Summary
تكون البويضات في الثدييات المعروف أن يكون عرضه للخطأ، لا سيما بسبب ميسيجريجيشن كروموسوم. توضح هذه المخطوطة الكروماتين انتشرت إعداد أساليب للماوس الطور الأول، الطورية الأول والثاني نظموا بويضات. تسمح هذه التقنيات الأساسية لدراسة البروتينات المرتبطة الكروماتين ومورفولوجيا كروموسوم طوال تكون البويضات الثديية.
Abstract
الكروماتين انتشار التقنيات قد استخدمت على نطاق واسع لتقييم التعريب الحيوي للبروتينات المختلفة خلال الجاميطات، خاصة بالنسبة للحيوانات المنوية. تسمح هذه التقنيات للتصور من البروتين والحمض النووي التعريب أنماط أثناء الأحداث هو مثل الكروموسوم مثلى الأقران، إصلاح تشابك والحمض النووي. في حين قد وصفت بعض البروتوكولات في الأدب، الكروماتين العامة انتشار تقنيات استخدام بويضات الثدييات الطور الأول محدودة وصعبة بسبب توقيت بدء الانقسام في المبيضين الجنين. وفي المقابل، يمكن جمع spermatocytes الطور الأول من الفئران الذكور الأحداث مع زيادة الغلات دون الحاجة إلى ميكروديسيكشن. ومع ذلك، من الصعب الحصول على عدد سكانها متزامنة نقية من الخلايا في مراحل محددة بسبب عدم تجانس السكان الخلية الجرثومية هو وهو بعد في الخصية الأحداث والبالغين. للمراحل المتأخرة من الانقسام الاختزالي، أنها مفيدة لتقييم بويضات يمر الانقسام الاختزالي الأول (مي) أو الانقسام الاختزالي الثاني (MII)، لأنه يمكن جمعها من الفئران الإناث البالغات مجموعات من بويضات ناضجة وحفز ليستأنف الانقسام الاختزالي في الثقافة. هنا، أساليب للاستعدادات الكروماتين هو انتشار استخدام بويضات تشريح من الجنين، حديثي الولادة والمبايض الكبار موصوفة بمصاحبة عروض فيديو. كروموسوم ميسيجريجيشن الأحداث في بويضات الثدييات متكررة، لا سيما خلال مي. يمكن استخدام هذه الأساليب لتقييم وتميز آثار الطفرات المختلفة أو التعرض البيئي خلال المراحل المختلفة لتكون البويضات. كما أن هناك اختلافات واضحة بين تكون البويضات والحيوانات المنوية، التقنيات الموضحة داخل لا تقدر بثمن لزيادة فهمنا لتكون البويضات الثديية والميزات ديمبرافيك جنسياً لديناميات كروموسوم والبروتين خلال الانقسام الاختزالي .
Introduction
خلال الحيوانات المنوية، موجات شبه متزامن كبيرة من الخلايا الجرثومية هو يتم بسرعة واستمرار تغذية في الخصية في بداية سن البلوغ، وطوال مرحلة البلوغ1. على النقيض من الذكور، وهو بدأ الانقسام في الإناث فقط أثناء التطور الجنيني. عقب الولادة، تظل بويضات المقبوض عليهم في مرحلة ديكتياتي طويلة من الطور الأول أنا مع حويصلة جيرمنال سليمة (غف؛ المغلف النووية) حتى سن البلوغ. في بداية سن البلوغ، يتم تحديد مجموعة فرعية بويضات دورياً للخضوع للنمو والنضج، الاحتفال ببدء استئناف هو. هو استئناف في بويضات شجيرة يتجلى اختفاء غف في عملية تعرف باسم حويصلة جيرمنال انهيار (جفبد). ثم يخضع البويضات كروموسوم التكثيف والعزل، متبوعاً بقذف الجسم القطبي. بويضات تصبح القبض عند التقدم لصناعة المعلومات وتحفز لاستكمال الشعبة هو الثاني والنهائي إلا بعد الإخصاب.
خصوبة الإناث يعتمد اعتماداً كبيرا على نجاح الطور الأول هو أنا التدرج. المفتاح لهذا هو تكوين الربط الفعلي بين الكروموزومات المتماثلة المعروفة باسم تشياسماتا، الذي هو توسط إصلاح فواصل مزدوجة حبلا الحمض النووي المستحث (دسبس) عن طريق وصلة التحويلة جزئ2. تحدث هذه العملية في سياق السقالة الغنية بالبروتين الحيوي المعروف باسم المجمع سينابتونيمال (SC) التي تشكل بين الكروموزومات المتماثلة لتسهيل على تشابك3. اتفاقية استكهولم هي الزمام مثل هيكل ثلاثي يتكون من عنصرين الجانبية متوازية متصلة بالمنطقة الوسطى البروتينات التي تحمل هومولوجس معا في جميع أنحاء الجارية إصلاح الحمض النووي. قبل انتصاف، تشكيل سلائف العناصر الجانبية، وتسمى العناصر المحورية، بين الأخت شقاً الصبغي. وتشكل البروتينات المعقدة سينابتونيمال مثل SYCP2 و SYCP3 العناصر المحورية التي كولوكاليزي على المحاور التماسك chromatid الشقيقة أثناء الطور الأول في وقت مبكر. هذه لاحقاً كمواقع للبروتين خيوط عرضية، SYCP1، مما يسهل الجمعية العنصر المركزي وتشابك بين homologs محاذاة4الربط. في بويضات الماوس، تشابك كاملة يتم الإشارة إلى وجود 20 تماما متداخلة تمتد SYCP3 و SYCP1، التي يمكن تصور باستخدام لونين انتشار الأعمال التحضيرية. اكتمال تشابك عند دخول [سوبستج] باتشيتيني، حيث زينت ناضجة عمليات الانتقال التي تتجه بشكل تشياسماتا بين هومولوجس موتل dimers homolog (MLH1/3) لتعزيز تلك المعالجة الدقيقة5،6 , 7-صون الهيكلية لمجمعات الكروموسومات (SMC)، بما في ذلك كوسين، كوندينسين، ومعقدة، SMC5/6 هامة لتنظيم كروموسوم ديناميات وهيكل خلال الانقسام الاختزالي8،9، 10،،من1112. مجتمعة، هذه الأحداث ضمان اتجاه ثنائية السليم من الكروموزومات المتماثلة لمعارضة أقطاب المغزل عقب تفكك المحكمة العليا.
