Summary
Oogenesis ביונקים ידוע להיות מועדת לטעויות, במיוחד עקב כרומוזום missegregation. כתב יד זה מתאר שיטות הכנה כרומטין להפיץ prophase העכבר, מפה של אני, oocytes ביים השני. טכניקות יסוד אלה מאפשרים לימוד חלבוני כרומטין מכורך כרומוזום מורפולוגיה ברחבי oogenesis יונקים.
Abstract
טכניקות התפשטות כרומטין היה בשימוש נרחב כדי להעריך לוקליזציה דינמי של חלבונים שונים במהלך gametogenesis, במיוחד עבור יצירת זרע. טכניקות אלה מאפשרות ויזואליזציה של חלבון ודפוסי לוקליזציה DNA במהלך אירועים meiotic כגון כרומוזום הומולוגי זיווג, synapsis, ה-DNA תיקון. בעוד כמה פרוטוקולים תוארו בספרות, כרומטין כללי התפשטות באמצעות oocytes prophase בתרבית של טכניקות הם מוגבלים וקשה בשל העיתוי של מיוזה חניכה של השחלות עוברית. לשם השוואה, ניתן לאסוף prophase spermatocytes של עכברים זכר לנוער עם תשואות גבוהות ללא צורך microdissection. עם זאת, קשה להשיג אוכלוסיה מסונכרן טהור של תאים בשלבים מסוימים עקב הטרוגניות של אוכלוסיות meiotic, פוסט-meiotic תא הנבט ב בזרמה לנוער ומבוגרים. בשלבים מאוחרים יותר של מיוזה, זה יתרון כדי להעריך oocytes עוברים מיוזה I (MI) או מיוזה II (MII), כי קבוצות של oocytes בוגר יכול להיות שנאסף עכברים נקבה בוגרת מגורה כדי לחדש את המיוזה בתרבות. . הנה, שיטות ההכנות כרומטין meiotic להתפשט באמצעות oocytes גזור מן העובר, neonatal, השחלות למבוגרים מתוארים בליווי הדגמות וידאו. כרומוזום missegregation םיעוריא oocytes יונקים הם בתדירות גבוהה, במיוחד במהלך MI. שיטות אלה ניתן להשתמש כדי להעריך ולאפיין את ההשפעות של מוטציות שונות או חשיפות סביבתיות בשלבים שונים של oogenesis. שכן, ישנם הבדלים ברורים בין oogenesis לבין יצירת זרע מהטכניקות שתוארו בתוך הם לא יסולא בפז כדי להגדיל את ההבנה שלנו של יונקים oogenesis ותכונות dimorphic מינית של דינמיקה כרומוזום וחלבון במהלך המיוזה .
Introduction
במהלך יצירת זרע, סינכרונית למחצה גלי העלייה הגדולים של meiotic בתאי הנבט במהירות ובאופן רצוף מתחדשות ב בזרמה בתחילת גיל ההתבגרות וברחבי לבגרות1. בניגוד הזכרים, מיוזה אצל נקבות מאותחלת אך ורק במהלך התפתחות העובר. בעקבות הלידה, oocytes נשארים נעצר בשלב dictyate ממושך של prophase אני עם שלפוחית-germinal שלם (GV; מעטפת הגרעין) עד גיל ההתבגרות. מיד עם תחילת גיל ההתבגרות, תת-קבוצה של oocytes המזמורים נבחרים לעבור גדילה, התבגרות, סימון אתחול של חידוש meiotic. חידוש meiotic ב oocytes וחוה מתבטאת על ידי היעלמותו של GV בתהליך המכונה התמוטטות germinal שלפוחית (GVBD). Oocyte לציפוי כרומוזום עיבוי, סגרגציה, ואחריו הגוף קוטב ההבלטה. Oocytes הופכים נעצרה על סדר MII, מומרץ כדי להשלים את החטיבה השנייה והאחרונה meiotic רק לאחר ההפריה.
פוריות נשית תלויה מאוד להצלחת meiotic prophase אני התקדמות. המפתח לכל זה היא היווצרות-חיבור פיזי בין כרומוזומים הומולוגיים הידועה בשם chiasmata, אשר מתווך על ידי תיקון המושרה מעברי חוט כפול דנ א (DSBs) באמצעות כבל מוצלב רקומבינציה2. תהליך זה מתרחש בתוך ההקשר של לפיגום עשירים בחלבון דינאמית הידועה בשם המתחם synaptonemal (SC) המהווה בין כרומוזום הומולוגי כדי להקל על שלהם synapsis3. SC הוא דמוי רוכסן tripartite מבנה המורכב שני אלמנטים לרוחב מקבילים המחוברים באמצעות חלבונים באזור המרכז שמחזיק homologs יחד במהלך מתמשך DNA לתקן. לפני synapsis, מבשרי מרכיבי לרוחב, שנקרא אלמנטים צירית, יוצרים בין האחות chromatids. Synaptonemal קומפלקס חלבונים כגון SYCP2 ו- SYCP3 טופס צירית הגורמים colocalize בצירים לכידות כרומטידה אחות במהלך prophase המוקדמות. אלה מאוחר יותר לשמש מחייב אתרים עבור החלבון נימה רוחבי, SYCP1, אשר מאפשר הרכבה יסוד מרכזי, synapsis בין מיושר homologs4. ב oocytes העכבר, synapsis מלאה מסומן על ידי הנוכחות של 20 לגמרי חופפים מתיחות SYCP3 ו SYCP1, אשר ניתן לאבחן באמצעות כרומטין להפיץ את ההכנות. Synapsis הושלמה בעת כניסתו substage pachytene, לפיה ג'יי ג'יי אברהמס בוגרת זה נועדו טופס chiasmata בין homologs מעוטרים mutL הדימרים homolog (MLH1/3) כדי לקדם את עיבוד מדויק שלהם,5,6 , 7. קיום מתחמי כרומוזומים (SMC), כולל cohesin, condensin ו- SMC5/6 מתחם מבניים חשובים עבור הרגולציה של כרומוזום dynamics ומבנה במהלך המיוזה8,9, 10,11,12. באופן קולקטיבי, אירועים אלה להבטיח bi-כיוון נכון של כרומוזומים הומולוגיים מנוגדות הפולנים פלך בעקבות פירוק של SC.
