कम । दरअसल, नियमित आर्थोपेडिक सर्जरी के बाद एक फ्रैक्चर की मरंमत के लिए, बुजुर्ग रोगियों के रूप में कई के रूप में ५०% प्रलाप की तरह neurologic जटिलताओं से पीड़ित हैं । इसके अलावा, क्षमता को चंगा करने के लिए और सर्जरी के बाद ऊतक पुनर्जंम उंर के साथ कम हो जाती है, और फ्रैक्चर की मरंमत की गुणवत्ता और प्रत्यारोपण के भी osseous एकीकरण प्रभाव कर सकते हैं । इस प्रकार, तंत्र की एक बेहतर समझ है कि ड्राइव इन उंर पर निर्भर परिवर्तन रणनीतिक लक्ष्य प्रदान करने के लिए इस तरह की जटिलताओं के लिए जोखिम को कम करने और परिणामों का अनुकूलन सकता है । यहां, हम टिबियल फ्रैक्चर के एक नैदानिक प्रासंगिक माउस मॉडल परिचय । इन चूहों में पश्चात परिवर्तन संज्ञानात्मक विकलांगता सामांयतः मनुष्यों में नियमित आर्थोपेडिक सर्जरी के बाद मनाया के कुछ नकल । संक्षेप में, एक चीरा कड़ाई अपूतित शर्तों के तहत सही हिंद अंग में किया जाता है । मांसपेशियों को असंबद्ध कर रहे हैं, और एक ०.३८ मिमी स्टेनलेस स्टील पिन टिबिया के ऊपरी शिखा में डाला जाता है, intramedullary नहर के अंदर. Osteotomy तो प्रदर्शन किया है, और घाव स्टेपल है । हम पश्चात neuroinflammation और व्यवहार परिवर्तन पर शल्य चिकित्सा आघात के प्रभाव की जांच करने के लिए इस मॉडल का इस्तेमाल किया है । parabiosis, एक शल्य मॉडल जिसमें 2 चूहों anastomosed है के साथ संयोजन में इस फ्रैक्चर मॉडल लागू करके, हम कोशिकाओं और स्रावित कारकों का अध्ययन किया है कि प्रणालीबद्ध अंग समारोह और चोट के बाद ऊतक पुनर्जनन कायाकल्प । हमारे कदम दर कदम प्रोटोकॉल का पालन करके, इन मॉडलों को उच्च निष्ठा के साथ reproduced किया जा सकता है, और शल्य चिकित्सा आघात से बदल रहे हैं कि कई जीवविज्ञान रास्ते पूछताछ करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Introduction

सर्जरी चिकित्सा स्वास्थ्य देखभाल प्रणाली बदल गया है और लगातार अत्याधुनिक प्रौद्योगिकी, बेहतर सुरक्षा, और जीवन की गुणवत्ता बनाए रखा काटने के लिए योगदान दे रहा है । दुर्भाग्य से, शल्य चिकित्सा भी pathophysiologic प्रतिक्रियाओं कि घाव में संक्रमण, neurologic दोष सहित पश्चात जटिलताओं के लिए नेतृत्व कर सकते है लाती है, और यहां तक कि मृत्यु, विशेष रूप से बुजुर्ग रोगियों में1,2। आर्थोपेडिक सर्जरी नियमित रूप से किया जाता है, विशेष रूप से पुराने वयस्कों में, जीवन की गुणवत्ता में सुधार और आम हड्डी चोटों की मरंमत करने के लिए । हालांकि, आर्थोपेडिक सर्जरी के रोगियों जो ६५ साल और पुराने अनुभव के ५०% के लिए कर रहे है ऐसे पश्चात प्रलाप के रूप में neurologic विकलांगता । यह लगातार गरीब पूर्वानुमान के साथ संबद्ध, यानी, 5-6 महीने में मृत्यु दर के लिए बढ़ा जोखिम गुना, लगातार कार्यात्मक गिरावट, रोगी प्रति नर्सिंग समय में वृद्धि हुई, अस्पताल में रहने की लंबाई में वृद्धि हुई, और नर्सिंग होम प्लेसमेंट की उच्च दर 3 , 4 , 5. उंनत उंर सहित कुछ जोखिम कारक, की पहचान की गई है, लेकिन थोड़ा सर्जरी के बाद neurologic विकलांगता के लिए जिंमेदार तंत्र के बारे में जाना जाता है ।