دورة الخلية هو نموذج قوية لدراسة أدوار مختلف البروتينات في صيانة الجينوم بسبب التعريفي المبرمجة وإصلاح لاحقة من "دسبس الحمض النووي". وعلاوة على ذلك، الانقسام الاختزالي الثدييات أيضا نموذج ذات صلة لدراسة تعديلات جينية والطباعة13. ومع ذلك، من الصعب من الناحية الفنية لتقييم هذه الأحداث أثناء الانقسام الاختزالي الإناث، الذي ينعقد في المبيضين الأجنة والأطفال حديثي الولادة في الثدييات (الشكل 1). ويمكن تقسيم المراحل الفرعية 5 الطور الأول: ليبتونيما، زيجونيما، باتشينيما، ديبلونيما وديكتياتي. وهنا، نحن تصف كيفية عزل والتمييز بين الأجنة والمواليد المبيض والخصيتين (الشكل 2). مقتبس من الأساليب المذكورة سابقا، وهذه المخطوطة يوجز أيضا بروتوكول (الخطوة 1) مع الفيديو مظاهرة لإعداد الإناث في الطور الأول هو أنا الكروماتين ينتشر14،،من1516،17 . عندما يقترن مع إيمونولابيلينج، كما هو موضح في الخطوات من 6-7، يتيح هذا البروتوكول مفصلة التحليل المجهري للطور الأول أنا الأحداث في بويضات.
تكون البويضات عرضه للخطأ، وتمثل الكروموسوم ميسيجريجيشن الأحداث خلال الشعبة الأولى هو المصدر الأكثر شيوعاً للأمراض الوراثية في نسل18،19. في هذه المخطوطة (الخطوة 2 من البروتوكول)، يصف لنا بروتوكول الذي يتم استخراج بويضات ناضجة نظموا غف من المبايض معبي من الفئران الإناث البالغات. تحت ظروف داعمة، يخضع بويضات شجيرة استئناف مستقلة عن الهرمون للانقسام بعد عزلة والثقافة20. وعقب استئناف هو، بويضات التقدم من خلال الانقسام الاختزالي أنا، ثم القبض على الطورية الثاني. بويضات تظل المقبوض عليهم في الطورية الثاني، ما لم يكن المخصبة. في الخطوات من 2-5، علينا أن نكيف بروتوكولات تم الإبلاغ عنها سابقا مع الفيديو مظاهرة لوصف كيفية جمع، الثقافة وإعداد بويضات مي وصناعة المعلومات ل الاستعدادات الكروماتين نشر21. يسمح هذا الكروماتين نشر تقنية إيمونولابيلينج واضحة من البروتينات المرتبطة بالكروموسومات. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا استخدامها للتمييز بين الكروموزومات الثنائي التكافؤ وأونيفالينت هذا البروتوكول، وكذلك حل واحد الأخت شقاً الصبغي لتيسير تقييم ploidy البويضات. لذلك، بالإضافة إلى الكشف عن أنماط البروتينات هو التعريب، هذا البروتوكول يمكن أيضا بمثابة أداة قيمة للغاية لتوضيح الأسباب المحتملة كروموسوم ميسيجريجاتيون خلال مي وصناعة المعلومات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة جون هوبكنز. وأجريت تجارب على الفئران البرية من نوع C57BL/6J.
1-حصاد المبايض الجنين أو حديثي الولادة، وإعداد الكروماتين الطور الأول ينتشر
- لاستخراج الأجنة في أيام 14.5 – 19.5 بوست--كويتوم (dpc) التضحية الإناث الحوامل عن طريق عنق الرحم التفكك أو CO2 خنقاً وفقا للمبادئ التوجيهية إياكوك.
ملاحظة: ليوم الولادة المبايض 1-5 قم بالتخطي إلى الخطوة 1، 3. ويلخص الشكل 1 مراحل الطور الأول هو إثراء في مختلف العصور الجنينية وما بعد الولادة. - فتح تجويف أبدومينوبيلفيك استخدام مقص عقيمة، مما يجعل من فتح على شكل V. تشريح خارج الرحم الأم القرن الأفريقي، وفصل الأجنة من المشيمة، ونقل الأجنة في أطباق بتري 35 ملم تحتوي على 3 مل من قبل حرارة 1 × العازلة الفوسفات المالحة (PBS) عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن استخدام حاضنة فليبتوب تعيين في 37 درجة مئوية للحفاظ على درجة الحرارة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا استخدام مرحلة زجاج وينظم درجة حرارة للحفاظ على درجة الحرارة أثناء معالجة المبيض. - مع المقص الجراحي 3.5 بوصة، التضحية بالأجنة أو الجراء عن طريق قطع الرأس وفقا للمبادئ التوجيهية إياكوك. وضع الأجنة مقطوعة أو الجراء في برنامج تلفزيوني المعالجون مسبقاً قبل تشريح أخرى.
- تشريح الجنين أو ألجرو واحد في وقت واحد في طبق بتري منفصلة 35 ملم تحتوي على 3 مل من برنامج تلفزيوني المعالجون مسبقاً عند 37 درجة مئوية. المضي قدما من خلال قطع على طول خط الوسط البطني النصف الخلفي للجنين، على امتداد النصف الأمامي أدناه الأمامية ومباشرة فوق هند أطرافه والذيل كما هو مبين في الشكل 2 ألف–باء.
- فتح البطن باستخدام مقص جراحي 3.5 بوصة. استخدام الملقط مقلوب غرامة تهجير أو إزالة الكبد وحلقات من الأمعاء، تعريض المبايض في طبق بتري 35 ملم جديدة تحتوي على 3 مل من برنامج تلفزيوني المعالجون مسبقاً عند 37 درجة مئوية (انظر دليل في الشكل 2). وتقع المبايض مباشرة أسفل وخلف الكلي نحو الجدار الخلفي التجويف الصفاقى (الشكل 2–ج). ويرد دليل للتفريق بين الذكور والإناث في الغدد التناسلية في 2D الشكل.
ملاحظة: للظروف المثلى، سرعة تشريح المبايض بعد التضحية بالإناث الحوامل. - إزالة كلا المبيضين من كل الجنين الأنثى باستخدام زوج من الملقط الجميلة ذات الرؤوس تحت نطاق تشريح ومكان في نظارات مشاهدة أو آبار منفصلة من بئر متعدد لوحة تحتوي على 0.5 إلى 1.0 مل من برنامج تلفزيوني المعالجون مسبقاً والحفاظ على 37 درجة مئوية.
- ضع كل زوج من المبايض في 0.5 مل هيبو-استخراج المخزن المؤقت (17 ملم سترات صوديوم ثنائي هيدرات، السكروز 50 مم، 5 ملم يدتا، 0.5 مم DTT، 30 ملم تريس-HCl، مثبط البروتياز، pH 8.2) في كوب يشاهد نظيفة أو بئر صغير من لوحة 9-جيدا، مع التأكد من أن تزج شركات المبيضين ليتيلي. احتضان لمدة 15 دقيقة على الأقل، ولكن ليس أكثر من 30 دقيقة.
ملاحظة: جعل العازلة هيبو-استخراج جديدة واستخدامها ضمن ح 2 لإضافة القيمة. - أثناء الحضانة، باستخدام قلم PAP حاجز مسعور، رسم مربعين2 22 × 22 ملم على زجاج نظيفة 25 × 75 مم2، 1 مم سميكة مجهر الشريحة كما هو مبين في الشكل 3 ألف.
ملاحظة: يمكن إعداد الشرائح قبل الموعد المحدد. - "الماصة؛" 45-50 ميليلتر من السكروز 100 مم إلى شريحة نظيفة ونقل زوج واحد من المبايض إلى الانخفاض.