מחזור התא meiotic הוא מודל חזק כדי לבחון את התפקידים של חלבונים שונים בתחזוקת הגנום עקב אינדוקציה מתוכנת תיקון עוקבות של דנ א DSBs. יתר על כן, בתרבית של המיוזה היא גם דוגמנית הרלוונטיים לצורך המחקר של שינויים epigenetic, החתמה13. עם זאת, מבחינה טכנית קשה להעריך אירועים אלה במהלך המיוזה הנשי, אשר מתקיים בעובר ו neonatal השחלות אצל יונקים (איור 1). Prophase אני יכול להיות מחולק 5 substages: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema ו- dictyate. במסמך זה, אנו מתארים כיצד לבודד, להבחין בין עוברי ו neonatal השחלות, האשכים (איור 2). הותאם מפעולות שתואר קודם לכן, כתב יד זה גם מתאר פרוטוקול (שלב 1) עם הפגנה וידאו להכנת prophase meiotic הנשי אני כרומטין מתפשט14,15,16,17 . בשילוב עם immunolabelling, כפי שמתואר שלבים 6-7, פרוטוקול זה מאפשר ניתוח מיקרוסקופי מפורט של prophase אני אירועים oocytes.
Oogenesis מועדת לשגיאות, כרומוזום missegregation אירועים במהלך החטיבה meiotic הראשון מייצג את המקור הנפוץ ביותר של מחלה גנטית רומא18,19. כתב יד זה (פרוטוקול שלב 2), נתאר פרוטוקול שבו oocytes ביים-GV בוגרת המחולצים להתקפת השחלות של עכברים הנשי למבוגרים. בתנאים תומכת, oocytes וחוה עוברים הורמון מחלמן תלויית חידוש מיוזה בעקבות בידוד ותרבות20. בעקבות חידוש meiotic, oocytes להתקדמות מיוזה, ואז לעצור-מפה של השני. Oocytes נשארים נעצר ב מפה של השני, אלא אם כן מופרית. שלבים 2-5, אנחנו להסתגל פרוטוקולים שדווחה בעבר עם הפגנה וידאו כדי לתאר כיצד לאסוף, תרבות ולהכין oocytes MI, MII כרומטין להפיץ את ההכנות21. זה כרומטין התפשטות הטכניקה מאפשר immunolabelling ברורה של חלבונים הקשורים כרומוזומים. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי להבדיל בין כרומוזום טרינארית ו univalent, ולא ניתן לפתור עוד אחות אחת chromatids כדי להקל על הערכה של oocyte פלואידיות. לכן, בנוסף חשיפת דפוסי לוקליזציה של חלבונים meiotic, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כלי רב ערך עבור שחקרתי סיבות פוטנציאליות של כרומוזום missegregation במהלך MI MII.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) מאוניברסיטת ג'ונס הופקינס. הניסויים נערכו על עכברים C57BL/6J פראי-סוג.
1. קצירת השחלות עוברית או Neonatal והכנה של כרומטין Prophase מתפשט
- כדי לחלץ עוברי-14.5 – 19.5 ימים פוסט-coitum (dpc) להקריב הנקבות בהריון דרך נקע בצוואר הרחם או חנק2 CO בהתאם להנחיות IACUC.
הערה: עבור יום כמחנכת 1 – 5 השחלות דלג לשלב 1.3. איור 1 מסכמת את שלבי meiotic prophase מועשר בגילאים שונים של אחרי לידה. - פתח את חלל abdominopelvic באמצעות מספריים סטרילי, עושה חור בצורת V. שווייץ הקרן הרחם האימהי, להפריד את העוברים השליה, העברת העוברים 35 מ מ פטרי המכילות 3 מ"ל של טרום ומחוממת 1 x פוספט מאגר, תמיסת מלח (PBS) ב- 37 מעלות צלזיוס.
הערה: חממה fliptop להגדיר ב 37 ° C יכול לשמש כדי לשמור על הטמפרטורה. בנוסף, שלב זכוכית טמפרטורה מוסדר יכול לשמש גם כדי לשמור על טמפרטורה במהלך השחלה מניפולציה. - עם מספריים כירורגיים 3.5 אינץ, להקריב עוברי או הגורים באמצעות עריפת ראש בהתאם להנחיות IACUC. מקום עוברי ערופת הראש או הגורים PBS ומחוממת מראש לפני ניתוח נוסף.
- לנתח את העובר או גור אחד במועד בצלוחית נפרדת 35 מ מ המכיל 3 מ"ל של PBS ומחוממת מראש ב- 37 מעלות צלזיוס. המשך על ידי חיתוך לאורך הקו האמצעי הגחון של החצי האחורי של העובר, לאורך החצי הקדמי מתחת את forelimbs ישירות מעל הינד-איבריו ואת הזנב כפי שמתואר באיור 2A–B.
- לפתוח את הבטן בעזרת מספריים כירורגיים 3.5 אינטש. בעזרת מלקחיים שקצהו הקנס תסיטו או להסיר את הכבד ואת לולאות של המעי הגס, חשיפת השחלות בתוך צלחת פיטרי 35 מ מ חדש המכיל 3 מ"ל של PBS ומחוממת מראש ב 37 מעלות צלזיוס (ראה מדריך איור 2B). השחלות ממוקמים מיד מתחת ומאחורי הכליה לכיוון הקיר האחורי של חלל הצפק (איור 2 ב–ג). מדריך עבור הבחנה בין זכר ונקבה גונדות ניתנת איור דו-ממדי.
הערה: תנאים אופטימליים, במהירות לנתח את השחלות אחרי הנקבה ההרה מוקרבת. - להסיר את השחלות הן מן כל העובר נקבה באמצעות זוג מלקחיים שקצהו הקנס תחת דיסקציה היקף ומקום במשקפיים השעון או בארות נפרדים של באר מרובה צלחת המכילה 0.5 עד 1.0 מ של PBS ומחוממת מראש ולשמור ב 37 º C.
- מקם כל זוג של השחלות במאגר 0.5 mL היפו-מיצוי (17 מ"מ ציטראט trisodium וגופרית והרכבו, סוכרוז 50 מ"מ, 5 מ"מ EDTA, 0.5 מ מ DTT, 30 מ מ טריס-HCl, מעכב פרוטאז, pH 8.2) זכוכית השעון נקי או טוב קטן של צלחת 9-ובכן, מקפיד לטבול את הפקודה comp השחלות letely. דגירה לפחות 15 דקות, אך לא יותר מ- 30 דקות.
