Det här protokollet beskriver en musmodell av ortopedisk kirurgi som har använts för att studera mekanismer av postoperativ neuroinflammation och beteendeförändringar, och i kombination med parabiosis, att studera vävnadsregeneration vid åldrande.
Kirurgi används ofta för att förbättra och bibehålla livskvaliteten. Tyvärr, i utsatta patienter såsom äldre, komplikationer kan uppstå och avsevärt minska resultatet. Faktiskt efter rutinmässig ortopedisk operation för att reparera en fraktur, lider så många som 50% av äldre patienter av neurologiska komplikationer som delirium. Även förmågan att läka och återskapa vävnad efter operation minskar med åldern och kan påverka kvaliteten på frakturreparation och även bendefekter integration av implantat. En bättre förståelse av mekanismer som driver dessa åldersberoende förändringar kan således ge strategiska mål för att minimera risken för sådana komplikationer och optimera resultat. Här introducerar vi en kliniskt relevant musmodell av Tibia fraktur. Postoperativa förändringar i dessa möss efterlikna några av de kognitiva funktionsnedsättningar som vanligt förekommande efter rutinmässig ortopedisk kirurgi hos människor. Kort, ett snitt görs i den högra bakbenen under strikt aseptiska förhållanden. Muskler är längre är kopplade, och en 0,38 mm rostfri nål sätts in i övre krönet av skenbenet, inuti den intramedullära kanalen. Osteotomi utförs sedan och såret är häftade. Vi har använt denna modell för att undersöka effekterna av kirurgiskt trauma på postoperativ neuroinflammation och beteendeförändringar. Genom att tillämpa denna fraktur modell i kombination med parabiosis, en kirurgisk modell där 2 möss är anastomoseras, har vi studerat celler och utsöndrade faktorer som systemiskt föryngra organ funktion och vävnad förnyelse efter skada. Genom att följa vår steg för steg-protokoll, dessa modeller kan återskapas med HiFi och kan anpassas till förhöra många biologiska spridningsvägar som ändras av kirurgiskt trauma.
Kirurgi har förvandlat den medicinska vården och bidrar kontinuerligt till spetsteknologi, förbättrad säkerhet, och underhålls av livskvalitet. Tyvärr, kirurgi också inducerar patofysiologiska svaren som kan leda till postoperativa komplikationer inklusive sårinfektioner, neurologiska funktionsnedsättningar och även dödlighet, särskilt i äldre patienter1,2. Ortopedisk kirurgi utförs rutinmässigt, särskilt hos äldre vuxna, att förbättra livskvalitet och reparera vanliga ben skador. Emellertid upp till 50% av ortopedisk kirurgi patienter som är 65 år och äldre erfarenhet neurologiska funktionsnedsättningar såsom postoperativt delirium. Detta konsekvent korrelerar med dålig prognos, dvs, 5 gånger ökad risk för dödlighet vid 6 månader, ihållande funktionell nedgång, ökade omvårdnad gång per patient, ökad längd av sjukhusvistelse och högre priser på sjukhem placering 3 , 4 , 5. vissa riskfaktorer, inklusive Avancerad ålder, har identifierats, men lite är känt om mekanismerna som ansvarar för neurologiska funktionsnedsättningar efter operation.
Eftersom frakturer är mycket vanliga hos äldre, har vi etablerat en musmodell av Tibia fraktur att fastställa påverkan av perifera trauma på postoperativ återhämtning, inklusive neuroinflammation och hjärnan hälsa (kognitiv funktion)6, 7. denna modell, som ursprungligen beskrevs av Harry o.a. 8, består av intramedullära fastlåsning och Tibia fraktur under generell anestesi och analgesi, och således härmar de hudskada, muskel trauma, och ben reparera associerade med gemensamma långa rörben frakturer och reparera hos människor. Efter detta förfarande, möss visar förändringar i inflammatoriska markörer liknande förändringar som observerats i människor9,10, liksom mikrogliala aktiveringen i hippocampus, som är associerad med underskott i deklarativa minnet och Hippocampus neuroplasticitet6,7,11. Tidigare har vi kombinerat denna fraktur modell med parabiosis. Parabiosis är en kirurgisk modell där 2 möss är anastomoseras och därmed dela en cirkulationssystemet. Denna modell har lämnat ett genombrott i förståelsen av reglerande effekter av cirkulerande celler och humorala faktorer på organfunktion i samband med ålder och sjukdom12,13,14. Med detta tillvägagångssätt upptäckte vi nyligen systemisk faktorer associerade med åldersberoende fracture healing12.