- استخدام نهايات اثنين ز 27 الإبر الحادة، ندف المبايض عن بعضها البعض بتحرير الخلايا في محلول السكروز. مع الملقط، إزالة القطع الكبيرة من المبيض وعناية "الماصة؛" محلول السكروز لتفريق الخلايا.
- ميليلتر 40 مكان حل مثبت (بارافورمالدهيد 1% (منهاج عمل بيجين) والمنظفات 0.2% (انظر الجدول للمواد)، الرقم الهيدروجيني 9.2) في كل مربع من الشريحة استعداد. مع تلميح ماصة 200 ميليلتر، نشر الحل مثبت بالتساوي على سطح الشريحة.
- "الماصة؛" 20 ميليلتر من مزيج السكروز على الساحة كل من الشريحة التي تحتوي على مثبت.
ملاحظة: وهذا يساوي استخدام زوج واحد من المبايض كل شريحة. - احتضان الشرائح الموجودة في دائرة مغلقة رطبة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: يمكن أن تتراوح الحضانة بين عشية وضحاها حوالي (12-15 ساعة) في درجة حرارة الغرفة. - افتح غطاء الدائرة والسماح للشرائح أيردري تماما.
- تغسل شرائح في جرة كوبلين التي تحتوي على 50 مل من محلول عامل ترطيب-برنامج تلفزيوني 0.4 في المائة (انظر الجدول للمواد) لمدة 2 دقيقة، الهواء الجاف، والمضي قدما في البروتوكول إيمونولابيلينج (الخطوة 6).
ملاحظة: قد يكون من الممكن لتخزين الشرائح في-80 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق، ولكن هذا يختلف تبعاً لبروتين الفائدة. لتحقيق أفضل النتائج الشروع فورا في بروتوكول إيمونولابيلينج (الخطوة 6).
2-الطورية أنا جمع البويضات
- إلى أقصى حد عدد المسام antral معزولة عن كل الماوس، إينترابيريتونيلي حقن الفئران الإناث عذراء ناضجة جنسياً مع 5 وحدات دولية من المصل تروج الحوامل مير (بمسج، المعروف أيضا الخيول تروج المشيمة (eCG)).
ملاحظة: للغله البويضيه الأمثل، الفئران يجب أن تكون 1 إلى 3 أشهر عمر، كما سينخفض عدد بويضات تحصد مع التقدم في السن. إعداد بمسج، حل زجاجة من 5000 وحدة دولية في 100 مل مخزن (مل U/0.1 5) PBS العقيمة في مختبرين استخدام واحد من 600 ميليلتر في-20 درجة مئوية. - بعد ح 44 – 48، إعداد مجموعة متوسطة، الحد الأدنى الأساسية المتوسطة ألفا (MEMα) المتوسطة وتستكمل مع 5% مصل بقرى الجنين (FBS) والبومين المصل البقري 3 ملغ/مل (جيش صرب البوسنة؛ MEMΑ/BSA/FBS). تعقيم وسائل الإعلام من خلال عامل تصفية مسام 0.2 ميكرون. صب 2.5 مل من MEMα/جيش صرب البوسنة/FBS المتوسطة في صحن زجاج واحد كل الماوس والحارة إلى 37 درجة مئوية في 5% CO2 حاضنة.
ملاحظة: جمع ووسائط الثقافة التي هي متوفرة تجارياً (M2 و M16) أخرى أيضا تستخدم عادة.
تنبيه: من المستحسن إزالة ثقافة الأطباق من 5% CO2 حاضنة واحدة في وقت واحد لمدة محدودة لتقليل التعرض للهواء المحيط أثناء خطوات التلاعب. - التضحية الفئران عن طريق عنق الرحم التفكك أو CO2 خنقاً وفقا للمبادئ التوجيهية إياكوك.
- فتح تجويف أبدومينوبيلفيك استخدام مقص عقيمة، مما يجعل من فتحه كبيرة على شكل V. استخدام الملقط، يزيح الأمعاء نحو رأس الماوس. حدد موقع كل القرن الرحم؛ المبايض هي تقديم الأقرب إلى القفص الصدري. اضغط قناة مع الملقط غرامة وقطع متفوقة الدهون على المبيض باستخدام مقص التشريح (الشكل 4). الاستمرار في الاحتفاظ قناة، ومع مجموعة أخرى من الملقط غرامة الإفراج عن المبيض من الجراب والمكان إلى جمع الصحن الذي يحتوي على MEMα/جيش صرب البوسنة/FBS المتوسطة.
ملاحظة: كما هو الحال في الخطوة 1، من الضروري الحفاظ على المبيضين عند 37 درجة مئوية وعلى الساعة 5% CO2. يمكن استخدام حاضنة فليبتوب التوصيل إلى 5% CO2 ميكس للسماح للصيانة المثلى لدرجات الحرارة ومستويات2 CO. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أيضا استخدام مرحلة زجاج وينظم درجة حرارة الحفاظ على درجة الحرارة من خلال التلاعب بالبويضات. - استخدام المحاقن 1 مل مع إبرة 27-قياس (أو حجم مماثل)، الإفراج عن مجمعات البويضيه الركام بثقب المسام antral كبيرة يدوياً.
- بينما لاحظ من خلال مجهر تشريح، جمع بويضات نظموا غف استخدام ماصة زجاجية تعمل بالفم أو الشعرية، أو تعمل باليد ميكرومتر-حقنه (الشكل 5). فقط جمع بويضات التي تم إصدارها من المسام أنترال. بويضات غف قد يبلغ قطرها حوالي 90 غف بويضات ميكرومتر. قد تكون محاطة بطبقات 2-3 من الخلايا granulosa، ويكون إجمالي يبلغ قطرها حوالي 200 ميكرومتر.
- الثقافة بويضات في كوب يشاهد نظيفة أو لوحة 9-كذلك يتضمن المتوسطة MEMα/جيش صرب البوسنة/FBS ح 6 تصل إلى الطورية أنا في 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO 5%.
- انتقل إلى الخطوة 4.
3-الطورية الثاني (صناعة المعلومات) جمع البويضات
- لتحقيق أقصى قدر من بويضات معزولة عن كل الماوس، إينترابيريتونيلي حقن الفئران الإناث عذراء ناضجة جنسياً مع 5 وحدات دولية من بمسج. بعد ح 44 – 48، إينترابيريتونيلي حقن 5 وحدات دولية من تروج المشيمية البشرية (hCG).
ملاحظة: للغله البويضيه الأمثل، الفئران يجب أن تكون 1 إلى 3 أشهر عمر، كما سينخفض عدد بويضات تحصد مع التقدم في السن. لإعداد قوات حرس السواحل الهايتية، حل زجاجة 10000 U في 200 مل برنامج تلفزيوني (5 مل U/0.1). تخزين في مختبرين استخدام واحد من 600 ميليلتر في-20 درجة مئوية. - وبعد 12-14 ساعة، إعداد MEMα/جيش صرب البوسنة/FBS جمع المتوسطة، كما هو موضح في الخطوة 2، 2، أعلاه.
