Summary
פרוטוקול זה מתאר מודל העכבר של כירורגיה אורתופדית, שבו נעשה שימוש כדי לחקור מנגנונים של neuroinflammation לאחר הניתוח, שינויים התנהגותיים, וכאשר בשילוב עם parabiosis, ללמוד התחדשות רקמות במהלך ההזדקנות.
Abstract
הניתוח משמש בדרך כלל כדי לשפר ולתחזק את איכות החיים. למרבה הצער, בחולים פגיעים כגון הקשישים, סיבוכים עשוי להתרחש, לצמצם באופן משמעותי את התוצאה. ואכן, אחרי שגרתי אורתופדיה לתיקון שבר, כ 50% מהחולים קשישים סובלים סיבוכים נוירולוגיים כמו הזיות. בנוסף, היכולת לרפא ולחדש רקמות אחרי ניתוח פוחתת עם הגיל, יכולים להשפיע על איכות תיקון שבר ושילוב אפילו osseous של שתלים. לפיכך, הבנה טובה יותר של מנגנוני לנהוג שינויים תלויי-גיל אלה יכול לספק מטרות אסטרטגיות כדי למזער את הסיכון של סיבוכים כאלה ולמטב את התוצאות. כאן, אנחנו מציגים מודל העכבר הרלוונטית קלינית של שבר הטיביאלי. שינויים אלו עכברים לאחר הניתוח לחקות חלק ליקויים קוגניטיביים נצפו בדרך כלל לאחר ניתוח אורתופדי שגרתית אצל בני אדם. בקצרה, מבוצע חתך האיבר הינד נכון בתנאים בקפדנות אספטי. השרירים הם לבטל את שיוך, סיכה 0.38 מ מ נירוסטה מוכנס לתוך הפסגה העליונה של עצם השוקה, בתוך התעלה אורתופדיים. Osteotomy ואז מבוצעת, הפצע יהודק. השתמשנו מודל זה לחקור את ההשפעות של טראומה כירורגי על neuroinflammation לאחר הניתוח ושינויים התנהגותיים. על-ידי החלת מודל שבר זה בשילוב עם parabiosis, מודל כירורגי שבו שני עברים הם anastomosed, למדנו תאים וגורמים המופרש זה מערכתית להצעיר את התחדשות הרקמות ותפקוד איברים לאחר פציעה. לפי פרוטוקול צעד אחר צעד שלנו, מודלים אלה שניתן להפיק עם דיוק גבוה, ניתן להתאים לחקור משעולים ביולוגיים רבים שמשתנים כירורגית טראומה מינית.
Introduction
הניתוח הפך את מערכת הבריאות רפואי ללא הרף תורמת רתימת הטכנולוגיה, בטיחות משופרת, ומתוחזק איכות החיים. למרבה הצער, הניתוח גורם גם תגובות pathophysiologic זה יכול להוביל לסיבוכים לאחר הניתוח כולל זיהומים בפצע, ליקויים נוירולוגיים, אפילו התמותה, בפרט בחולים קשישים1,2. כירורגיה אורתופדית מתבצע באופן שגרתי, במיוחד אצל מבוגרים יותר, כדי לשפר את איכות החיים ולתקן פציעות נפוצות העצם. עם זאת, עד 50% מהחולים אורתופדיה 65 שנה, מבוגר יותר ניסיון ליקויים נוירולוגיים כגון הזיות. זה בעקביות בקורלציה עם פרוגנוזה גרועה, קרי, 5-fold סיכון מוגבר לתמותה ב 6 חודשים, ירידה תפקודית מתמיד, גדל זמן לכל לחולה, הגדלת אורך השהות בבית החולים, שיעור גבוה יותר של מיקום בית אבות סיעודי 3 , 4 , 5. כמה גורמי סיכון, לרבות גילו המתקדם, זוהו, אבל מעט מאוד ידוע על המנגנון האחראי על ליקויים נוירולוגיים לאחר הניתוח.
מאז שברים נפוצים מאוד אצל הקשישים, הקמנו דגם העכבר של שבר הטיביאלי כדי לקבוע את ההשפעה של טראומה היקפיים על התאוששות לאחר הניתוח, כולל neuroinflammation והמוח בריאות (תפקוד קוגניטיבי)6, 7. מודל זה, תיארו את התופעה על ידי הארי. et al. 8, מורכב לשדי הצמדה ותשבור הטיביאלי תחת הרדמה כללית, שיכוך כאבים ובכך מחקה את העור פציעה, טראומה שריר, ועצם תיקון מזוהה עם שברים עצם נפוצים ותיקון בבני אדם. לאחר הליך זה, עכברים להדגים שינויים בסמני דלקת דומה לשינויים שנצפתה בני9,10, כמו גם הפעלת microglial בהיפוקמפוס, אשר מזוהה עם גירעונות בזיכרון הצהרתי, בהיפוקמפוס והנוירולוגיה הפלסטית6,7,11. קודם לכן שילבנו מודל זה שבר עם parabiosis. Parabiosis הוא מודל כירורגי שבו שני עברים הם anastomosed ובכך ושיתוף של מערכת הדם. מודל זה סיפקה פריצת דרך בהבנה של השפעות הרגולציה של מחזורי תאים וגורמים ההורמונאלית על תפקוד האיבר בהקשר של הגיל ומחלות12,13,14. באמצעות גישה זו גילינו לאחרונה מערכתית גורמים הקשורים עם שבר תלויי-גיל12ריפוי.