Här introducerar vi ett protokoll som kombinerar den tibial fraktur modellen med parabiosis att studera ben-till-hjärnan åldras-anhörigen mekanismer, som är relevanta för regenerativ medicin och Neuroimmunologi. Protokoll 1A beskriver parabiosis förfarandet och 1B protokolldetaljer förfarandet tibial fraktur (figur 1A). Dessa kan utföras självständigt eller i kombination, beroende på förhör.
Frakturer är ett vanligt kliniskt problem, och förbli en ledande orsak till sjuklighet, särskilt i den snabbt växande äldre befolkningen. Här introducerar vi ett stegvisa protokoll för en musmodell av Tibia fraktur att studera mekanismer som ansvarar för postoperativ neuroinflammation och kognitiv svikt. Denna modell kan kombineras med parabiosis kirurgi att studera neuro-immun interaktioner, vävnadsregenerering och andra signalering processer. Förstå dessa mekanismer kommer att ge strategiska mål för att minimera riskerna för postoperativa komplikationer och optimera resultat.
Flera ortopediska modeller har utvecklats för att studera ben reparation i gnagare25. Vi antas och ändras proceduren tibial fraktur, som ursprungligen beskrevs av Harry o.a. 8, att studera effekter av ortopedisk kirurgi på hjärnans funktion. Vi har också använt denna fraktur modell i kombination med vår parabiosis modell för att undersöka faktorer som ansvarar för läkning och åldersberoende vävnadsregeneration. När de utförs under flyktiga narkos, proceduren tibial fraktur kräver endast ca 15 min per djur, resulterar i noll till minimal dödlighet (beroende på ålder av mus och underliggande genetiska mottaglighet), och recapitulates gemensamma förolämpningar som är associerad med långa rörben fraktur och ortopediska kirurgiskt trauma. Således, denna modell är perfekt för förhör biologiska spridningsvägar och utföra längsgående bedömningar. Det är dock kritisk som det osteotomi och fästa är reproducerbara och att skada på den mjuka vävnaden är konsekvent. Mjukdelsskador kan anpassas, till exempel genom strippning periostet och klämmande omgivande muskler för att göra operationen mer traumatiskt. Modeller av traumatisk fraktur framkallas av icke-fasta trubbigt trauma eller trepunkts böjning skulle inte ge sådan konsekvens eller noggrannhet. Dessa procedurer resultera ofta i re-skada, vilket leder till långvarig inflammatorisk reaktion. Modeller av fraktur med stel fixering har däremot en mer måttlig inflammation, vilket inte fullt recapitulate det skada i samband med ortopedisk kirurgi26,27.
Andra modeller som använder titanlegering fästa har utvecklats att noga härma mänskliga artroplastik och kan vara mer relevant att förhöra protes instabilitet, osteolys och protes-associerade komplikationer i möss28,29 . Borrhålet modeller fruktar som den som presenteras här, ger tillräcklig stabilisering, och möss kan testas i behavioral paradigm utan betydande underskott som kunde blanda ihop sådana uppgifter som luftkonditionering eller öppna fält locomotion/ångest testning6 ,7,11,15,19,20. Roterande missbildningar kan dock uppstå om upptagning inte är ordentligt låst. Vissa modeller använder en extern fixeringsanordning, som ger överlägsen stabilisering men är svårt för att genomföra i en mus tibia, även om det kan genomföras framgångsrikt i en mus lårbenet27.