- التضحية الفئران عن طريق عنق الرحم التفكك أو CO2 خنقاً وفقا للمبادئ التوجيهية إياكوك.
- فتح تجويف أبدومينوبيلفيك استخدام مقص عقيمة، مما يجعل من فتحه كبيرة على شكل V. استخدام الملقط، يزيح الأمعاء نحو رأس الماوس. تحديد موقع كل القرن الرحم والمبايض هي الموجودة الدانية إلى القفص الصدري. اضغط قناة مع الملقط غرامة وقطع متفوقة الدهون على المبيض باستخدام مقص التشريح (الشكل 4). ثم إزالة المبيض وقناة ووضع في جمع الصحن الذي يحتوي على MEMα/جيش صرب البوسنة/FBS المتوسطة.
ملاحظة: كما هو الحال في الخطوتين 1 و 2، من الضروري الحفاظ على المبيضين عند 37 درجة مئوية وعلى الساعة 5% CO2. يمكن استخدام حاضنة فليبتوب التوصيل إلى 5% CO2 ميكس للسماح للصيانة المثلى لدرجات الحرارة ومستويات2 CO. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أيضا استخدام مرحلة زجاج وينظم درجة حرارة الحفاظ على درجة الحرارة من خلال التلاعب بالبويضات. - استخدام المحاقن 1 مل مع 27 ز (أو حجم مماثل) أو الملقط حادة، المسيل للدموع حفرة في ampulla قناة للإفراج عن بويضات الذااره.
ملاحظة: يكون حريصا على عدم إتلاف بويضات في أمبالا. سوف تظهر ampulla متورمة وشفافة حيث بويضات مرئية (الشكل 4). - الحصاد الذااره بويضات من ampulla قناة إلى طبق جديد مع جمع المتوسطة باستخدام ماصة زجاجية تعمل بفم أو الشعرية، أو تعمل باليد ميكرومتر-حقنه (الشكل 5).
- انتقل إلى الخطوة 4.
4-البويضيه تعرية وإزالة Zona Pellucida
- إعداد 300 وحدة دولية/مل من البروتين السكري المثبط في MEMα المتوسطة وتستكمل مع 3 مغ/مل جيش صرب البوسنة سلب بويضات المحيطة بالخلايا الركام (2.5 مل في الماوس) في مشاهدة الزجاج، والحفاظ على 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
ملاحظة: فعالية البروتين السكري المثبط ينخفض انخفاضا حادا بعد ح 1 من إعداد. علاج البروتين السكري المثبط لبويضات الوزارة، غير مطلوب. - كشف مجمعات الخلايا البويضيه الركام إلى 300 وحدة دولية/مل من البروتين السكري المثبط في MEMα/جيش صرب البوسنة لمدة 3 دقائق سلب بويضات المحيطة بالخلايا الركام.
تحذير: لا تتجاوز 3 دقائق بالتعرض للبروتين السكري المثبط، كما أنها سوف تلحق الضرر بويضات. - أغسل بويضات، ونقل بويضات جديدة استعد الطبق المتوسط MEMα/جيش صرب البوسنة. استخدام ماصة زجاجية صغيرة تعمل بالفم أو الشعرية (أكبر قليلاً من قطر البويضات، وهو ما يقرب من 90 ميكرون)، "الماصة؛" المجمعات أعلى وأسفل تماما فصل الخلايا الركام. تسمح بويضات لاسترداد في الحاضنة أثناء التحضير للخطوة التالية.
- الحل تيرودي الحمضية الحارة، MEMα/جيش صرب البوسنة، ووسائل الإعلام وايموث إلى 37 درجة مئوية (500 ميليلتر في الماوس). 300 مكان ميليلتر في كل بئر من ألواح زجاجية صغيرة 9-جيدا.
- لإزالة zona pellucida (ZP) نقل بويضات 5 – 10 إلى الحل تيرودي. كشف بويضات لفقط 30-45 ثانية إلى الحل.
ملاحظة: التعرض القليل جداً لأن الحل لن إزالة ZP في تماما، الذي سيمنع بويضات من الانفجار والصبغيات من الانتشار. تعرض الكثير سوف تضر وتقتل البويضات. مشاهدة حل ZP تحت مجهر تشريح يمكن أن تساعد في الاستفادة المثلى من وقت التعرض.
تنبيه: استخدام الحل الطازجة تيرودي حرجة، حسب وظيفتها في الانخفاض مع التقدم في السن. استخدام بئر جديدة لحل تيرودي لكل مجموعة من بويضات تعامل لضمان الهضم موحدة ZP. - فورا بعد إزالة ZP، يغسل بويضات بنقل إلى حرارة MEMα/جيش صرب البوسنة/FBS المتوسطة. كرر هذه الخطوة من المياه والصرف الصحي.
ملاحظة: كن حذراً عند نقل، كما بويضات ستتمسك بسهولة معا وماصة زجاجية أو إزالة ZP التالي الشعرية. قبل ترطيب ماصة زجاجية أو شعري في المتوسط في وايموث سيقلل من بويضات الالتصاق معا. - نقل والسماح بويضات لاسترداد لمدة 30 دقيقة في المتوسط في وايموث عند 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO 5%.
- انتقل إلى الخطوة 5.
5-مي وينتشر الكروماتين البويضيه صناعة المعلومات
- استخدام قلم PAP، رسم مستطيل2 11 × 44 مم على الشريحة الزجاجية كما هو موضح في الشكل 6A.
- معطف الشريحة مع طبقة رقيقة من مثبت (بارافورمالدهيد 1%، 0.2% 100 تريتون العاشر في ح2س، الأس الهيدروجيني 9.2) بيبيتينج 100 ميليلتر من مثبت على الشريحة وهزاز الشريحة ذهابا وإيابا. انقر فوق الشريحة للتخلص من فائض مثبت.
- تلتقط بين 5-10 بويضات بإبرة ماصة فم صغير مع القليل من وسائل الإعلام قدر الإمكان واسحب الإبرة في خط عبر الشريحة المغلفة بمثبت أثناء إيداع بويضات من 1 سم فوق الشريحة إلى الحل مثبت. تنفيذ هذه الخطوة باستخدام مجهر تشريح للتأكد من أنه قد تم إيداع بويضات وأنه قد انفجر.
ملاحظة: ينبغي الاندفاع بويضات فورا على الشريحة. الارتفاع الذي يتم بويضات أودعت أثر درجة الكروماتين ينتشر. راجع نتائج الممثل في الشكل 6 للحصول على مزيد من التفاصيل. - احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة في غرفة مغلقة هوميديفيد بين عشية وضحاها للسماح الكروماتين على الالتزام.
- السماح للشرائح أيردري تماما وشطف الشرائح في جرة كوبلين التي تحتوي على 50 مل من 0.4 في المائة عامل ترطيب-ح2س، pH 8.0.
- انتقل إلى الخطوة 6.
6-إيمونولابيلينج
- إعداد جسم إضعاف المخزن المؤقت (مصرف التنمية الآسيوي) المبينة في الجدول 1.