כאן, אנחנו מציגים את פרוטוקול שמשלב המודל שבר tibial parabiosis ללמוד מנגנונים תלויי-גיל עצמות-כדי-מוח, רלבנטיות רפואה רגנרטיבית ו- neuroimmunology. פרוטוקול 1A מתאר את הליך parabiosis, ואת פרוטוקול 1B פרטי ההליך שבר הטיביאלי (איור 1 א'). אלה ניתן לבצע באופן עצמאי או בשילוב, בהתאם לאופי החקירה.
Protocol
כל ניסויים בבעלי חיים היו שנערך לפי מוסדות לאומיים של בריאות המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה, שאושרו על-ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים & שימוש הוועדה (IACUC) באוניברסיטת דיוק.
1. חיות ניסוי
- לשמור עכברים בסביבה ממוזגים עם 12-h/כהה מחזורים וגישה נכונה תקן מזון ומים. האוס לא יותר מ-5 הארנבונים מאותה לכל כלוב, ולהימנע תנאים המעודדים יכול להילחם.
- השתמש נקבות עכברים C57BL6/J-3 חודשים של גיל (צעירים) או 18 חודשים של גיל (הישן).
- עבור parabiosis, להתאקלם שני עברים יחד במשך לפחות שבועיים לפני הניתוח. עכברים הם פראי-סוג C57BL6/J או eGFP +.
- בדוק את מצב הגוף ואת המראה הכללי של עכברים מדי יום.
2. לפני הניתוח ההתקנה עבור Parabiosis וכירורגיה אורתופדית
- שוקלים העכברים 2.
- לנהל הרדמה כללית באמצעות מערכת הרדמה בקצב קבוע O2 זרימה של 0.2 L/הגבלת שימוש איזופלוריין 5% עבור אינדוקציה בתא אינדוקציה.
הערה: עומק ההרדמה יכול לאשר שימוש קמצוץ הבוהן. - במקום העכברים על כרית מחוממת במצב פרקדן. השתמש בדיקה רקטלית כדי לפקח על טמפרטורת הגוף לאורך כל הליך כירורגי.
- כדי לשמור על הרדמה, להוריד את ריכוז איזופלוריין ל- 2.0% ב- 0.2 L/דקה דרך facemask הנשאף. צג כדי להבטיח עומק נאותה של הרדמה.
- לפקח על פרמטרים הפיזיולוגיות (קצב נשימה, חמצן, לב לנצח) לא-פולשנית באמצעות של מתקפים oximeter (אופציונלי).
3. parabiosis ניתוח (פרוטוקול 1A)
- לנהל נגד כאבים (איטי/SR. הבופרנורפין, שחרור, 0.1 מ"ג/ק"ג subcutaneously) לאחר הגיוס ולפני ניתוח מניפולציה. הכנס נמשך (0.25%)-האגף לפני הפתיחה. החל העין סיכה.
הערה: פרוטוקול parabiosis ניתן לבצע באופן עצמאי של השבר הטיביאלי. - לשימוש בכל הגוף הפנימי תפירת, חומר תפרים polydioxanone 4-0. עבור כל תפירת חיצוני, השתמש חומר תפרים פוליפרופילן 4-0.
- לגלח את כל העכברים 2 לאורך קו רציף של המרפק, האגף הברך בצד להתאחד. לחיטוי יוד + 70% אלכוהול העור לקרצף מעל 3 לסירוגין מחזורים לקראת החתך.
בשימוש כלי נגינה בלוק ולשמור על שדה סטרילי.
הערה: הנח את העכבר פראי-סוג בצד ימין של העכבר eGFP והכן את האגף השמאלי של העכבר פראי-סוג, באגף הימני של העכבר eGFP לניתוח (איור 1). - על כל העכבר, להשתמש מספריים לעשות חתך בעור לאורך האגף, החל proximal עד הברך רק הפרוקסימלית המרפק, מבלי להפריע את השרירים מתחת לעור.
- הצטרפות שרירי התלת-ראשי החיות בתפרים קטע 2.
- הצטרפות הקירות הגוף לאורך האגף בתפר בורח, רצוף של 7-9 עובר.
- הצטרפות הארבע של החיה עם התפרים קטע 2.
- סגור את העור של parabionts 2 עם התפרים קטוע.
- לאפשר עכברים ער באוויר פתוח.