הערה: להפוך את מאגר היפו-מיצוי טרי ולהשתמש בתוך שעתיים של DTT בנוסף. - במהלך הדגירה, באמצעות עט PAP הידרופובי המכשול, לצייר שני 22 x 22 מ מ2 ריבועים על זכוכית נקי 25 x 75 מ מ2, שקופיות מיקרוסקופ בעובי 1 מ מ כפי שמוצג באיור 3 א.
הערה: ניתן להכין שקופיות מבעוד מועד. - Pipette 45 – 50 µL של 100 מ מ סוכרוז לשקופית נקי ולהעביר זוג אחד של השחלות לירידה.
- באמצעות קצות שתי מחטים 27 G חדה, להקניט את השחלות לגזרים לשחרר תאים בתוך תמיסת סוכרוז. עם מלקחיים, להסיר חתיכות גדולות של השחלה, בזהירות פיפטה סוכרוז פתרון כדי לפזר את התאים.
- מקום 40 µL של פתרון מקבע (1% paraformaldehyde (PFA), דטרגנט 0.2% (ראה טבלה של חומרים), pH 9.2) לתוך כל ריבוע של השקופית מוכן. עם טיפ 200 µl פיפטה, להפיץ הפתרון מקבע באופן שווה על פני שקופיות.
- פיפטה 20 µL של המיקס סוכרוז על כל ריבוע של השקופית המכילה את מקבע.
הערה: זה משווה ל באמצעות זוג אחד של השחלות לכל שקופית. - דגירה השקופיות בחדר לחים סגורה ללילה בטמפרטורת החדר.
הערה: לילה הדגירה יכולה לנוע סביב (12-15 שעות) בטמפרטורת החדר. - פותחים את המכסה קאמרית ולאפשר שהשקופיות מילה נהדרת לחלוטין.
- לשטוף שקופיות בתוך צנצנת Coplin המכיל 50 מ של פתרון סוכן הרטבה-PBS 0.4% (ראה טבלה של חומרים) למשך 2 דקות, אוויר יבש, והמשך פרוטוקול immunolabelling (שלב 6).
הערה: ייתכן ניתן לאחסן את השקופיות ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר, אך זה משתנה בהתאם החלבון עניין. לקבלת תוצאות מיטביות, להמשיך מיד פרוטוקול immunolabelling (שלב 6).
2. מפה של אני אוסף Oocyte
- כדי להגדיל את מספר זקיקים antral מבודד בכל עכבר, intraperitoneally להזריק בגרו עכברים הנשי בתולה עם IU 5 של גונדוטרופין סרום של סוסה הרה (PMSG, הידוע גם בשם אקווין גונדוטרופין כוריוני (א)).
הערה: עבור תשואה אופטימלית oocyte, עכברים צריך להיות 1 עד 3 חודשים של גיל, כמו מספר oocytes שנקטפו יקטן עם הגיל. כדי להכין PMSG, להמיס בקבוק של 5,000 יחב ב- 100 מ של סטרילי PBS (U/0.1 5 מ ל) בחנות aliquots לשימוש יחיד של 600 µL ב-20 ° C. - לאחר 44-48 h, להכין אוסף בינוני, המינימום חיוני בינוני אלפא (MEMα) בינוני בתוספת 5% סרום שור עוברית (FBS) ו- 3 מ"ג/מ"ל אלבומין שור (BSA; MEMΑ/BSA/FBS). לחטא מדיה דרך מסנן נקבובית 0.2 µm. Decant 2.5 מ של MEMα/BSA/FBS בינוני לתוך צלחת זכוכית אחת לכל העכבר וחם עד 37 ° C בחממה2 CO 5%.
הערה: אחרים אוסף ומדיה תרבות שאינם זמינים מסחרית (M2 ו- M16) גם משמשות.
התראה: אנו ממליצים הסרת תרבות מנות 5% CO2 החממה אחד בכל פעם על משך זמן מוגבל למזער את החשיפה הסביבתית במהלך השלבים מניפולציה. - להקריב את העכברים דרך נקע בצוואר הרחם או חנק2 CO בהתאם להנחיות IACUC.
- פתח את חלל abdominopelvic באמצעות מספריים סטרילי, עושה חור גדול בצורת V. באמצעות מלקחיים, תחסיר המעיים אל הראש של העכבר. לאתר כל קרן הרחם; השחלות הן מציגות proximal לכלוב הצלעות. להחזיק את oviduct עם מלקחיים בסדר וחותכים ממונה השמן השחלה באמצעות חיתוך מספריים (איור 4). המשיכו להחזיק את oviduct, עם עוד זוג מלקחיים בסדר לשחרר את השחלה בורסה, המקום לתוך תבשיל אוסף MEMα/BSA/FBS בינוני.
הערה: כמו שלב 1, זה הכרחי כדי לשמור על השחלות ב 37 מעלות צלזיוס ולשמור ב- 5% CO2. חממה fliptop מכור עד 5% CO2 מיקס יכול לשמש כדי לאפשר תחזוקה אופטימאליים של טמפרטורה ורמות2 CO. בנוסף, שלב זכוכית טמפרטורה מוסדר אמור לשמש גם כדי לשמור על טמפרטורה במהלך oocyte מניפולציה. - באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט בקוטר 27 (או גודל דומה), שחרר cumulus oocyte תסביכים על-ידי באופן ידני ניקב את זקיקי antral גדולים.
- תוך כדי התבוננות דרך מיקרוסקופ לנתיחה, לאסוף oocytes ביים-GV באמצעות פיפטה מזכוכית המופעלים באמצעות הפה של נים, או המופעל ביד מיקרומטר-מזרק (איור 5). רק לאסוף oocytes שפורסמו antral זקיקים. GV oocytes יש קוטר של 90 מיקרומטר. GV oocytes עשוי להיות מוקף 2-3 שכבות של תאים granulosa ויש קוטר סך של-200 מיקרומטר.