फ्रैक्चर के बाद से बुजुर्गों में बहुत आम हैं, हम टिबियल फ्रैक्चर के एक माउस मॉडल की स्थापना की है पश्चात वसूली पर परिधीय आघात के प्रभाव का निर्धारण, neuroinflammation और मस्तिष्क स्वास्थ्य सहित (संज्ञानात्मक समारोह)6, 7. यह मॉडल, मूलतः हैरी एट अल द्वारा वर्णित है । 8, intramedullary लगाए और सामान्य संज्ञाहरण और analgesia के तहत टिबियल फ्रैक्चर के होते हैं, और इस तरह त्वचा की चोट, मांसपेशी आघात, और आम लंबी हड्डी भंग और मनुष्यों में मरम्मत के साथ जुड़े हड्डी की मरंमत की नकल । इस कार्यविधि के बाद, चूहों में परिवर्तनों के समान भड़काऊ मार्करों में परिवर्तन प्रदर्शित करता है मनुष्यों में9,10, साथ ही हिप्पोकैम्पस में microglial सक्रियण, जो declarative स्मृति में घाटे के साथ जुड़ा हुआ है और हिप्पोकैम्पस neuroplasticity६,७,११. हम पहले parabiosis के साथ इस फ्रैक्चर मॉडल संयुक्त है । Parabiosis एक शल्य मॉडल है जिसमें 2 चूहे anastomosed हैं, और इस तरह एक संचार प्रणाली का हिस्सा है । यह मॉडल आयु और रोग12,13,14के संदर्भ में अंग समारोह पर परिसंचारी कोशिकाओं और विनोदी कारकों के विनियामक प्रभाव की समझ में एक सफलता प्रदान की गई है । इस दृष्टिकोण का उपयोग कर हम हाल ही में की खोज प्रणालीगत कारकों उम्र निर्भर फ्रैक्चर हीलिंग12के साथ जुड़े.

यहां, हम एक प्रोटोकॉल है कि parabiosis के साथ टिबियल फ्रैक्चर मॉडल को जोड़ती है शुरू करने के लिए अस्थि-मस्तिष्क आयु निर्भर तंत्र है, जो अपक्षयी दवा और neuroimmunology के लिए प्रासंगिक है अध्ययन । प्रोटोकॉल 1a parabiosis कार्यविधि का वर्णन करता है, और प्रोटोकॉल 1b विवरण टिबियल फ्रैक्चर प्रक्रिया (चित्र 1a) । ये स्वतंत्र रूप से या संयोजन में किया जा सकता है, पूछताछ की प्रकृति पर निर्भर करता है ।

Protocol

सभी पशु प्रयोगों की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार आयोजित किया गया, और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) ड्यूक विश्वविद्यालय में द्वारा अनुमोदित ।

1. प्रायोगिक पशु

  1. चूहों को एक वातानुकूलित वातावरण में 12-h प्रकाश/अंधेरे चक्र और मानक भोजन और पानी के लिए उचित उपयोग के साथ रखें । घर नहीं पिंजरे प्रति 5 littermates से अधिक है, और शर्तों है कि लड़ प्रोत्साहित कर सकता से बचें ।
  2. उम्र के 3 महीने (युवा) या उम्र के 18 महीने (पुराने) में मिहला C57BL6/J चूहों का प्रयोग करें ।
  3. parabiosis के लिए, acclimate 2 चूहों को एक साथ सर्जरी से पहले कम से दो सप्ताह के लिए । चूहों या तो जंगली-प्रकार C57BL6/जे या eGFP + हैं ।
  4. शरीर की हालत और दैनिक चूहों की समग्र उपस्थिति की जाँच करें.

2. Parabiosis और आर्थोपेडिक सर्जरी के लिए ऑपरेटिव सेटअप

  1. 2 चूहों वजन ।
  2. ०.२ एल के एक निरंतर ओ2 प्रवाह दर पर एक संज्ञाहरण प्रणाली के माध्यम से सामान्य संज्ञाहरण प्रशासन एक प्रेरण कक्ष में प्रेरण के लिए 5% isoflurane का उपयोग करें ।
    ध्यान दें: संज्ञाहरण की गहराई एक पैर की अंगुली चुटकी का उपयोग कर पुष्टि की जा सकती है ।
  3. एक लापरवाह स्थिति में एक गरम पैड पर चूहों प्लेस । एक गुदा जांच का उपयोग करने के लिए शल्य प्रक्रिया में शरीर के तापमान पर नजर रखने के ।
  4. संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए, एक facemask के माध्यम से ०.२ एल में २.०% के लिए isoflurane की साँस एकाग्रता कम/ संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई को सुनिश्चित करने के लिए निगरानी ।
  5. मॉनिटर शारीरिक मापदंडों (श्वसन दर, ऑक्सीजन संतृप्ति, और दिल की धड़कन) गैर-इनवेसिव एक पल्स oximeter का उपयोग कर (वैकल्पिक).