- כדי להבטיח הצלחה של פרוטוקול זה, הבריאות של הזוגות חייבת להישמר: לנטר את הזוגות מדי יום; לבצע את מצב הגוף הבקיע פעמיים בשבוע; שוקל את הזוגות פעמיים בשבוע.
הערה: כל זוג שוכן בנפרד.
הערה: אם משתמש הבופרנורפין רגיל (כלומר לא איטי/SR שחרור) ואז לנהל 0.1 mg/kg subcutaneously 1 מ"ל של תמיסת מלח לכל העכבר פעמיים ביום למשך 3 ימים. - לאפשר 4 שבועות של החלמה כדי להבטיח זרימת משותף בין parabionts אם מבצע ניתוח שבר הטיביאלי.
4. ניתוח שבר הטיביאליס (פרוטוקול 1B)
- לנהל נגד כאבים (הבופרנורפין, 0.1 מ"ג/ק"ג subcutaneously) לאחר הגיוס ולפני ניתוח מניפולציה. הכנס נמשך (0.25%) באתר כירורגית proximal ועד לברך לפני הפתיחה. החל העין סיכה.
- לגלח את האספקט המדיאלי של האיבר הינד נכון של העכבר כדי לחשוף את האזור הכירורגי, לחטא עם יוד + קרצוף העור אלכוהול 70% מעל 3 לסירוגין מחזורים. לשמור על שדה כירורגי סטרילי לאורך כל ההליך. כדי להגביל את הזיהום; השתמש בכלים בלוק וכפפות; להשלים את הניתוח תחת מיקרוסקופ ויבתר (אופציונלי); ולהשתמש כרית החימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף.
הערה: אם הפרוטוקול מבוצע על parabionts, העכבר רק 1. היא סדוקה בזוג (עצם השוקה נכון של העכבר הנכון) ראה איור 1B עבור תרשים כללי של השבר. על parabionts. - להשתמש מספריים לעשות חתך בעור לאורך האספקט המדיאלי של האיבר הינד נכון proximal ועד לברך עד midshaft של עצם השוקה על העכבר הנכון.
- לחשוף את midshaft של עצם השוקה, חזותית לאתר את diaphysis. Flex הברך והמחש את השוקה באמצעות רצועה צלחית-הירך כנקודת ציון.
- לדמיין את הגיד ברך; תרגיל באופן ידני על ידי גלגול באגודל ובאצבע חור 0.5 מ מ בתוך התעלה לשדי באמצעות מחט 25-מד.
הערה: החור קדח יפעל במקביל לאורך עצם השוקה, על דרך השוקה. - להוסיף סיכה 0.38 מ מ נירוסטה דרך החור כ 15 מ מ לתוך חלל מדולרי עד ההתנגדות הוא הרגיש, לחתוך מיושרות עם השוקה שימוש בחותך תיל (ראו 1 וידאו משלים שחזור תלת-ממד).
- באמצעות מספריים בון ישר, שבר את שוקה midshaft (diaphysis). ראה איור 1C תרשים כללי של השבר.
- מבחינה ויזואלית לבחון את השבר האתר ואת לרקמות סמוכות כדי לפקח על ייצוב של המראה שבר.
- סגור עם סיכות עורי.
- במקום העכברים על רפידות מחוממת להתאושש לפני שחזר להם כלוב נקי הביתה. להזריק תמיסת מלח 1 מ"ל prewarmed (37 ° C) subcutaneously ב עכבר כל החלפת נוזלים.
- בדוק עכברים מדי יום עבור סימני צליעה, זיהום או דימום.
הערה: אם משתמש הבופרנורפין רגיל (כלומר לא איטי/SR שחרור) ואז לנהל 0.1 mg/kg subcutaneously 1 מ"ל של מלוחים מדי יום במשך 3 ימים.
Representative Results
לאחר אדוני רוחבי בוצעו בקפידה בתנאים סטריליים עם הכנסה קבועה של סיכות, תפירה נאותה, עכברים הראה שום סימנים של צליעה, זיהום או דימום ברגל שמאל לאחר הניתוח. ריפוי אורטופדי הוערכה באמצעות ניתוח רדיוגרפי ו- histomorphometry לאחר Safranin-O צביעת (איור 2). צילומי רנטגן של tibiae שבר midshaft ציינו יותר בתצהיר רקמות בתוך טבעת שבר של עכברים צעירים מאשר בטבעת שבר של עכברים בגיל העמידה. יבלות שבר decalcified, המוטבעות פרפין הכנה לבדיקה היסטולוגית. קטעים היו מוכתמים Safranin-O, רקמות התצהיר היה לכמת באמצעות ניתוח histomorphometry. שבר יבלות של עכברים צעירים הכיל יותר עצם ורקמות שהותירה פחות מאשר שבר יבלות של עכברים בגיל העמידה.