- תרבות oocytes זכוכית השעון נקי או צלחת 9-ובכן המכיל MEMα/BSA/FBS בינונית במשך 6 שעות להגיע מפה של אני-37 מעלות צלזיוס ב חממה2 CO 5%.
- המשך לשלב 4.
3. מפה של השני (MII) Oocyte אוסף
- כדי להגדיל oocytes מבודד בכל עכבר, intraperitoneally להזריק בגרו עכברים הנשי בתולה עם IU 5 של PMSG. לאחר 44-48 שעות, intraperitoneally להזריק 5 IU של גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG).
הערה: עבור תשואה אופטימלית oocyte, עכברים צריך להיות 1 עד 3 חודשים של גיל, כמו מספר oocytes שנקטפו יקטן עם הגיל. כדי להכין hCG, להמיס בקבוק של 10,000 U ב- 200 מ ל PBS (U/0.1 5 מ ל). אחסן aliquots לשימוש יחיד של 600 µL ב-20 ° C. - לאחר 12-14 שעות, להכין MEMα/BSA/FBS אוסף בינוני, כפי שמתואר בשלב 2.2, לעיל.
- להקריב את העכברים דרך נקע בצוואר הרחם או חנק2 CO בהתאם להנחיות IACUC.
- פתח את חלל abdominopelvic באמצעות מספריים סטרילי, עושה חור גדול בצורת V. באמצעות מלקחיים, תחסיר המעיים אל הראש של העכבר. לאתר כל קרן הרחם, השחלות הן להציג proximal לכלוב הצלעות. להחזיק את oviduct עם מלקחיים בסדר וחותכים ממונה השמן השחלה באמצעות חיתוך מספריים (איור 4). לאחר מכן להסיר את השחלה ואת oviduct, מניחים צלחת אוסף המכיל MEMα/BSA/FBS בינוני.
הערה: כמו שלבים 1 ו- 2, זה הכרחי כדי לשמור על השחלות ב 37 מעלות צלזיוס ולשמור ב- 5% CO2. חממה fliptop מכור עד 5% CO2 מיקס יכול לשמש כדי לאפשר תחזוקה אופטימאליים של טמפרטורה ורמות2 CO. בנוסף, שלב זכוכית טמפרטורה מוסדר אמור לשמש גם כדי לשמור על טמפרטורה במהלך oocyte מניפולציה. - באמצעות מזרק 1 מ"ל עם 27 G (או גודל דומה) או חדים מלקחיים, יפער חור ampulla של oviduct כדי לשחרר את oocytes MII.
הערה: יש להיזהר לא לגרום נזק את oocytes ב ampulla. Ampulla יופיעו נפוח ולא שקוף כזה oocytes הם גלויים (איור 4). - קציר oocytes MII מ ampulla של oviduct לתוך תבשיל חדש אוסף בינונית בעזרת פיפטה מזכוכית המופעלים באמצעות הפה של נים, או המופעל ביד מיקרומטר-מזרק (איור 5).
- המשך לשלב 4.
4. oocyte ומזוהות והסרה Zona Pellucida
- להכין 300 IU/mL של hyaluronidase בינוני MEMα בתוספת 3 מ"ג/מ"ל של BSA כדי מערטל oocytes של סביב cumulus תאים (2.5 מ ל/עכבר) זכוכית שעון, והשאר ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
הערה: Hyaluronidase יעילות יורד בחדות לאחר h 1 של הכנה. עבור MII oocytes, טיפול hyaluronidase אינו נדרש. - לחשוף oocyte-תלולית מכלולי תא ל 300 IU/mL של hyaluronidase ב MEMα/BSA למשך 3 דקות כדי מערטל oocytes של קומולוס תאים המקיפים אותם.
התראה: לא יעלה על 3 דקות חשיפה hyaluronidase, כפי. יהרוס את oocytes. - כדי לשטוף את oocytes, העברה oocytes טרי חימם צלחת בינונית MEMα/BSA. באמצעות פיפטה זכוכית קטנים המופעלים באמצעות הפה או נים (מעט גדול יותר מקוטר oocyte, המהווה כ 90 מיקרומטר), pipette את מתחמי למעלה ולמטה כדי לנתק לחלוטין את התאים קומולוס. אפשר את oocytes לשחזר בחממה תוך כדי הכנה. השלב הבא.
- הפתרון של Tyrode חומצי חמים, MEMα/BSA ומדיה של Waymouth ל- C ° 37 (500 µL/עכבר). µL המקום 300 בכל טוב של צלחות זכוכית קטן 9-. טוב.
- כדי להסיר את pellucida zona (מסוג ZP) להעביר 5 – 10 oocytes לתוך הפתרון של Tyrode. לחשוף את oocytes רק 30-45 שס. הפתרון.
הערה: מעט מדי חשיפה הפתרון לא יסיר את מסוג ZP לחלוטין, אשר ימנע את oocytes מתפרצת, כרומוזומים מלהתפשט. חשיפה מוגזמת לפגוע ולהרוג את oocyte. צופה את התמוססות מסוג ZP תחת המיקרוסקופ ניתוח יכול לסייע אופטימיזציה זמן החשיפה.
התראה: באמצעות הפתרון של Tyrode טריים הוא קריטי, כמו הפונקציה יורדת עם הגיל. להשתמש טוב טרי של הפתרון של Tyrode עבור כל קבוצה של מטופלים כדי להבטיח העיכול אחיד של מסוג ZP oocytes. - מיד לאחר הסרת מסוג ZP, לשטוף את oocytes על ידי העברת לתוך בינוני MEMα/BSA/FBS ומחוממת. חזור על שלב זה לשטוף.
הערה: היה זהיר בעת העברה, כמו oocytes. בקלות להישאר ביחד, פיפטה מזכוכית או הסרת נימי הבאים מסוג ZP. מראש להרטיב את פיפטה מזכוכית או נים במדיום של Waymouth יצמצם oocytes נשארים יחד. - העברת ולאפשר את oocytes להתאושש במשך 30 דקות של Waymouth בינוני ב 37 ° C בחממה2 CO 5%.
- המשך לשלב 5.
5. MI וכפולות כרומטין Oocyte MII
- באמצעות עט PAP, צייר מלבן2 11 x 44 מ"מ על השקופית זכוכית כפי שמוצג באיור 6A.