3. Parabiosis सर्जरी (प्रोटोकॉल 1a)

  1. प्रशासन analgesia (buprenorphine, SR/धीमी गति से जारी, ०.१ मिलीग्राम/किलोग्राम चमड़े के बाद) प्रेरण और शल्य हेरफेर से पहले । बस खोलने से पहले पार्श्वों में bupivacaine (०.२५%) नेत्र स्नेहक लागू करें ।
    नोट: parabiosis प्रोटोकॉल टिबियल फ्रैक्चर से स्वतंत्र रूप से किया जा सकता है ।
  2. सभी आंतरिक शरीर suturing के लिए, 4-0 polydioxanone टांका सामग्री का उपयोग करें । सभी बाहरी suturing के लिए, 4-0 के टांके सामग्री का उपयोग करें ।
  3. कोहनी से एक निरंतर लाइन के साथ 2 चूहों में से प्रत्येक दाढ़ी, पार्श्व, और पक्ष पर घुटने में शामिल होने के लिए । आयोडीन के साथ संक्रमित + ७०% अल्कोहल की त्वचा सफ़ाई चीरा के लिए तैयारी में 3 से अधिक चक्र बारी ।
    autoclaved उपकरणों का इस्तेमाल किया और एक बाँझ क्षेत्र को बनाए रखने.
    नोट: eGFP माउस के अधिकार के लिए जंगली प्रकार के माउस प्लेस, और जंगली प्रकार माउस और शल्य चिकित्सा के लिए eGFP माउस के दाहिने पार्श्व के बाएं पार्श्व तैयार (चित्रा 1) ।
  4. प्रत्येक माउस पर, एक कैंची का उपयोग करने के लिए पार्श्व के साथ एक त्वचा चीरा, घुटने के लिए समीपस्थ को लेकर सिर्फ कोहनी को समीपस्थ, और त्वचा के नीचे की मांसपेशियों को परेशान किए बिना ।
  5. 2 बाधित टांके के साथ जानवरों के triceps में शामिल हों ।
  6. 7-9 गुजरता के एक चल रहा है, सतत सीवन के साथ पार्श्वों के साथ शरीर की दीवारों में शामिल हों ।
  7. 2 बाधित टांके के साथ पशु के quadriceps में शामिल हों ।
  8. बाधित टांके के साथ 2 parabionts की त्वचा को बंद करें ।
  9. चूहों परिवेशी हवा में जाग करने के लिए अनुमति दें ।
  10. इस प्रोटोकॉल की सफलता सुनिश्चित करने के लिए, जोड़े के स्वास्थ्य को बनाए रखा जाना चाहिए: दैनिक जोड़े की निगरानी; शरीर की स्थिति दो बार साप्ताहिक स्कोरिंग प्रदर्शन; और दो बार साप्ताहिक जोड़े तौलना ।
    नोट: प्रत्येक जोड़ी व्यक्तिगत रूप से स्थित है ।
    नोट: यदि नियमित रूप से buprenorphine का उपयोग करना (यानी नहीं SR/धीमी गति से जारी) तो प्रशासन ०.१ मिलीग्राम/kg में चमड़े के ऊपर 1 मिलीलीटर में दो बार दैनिक 3 दिनों के लिए ।
  11. parabionts के बीच साझा संचलन सुनिश्चित करने के लिए रिकवरी समय के 4 सप्ताह की अनुमति दें यदि टिबियल फ्रैक्चर सर्जरी प्रदर्शन ।

4. टिबियल फ्रैक्चर सर्जरी (प्रोटोकॉल 1b)

  1. प्रेरण के बाद और शल्य हेरफेर से पहले analgesia प्रशासन (buprenorphine, ०.१ मिलीग्राम/ बस खोलने से पहले घुटने को समीपस्थ शल्य साइट पर bupivacaine (०.२५%) नेत्र स्नेहक लागू करें ।
  2. शल्य क्षेत्र बेनकाब करने के लिए माउस के अधिकार हिंद अंग के औसत दर्जे का पहलू दाढ़ी, और आयोडीन के साथ संक्रमित + ७०% अल्कोहल त्वचा सफ़ाई पर 3 बारी चक्र । प्रक्रिया में एक बाँझ शल्य क्षेत्र बनाए रखें । संदूषण को सीमित करने के लिए; autoclaved उपकरणों और दस्ताने का प्रयोग करें; एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत सर्जरी पूर्ण करें (वैकल्पिक); और शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए एक हीटिंग पैड का उपयोग करें ।
    नोट: यदि प्रोटोकॉल parabionts पर किया जाता है, केवल 1 माउस जोड़ी में खंडित (सही माउस का सही टिबिया) है । parabionts पर फ्रैक्चर के एक योजनाबद्ध आरेख के लिए चित्र 1b देखें ।
  3. एक कैंची का उपयोग करने के लिए दाहिने हिंद अंग के एक औसत दर्जे का पहलू के साथ घुटने के लिए सही माउस पर टिबिया के midshaft के लिए समीपस्थ चीरा ।
  4. टिबिया के midshaft को बेनकाब और नेत्रहीन diaphysis का पता लगाने । घुटने फ्लेक्स और एक मील का पत्थर के रूप में वुटने-ऊरु बंधन का उपयोग टिबियल पठार कल्पना ।
  5. patellar पट्टा कल्पना; मैन्युअल intramedullary नहर में एक 25-गेज सुई का उपयोग कर एक ०.५ मिमी छेद रोलिंग अंगूठे और तर्जनी द्वारा ड्रिल.
    नोट: ड्रिल होल टिबिया साथ समानांतर चलेंगे, में टिबियल पठार के माध्यम से ।
  6. डालें एक ०.३८ मिमी स्टेनलेस स्टील के बारे में छेद के माध्यम से दिमाग़ी गुहा में 15 मिमी के माध्यम से जब तक प्रतिरोध महसूस किया है, और टिबियल पठार एक तार कटर का उपयोग कर के साथ फ्लश कटौती (एक 3 डी पुनर्निर्माण के लिए अनुपूरक वीडियो 1 देखें) ।
  7. सीधे बॉन कैंची का प्रयोग, टिबिया midshaft (diaphysis) फ्रैक्चर । फ्रैक्चर के एक योजनाबद्ध आरेख के लिए चित्रा 1C देखें ।
  8. नेत्रहीन फ्रैक्चर साइट और फ्रैक्चर दृष्टि के स्थिरीकरण के लिए निरीक्षण करने के लिए आसंन ऊतकों का निरीक्षण ।
  9. अधययन स्टेपल के साथ बंद करो ।
  10. एक साफ घर पिंजरे के लिए उन्हें लौटने से पहले ठीक करने के लिए गरम पैड पर चूहों प्लेस । 1 मिलीलीटर गरम (३७ ° c) तरल प्रतिस्थापन के लिए प्रत्येक माउस में सामांय खारा नमकीन सुई ।
  11. लंगड़ा, संक्रमण, या रक्तस्राव के लक्षण के लिए दैनिक चूहों की जांच करें ।
    नोट: अगर नियमित रूप से buprenorphine का उपयोग (नहीं SR/धीमी गति से जारी) तो प्रशासन ०.१ मिलीग्राम/kg के 1 मिलीलीटर खारा में दैनिक 3 दिनों के लिए ।