שבר הטיביאלי גורם לדלקת מערכתית ומרכזי6,7,11,15,16. אכן, רמות היקפיים של ציטוקינים פרו-דלקתיים ודפוסי סכנה-הקשורים מולקולרית (DAMPs) במהירות גבוהות לאחר ניתוח אורתופדי, שניהם בעכברים ובבני אדם7,17,18. זה תורם הפעלה של microglial תאים במוח באמצעות מספר מנגנוני איתות הכוללים מסלולים ההורמונאלית, סלולר ועצביים7,15,19,20, 21. בעקבות הניתוח, בתפקוד אנדותל, פתיחת מחסום הדם - מוח ואת macrophage פריפריאלי הסתננות לתרום חריפה neuroinflammation בהיפוקמפוס פראי-סוגים, Ccr2RFP / + Cx3cr1GFP / + עכברים בוגרים15 , 19, ואת קושרו עם גירעונות הזיכרון העוקבים הדומות דליריום אנושי ולאחר הניתוח בתפקוד הקוגניטיבי15,19,22. תגובה neuroinflammatory זו היא מתעצמת בבעלי חיים בגיל העמידה, עם שינויים משמעותיים microglial מורפולוגיה, כפי שזוהו על-ידי רשות השידור-1 immunostaining (איור 3).
באמצעות המודל שבר הטיביאלי המתואר כאן, מצאנו גם נוירוג'נסיס בהיפוקמפוס transiently לקוי, כפי שמעידים על הפחתת doublecortin (DCX) immunostaining הפיתול משוננת20. מדידות electrophysiologic הויסעגט (LTP), פונדקאית עבור פונקצית זיכרון, חשף להפרעה תלויי-זמן והנוירולוגיה הפלסטית במשככי11. עכברים לאחר הניתוח להציג גם לליקויים בתפקוד הזיכרון תלוי בהיפוקמפוס, לדוגמה באמצעות פחד מיזוג הערכה התנהגותית (איור 4). במיזוג פחד, עכברים להציב בחדר, חשוף של הסימן השמיעה ואחריו של גירוי aversive (קרי, footshock). שלושה ימים אחרי הניתוח הטיביאלי, עכברים נבדקים בבית הבליעה מיזוג, הפעם ללא כל גירוי שמיעתי או aversive, הקפאת התנהגות נרשם כמו אינדקס של זיכרון (ראה פרוטוקול מפורט23).
גילו המתקדם הוא גורם סיכון קריטי עבור ירידה בזיכרון. ובכל זאת, ככל שאנו מתבגרים, יכולת התחדשות ותיקון רקמות גם פוחתת אף ממעטים להבין מנגנונים אלה. לפיכך, אנו נעשה שימוש בפרוטוקולים המתוארים במסמך זה כדי לבצע parabiosis heterochronic (זיווג בעלי חיים צעירים/זקנה), העריך שבר ריפוי בתוך העכבר בגילאי (עבור parabiosis מפורט פרוטוקול ראה24). דם-שיתוף בין זוגות parabiotic היה אישר, יימצא שווה12. חשיפה תיקון עצם מחזור נעורים משופרת עם האיחוד קודמות, גדל עצם התצהיר, וירידה פיברוזיס (איור 5)12. זה התחדשות של התחדשות העצם אירעה עצמאית של תאי העצם אוסטאוקלצין-חיוביות אנדוגני (איור 5, חום תאים), אבל מעדיף הסתמכה על תאים CD45-חיוביות היגרו parabiont צעירים (איור 5, כחול תאים) . תוצאות אלו מצביעות על התאים hematopoietic CD45-חיוביות להפריש משרה מראה צעיר ובריא, אשר מסוגל לאותת לתאים osteoblastic בגילאי וגורם להם להיות יותר פעיל.