- מעיל השקופית עם שכבה דקה של מקבע (1% paraformaldehyde, 0.2% 100 טריטון-X H2O, pH 9.2) על ידי pipetting µL 100 של מקבע אותן לשקופית, נדנדה השקופית אחורה וקדימה. הקש על השקופית כדי להיפטר מקבע עודף.
- לאסוף בין 5-10 oocytes עם מחט פיפטה פה קטן עם כמו מדיה קטן ככל האפשר וגרור את המחט בשורה לרוחב השקופית מצופים מקבע בעת הפקדת את oocytes מ- 1 ס מ מעל לשקופית לתוך הפתרון מקבע. יש לבצע פעולה זו באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה על מנת להבטיח כי נצברים את oocytes, כי הם שלו.
הערה: oocytes צריך פרץ מיד בשקופית. הגובה בו הם oocytes להפקיד השפעת מידת כרומטין מתפשטת. ראה תוצאות נציג איור 6 לפרטים נוספים. - דגירה שקופיות בטמפרטורת החדר בחדר סגור humidified בין לילה כדי לאפשר את כרומטין לדבוק.
- לאפשר את השקופיות מילה נהדרת לחלוטין ולשטוף שקופיות בתוך צנצנת Coplin המכיל 50 מ של 0.4% סוכן הרטבה-H2O, pH 8.0.
- המשך לשלב 6.
6. Immunolabelling
- הכנת המאגר דילול נוגדנים (ADB) שמתואר בטבלה 1.
- להכין שני כדים Coplin המכילים 50 מ של שטיפת (WB) בופר (10% ADB מדולל ב- PBS), ואת אחד צנצנת Coplin המכיל 50 מ ל WB 0.05% פתרון דטרגנט (למשללהוסיף 250 µL של 10% סבון 50 מ ל WB).
- לשטוף את השקופיות שהוכנו בסעיף 1 ו-5 של פרוטוקול זה 10 דקות בצנצנת אחת Coplin, המכיל 50 מ של WB.
התראה: אל תתנו את השקופיות יבש בשלב כלשהו במהלך immunolabelling. - לשטוף את השקופיות 10 דקות Coplin צנצנת המכילה 50 מ ל WB, פתרון דטרגנט 0.05%. לאחר מכן, לשטוף את השקופיות בצנצנת Coplin הנותרים המכילים 50 מ של WB פתרון עבור 10 דקות.
- הקש את עודף שקופית נוזלי ולכסות עם 100 µL של נוגדנים ראשי הנבחרת מדולל ב- ADB. דגירה ב 4 ° C בין לילה בחדר לחים סגור.
הערה: הדגירה יכולה להתקצר 2 כדי 3 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס. השתמש כרכים קטנים של נוגדנים (למשל, 50 µL) על ידי כיסוי השקופית עם coverslip או מצלמות-מיקרוסקופים. - לשטוף שקופיות בתוך צנצנת Coplin המכיל 50 מ של 0.2% סוכן הרטבה-PBS פתרון, pH 8.0.
- חזור על שלבים 6.2-6.5.
- הקש את עודף שקופית נוזלי ולכסות עם 100 µL של הנבחרת נוגדנים משניים מדולל ב- ADB. דגירה שקופיות 1 עד 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס בתוך תא סגור לח.
- רחץ בשקופיות 2 פעמים עבור 10 דקות בתוך צנצנות Coplin המכיל 50 מ של 0.2% סוכן הרטבה-PBS פתרון, pH 8.0.
- רחץ בשקופיות 2 פעמים עבור 5 דקות בצנצנות Coplin המכיל 50 מ של 0.2% סוכן הרטבה-H2O פתרון, pH 8.0.
7. הרכבה שקופיות
- Prophase כרומטין ממרחים מוכנים בשלב 2, להוסיף 100 µL של הרכבה בינונית המכיל 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי, 1.5µg / mL). עבור כרומטין MI, MII מתפשט מוכן בשלב 5, להוסיף 50 µL של הרכבה בינונית המכיל דאפי (1.5µg / mL). בעדינות כתם נוזלי עודף משם.
- מקום של coverslip 22 מ"מ x 60 מ"מ על העליונה, לאטום עם לק ברורה. לאחסן בקופסה שקופית 4 ° C או-20 ° C עד הערכה באמצעות מיקרוסקופ זריחה.
הערה: ברז בקלילות על מכסה להיפטר עודף הרכבה בינונית לפני איטום עם לק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תארנו שתי טכניקות בשביל להמחיש והערכה הכרומוזומים. oocytes meiotic. הטכניקה הראשונה היא ששירתה לקראת הערכת התקדמות prophase של השחלות עובריים ו neonatal. Prophase כרומטין התפשטות ההכנות בעל ערך רב להמחשת תהליכים דינאמיים רבים במהלך המיוזה, כולל כרומוזום זיווג, synapsis, desynapsis, רקומבינציה הומולוגית, ו שיפוץ כרומוזום epigenetic. . הנה, הראו את התועלת של שיטה זו להמחשת חזקים וניתוח כמותי של כבל מוצלב-צורה oocytes שנקטפו C57BL/6J עוברי (איור 3B ו- 3 C). להעשיר עבור תאים substage pachytene, עכבר עוברי אוחזרו ב 18.5 dpc (איור 1). שניים רס ן יש היסטוריה ארוכה כיעד של substage pachytene של prophase אני הם הסיום של synapsis בין homologs, היווצרות של כבל מוצלב MLH1 3-חיובי אחד לפחות לכל זוג homolog. Synapsis מלאה בין homologs באה לידי ביטוי על ידי הנוכחות של 20 חופפים SYCP3, SYCP1 נמתח. כדי לאפיין מוצלב-צורה פראי-סוג oocytes אנו immunolabeled prophase כרומטין להפיץ את ההכנות באמצעות נוגדנים המאתרות SYCP3, SYCP1, MLH1, צבעונית הדנ א באמצעות דאפי. איור 3B מתארת תמונת הנציגה של oocyte הבמה pachytene, אשר מתבטא בפערים הנוכחות של 27 foci MLH1 מפוזרים לאורך 20 מבנים SC שהרכבתם. המספר הממוצע של ג'יי ג'יי אברהמס MLH1-חיוביות זוהה פראי-סוג oocytes היה 24 ±3 (איור 3 C, N = 15 oocytes). דמות תלת-ממד מראה SMC6 מועשר באזור הטרוכרומטין (PCH) pericentromeric ולאורך הזרועות כרומוזום foci MLH1 מפוזרים לאורך SC בשלב pachytene. איור 3E מתארת oocyte pachytene ביים הכנת ממרח כרומוזום הייתה תת אופטימלית ואיפה כרומוזומים בודדים הם נבדלים, מניעת הערכה מדויקת של SYCP3, SMC6, MLH1. יכול להיות שנצפו כפולות כרומוזום תת אופטימלית כאשר דגירה של השחלות במאגר היפו-החילוץ היא יותר מדי זמן או לא לאורך זמן מספיק.