- إعداد اثنين كوبلين الجرار التي تحتوي على 50 مل من غسل العازلة (البنك الدولي) الحل (10% المخفف بنك التنمية الآسيوي في برنامج تلفزيوني)، وَجْرَةَ كوبلين واحدة تحتوي على 50 مل الحل المنظفات البنك الدولي و 0.05% (مثلاً، إضافة 250 ميليلتر من المنظفات 10 في المائة إلى 50 مل البنك الدولي).
- يغسل الشرائح التي تم إعدادها في القسم 1 و 5 من هذا البروتوكول لمدة 10 دقائق في جرة كوبلين واحدة تحتوي على 50 مل من البنك الدولي.
تنبيه: لا تدع الشرائح الجافة عند أي نقطة أثناء إيمونولابيلينج. - يغسل الشرائح لمدة 10 دقيقة في كوبلين جرة تحتوي على 50 مل البنك الدولي والحل المنظفات 0.05%. ثم، يغسل الشرائح في جرة كوبلين المتبقية التي تحتوي على 50 مل من محلول البنك الدولي لمدة 10 دقائق.
- انقر فوق إيقاف الشريحة السائل والغطاء الزائدة مع 100 ميليلتر من الأجسام المضادة الأساسي المحدد المخفف في بنك التنمية الآسيوي. تبني في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها في غرفة مغلقة لرطبة.
ملاحظة: يمكن تقصير مدة الحضانة إلى 2 إلى 3 ساعة عند 37 درجة مئوية. استخدام أحجام أصغر من الأجسام المضادة (مثلاً، 50 ميليلتر) التي تغطي الشريحة مع ساترة أو بارافيلم. - شطف الشرائح في جرة كوبلين التي تحتوي على 50 مل من 0.2% عامل ترطيب-برنامج تلفزيوني الحل، pH 8.0.
- كرر الخطوات من 6.2 إلى 6.5.
- انقر فوق إيقاف الشريحة السائل والغطاء الزائدة مع 100 ميليلتر من الأجسام المضادة الثانوية المحددة المخفف في بنك التنمية الآسيوي. احتضان الشرائح 1 إلى 2 ساعة عند 37 درجة مئوية في غرفة مغلقة لرطبة.
- تغسل شرائح 2 مرات عن 10 دقيقة في الجرار كوبلين التي تحتوي على 50 مل من 0.2% عامل ترطيب-برنامج تلفزيوني الحل، pH 8.0.
- تغسل شرائح 2 مرات لمدة 5 دقائق في الجرار كوبلين التي تحتوي على 50 مل من 0.2% عامل ترطيب-ح2س الحل، pH 8.0.
7-تركيب الشرائح
- بالنسبة للطور الأول الكروماتين ينتشر إعدادها في الخطوة 2، إضافة 100 ميليلتر من تصاعد المتوسطة التي تحتوي على 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI، 1.5µg/mL). إضافة ينتشر الكروماتين مي والوزارة مستعدة في الخطوة 5, 50 ميليلتر من تصاعد المتوسطة التي تحتوي على DAPI (1.5µg/mL). لطخة بلطف السائل الزائدة بعيداً.
- ضع ساترة 22 مم × 60 مم في الأعلى وختم مع طلاء الأظافر واضحة. تخزين في مربع شريحة في 4 درجات مئوية أو-20 درجة مئوية إلى التقييم عن طريق الفحص المجهري الأسفار.
ملاحظة: اضغط طفيفة في كشف الغطاء التخلص من تصاعد الزائدة المتوسطة قبل الختم بطلاء الأظافر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لقد قمنا بوصف اثنين من التقنيات لتصور وتقييم الكروموسومات هو في بويضات. الأسلوب الأول هو تهتم تجاه تقييم تطور الطور الأول في المبيضين الأجنة وحديثي الولادة. هي قيمة بشكل لا يصدق لتصور العديد من العمليات الحيوية خلال الانقسام الاختزالي، بما في ذلك كروموسوم الأقران، تشابك الطور الأول الكروماتين انتشار الأعمال التحضيرية وديسينابسيس، ممارسو مثلى، ويعيد البناء كروموسوم جينية. هنا، وقد أثبتنا جدوى هذا الأسلوب للتصور قوية والتحليل الكمي لتشكيل كروس في بويضات حصادها من الأجنة C57BL/6J (الشكل 3B و 3 ج). لإثراء لخلايا في [سوبستج pachytene]، تم استرجاع الأجنة الماوس في dpc 18.5 (الشكل 1). رئيسيين السمات المميزة باتشيتيني [سوبستج] من الطور الأول الأول هي انتهاء تشابك بين هومولوجس، وتكوين واحد على الأقل كروس MLH1/3-إيجابية كل زوج هومولوج. تشابك كاملة بين homologs يتجلى بوجود 20 المتداخلة SYCP3 وتمتد SYCP1. لتحديد خصائص تكوين كروس في بويضات البرية من نوع أننا إيمونولابيليد الطور الأول الكروماتين انتشار الأعمال التحضيرية باستخدام الأجسام المضادة التي تكشف عن SYCP3 و SYCP1 و MLH1، والملون الحمض النووي باستخدام DAPI. ويصور الشكل 3B صورة تمثيلية من البويضيه المرحلة باتشيتيني، مما يدل على ذلك وجود البؤر MLH1 27 الموزعة على طول 20 هياكل اتفاقية استكهولم مجمع بشكل كامل. وكان متوسط عدد عمليات الانتقال الإيجابي MLH1 اكتشفت في بويضات البرية من نوع 24 ±3 (الشكل 3 جيم، N = 15 بويضات). يظهر الشكل 3D SMC6 أثري في منطقة هيتيروتشروماتين (برستيج) بيريسينتروميريك وعلى طول الأسلحة كروموسوم، والبؤر MLH1 الموزعة على امتداد اتفاقية استكهولم في مرحلة باتشيتيني. يصور الشكل 3E البويضيه pachytene نظموا من حيث إعداد انتشار كروموسوم كان دون المستوى الأمثل والكروموزومات الفردية لا يمكن تمييزها، منع التقييم الدقيق ل SYCP3 و SMC6 و MLH1. ويمكن ملاحظة ينتشر كروموسوم دون المستوى الأمثل عندما الحضانة المبايض في المخزن المؤقت لاستخراج هيبو لفترة طويلة أو لفترة طويلة لا يكفي.