איור 1: ייצוג סכמטי של parabiosis ושל ניתוח שבר הטיביאלי. ציר זמן עבור ביצוע parabiosis הטיביאלי שבר (פרוטוקול 1A) או הטיביאלי שבר לבד (פרוטוקול 1B) (A). Tibiae (B) של עכברים בן 20 חודש בזוגות parabiotic isochronic או heterochronic היו שבורות (רגל ימין של העכבר הנכון. היא סדוקה, כפי מסומן עם X). עכברים אפורים מתארים עכברים wildtype בעוד עכברים ירוקים מתארים עכברים eGFP. (ג) תרשים סכמטי של שבר הטיביאלי דגם עם הצמדה אורתופדיים, פיר אמצע שבירה. ראה גם משלים Video 1 עבור שחזור תלת-ממד של האיבר הינד, הצמדה של עצם השוקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: שבר הטיביאלי ריפוי בתוך העכבר צעירים ומבוגרים מודלים. Tibiae של עכברים צעירים או זקנים היו שבורות והיו שבר יבלות ובדוקים 21 ימים שלאחר הפציעה. הדמיה רדיוגרפי (A) היסטולוגית מכתים (Safranin-O) שימשו כדי להעריך את השבר פוסט שבר 21 ימים יבלות. צביעת מראה סילוק רקמות proteoglycans (הכלול בתוך הסחוס) באדום ובכחול. קווים מקווקווים מציינים את המיקום המשוער של קסם השבר. Histomorphometry (B) נעשה שימוש כדי להעריך את כמות עצם סחוס, רקמות שהותירה להפקיד בתוך השבר פוסט שבר 21 ימים קסם. הנתונים מבוטאים אומר ± מרווחי ביטחון של 95%, * P < 0.05, סטטיסטית (חד-כיווני אנובה, הבדיקה של Dunnett), סולם העמודות מייצגות 2 מ מ, תמונות התקבלו באמצעות מיקרוסקופ, המטרה 1.25 x. n = 9 עבור כל דגימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ניתוח המושרה תלויי-גיל microglial ההפעלה בהיפוקמפוס. ניתוח שבר הטיביאלי גורם גדול neuroinflammation בהיפוקמפוס בעכברים בגילאי (חודש בן 20) לעומת עכברים C57BL6/J בן 4 חודשים. המוח-סעיף מכתים עם סמן microglial רשות השידור-1 מראה חיובי יותר תאים ושינויים מורפולוגיות כירורגי קבוצות 24 שעות לאחר הניתוח. תמונות התקבלו עם מיקרוסקופ פלורסנטי עם הגדלה של 100 x.; סרגל קנה מידה מייצג 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: ליקויי נוירוג'נסיס הויסעגט, פונקציית הזיכרון לאחר ניתוח שבר הטיביאלי. (א) DCX, סמן כמותיים נוירוג'נסיס, פוחת באופן משמעותי בתוך הפיתול משוננת ההיפוקמפוס-24 שעות לאחר הניתוח. תמונות התקבלו עם מטרה מיקרוסקופ לסריקת לייזר קונפוקלי עם ההגדלה של 10 x; גודל בר מייצג 10 מיקרומטר. Electrophysiology (B) פרוסות בהיפוקמפוס פקדים או עכברים 24 שעות לאחר הניתוח. הויסעגט (LTP) היה המושרה על ידי גירוי בתדירות גבוהה (מערכת קבצים הירארכית) והקליט יותר מ 1 ה שדה פוטנציאל postsynaptic מעוררים (fEPSPs) נרשמו מ radiatum הרובד CA1 באמצעות פיפטה הקלטה חוץ-תאית מלא רגיל נוזל מוחי שדרתי מלאכותי. ב- 24 שעות לאחר הניתוח, אינדוקציה LTP להפליא מופחתת בהשוואה בקרת עכברים. נתונים מבוטא זאת אומרת ± s.e.m. n = 3, * 0.05 < p 1-way ANOVA. (C) Hippocampal תלוית פונקציה זיכרון (כהגדרתו % להקפאת באמצעות מעקב פחד מיזוג) הוא לקוי בעכברים לאחר ניתוח לעומת שולט וחיות נחשף לחומר הרדמה בלבד. נתונים מבוטא זאת אומרת ± s.e.m. n = 9-10, * 0.05 < p 1-way ANOVA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: ניתוח Parabiosis מוביל התחדשות של שבר ריפוי שיתוף הדם, תורם-תא engraftment. Isochronic, heterochronic parabiosis זיווגים הוקמו, העכבר בגילאי כל זוג היה סדוק, העריך להילינג עצם. (א) שבר יבלות נחקרו באמצעות הדמיה רדיוגרפי. קווים מקווקווים מציינים את המיקום המשוער של קסם השבר. Engraftment (B) של תאים eGFP + אושר בתוך מח העצם. אימונוהיסטוכימיה (C) של קסם שבר שימש לזיהוי תאי התורם eGFP+ (כחול) והן של אוסטאוקלצין+ osteoblastic תאים (חום) parabiont. סולם העמודות מייצגות 50 מיקרומטר, תמונות התקבלו באמצעות מטרה 40 x. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלים וידאו 1: שחזור תלת-ממד של האיבר הינד, הצמדה של עצם השוקה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Discussion
שברים הן בעיה קלינית נפוצה, להישאר גורם התחלואה, במיוחד בקרב האוכלוסייה בכיר בצמיחה. כאן, אנחנו מציגים את פרוטוקול צעד אחר צעד עבור דגם העכבר של שבר הטיביאלי לחקור מנגנונים האחראים neuroinflammation לאחר הניתוח, פגיעה קוגניטיבית. מודל זה יכול להיות משולב עם ניתוח parabiosis ללמוד אינטראקציות נוירו-החיסון, התחדשות רקמות ותהליכים איתות אחרים. הבנת המנגנונים האלה יספקו מטרות אסטרטגיות כדי למזער את הסיכונים סיבוכים לאחר הניתוח ולמטב את התוצאות.