Representative Results

अनुप्रस्थ osteotomies के बाद सावधानी से पिन और उचित suturing के स्थिर प्रविष्टि के साथ बाँझ शर्तों के तहत प्रदर्शन किया गया, चूहों लंगड़ा, संक्रमण, या सर्जरी के बाद बाएँ पैर में खून बह रहा है के कोई संकेत नहीं दिखाया. आर्थोपेडिक हीलिंग Safranin-O धुंधला (चित्रा 2) के बाद रेडियोग्राफिक विश्लेषण और histomorphometry का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया था । रेडियोग्राफ midshaft खंडित tibiae वृद्ध चूहों के फ्रैक्चर calluses की तुलना में युवा चूहों के फ्रैक्चर calluses में अधिक ऊतक जमाव संकेत दिया । फ्रैक्चर calluses decalcified और ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण के लिए तैयार करने में आयल में एंबेडेड थे । वर्गों Safranin के साथ दाग-ओ थे और ऊतक जमाव histomorphometry विश्लेषण का उपयोग quantified था । युवा चूहों के फ्रैक्चर calluses अधिक हड्डी और वृद्ध चूहों से फ्रैक्चर calluses से कम fibrotic ऊतक निहित ।

टिबियल फ्रैक्चर उत्प्रेरण प्रणालीगत और केंद्रीय सूजन6,7,11,15,16। दरअसल, समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस और खतरे से संबंधित आणविक पैटर्न (नम) के परिधीय स्तर के आर्थोपेडिक सर्जरी के बाद तेजी से ऊंचा कर रहे हैं, दोनों चूहों और मनुष्यों में7,17,18. यह कई संकेतन विनोदी, सेलुलर, और ंयूरॉन रास्ते से जुड़े तंत्र के माध्यम से मस्तिष्क में microglial कोशिकाओं के सक्रियण के लिए योगदान देता है7,15,19,20, 21. सर्जरी के बाद, endothelial शिथिलता, रक्त मस्तिष्क बाधा खोलने, और परिधीय मैक्रोफेज घुसपैठ जंगली प्रकार में तीव्र हिप्पोकैम्पस neuroinflammation में योगदान और Ccr2आरएफपी/+ Cx3cr1GFP/+ वयस्क चूहों15 , 19, और बाद में स्मृति घाटे है कि मानव प्रलाप और पश्चात संज्ञानात्मक रोग15,19,22के समान के साथ जुड़े रहे हैं । इस neuroinflammatory प्रतिक्रिया microglial आकृति विज्ञान में महत्वपूर्ण परिवर्तन के साथ, वृद्ध पशुओं में गहरा है, के रूप में आईबीए-1 immunostaining (चित्रा 3) द्वारा पता चला ।