يمكن استخدام الأسلوب الثاني وصف لتقييم مورفولوجيا الكروماتين في بويضات عقب استئناف هو (الشكل 6B-د). التعريب البروتين، فضلا عن بلويدي، ويمكن بسهولة تقييم، كشف الأسباب المحتملة للأخطاء العزل الصبغي. الشكل 6B يصور البويضيه مي عرض 20 الكروموسومات ومسح السنترومير وتلطيخ هيتيروتشروماتين بيريسينتروميريك. الرقم 6 صورة أسرع حيث يمكن رؤية توبويسوميراسي IIα (توبوي) على طول الأسلحة كروموسوم وفي برستيج. يصور الشكل 6 البويضيه الوزارة حيث أخت زوجي يمكن تمييز شقاً الصبغي مورفولوجيا كروموسوم والسنترومير. تتضمن الأخطاء الشائعة التي ينظر إليها عند محاولة هذا الأسلوب بويضات لا تنفجر عندما صدر على شريحة المغلفة بمنهاج عمل بيجين، فضلا عن الكروموسومات تنتشر متباعدة جداً (6E الشكل–و). إذا لم تتم إزالة ZP تماما، سوف تظل الكروموزومات المرتبطة بمحور الدوران، كما هو مبين في الشكل 6E. إذا كان يتم إسقاط بويضات عالية جداً من الشريحة المغلفة بمنهاج عمل بيجين، ويمكن أن تنتشر الكروموزومات جداً متباعدة كما هو مبين في الشكل 6F.
رقم 1: الطور الأول هو الفترة الزمنية أثناء تطوير الأجنة والمواليد الإناث- ملامح الأزرق يشير إلى السكان من الطور الأول محددة المرحلة الفرعية الخلايا الجرثومية (leptotene، زيجوتيني، باتشيتيني، ومراحل طور/ديكتياتي) لوحظ أثناء تطوير الأجنة وحديثي الولادة. زيادة اللون الأزرق الداكن يشير إلى توقيت المرحلة الفرعية المحددة من الطور الأول الذي يصبح أكثر وفرة. وكان هذا الرقم مقتبس من مرجع2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: استخراج المبيض من الأجنة والمواليد الإناث الجراء. (أ، ب) أول خطوة من نوعها (1) هو المشار إليه أعلاه الأمامية لقطع رأس الجنين في مفرق الرأس/العنق فور استرجاع من القرن الرحم الأم. وتتكون القطعة الثانية (2) على طول خط الوسط البطني النصف الخلفي للجنين، تليها شقوق على طول النصف الأمامي أدناه الأمامية (3). اعتماد قطع نهائي لإزالة أطرافه هند والذيل (4). (أ) أمامي عرض تخطيطي من التخفيضات تشريح لعزل المبيض من الإناث الجراء. (ب) الجانب التخطيطي عرض التخفيضات تشريح لعزل المبايض مع المواضع النسبية للأجهزة الداخلية. وتشمل المناطق التي سيظهر في ضوء أحمر في الكبد والأمعاء، التي يتم إزالتها خلال التشريح. الجدار الظهرية والأجهزة المرتبطة بها تظهر في الضوء الأزرق. وتشمل هذه المنطقة المبايض، التي أرفقت بالقطبين أقل شأنا من الكلي في الجزء العلوي من الرحم القرن الأفريقي. (ج) عرض أمامي التخطيطي الجدار الظهرية للجنين بعد إزالة الكبد والأمعاء. (د) التمثيل التخطيطي للاختلافات المورفولوجية بين الذكور والإناث الغدد التناسلية في ما يقرب من 15 – 18 dpc. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الطور الأول الممثل الكروماتين انتشار الأعمال التحضيرية- (A) الزجاج الشريحة التخطيطي للطور الأول الكروماتين انتشار الأعمال التحضيرية. وتمثل الخطوط العريضة المربعة السوداء مانع السائل القلم الخطوط العريضة. (ب، ج) صور الممثل والتحديد الكمي لتشكيل كروس في بويضات المرحلة البرية من نوع باتشيتيني باستخدام لونين الطور الأول انتشار إعداد الأساليب الموصوفة في الخطوة 1. ينتشر الكروماتين (ب) أجريت باستخدام المبايض أجنة الفأر fromC57BL/6J معزولة في 18.5 dpc. ينتشر الكروماتين كانت إيمونولابيليد مع الأجسام المضادة ضد بروتين العنصر الأفقي SC SYCP3 (أحمر)، والبروتين العنصر المركزي SC MLH1 SYCP1 (أرجواني)، (الأخضر، علامة الحدث كروس) و DAPI (أزرق، الحمض النووي). شريط المقياس = 10 ميكرون. (ج) الأرض دوت MLH1 بؤر انتشار التهم التي تم الحصول عليها من الكروماتين المرحلة pachytene 15 الأعمال التحضيرية. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. المقارنة (د، ه) للأمثل (د) ودون المستوى الأمثل من الطور الأول (ه) نشر الأعمال التحضيرية، على التوالي. ينتشر الكروماتين كانت إيمونولابيليد مع الأجسام المضادة ضد MLH1 SMC6 (أحمر)، (أخضر)، و SYCP3 (أزرق). شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: رسم تخطيطي للكبار المبيض. ويصور هذا الرسم التخطيطي تشريح المبيض الماوس الكبار، قناة، ampulla والرحم. يجب إزالة المبايض الماوس بشق حذراً من الأربطة ربط المبايض للقطبين أقل شأنا من الكليتين، والجدار الخلفي للبطن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: صور ماصة زجاجية تعمل بالفم والزجاج الشعرية وتعمل باليد ميكرومتر-المحاقن المستخدمة للتلاعب بالبويضات. (أ) مناور البويضيه ماصة زجاجية يتكون من المكونات التالية في تسلسل: قطعة الفم والأنابيب المطاط (3.2 الداخلية مم (ID) × 6.4 مم القطر الخارجي (OD))، نصيحة ماصة 1 مل، مطاط أنابيب (معرف 6.4 مم × 11.1 ملم OD) والزجاج ماصة باستور. انسحبت نهاية الزجاج ماصة باستور قد تم تسخينها على لهب والنهاية لإنشاء حد الغرامة ذات الرؤوس (5A الشكل1). (ب) مناور البويضيه الشعرية الزجاج يتكون من المكونات التالية في تسلسل: قطعة الفم، 0.45 ميكرومتر تصفية (اختياري)، مطاط أنابيب (معرف 3.2 مم × 6.4 ملم OD)، نصيحة ماصة 1 مل، وأنابيب مطاط (معرف 6.4 مم × 11.1 ملم OD) والشعرية الزجاج ميليلتر 70. أنابيب شعرية زجاجية تسخينها على لهب في المركز وسحبت في اتجاهين متعاكسين لإنشاء اثنين من الشعيرات الدموية مع نهايات مقلوب غرامة (5B الشكل1). (ج) حقنه الميكرومتر تعمل باليد ويتكون من المكونات التالية في تسلسل: ميتوتويو ميكرومتر 150-208 الرأس (المتوسطة الحجم، 0-1 "تتراوح، 0.001" التخرج)، حقنه 5 مللي، وأنابيب مطاط (معرف 3.2 مم × 6.4 ملم OD)، نصيحة ماصة 1 مل، مطاط أنابيب (معرف 6.4 مم × 11.1 ملم OD)، 1 مل ماصة نصيحة ونصيحة تحميل جل2 83 × 0.5 مم. رئيس ميكرومتر 150-208 ميتوتويو بشدة إدراج المحاقن 5 مل (الشكل 51). لضمان نصيحة تحميل جل يتم تثبيتها بشكل أمن، ماصة 1 مل ربط قطع نصيحة (الشكل 52). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: الطورية الممثل الأول والثاني البويضيه الكروماتين انتشار الأعمال التحضيرية. (أ) الشريحة التخطيطي الطورية الأول والثاني البويضيه الكروماتين انتشار الأعمال التحضيرية. بويضات (الدوائر) أطلقت عن طريق ماصة زجاجية تعمل بالفم أو شعري في خط مستقيم (بعد السهم). يمثل المخطط مستطيل أسود سائل مانع القلم المخطط التفصيلي. (ب، ج) الطورية الأمثل أنا الكروماتين انتشرت إعداد. الطورية أنا الكروموسومات كانت ملطخة DAPI (أزرق، الحمض النووي)، وإيمونولابيليد للشبكة (الخضراء، كينيتوتشوري/السنترومير ماركر). تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون. (ب) الأجسام المضادة ضد H4 هستون (الميثيل di K20، ثلاثي الميثيل K20) كانت تستخدم لتسمية بيريسينتروميريك هيتيروتشروماتين (برستيج). (ج) الأجسام المضادة ضد IIα توبويسوميراسي (توبوي) استخدمت لتسمية المحاور برستيج وكروموسوم. (د) نشر الكروماتين الثاني الطورية الأمثل إعداد. الكروموسومات الطورية الثاني كانت ملطخة DAPI (أزرق، الحمض النووي)، وإيمونولابيليد للشبكة (الأخضر)، و H4 هستون (دي-ميثيل K20، K20 ثلاثي ميثيل) لتسمية برستيج. شريط الحجم: 10 μm. (ه، و) الطورية الفقيرة أنا الكروماتين انتشار الأعمال التحضيرية. كانت ملطخة الكروموزومات DAPI (أزرق، الحمض النووي)، وإيمونولابيليد للشبكة (الأخضر) وعنصر هو كوسين، REC8. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون (ه) البويضات لا تنفجر عند الإفراج عنهم على شريحة المغلفة بمنهاج عمل بيجين. (و) الكروموسومات التي كانت تنتشر متباعدة جداً. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| البند | المبلغ | التركيز النهائي |
| 1 x برنامج تلفزيوني | 50 مل | س 1 |
| مرض التصلب العصبي المتعدد. | ز 1.5 | 3% (w/v) |
| مصل الحصان | 5 مل | 10% (v/v) |
| المنظفات 10% (انظر جدول المواد) في برنامج تلفزيوني |
250 ميكروليتر | 0.05% (v/v) |
الجدول 1: جسم إضعاف المخزن المؤقت (مصرف التنمية الآسيوي) الوصفة. تخزين بنك التنمية الآسيوي في 4 درجات مئوية أو تجميد الأرصدة في-20 درجة مئوية إذا صنع كميات أكبر. بنك التنمية الآسيوي يمكن أن تصبح ملوثة، لذا تأكد من تقنيات العقيم الجيدة المستخدمة وتقييم الحل للتلوث قبل كل استعمال. يمكن أيضا إعداد مختبرين أصغر من بنك التنمية الآسيوي للحد من التلوث.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الكروماتين انتشار الأعمال التحضيرية تسمح للباحثين لدراسة زمنياً الانقسام الثدييات الإناث والتعريب الحيوي للبروتينات المشاركة. الحيزات الكروماتين الأجنة وحديثي الولادة تسمح بالتحليل الدقيق للأحداث في جميع أنحاء هو الطور الأول. الطورية والطوريه الثاني ينتشر الكروماتين يمكن استخدامها للتمييز بين شقيقة واحد شقاً الصبغي من أزواج الأخوات وإقران الكروموزومات المتماثلة، فضلا عن تقييم بلويدي. وبالمقارنة، البروتوكول هو موضح هنا يمكن يكون من المفيد مقارنة إيمونولابيلينج البويضات كلها، التي كثيرا ما تنتج مستويات عالية من الإشارات الخلفية التي ينقص قرار البروتينات المرتبطة الكروماتين. وعلاوة على ذلك، تمثل الكروماتين انتشار التقنيات بديلاً جذاباً لتصوير خلية يعيش، الأمر الذي يتطلب استثماراً كبيرا من الوقت والمعدات المتخصصة.
يمكن أن تكون المبايض الأجنة والأطفال حديثي الولادة صعوبة في تحديد موقع واستخراج. ونحن نوصي بعناية استخراج كافة الأجهزة والمواد إلى جانب الكليتين في طبق منفصل يحتوي على برنامج تلفزيوني قبل البحث عن المبايض واستخدام طبق طازجة من برنامج تلفزيوني لكل الأجنة/ألجرو (الشكل 2) الأخرى. إذا كان الجنين/ألجرو الذكور، سوف تكون الخصية يمكن تمييزها بتشكيل أنبوب، فضلا عن موقع الغدد التناسلية (الشكل 2D). كما وضع الأجنة الذكور، سوف تنزل الخصيتين نحو القضيب، أصبحت أكبر حجماً وبيضاوية الشكل.
البويضيه الكروماتين انتشار تقنية يتطلب التمكن من جمع البويضات والتلاعب باستخدام ماصة زجاجية تعمل بالفم أو الشعرية. نحن نوصي بممارسة السيطرة ماصة الفم قبل تنفيذ هذا البروتوكول. سحب الزجاج الحجم المناسب الماصة/الشعرية لجمع وتعرية بويضات ستزيد فرص النجاح والكفاءة بالتقليل من الوقت بويضات خارج الحاضنة، وكذلك كما هو الحال في الحل تيرودي. التوقيت الصحيح لإزالة ZP بالغ الأهمية لنجاح هذا الأسلوب. إذا هي المحتضنة بويضات في الحل في تيرودي لكمية غير كافية من الوقت، سوف لا تتم إزالة في ZP تماما. وهذا يمنع بويضات تتضاعف كفاءة على الشريحة، كما يتبين في الشكل 6E. ومع ذلك، إذا هي المحتضنة بويضات في الحل في تيرودي لفترة طويلة جداً، جودة البويضات وتلطيخ الفلورة المصب سوف تتعرض لخطر شديد. نوصي بمشاهدة بويضات تحت مجهر لتحديد الوقت بالضبط ZP يذوب في الحل في تيرودي. إضافة فقط 5-10 بويضات في وقت حل تيرودي لتقليل التعرض المفرط. إذا تم إصدارها بويضات عالية جداً فوق الشريحة المغلفة بمنهاج عمل بيجين، ويمكن أن تنتشر الكروموزومات متباعدة جداً (الشكل 6F). تم العثور على أفضل النتائج عندما يتم تحرير بويضات 1 سم فوق الشريحة. وتشمل العوامل الأخرى التي يمكن أن تعرقل النتائج التعرض المطول لانخفاض مستويات2 CO في الهواء المحيط خلال الخطوات التلاعب البويضيه. وهذا يسبب تقلبات الأس الهيدروجيني في وسائط الإعلام التي تضر بجودة البويضات وهو الظاهر بتغيير اللون التدريجي لوسائل الإعلام من الأحمر البرتقالي إلى الوردي. يقلل أيضا من قدرة التخزين المؤقت لوسائط الإعلام على مر الزمن؛ ولذلك، لا نوصي باستخدام الوسائط التي تم تخزينها (4 درجة مئوية) لمدة أطول من أسبوع واحد. ويشيع استخدام M2 المتوسطة، التي لا تتطلب CO2 تخزينها مؤقتاً، كبديل لذلك.