מספר מודלים אורטופדי פותחו ללמוד תיקון עצם מכרסמים25. אנחנו אימצה, לשנות הליך זה שבר הטיביאלי, תיארו את התופעה על ידי הארי. et al. 8, ללמוד על ההשפעות של ניתוח אורתופדי על תפקוד המוח. גם השתמשנו מודל שבר זה בשילוב עם מודל parabiosis שלנו לחקור גורמים שאחראים על עצם ריפוי והתחדשות רקמות תלויי-גיל. כאשר מבוצעת בהרדמה כללית נדיפים, הליך זה שבר הטיביאלי דורש רק כ 15 דקות לכל חיה, התוצאה אפס התמותה מינימלי (תלוי בגילו של העכבר על susceptibilities גנטית כבסיס), וזה recapitulates נפוצות עלבונות המשויך לונג-שבר וטראומה כירורגית אורתופדית. לפיכך, המודל הזה הוא אידיאלי עבור חוקרים מסלולים ביולוגיים וביצוע הערכות האורך. עם זאת, זה קריטי זה osteotomy, הצמדה לשחזור, ויש את הנזק ברקמה הרכה עקבית. נזק לרקמות רכות יכול להיות מאופנן, לדוגמה על-ידי בנוכחות אחר קרום העצם, התכווצות השרירים שמסביב לבצע את הניתוח יותר טראומטי. מודלים של שבר הטראומטית הנגרמת על ידי שאינו קבוע טראומה קהה או כיפוף השלשה לא יספק עקביות או דיוק כזה. הליכים אלה לעיתים קרובות לגרום re-פציעה, מה שמוביל לתגובה דלקתית ממושכת. לעומת זאת, מודלים של שבר מעורבים קיבוע נוקשה יש דלקת מתונה יותר, אשר לא לסכם באופן מלא את הנזק המשויך אורתופדיה26,27.
דגמים אחרים באמצעות הצמדה סגסוגת טיטניום פותחו כדי שכיחיםהחלפת האנושי מקרוב מחקים, עשוי להיות רלוונטי יותר לחקור את חוסר היציבות של תותבת, osteolysis, וסיבוכים הקשורים תותבת עכברים28,29 . מודלים לקדוח חורים כמו זה המוצג כאן, מספקים מייצב נאותה, עכברים יכול להיבדק בפרדיגמות התנהגותי ללא חסרונות משמעותיים זה יכול לבלבל משימות כגון פחד מיזוג או פתח שדה ומכניקה/חרדה בדיקות6 ,7,11,15,19,20. עם זאת, מומים המסתובבת יכול להתרחש אם הקיבעון לא נעולה כראוי. בדגמים מסוימים להשתמש fixator חיצוני, אשר מספק מייצב מעולה אבל הוא מאתגר ליישם בשוקה העכבר, למרות שזה יכול להיות מיושם בהצלחה הירך של העכבר27.
ליקויים קוגניטיביים, כולל הזיות לאחר הניתוח בתפקוד הקוגניטיבי, סיבוכים נפוצים לאחר ניתוח אורתופדי לתיקון שבר, בפרט בחולים קשישים ומקומט30. מודל זה העכבר הרלוונטית קלינית של ניתוח שבר הטיביאלי מדגים שכי לאחר הניתוח ציטוקין מערכתית שחרור6,7,17, ליקויי מחסום הדם - מוח פונקציה15,19 , שונה microglial מורפולוגיה16,22, לתרום ליקוי זיכרון ואני עשוי לייצג תכונות קריטיות של סיבוכים נוירולוגיים לאחר הניתוח אצל חולים רבים אחרי ניתוח אורטופדי. חשוב לציין כי ניתוחים אחרים השתמשו לדגמן לאחר הניתוח בתפקוד הקוגניטיבי בעכברים. אלה כוללים בטן31,32,33 ו ניתוח כלי דם34 , וכן שטחיים לטראומה35,36. הטכניקה parabiosis ישימה לכל של מודלים אלה, אשר חולקים הקצה דומים, כולל דלקת, הפעלת גליה חסרונות התנהגותיים, זה עשוי להיות מתווכת על ידי מנגנונים משותפים.
מחקרים הכוללים parabiosis גילו תפקידים הרומן במחזור גורמים יכולים להשפיע על תפקוד קוגניטיבי, neuroinflammation, והתחדשות רקמות ב חיות בגיל37,38,39,40 ,41,42. אנחנו הראו ש-parabiosis הזה יכול להיות משולב בהצלחה עם שבר הטיביאלי המודל המתואר כאן לחקור מסלולים משובי וללמוד מנגנונים מעורבים גורמים נישא בדם כי ההשפעה ריפוי, שבר תיקון12. כאן, אנחנו הפגינו יכולת תיקון שבר של חיה גיל יכול יתרענן כאשר החיה בגילאי הוא anastomosed על חיים צעירים. ההיפוך של גיל היה נעוץ את engraftment של תאים hematopoietic באתר שבר. מעניין, התחדשות כזה יכול גם להיות מושגת באמצעות השתלת של מח העצם הצעיר לתוך עכברים בגיל העמידה. בהקשר זה, השתלת מח עצם יכול להיחשב בגישה אלטרנטיבית ישירים ופשוטים יותר כדי parabiosis. עם זאת, parabiosis הוא מודל עמידים יותר על חקירת הפונקציה של מחזורי תאים וגורמים. אנו מצפים כי שילוב של parabiosis ומודלים אורתופדיה ישחק תפקיד חשוב לענות על שאלות קריטיות perioperative טיפול וביולוגיה הזדקנות.