टिबियल फ्रैक्चर मॉडल का उपयोग यहां वर्णित है, हम भी क्षणिक बिगड़ा हिप्पोकैम्पस neurogenesis पाया, के रूप में DCX immunostaining में doublecortin (dentate) गाइरस में कमी का सबूत20। दीर्घकालिक potentiation (LTP), स्मृति समारोह के लिए एक किराए के Electrophysiologic माप, एक समय पर निर्भर व्यवधान neuroplasticity पश्चात11में पता चला । सर्जरी के बाद चूहों भी हिप्पोकैम्पस-निर्भर स्मृति समारोह में दोष प्रदर्शन, उदाहरण के लिए डर कंडीशनिंग व्यवहार मूल्यांकन का उपयोग (चित्रा 4) । डर कंडीशनिंग में, चूहों को एक चैंबर में रखा जाता है और एक aversive उत्तेजना (यानी, footshock) के बाद एक श्रवण क्यू से अवगत कराया जाता है । तीन दिन टिबियल सर्जरी के बाद, चूहों कंडीशनिंग चैंबर में परीक्षण कर रहे हैं, किसी भी श्रवण या aversive उत्तेजना के बिना इस बार, और ठंड व्यवहार स्मृति के एक सूचकांक के रूप में दर्ज किया गया है (एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए देखें23) ।

उंनत उंर स्मृति गिरावट के लिए एक महत्वपूर्ण जोखिम कारक है । फिर भी, हम उंर के रूप में, ऊतक की मरंमत और पुनर्जनन के लिए क्षमता को कम हालांकि इन तंत्र खराब समझ में रहते हैं । इस प्रकार, हम प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया heterochronic parabiosis प्रदर्शन करने के लिए (युवा/पुराने जानवरों बाँधना) और वृद्ध माउस के भीतर का आकलन फ्रैक्चर हीलिंग (एक विस्तृत parabiosis प्रोटोकॉल के लिए24देखें) । parabiotic जोड़े के बीच रक्त-बंटवारे की पुष्टि हुई, और12के बराबर पाया गया । पहले संघ के साथ एक युवा संचलन बढ़ाया हड्डी की मरंमत करने के लिए एक्सपोजर, अस्थि जमाव में वृद्धि हुई है, और फाइब्रोसिस की कमी हुई (चित्रा 5)12। हड्डी पुनर्जनन के इस कायाकल्प अंतर्जात osteocalcin के स्वतंत्र हुई-सकारात्मक osteoblasts (चित्रा 5, ब्राउन सेल), बल्कि CD45 पर भरोसा-सकारात्मक कोशिकाओं है कि युवा parabiont से चले गए (चित्रा 5, ब्लू सेल) . इन परिणामों से संकेत मिलता है कि CD45-सकारात्मक टेम कोशिकाओं को एक युवा और स्वस्थ जगह है, जो वृद्ध osteoblastic उंहें प्रेरित करने के लिए और अधिक सक्रिय हो कोशिकाओं को संकेत करने में सक्षम है स्रावित ।