הטכניקה השנייה המתוארת ניתן להעריך כרומטין מורפולוגיה ב oocytes בעקבות חידוש meiotic (איור 6B-D). לוקליזציה של חלבון, כמו גם פלואידיות, יכול בקלות להיות מוערך, חשיפת סיבות פוטנציאליות של כרומוזום סגרגציה שגיאות. איור 6B מתאר של oocyte MI מציג 20 כרומוזומים ונקה צנטרומר, צביעת הטרוכרומטין pericentromeric. איור 6C היא תמונה מוגדלת שבו טופואיזומראז IIα (TOPOII) ניתן לראות לאורך הזרועות כרומוזום, הכביש הראשי. איור 6D מתארת oocyte MII איפה אחותי לזווג ניתן להבחין chromatids על ידי כרומוזום, צנטרומר מורפולוגיה. שגיאות נפוצות ראיתי בעת ניסיון טכניקה זו כוללים את oocytes לא מתפוצץ כאשר שוחרר על גבי השקופית מצופים מחברים, וכן כרומוזומים הפצת רחוקות מדי (איור 6E–F). אם מסוג ZP לא יוסר לחלוטין, הכרומוזומים יישאר משוייך בכישור, כפי שמוצג באיור 6E. אם oocytes בוטלו גבוה מדי של השקופית מצופים PFA יכול להתפשט גם רחוקים כפי שהיא מתוארת דמות 6Fהכרומוזומים.
איור 1: ציר הזמן Meiotic prophase במהלך התפתחות עובריים ו neonatal הנשי. קווי המתאר הכחולים מצביעים על אוכלוסיות ספציפיות prophase תת שלב בתאי הנבט (leptotene, zygotene, pachytene ו diplotene/dictyate שלבים) ציין במהלך התפתחות עובריים neonatal. הגדלת צבע כחול כהה מציינת העיתוי שבו הבמה תת prophase מסוים הופך שופע יותר. איור זה הותאם אסמכתא2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: מן העוברים וגורי הנשי neonatal החילוץ השחלה. (A, B) החתך הראשון (1) מתבצע מעל forelimbs כדי לערוף את העובר בצומת ראש/צוואר מיד עם אחזור מן הקרן הרחם האימהי. השני (2) החתך לאורך הקו האמצעי הגחון של החצי האחורי של העובר, ואחריו חתכים לאורך החצי הקדמי מתחת forelimbs (3). חתך הסופי מתבצע להסרת הינד איבריו ואת הזנב (4). (א) נוף חזיתי סכמטית לנתיחה חתכים עבור בידוד של השחלות של הגורים הנקבה. תיאור סכמטי של דיסקציה חתכים עבור בידוד של השחלות עם היחסיים של איברים פנימיים (B) לצד תצוגה. האזורים מוצגים באור אדום כוללות את הכבד ואת המעיים, אשר יוסרו במהלך ניתוח. הקיר הגבי האיברים הקשורים מוצגים באור כחול. אזור זה כולל את השחלות, אשר מחוברים הפולנים נחות של הכליות בחלק העליון של הקרן הרחם. (ג) הקדמית הצג סכימתי של קיר הגבי של העובר בעקבות הסרת הכבד והמעיים. (ד) ייצוג סכמטי של הבדלים מורפולוגיים בין זכר ונקבה גונדות-כ 15-18 dpc. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: prophase נציג כרומטין להפיץ את ההכנות. (א) זכוכית שקופית מפרטים טכניים עבור prophase כרומטין להפיץ את ההכנות. קווי מתאר של ריבוע שחור מייצגים מתאר עט חוסם נוזלי. (ב, ג) כימות של כבל מוצלב-צורה pachytene פראי-סוג שלב oocytes באמצעות prophase כרומטין ותמונות נציג להתפשט הכנה בשיטות המתוארות בשלב 1. כפולות כרומטין (B) בוצעו באמצעות השחלות fromC57BL/6J העכבר עוברי מבודד-18.5 dpc. ממרחים כרומטין היו immunolabeled עם נוגדנים נגד החלבון רכיב לרוחב SC SYCP3 (אדום), ואת החלבון יסוד מרכזי SC MLH1, SYCP1 (מגנטה) (טוש ירוק, אירוע מוצלב), דאפי (כחול, דנ א). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (ג) נקודה מגרש של מוקדים MLH1 שהתקבלו 15 pachytene הבמה כרומטין להפיץ את ההכנות. קווי שגיאה לייצג סטיית תקן. (D, E) השוואה של האופטימלית (D) ו prophase (E) תת אופטימלית להפיץ את ההכנות, בהתאמה. ממרחים כרומטין היו immunolabeled עם נוגדנים נגד SMC6 (אדום), MLH1 (ירוק), ו- SYCP3 (כחול). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: תרשים סכמטי של השחלה למבוגרים. דיאגרמה זו מתארת את האנטומיה של העכבר למבוגרים השחלה, oviduct, ampulla הרחם. העכבר השחלות יש להסיר על ידי חתך זהיר של הרצועות חיבור השחלות הפולנים נחות של הכליות, הקיר האחורי של הבטן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: תמונות של פיפטה המופעלים באמצעות הפה זכוכית, זכוכית נימי המופעל ביד מיקרומטר-המזרק משמש oocyte מניפולציה. (א) manipulator oocyte פיפטה מזכוכית מורכב הרכיבים הבאים ברצף: פה-גדול, צינורות גומי (3.2 מ מ הקוטר הפנימי (ID) x מ מ 6.4 הקוטר החיצוני (OD)), עצה פיפטה 1 מ"ל, צינורות גומי (מזהה 6.4 מ מ x מ מ 11.1 OD) וזכוכית פסטר פיפטה. הסוף של הזכוכית