לסיכום, אנחנו מציגים את פרוטוקול צעד אחר צעד עבור דגם העכבר של שבר הטיביאלי לחקור מנגנונים האחראים neuroinflammation לאחר הניתוח, פגיעה קוגניטיבית לאחר ניתוחים אורתופדיים. מודל זה יכול להיות משולב עם הליך parabiosis ללמוד אינטראקציות נוירו-החיסון, התחדשות רקמות, מסלולים אחרים. הגדרת מנגנונים אלה תספק מטרות אסטרטגיות כדי למזער את הסיכונים סיבוכים לאחר הניתוח ולמטב את התוצאות.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים קטי גייג ', BS (החוג להרדמה, המרכז הרפואי של אוניברסיטת דיוק, דורהאם, NC) לקבלת סיוע העריכה. NT מאשר תמיכה של מענק חדשנות החלום של הדוכס להרדמה ו- NIH/ניאה R01 AG057525-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-017-25 | Other volatile agents or injectable anesthesia can be also used |
| Buprenorphine | Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals | NDC 12496- 6757-1 | Optional and depending on individual Institutional Animal Care and Use Committee recommendations |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | 70% solution for antiseptic treatment of skin and cleaning |
| 10% povidone Iodine | Dynarex | For antiseptic treatment of skin | |
| SomnoSuite | Kent Scientific | SS-01 | Low Flow Anesthesia system |
| MouseSTAT | Kent Scientific | PS1161 | Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor |
| Shaver | Wahl | 9854L | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Scalpel Handle | Fine science tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades - #11 | Fine science tools | 10011-00 | |
| Adson Forceps | Fine science tools | 11006-12 | Needed for stripping the periosteum |
| Iris Forceps | Fine science tools | 11066-07 | Useful (1x2 teeth) to causing localized muscle/soft tissue trauma |
| Bonn Scissors (Straight) | Fine science tools | 14084-08 | Good for osteotomy, note to change regularly as becomes blunt |
| Fine Scissors | Fine science tools | 14058-09 | Sharp scissors for cutting sutures |
| 22G x 3.5 In Quincke Spinal Needle | BD | 405181 | Use inner rod for pinning |
| Needle Holders | Fine science tools | 12001-13 | |
| Suture | Look | 1079B | |
| C57BL6/J | Jackson Laboratory | stock no. 000664 | |
| eGFP+ (expressing enhanced green fluorescent protein ubiquitously) | Jackson Laboratory | stock no. 003291 |
References
- Terrando, N., et al. Perioperative cognitive decline in the aging population. Mayo Clin Proc. 86 (9), 885-893 (2011).
- Lord, J. M., et al. The systemic immune response to trauma: an overview of pathophysiology and treatment. Lancet. 384 (9952), 1455-1465 (2014).
- Inouye, S. K., Westendorp, R. G., Saczynski, J. S.
- Han, J. H., et al. Delirium in the emergency department: an independent predictor of death within 6 months. Ann Emerg Med. 56 (3), 244-252 (2010).
- Marcantonio, E. R., Flacker, J. M., Wright, R. J., Resnick, N. M. Reducing delirium after hip fracture: a randomized trial. J Am Geriatr Soc. 49 (5), 516-522 (2001).
- Cibelli, M., et al. Role of interleukin-1beta in postoperative cognitive dysfunction. Ann Neurol. 68 (3), 360-368 (2010).
- Terrando, N., et al. Tumor necrosis factor-alpha triggers a cytokine cascade yielding postoperative cognitive decline. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20518-20522 (2010).
- Harry, L. E., et al. Comparison of the healing of open tibial fractures covered with either muscle or fasciocutaneous tissue in a murine model. J Orthop Res. 26 (9), 1238-1244 (2008).
- Hirsch, J., et al. Perioperative cerebrospinal fluid and plasma inflammatory markers after orthopedic surgery. J Neuroinflammation. 13 (1), 211 (2016).
- Neerland, B. E., et al. Associations Between Delirium and Preoperative Cerebrospinal Fluid C-Reactive Protein, Interleukin-6, and Interleukin-6 Receptor in Individuals with Acute Hip Fracture. J Am Geriatr Soc. 64 (7), 1456-1463 (2016).
- Terrando, N., et al. Aspirin-triggered resolvin D1 prevents surgery-induced cognitive decline. FASEB J. 27 (9), 3564-3571 (2013).
- Baht, G. S., et al. Exposure to a youthful circulaton rejuvenates bone repair through modulation of beta-catenin. Nat Commun. 6, 7131 (2015).
- Brack, A. S., et al. Increased Wnt signaling during aging alters muscle stem cell fate and increases fibrosis. Science. 317 (5839), 807-810 (2007).