حد الكروماتين انتشار الأعمال التحضيرية هو انعدام تصور الكروماتين في سياق الأصلي للخلية. ولا يمكن تصور المواد الخلوية خارج النواة ولا يمكن تقييم تكوين المغزل. ولذلك، يمكن استخدام أساليب أخرى لتقييم تكون البويضات بالإضافة إلى حيزات الكروماتين، مثل إيمونولابيلينج البويضات كلها بعد العلاج موناسترول، الذي يطوي المغزل ثنائية القطبية إلى مغزل أحادية قطبية22. وهذا ما يسمح الأخت شقاً الصبغي إلى تقييم في سياق الخلية. جماعياً، يمكن بسهولة تطبيق الكروماتين انتشار الأساليب الموصوفة هنا لتقييم ploidy مورفولوجيا وكروموسوم الكروماتين في جميع أنحاء تكون البويضات في نماذج الرواية المعدلة وراثيا ومتحولة الماوس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
نيجمس (R01GM11755) إلى P.W.J وعلى تدريب منحة زمالة من الوطنية سرطان معهد (NIH) (CA009110) للزمان و J.H. كان تأييد هذا العمل
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Quality Biological | 119-069-161 | |
| 60 mm x 15 mm petri dishes | Denville | T1106 | |
| 35mm x 12mm petri dishes | Denville | T1103 | |
| Fine forceps | VWR | 300-050 | |
| Micro dissection scissors | Ted Pella | 1340 | |
| Dissecting scissors, sharp tip, 41/2" | VWR | 82027-578 | |
| Watch glass square 1 5/8 | Carolina Biological Supply Company | 742300 | Autoclave before each use |
| Sucrose | Sigma | S8501 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Sigma | S1804 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 646563 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| 50x Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in) | Becton, Dickinson (BD) | 309623 | |
| Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick) | Thermo | 3063-002 | |
| Super PAP pen, large (liquid blocker) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| 16% Paraformaldehyde aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Detergent in manuscript |
| Immuno stain moisture chamber | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Coplin jars | Fisher | 08-815 | |
| Photo-flo 200 | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 74257 | Wetting agent in manuscript |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | G4877 | Store aliquots at -20C |
| Human chorionic gonadotropin (HCG) | Sigma | C0434 | Store aliquots at -20C |
| PYREX Spot Plates with nine concave cavities | Fisher | 13-748B | Autoclave before each use |
| Glass capillary | Fisher | 22260943 | For making oocyte collection needles |
| Brand Parafilm M | Sigma | BR701501 | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5B | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5D | For making oocyte collection needles |
| Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing | Sigma | A5177-5EA | For making oocyte collection needles |
| Mitutoyo micrometer head | Mituoyo | 150-208 | For making oocyte collection needles |
| Syringe 5 mL | BD Biosciences | 309646 | For making oocyte collection needles |
| Syringe filter 0.45 μm filter | Corning | 431220 | For making oocyte collection needles |
| Glass Pasteur Pipette 5 3/4" | Fisher | 13-678-6A | For making oocyte collection needles |
| 83 x 0.5 mm pipette tip | Denville | P3080 | For making oocyte collection needles |
| α-MEM | Invitrogen | 11415049 | |
| Waymouth's media | Life Technologies | 11220035 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | A3160602 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3311 | For oocyte culture media |
| 500ml filter units 0.22um | Denville | F5227 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Tyrode’s solution | Sigma | T1788 | Store aliquots at -20C |
| Horse serum | Sigma | H-1270 | For ADB/wash buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A1470 | For ADB/wash buffer |
| VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope cover slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear nail polish | Amazon | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Mouse anti-MLH1 | Life Technologies | MA5-15431 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti-SYCP1 | Life Technologies | PA1-16763 | Dilution factor- 1:1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | Dilution factor- 1:50 |
| Human anti-centromere protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti- TOPOII | Abcam | ab109524 | Dilution factor- 1:100 |
| Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20) | Abcam | ab78517 | Dilution factor- 1:500 |
| Rabbit anti-Rec8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | Dilution factor- 1:10,000 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11057 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-21202 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-31573 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11004 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo-Fisher Scientific | A-11013 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11011 | Dilution factor- 1:500 |
References
- Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
- Keeney, S. Spo11 and the Formation of DNA Double-Strand Breaks in Meiosis. Genome Dyn Stab. 2, 81-123 (2008).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), (2015).
- Vries, F. A., et al. Mouse Sycp1 functions in synaptonemal complex assembly, meiotic recombination, and XY body formation. Genes Dev. 19 (11), 1376-1389 (2005).
- Baker, S. M., et al. Involvement of mouse Mlh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13 (3), 336-342 (1996).
- Lipkin, S. M., et al. Meiotic arrest and aneuploidy in MLH3-deficient mice. Nat Genet. 31 (4), 385-390 (2002).
- Kolas, N. K., et al. Localization of MMR proteins on meiotic chromosomes in mice indicates distinct functions during prophase I. J Cell Biol. 171 (3), 447-458 (2005).
- Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS Journal. 282 (13), 2426-2443 (2015).
- Lee, J. Roles of Cohesin and Condensin in Chromosome Dynamics During Mammalian Meiosis. J. Reprod Dev. 59 (5), 431-436 (2013).
- Verver, D. E., Hwang, G. H., Jordan, P. W., Hamer, G. Resolving complex chromosome structures during meiosis: versatile deployment of Smc5/6. Chromosoma. 125 (1), 15-27 (2016).
- Hopkins, J., et al. Meiosis-specific cohesin component, Stag3 is essential for maintaining centromere chromatid cohesion, and required for DNA repair and synapsis between homologous chromosomes. PLoS Genet. 10 (7), e1004413 (2014).
- Hwang, G., et al. SMC5/6 is required for the formation of segregation-competent bivalent chromosomes during meiosis I in mouse oocytes. Development. 144 (9), 1648-1660 (2017).
- Kota, S. K., Feil, R. Epigenetic transitions in germ cell development and meiosis. Dev Cell. 19 (5), 675-686 (2010).
- Taketo, T. Microspread ovarian cell preparations for the analysis of meiotic prophase progression in oocytes with improved recovery by cytospin centrifugation. Methods Mol Biol. 825 (1), 173-181 (2012).
- Sun, X., Cohen, P. E. Studying recombination in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 1-18 (2013).
- Kim, J. H., Ishiguro, K., Kudo, N., Watanabe, Y. Studying meiosis-specific cohesins in mouse embryonic oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 47-57 (2013).
- Susiarjo, M., Rubio, C., Hunt, P. Analyzing mammalian female meiosis. Methods Mol Biol. 558, 339-354 (2009).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Hum Mol Genet. 16, R203-R208 (2007).
- Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs In vivo and In vitro: I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
- Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 203-212 (2013).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