פסטר פיפטה יש כבר מחומם מעל להבה, ואת הקצה משך כדי ליצור קצה שקצהו פיין (5A איור1). (B) manipulator oocyte נימי זכוכית מורכב הרכיבים הבאים ברצף: פה-גדול, 0.45 לסנן מיקרומטר (אופציונלי), צינורות גומי (מזהה 3.2 מ מ x 6.4 מ מ OD), עצה פיפטה 1 מ"ל, צינורות גומי (מזהה 6.4 מ מ x מ מ 11.1 OD) ו- 70 נימי זכוכית µl. השפופרות נימי זכוכית מחומם מעל להבה במרכז ומשך בכיוונים מנוגדים כדי ליצור שני נימים עם קצוות משופעת בסדר (5B איור1). (ג) המזרק מיקרומטר המופעל ביד מורכב הרכיבים הבאים ברצף: Mitutoyo 150-208 מיקרומטר הראש (המזרח התיכון גודל, 0-1 ". טווח 0.001" הסיום), מזרק 5 מ ל, צינורות גומי (מזהה 3.2 מ מ x 6.4 מ מ OD), עצה 1 מ"ל פיפטה, צינורות גומי (מזהה 6.4 מ מ x מ מ 11.1 OD), עצה פיפטה 1 מ"ל, 83 x 0.5 מ מ2 ג'ל הטעינה עצה. Mitutoyo 150-208 מיקרומטר הראש בחוזקה מוכנס לתוך המזרק 5 מ"ל (5C איור1). כדי להבטיח שהטיפ הטעינה ג'ל הוא הידק בבטחה, פיפטה 1 מ"ל המחבר את הטיפ נחתך (5C איור2). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: מפה של הנציג השני oocyte כרומטין ואני להפיץ את ההכנות. (א) שקופית מפרטים טכניים עבור מפה של אני וההכנות II oocyte כרומטין כפולה. Oocytes (מעגלים) שוחרר באמצעות פיפטה מזכוכית המופעלים באמצעות הפה או נים בקו ישר (בעקבות החץ). מלבן שחור לרמות מייצג חוסם נוזלי העט לרמות. (B, C) מפה של האופטימלית אני כרומטין להפיץ הכנה. מפה של אני כרומוזומים היו מוכתמים דאפי (כחול, ה-DNA), ו- immunolabeled עבור CEN (סמן קינטוכור/צנטרומר ירוק). גודל ברים = 10 מיקרומטר. (B) נוגדנים נגד היסטון H4 (די מתיל K20, תלת מתיל K20) שימשו כדי לתייג הטרוכרומטין pericentromeric (PCH). (ג) נוגדנים נגד טופואיזומראז IIα (TOPOII) שימשו כדי לתייג את PCH וציר כרומוזום. (ד) מפה של האופטימלית II כרומטין להתפשט הכנה. מפה של השני כרומוזומים היו מוכתמים דאפי (כחול, ה-DNA), ו- immunolabeled עבור CEN (ירוק), ו- H4 היסטון (di-methyl K20, תלת-מתיל K20) לסמן את PCH. סרגל קנה מידה: 10µm- (E, F) המסכן מפה של אני כרומטין להפיץ את ההכנות. כרומוזומים היו מוכתמים דאפי (כחול, ה-DNA), ו immunolabeled עבור CEN (ירוק) הרכיב meiotic cohesin, REC8. גודל ברים = 10 מיקרומטר (E) oocyte שהתפוצצה לא מתבסס על גבי השקופית מצופים מחברים. כרומוזומים (נ) במקומות שונים מדי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| פריט | כמות | ריכוז סופי |
| 1 x PBS | 50 מ | 1 x |
| BSA | 1.5 גרם | 3% (w/v) |
| סרום סוס | 5 מ | 10% (v/v) |
| 10% דטרגנט (ראה טבלה של חומרים) ב- PBS |
250 ΜL | 0.05% (v/v) |
טבלה 1: נוגדנים דילול מאגר (ADB) המתכון. ADB ב 4 ° C או להקפיא מניות ב-20 ° C, אם מבצעים את כמויות גדולות יותר. ADB יכולים להיות מזוהמים, כך שעליך לוודא טוב טכניקות aseptic משמשים ולהעריך את הפתרון עבור זיהום לפני כל שימוש. ניתן גם להכין aliquots קטן של ADB כדי למזער את הזיהום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההכנות התפשטות כרומטין לאפשר לחוקרים ללמוד באופן כרונולוגי הנשי מיוזה יונקים ו לוקליזציה דינמי של חלבונים המעורבים. בכפולות כרומטין עובריים ו neonatal מאפשרים ניתוח קרוב של אירועים ברחבי meiotic prophase. מפה של מפה של השני ואני כרומטין כפולות יכול לשמש כדי להבחין בין האחות יחיד chromatids מ זיווג כרומוזומים הומולוגיים לזווג, והאחיות וכן להעריך פלואידיות. לשם השוואה, הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות יתרון בהשוואה oocyte כל immunolabelling, המייצרת לעיתים קרובות רמות גבוהות של האות רקע זה מקטין את הרזולוציה של חלבוני כרומטין מאוגד. יתר על כן, טכניקות התפשטות כרומטין מייצגות חלופה אטרקטיבית הדמיה לחיות תאים, אשר דורשת השקעה גדולה של זמן ושל ציוד מיוחד.
השחלות עובריים ו neonatal תתקשו לאתר ולחלץ. אנו ממליצים בקפידה חילוץ כל איברים אחרים, חומר חוץ הכליות בקערה נפרדת המכיל PBS לפני מחפש השחלות ושימוש תבשיל טריים של PBS עבור כל העובר/גור (איור 2B). אם הגורים/העובר הוא זכר, בזרמה יהיה ניתן להבחנה על ידי היווצרות צנורית, כמו גם המיקום של הגונדות (איור דו-ממדי). כאשר זכר העוברים מתפתחים, האשכים לרדת לכיוון הפין, הופך גדול יותר, בצורת אליפסה.