- Villeda, S. A., et al. The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function. Nature. 477 (7362), 90 (2011).
- Terrando, N., et al. Resolving postoperative neuroinflammation and cognitive decline. Ann Neurol. 70 (6), 986-995 (2011).
- Terrando, N., et al. Stimulation of the alpha7 Nicotinic Acetylcholine Receptor Protects against Neuroinflammation after Tibia Fracture and Endotoxemia in Mice. Mol Med. 20 (1), 667-675 (2015).
- Vacas, S., Degos, V., Tracey, K. J., Maze, M. High-mobility group box 1 protein initiates postoperative cognitive decline by engaging bone marrow-derived macrophages. Anesthesiology. 120 (5), 1160-1167 (2014).
- Zhang, Q., et al. Circulating mitochondrial DAMPs cause inflammatory responses to injury. Nature. 464 (7285), 104-107 (2010).
- Degos, V., et al. Depletion of bone marrow-derived macrophages perturbs the innate immune response to surgery and reduces postoperative memory dysfunction. Anesthesiology. 118 (3), 527-536 (2013).
- Zhang, M. D., et al. Orthopedic surgery modulates neuropeptides and BDNF expression at the spinal and hippocampal levels. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (43), E6686-E6695 (2016).
- Lu, S. M., et al. S100A8 contributes to postoperative cognitive dysfunction in mice undergoing tibial fracture surgery by activating the TLR4/MyD88 pathway. Brain Behav Immun. 44, 221-234 (2015).
- Feng, X., et al. Microglia mediate postoperative hippocampal inflammation and cognitive decline in mice. JCI Insight. 2 (7), e91229 (2017).
- Lugo, J. N., Smith, G. D., Holley, A. J.
- Kamran, P., et al. Parabiosis in mice: a detailed protocol. J Vis Exp. (80), (2013).
- Ning, B., et al. Surgicallyinduced mouse models in the study of bone regeneration: Current models and future directions (Review). Mol Med Rep. 15 (3), 1017-1023 (2017).
- Giannoudis, P. V., Einhorn, T. A., Marsh, D.
- Zwingenberger, S., et al. Establishment of a femoral critical-size bone defect model in immunodeficient mice. J Surg Res. 181 (1), e7-e14 (2013).
- Yang, S. Y., et al. Murine model of prosthesis failure for the long-term study of aseptic loosening. J Orthop Res. 25 (5), 603-611 (2007).
- Zhang, T., et al. The effect of osteoprotegerin gene modification on wear debris-induced osteolysis in a murine model of knee prosthesis failure. Biomaterials. 30 (30), 6102-6108 (2009).
- AGS/NIA Delirium Conference Writing Group, Planning Committee and Faculty. The American Geriatrics Society/National Institute on Aging Bedside-to-Bench Conference: Research Agenda on Delirium in Older Adults. J Am Geriatr Soc. 63 (5), 843-852 (2015).
- Li, Y., et al. Deferoxamine regulates neuroinflammation and iron homeostasis in a mouse model of postoperative cognitive dysfunction. J Neuroinflammation. 13 (1), 268 (2016).
- Tang, J. X., et al. Modulation of murine Alzheimer pathogenesis and behavior by surgery. Ann Surg. 257 (3), 439-448 (2013).
- Ren, Q., et al. Surgery plus anesthesia induces loss of attention in mice. Front Cell Neurosci. 9, 346 (2015).
- Fan, D., Li, J., Zheng, B., Hua, L., Zuo, Z. Enriched Environment Attenuates Surgery-Induced Impairment of Learning, Memory, and Neurogenesis Possibly by Preserving BDNF Expression. Mol Neurobiol. 53 (1), 344-354 (2016).
- Rosczyk, H. A., Sparkman, N. L., Johnson, R. W. Neuroinflammation and cognitive function in aged mice following minor surgery. Exp Gerontol. 43 (9), 840-846 (2008).
- Zhang, X., et al. Surgical incision-induced nociception causes cognitive impairment and reduction in synaptic NMDA receptor 2B in mice. J Neurosci. 33 (45), 17737-17748 (2013).
- Villeda, S. A., et al. The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function. Nature. 477 (7362), 90-94 (2011).
- Villeda, S. A., et al. Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice. Nat Med. 20 (6), 659-663 (2014).
- Smith, L. K., et al. beta2-microglobulin is a systemic pro-aging factor that impairs cognitive function and neurogenesis. Nat Med. 21 (8), 932-937 (2015).
- Katsimpardi, L., et al. Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors. Science. 344 (6184), 630-634 (2014).
- Sinha, M., et al. Restoring systemic GDF11 levels reverses age-related dysfunction in mouse skeletal muscle. Science. 344 (6184), 649-652 (2014).
- Castellano, J. M., et al. Human umbilical cord plasma proteins revitalize hippocampal function in aged mice. Nature. 544 (7651), 488-492 (2017).