Kognitiva funktionsnedsättningar, inklusive delirium och postoperativ kognitiv dysfunktion, är vanliga komplikationer efter ortopedisk kirurgi för reparation, speciellt i äldre och svaga patienter30. Detta kliniskt relevanta musmodell av Tibia fraktur kirurgi visar att postoperativ systemisk cytokin release6,7,17, nedsatt blod – hjärnbarriären funktion15,19 , och förändrad mikrogliala morfologi16,22, bidra till försämring av minnet och kan representera kritiska funktioner för postoperative neurologiska komplikationer ses hos många patienter efter ortopedisk kirurgi. Det är viktigt att notera att andra kirurgiska ingrepp har använts att modellera postoperativ kognitiv dysfunktion hos möss. Dessa inkluderar buken31,32,33 och vaskulär34 kirurgi, samt ytliga trauma35,36. Den parabiosis tekniken är tillämplig på alla dessa modeller, som delar liknande effektmått, inklusive inflammation, gliaceller aktivering och beteendemässiga underskott, som kan vara medierad av gemensamma mekanismer.
Studier som inkluderar parabiosis har avslöjat nya roller för cirkulerande faktorer som kan påverka kognitiva funktioner, neuroinflammation och vävnad föryngring i äldre djur37,38,39,40 ,41,42. Vi har visat att parabiosis kan framgångsrikt kombineras med den tibial fraktur modell som beskrivs här för att förhöra regenerativ vägar och studera mekanismer blodburna faktorer att påverka läkning och fraktur reparera12. Här, visat vi att frakturreparation kapaciteten hos ett äldre djur kan vara föryngras när åldern djuret är anastomoseras till en unga djur. Denna omsvängning av ålder var rotad i engraftment av hematopoetiska celler vid frakturstället. Intressant, kan sådan föryngring också uppnås genom transplantation av unga benmärg till åldern möss. I detta avseende kan benmärgstransplantation anses vara en mer direkt och enklare alternativ till parabiosis. Parabiosis är dock en mer robust modell för att undersöka funktionen av cirkulerande celler och faktorer. Vi förväntar oss att en kombination av parabiosis och ortopedisk kirurgi modeller kommer att spela en viktig roll i att svara på kritiska frågor i perioperativ vård och åldrande biologi.
Sammanfattningsvis införa vi ett stegvisa protokoll för en musmodell av Tibia fraktur att studera mekanismer som ansvarar för postoperativ neuroinflammation och kognitiv svikt efter ortopediska kirurgiska ingrepp. Denna modell kan kombineras med ett parabiosis förfarande att studera neuro-immun interaktioner, vävnadsregenerering och andra vägar. Definiera dessa mekanismer kommer att ge strategiska mål för att minimera riskerna för postoperativa komplikationer och optimera resultat.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Kathy Gage, BS (institutionen i anestesiologi, Duke University Medical Center, Durham, NC) för redaktionellt stöd. NT erkänner stöd från en dröm innovationsstöd från hertig anestesiologi och NIH/NIA R01 AG057525-01.
Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-017-25 | Other volatile agents or injectable anesthesia can be also used |
Buprenorphine | Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals | NDC 12496- 6757-1 | Optional and depending on individual Institutional Animal Care and Use Committee recommendations |
Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | 70% solution for antiseptic treatment of skin and cleaning |
10% povidone Iodine | Dynarex | For antiseptic treatment of skin | |
SomnoSuite | Kent Scientific | SS-01 | Low Flow Anesthesia system |
MouseSTAT | Kent Scientific | PS1161 | Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor |
Shaver | Wahl | 9854L | |
Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
Scalpel Handle | Fine science tools | 10003-12 | |
Scalpel Blades – #11 | Fine science tools | 10011-00 | |
Adson Forceps | Fine science tools | 11006-12 | Needed for stripping the periosteum |
Iris Forceps | Fine science tools | 11066-07 | Useful (1×2 teeth) to causing localized muscle/soft tissue trauma |
Bonn Scissors (Straight) | Fine science tools | 14084-08 | Good for osteotomy, note to change regularly as becomes blunt |
Fine Scissors | Fine science tools | 14058-09 | Sharp scissors for cutting sutures |
22G x 3.5 In Quincke Spinal Needle | BD | 405181 | Use inner rod for pinning |
Needle Holders | Fine science tools | 12001-13 | |
Suture | Look | 1079B | |
C57BL6/J | Jackson Laboratory | stock no. 000664 | |
eGFP+ (expressing enhanced green fluorescent protein ubiquitously) | Jackson Laboratory | stock no. 003291 |