Figure 1
चित्रा 1: parabiosis और टिबियल फ्रैक्चर सर्जरी के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. (क) parabiosis और टिबियल फ्रैक्चर (प्रोटोकॉल 1a) या टिबियल फ्रैक्चर अकेले (प्रोटोकॉल 1b) के लिए समयरेखा । (ख) isochronic या heterochronic parabiotic जोड़े में 20 महीने पुराने चूहों के Tibiae (सही माउस का दाहिना पैर खंडित किया गया है, एक एक्स के साथ चिह्नित के रूप में) । ग्रे चूहों wildtype चूहों चित्रित जबकि ग्रीन चूहों eGFP चूहों चित्रित. (C) intramedullary लगाए और मध्य शाफ्ट fracturing के साथ टिबियल फ्रैक्चर मॉडल की योजनाबद्ध आरेख । हिंद अंग और टिबिया के पिन के एक 3d पुनर्निर्माण के लिए अनुपूरक वीडियो 1 भी देखें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: युवा और पुराने माउस मॉडल के भीतर टिबियल फ्रैक्चर हीलिंग । जवान या बूढ़े चूहों के tibiae को खंडित किया गया और फ्रेक्चर के calluses को 21 दिन बाद चोट की जांच की गई । (क) रेडियोग्राफिक इमेजिंग और histologic धुंधला (Safranin-O) फ्रैक्चर calluses 21 दिनों के बाद फ्रैक्चर का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया । धुंधला नीले और proteoglycans में कोलेजन के ऊतकों से पता चलता है (उपास्थि भीतर समाहित) लाल रंग में । डैश्ड रेखाएं फ्रैक्चर घट्टा के अनुमानित स्थान को इंगित करती हैं । (ख) Histomorphometry फ्रैक्चर घट्टा 21 दिनों के बाद फ्रैक्चर के भीतर जमा अस्थि, उपास्थि, और fibrotic ऊतक की राशि का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । डेटा के रूप में व्यक्त कर रहे हैं मतलब ± ९५% विश्वास अंतराल, * P < 0.05, सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण (एक-तरफ़ा ANOVA, Dunnett का परीक्षण), स्केल पट्टियां 2 मिमी का प्रतिनिधित्व करती हैं, और छवियां एक माइक्रोस्कोप, 1.25 x उद्देश्य का उपयोग करके प्राप्त की गईं । n = 9 प्रत्येक नमूने के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: हिप्पोकैम्पस में सर्जरी प्रेरित उंर-निर्भर microglial सक्रियण । टिबियल फ्रैक्चर सर्जरी के वृद्ध चूहों में अधिक से अधिक हिप्पोकैम्पस neuroinflammation लाती है (20 महीने की उम्र) 4 महीने पुराने C57BL6/जे चूहों की तुलना में. मस्तिष्क धारा microglial मार्कर आईबीए-1 के साथ धुंधला और अधिक सकारात्मक कोशिकाओं और शल्य चिकित्सा समूहों में सुघड़ परिवर्तन से पता चलता है 24 सर्जरी के बाद एच । छवियों 100x का एक इज़ाफ़ा के साथ एक epifluorescent माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त किया गया.; स्केल बार 10 µm का प्रतिनिधित्व करता है । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: बिगड़ा neurogenesis, दीर्घकालिक potentiation, और स्मृति समारोह टिबियल फ्रैक्चर सर्जरी के बाद. (क) DCX, neurogenesis के लिए एक मात्रात्मक मार्कर, सर्जरी के बाद २४ ज में हिप्पोकैम्पस dentate गाइरस में काफी कम है. छवियाँ 10x के एक इज़ाफ़ा के साथ एक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप उद्देश्य के साथ प्राप्त किया गया; स्केल बार 10 µm. (ख) नियंत्रण या चूहों से हिप्पोकैम्पस स्लाइस में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी 24 एच सर्जरी के बाद का प्रतिनिधित्व करता है । दीर्घकालिक potentiation (LTP) उच्च आवृत्ति उत्तेजना (HFS) द्वारा प्रेरित किया गया था और 1 से अधिक दर्ज क्षेत्र उत्तेजक postsynaptic क्षमता (fEPSPs) CA1 परत से दर्ज किया गया radiatum एक extracellular रिकॉर्डिंग का उपयोग कर नियमित रूप से भरा पिपेट कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव । सर्जरी के बाद 24 ज में, LTP प्रेरण चूहों पर नियंत्रण की तुलना में उल्लेखनीय रूप से कम है । डेटा का अर्थ ± s.e.m. n = 3, * p < ०.०५ 1-way ANOVA के रूप में व्यक्त किया जाता है । (ग) हिप्पोकैम्पस-निर्भर स्मृति समारोह (ट्रेस डर कंडीशनिंग का उपयोग कर ठंड के% के रूप में परिभाषित) सर्जरी के बाद चूहों में ख़राब है नियंत्रण और जानवरों संज्ञाहरण के लिए ही उजागर की तुलना में । डेटा अर्थ ± s.e.m. n = 9-10, * p < ०.०५ 1-way ANOVA के रूप में व्यक्त किए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: Parabiosis सर्जरी फ्रैक्चर चिकित्सा के कायाकल्प की ओर जाता है, रक्त बांटने, और दाता-सेल engraftment. Isochronic और heterochronic parabiosis pairings की स्थापना की और प्रत्येक जोड़ी में वृद्ध चूहे खंडित और अस्थि चिकित्सा के लिए मूल्यांकन किया गया था । (क) रेडियोग्राफिक इमेजिंग के प्रयोग से फ्रैक्चर calluses की जांच की गई । डैश्ड रेखाएं फ्रैक्चर घट्टा के अनुमानित स्थान को इंगित करती हैं । (ख) अस्थि मज्जा के भीतर eGFP + कोशिकाओं की पुष्टि की गई Engraftment । (ग) Immunohistochemistry फ्रैक्चर की घट्टा का प्रयोग eGFP+ दाता कोशिकाओं (नीला) और osteocalcin+ osteoblastic कोशिकाओं (ब्राउन) की parabiont से पहचानने के लिए किया जाता था । स्केल बार्स ५० µm का प्रतिनिधित्व करती है और 40x उद्देश्य का उपयोग करके छवियां प्राप्त की गईं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अनुपूरक वीडियो 1:3 डी पुनर्निर्माण हिंद अंग और टिबिया के पिन के । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Discussion

फ्रैक्चर एक आम नैदानिक समस्या है, और रुग्णता का एक प्रमुख कारण, विशेष रूप से तेजी से बढ़ती वरिष्ठ आबादी में रहते हैं । यहां, हम टिबियल फ्रैक्चर के एक माउस मॉडल पश्चात neuroinflammation और संज्ञानात्मक हानि के लिए जिंमेदार तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल परिचय । इस मॉडल parabiosis सर्जरी के साथ संयुक्त किया जा सकता है न्यूरो प्रतिरक्षा बातचीत, ऊतक पुनर्जनन, और अंय संकेतन प्रक्रियाओं का अध्ययन । इन तंत्र को समझने के लिए पश्चात जटिलताओं के लिए जोखिम को कम करने और परिणामों का अनुकूलन रणनीतिक लक्ष्य प्रदान करेगा ।

कई आर्थोपेडिक मॉडल कुतर25में हड्डी की मरंमत का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है । हम अपनाया और इस टिबियल फ्रैक्चर प्रक्रिया को संशोधित, मूलतः हैरी एट अल द्वारा वर्णित । 8, मस्तिष्क समारोह पर आर्थोपेडिक सर्जरी के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए । हम भी हमारे parabiosis मॉडल के साथ संयोजन में इस फ्रैक्चर मॉडल का इस्तेमाल किया है कारकों की जांच करने के लिए कि अस्थि चिकित्सा और उंर पर निर्भर ऊतक पुनर्जनन के लिए जिंमेदार हैं । जब अस्थिर सामान्य संज्ञाहरण के तहत प्रदर्शन किया, इस टिबियल फ्रैक्चर प्रक्रिया केवल प्रति जानवर के बारे में 15 मिनट की आवश्यकता है, न्यूनतम मृत्यु दर के लिए शून्य में परिणाम (माउस और अंतर्निहित आनुवंशिक संवेदनशीलता की उम्र पर निर्भर करता है), और recapitulates आम लंबे समय से अस्थि भंग और आर्थोपेडिक सर्जिकल आघात के साथ जुड़े अपमान । इस प्रकार, इस मॉडल जीवविज्ञान रास्ते पूछताछ और अनुदैर्ध्य आकलन प्रदर्शन के लिए आदर्श है । हालांकि, यह महत्वपूर्ण है कि osteotomy और लगाए reproducible हैं, और है कि कोमल ऊतकों को नुकसान संगत है । कोमल ऊतक नुकसान संग्राहक जा सकता है, उदाहरण के लिए periosteum अलग करना और आसपास की मांसपेशियों को चुटकी में सर्जरी और अधिक दर्दनाक बनाने के लिए । दर्दनाक फ्रैक्चर के मॉडल गैर तय कुंद आघात या तीन सूत्री झुकने ऐसी निरंतरता या सटीकता प्रदान नहीं होता द्वारा प्रेरित । इन प्रक्रियाओं अक्सर फिर से चोट में परिणाम है, जो लंबे समय तक भड़काऊ प्रतिक्रिया की ओर जाता है । इसके विपरीत, कठोर निर्धारण को शामिल फ्रैक्चर के मॉडल एक अधिक उदारवादी सूजन है, जो पूरी तरह से आर्थोपेडिक सर्जरी के साथ जुड़े नुकसान दोहराऊंगा नहीं करता है26,27.

अंय मॉडल टाइटेनियम-मिश्र धातु का उपयोग कर बारीकी से मानव संधिसंधान की नकल करने के लिए विकसित किया गया है और अधिक कृत्रिम अंग अंग अस्थिरता, osteolysis, और कृत्रिम अंग अंग-चूहों में जुड़े जटिलताओं से पूछताछ के लिए प्रासंगिकहोसकता है 28, 29 . इस तरह के एक के रूप में ड्रिल होल मॉडल यहां प्रस्तुत, पर्याप्त स्थिरीकरण प्रदान, और चूहों महत्वपूर्ण घाटे है कि डर कंडीशनिंग या खुला क्षेत्र गतिवान/चिंता परीक्षण के रूप में इस तरह के कार्यों को मिला सकता है बिना व्यवहार मानदंड में परीक्षण किया जा सकता है6 ,7,11,15,19,20. हालांकि, यदि निर्धारण ठीक से लॉक नहीं किया गया हो, तो घुमाव विकृति हो सकती है । कुछ मॉडल एक बाह्य निर्धारणकर्ता है, जो बेहतर स्थिरीकरण प्रदान करता है, लेकिन एक माउस टिबिया में लागू करने के लिए चुनौतीपूर्ण है, हालांकि इसे सफलतापूर्वक एक माउस फीमर27में कार्यांवित किया जा सकता का उपयोग करें ।

प्रलाप और पश्चात संज्ञानात्मक रोग सहित संज्ञानात्मक हानि, फ्रैक्चर की मरंमत के लिए आर्थोपेडिक सर्जरी के बाद आम जटिलताओं हैं, विशेष रूप से बुजुर्ग और कमजोर रोगियों में30। टिबियल फ्रैक्चर सर्जरी के इस नैदानिक प्रासंगिक माउस मॉडल दर्शाता है कि पश्चात प्रणालीगत cytokine रिलीज6,7,17, बिगड़ा रक्त मस्तिष्क बाधा समारोह15,19 , और बदल microglial आकृति विज्ञान16,22, स्मृति हानि करने के लिए योगदान, और आर्थोपेडिक सर्जरी के बाद कई रोगियों में देखा पश्चात neurologic जटिलताओं की महत्वपूर्ण सुविधाओं का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । यह अन्य शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं चूहों में पश्चात संज्ञानात्मक रोग मॉडल के लिए इस्तेमाल किया गया है कि नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है. इनमें उदर31,३२,३३ और संवहनी३४ सर्जरी, साथ ही सतही आघात३५,३६शामिल हैं । parabiosis तकनीक इन मॉडलों, जो सूजन, glial सक्रियण, और व्यवहार घाटे, कि आम तंत्र द्वारा मध्यस्थता की जा सकती है सहित समान समापन, शेयर के सभी के लिए लागू है ।

अध्ययनों में शामिल है कि parabiosis कारकों है कि संज्ञानात्मक समारोह, neuroinflammation, और वृद्ध पशुओं में ऊतक कायाकल्प को प्रभावित कर सकते है परिसंचारी के लिए उपंयास भूमिकाओं का पता चला है३७,३८,३९,४० ,४१,४२. हमें पता चला है कि parabiosis सफलतापूर्वक टिबियल फ्रैक्चर मॉडल के साथ संयुक्त किया जा सकता है यहां वर्णित करने के लिए अपक्षयी रास्ते और अध्ययन रक्त जनित कारकों को शामिल तंत्र है कि उपचार और फ्रैक्चर की मरंमत12प्रभाव । यहां, हम प्रदर्शन किया है कि एक वृद्ध जानवर के फ्रैक्चर की मरंमत की क्षमता जब वृद्ध जानवर एक युवा जानवर के लिए anastomosed है कायाकल्प हो सकता है । उंर के इस उत्क्रमण फ्रैक्चर साइट पर टेम कोशिकाओं के engraftment में निहित था । दिलचस्प है, इस तरह के कायाकल्प भी वृद्ध चूहों में युवा अस्थि मज्जा के प्रत्यारोपण के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है । इस संबंध में, अस्थि मज्जा ट्रांसप्लांटेशन parabiosis करने के लिए एक अधिक प्रत्यक्ष और सरल वैकल्पिक दृष्टिकोण माना जा सकता है । हालांकि, parabiosis कोशिकाओं और कारकों परिसंचारी के समारोह की जांच के लिए एक और अधिक मजबूत मॉडल है । हमें उंमीद है कि parabiosis और आर्थोपेडिक सर्जरी मॉडल का एक संयोजन perioperative देखभाल और उंर बढ़ने जीवविज्ञान में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभानी होगी ।

सारांश में, हम टिबियल फ्रैक्चर के एक माउस मॉडल के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल परिचय पश्चात neuroinflammation और आर्थोपेडिक शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के बाद संज्ञानात्मक हानि के लिए जिंमेदार तंत्र का अध्ययन । इस मॉडल को न्यूरो प्रतिरक्षा संपर्क, ऊतक पुनर्जनन, और अंय रास्ते का अध्ययन करने के लिए एक parabiosis प्रक्रिया के साथ जोड़ा जा सकता है । इन तंत्र को परिभाषित करने के लिए पश्चात जटिलताओं के लिए जोखिम को कम करने और परिणामों का अनुकूलन रणनीतिक लक्ष्य प्रदान करेगा ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम कैथी पण धंयवाद, बी एस (एनेस्थिसियोलॉजी, ड्यूक विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र, डरहम, नेकां के विभाग) संपादकीय सहायता के लिए । NT ड्यूक एनेस्थिसियोलॉजी और NIH/NIA R01 AG057525-01 से एक ड्रीम नवाचार अनुदान से समर्थन स्वीकार करता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Piramal Healthcare NDC 66794-017-25 Other volatile agents or injectable anesthesia can be also used
Buprenorphine Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals NDC 12496- 6757-1 Optional and depending on individual Institutional Animal Care and Use Committee recommendations
Ethanol Fisher Scientific 04-355-451 70% solution for antiseptic treatment of skin and cleaning
10% povidone Iodine Dynarex For antiseptic treatment of skin
SomnoSuite Kent Scientific SS-01 Low Flow  Anesthesia system
MouseSTAT Kent Scientific PS1161 Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor
Shaver Wahl 9854L
Stereomicroscope Leica MZ6
Scalpel Handle Fine science tools 10003-12
Scalpel Blades - #11 Fine science tools 10011-00
Adson Forceps Fine science tools 11006-12 Needed for stripping the periosteum
Iris Forceps Fine science tools 11066-07 Useful (1x2 teeth) to causing localized muscle/soft tissue trauma
Bonn Scissors (Straight) Fine science tools 14084-08 Good for osteotomy, note to change regularly as becomes blunt
Fine Scissors Fine science tools 14058-09 Sharp scissors for cutting sutures
22G x 3.5 In Quincke  Spinal Needle BD 405181 Use inner rod for pinning
Needle Holders Fine science tools 12001-13
Suture Look 1079B
C57BL6/J Jackson Laboratory  stock no. 000664
eGFP+ (expressing enhanced green fluorescent protein ubiquitously) Jackson Laboratory  stock no. 003291

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References

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Xiong, C., Zhang, Z., Baht, G. S., Terrando, N. A Mouse Model of Orthopedic Surgery to Study Postoperative Cognitive Dysfunction and Tissue Regeneration. J. Vis. Exp. (132), e56701, doi:10.3791/56701 (2018).

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