Oocyte הטכניקה כרומטין להפיץ דורש מיומנות של אוסף oocyte ומניפולציה באמצעות פיפטה מזכוכית המופעלים באמצעות הפה או נים. מומלץ לתרגל שליטה על פיפטה בפה לפני ביצוע פרוטוקול זה. מושך את גודלו זכוכית פיפטה/נים לאוסף, ומזוהות oocytes יהיה להגדיל סיכויי הצלחה ויעילות על-ידי מזעור זמן oocytes נמצאים מחוץ החממה באותה מידה כמו הפתרון של Tyrode. התזמון הנכון להסרת מסוג ZP חשוב מאוד להצלחת בשיטה זו. אם oocytes מודגרת בפתרון של Tyrode עבור כמות מספיקה של זמן, מסוג ZP לא יימחק לחלוטין. פעולה זו מונעת את oocytes ייפרץ ביעילות בשקופית, כפי שניתן לראות באיור 6E. עם זאת, אם oocytes מודגרת בפתרון של Tyrode יותר מדי זמן, הזרם immunofluorescence מכתים ואיכות oocyte קשות ייחשף אנו ממליצים לראות את oocytes תחת מיקרוסקופ כדי לקבוע את הזמן המדויק מסוג ZP מתמוסס בפתרון של Tyrode. הוספת oocytes 5 – 10 רק במועד לפתרון של Tyrode יצמצם חשיפה מוגזמת. אם oocytes משתחררות מדי גבוה מעל לשקופית מצופים מחברים, הכרומוזומים יכול להיות להתפשט רחוקות מדי (איור 6F). ניתן למצוא תוצאות מיטביות בעת oocytes משתחררים 1 ס מ מעל לשקופית. גורמים אחרים זה יכול לעכב את תוצאות כוללים חשיפה ממושכת ירידה ברמות2 CO באוויר פתוח במהלך השלבים מניפולציה oocyte. זה גורם pH תנודות התקשורת כי פוגמים באיכות oocyte, והוא לכאורה על-ידי שינוי הצבע פרוגרסיבי של המדיה של כתום-אדום עד ורוד. יכולת האגירה של התקשורת גם פוחתת לאורך זמן; לכן, לא מומלץ שימוש במדיית כי כבר מאוחסן (4 ° C) במשך יותר משבוע. M2 בינוני, אשר אינה דורשת CO2 לאגור, משמשת כאלטרנטיבה.
מגבלה כרומטין להפיץ את ההכנות היא חוסר ויזואליזציה של כרומטין בתוך ההקשר המקורי של התא. לא ניתן לאבחן חומר הסלולר מחוץ לגרעין, פלך היווצרות לא יכול להיות מוערך. לכן, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כדי להעריך oogenesis בנוסף כרומטין כפולות, כגון oocyte כל immunolabelling לאחר טיפול monastrol, אשר מתמוטטת בכישור הקטבים לתוך מונו-קוטבי כישור22. דבר זה מאפשר אחותי chromatids לפנות לבדיקה בתוך ההקשר של התא. באופן קולקטיבי, ניתן להחיל כרומטין להפיץ בשיטות המתוארות כאן בקלות כדי להעריך פלואידיות כרומוזום ומורפולוגיה כרומטין ברחבי oogenesis במודלים חדשניים העכבר הטרנסגניים מוטציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIGMS (R01GM11755) כדי P.W.J על ידי מלגת גרנט אימונים מ הלאומי סרטן המכון (NIH) (CA009110) ג. ה, ג'יי-אייץ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Quality Biological | 119-069-161 | |
| 60 mm x 15 mm petri dishes | Denville | T1106 | |
| 35mm x 12mm petri dishes | Denville | T1103 | |
| Fine forceps | VWR | 300-050 | |
| Micro dissection scissors | Ted Pella | 1340 | |
| Dissecting scissors, sharp tip, 41/2" | VWR | 82027-578 | |
| Watch glass square 1 5/8 | Carolina Biological Supply Company | 742300 | Autoclave before each use |
| Sucrose | Sigma | S8501 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Sigma | S1804 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 646563 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| 50x Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in) | Becton, Dickinson (BD) | 309623 | |
| Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick) | Thermo | 3063-002 | |
| Super PAP pen, large (liquid blocker) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| 16% Paraformaldehyde aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Detergent in manuscript |
| Immuno stain moisture chamber | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Coplin jars | Fisher | 08-815 | |
| Photo-flo 200 | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 74257 | Wetting agent in manuscript |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | G4877 | Store aliquots at -20C |
| Human chorionic gonadotropin (HCG) | Sigma | C0434 | Store aliquots at -20C |
| PYREX Spot Plates with nine concave cavities | Fisher | 13-748B | Autoclave before each use |
| Glass capillary | Fisher | 22260943 | For making oocyte collection needles |
| Brand Parafilm M | Sigma | BR701501 | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5B | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5D | For making oocyte collection needles |
| Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing | Sigma | A5177-5EA | For making oocyte collection needles |
| Mitutoyo micrometer head | Mituoyo | 150-208 | For making oocyte collection needles |
| Syringe 5 mL | BD Biosciences | 309646 | For making oocyte collection needles |
| Syringe filter 0.45 μm filter | Corning | 431220 | For making oocyte collection needles |
| Glass Pasteur Pipette 5 3/4" | Fisher | 13-678-6A | For making oocyte collection needles |
| 83 x 0.5 mm pipette tip | Denville | P3080 | For making oocyte collection needles |
| α-MEM | Invitrogen | 11415049 | |
| Waymouth's media | Life Technologies | 11220035 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | A3160602 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3311 | For oocyte culture media |
| 500ml filter units 0.22um | Denville | F5227 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Tyrode’s solution | Sigma | T1788 | Store aliquots at -20C |
| Horse serum | Sigma | H-1270 | For ADB/wash buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A1470 | For ADB/wash buffer |
| VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope cover slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear nail polish | Amazon | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Mouse anti-MLH1 | Life Technologies | MA5-15431 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti-SYCP1 | Life Technologies | PA1-16763 | Dilution factor- 1:1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | Dilution factor- 1:50 |
| Human anti-centromere protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti- TOPOII | Abcam | ab109524 | Dilution factor- 1:100 |
| Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20) | Abcam | ab78517 | Dilution factor- 1:500 |
| Rabbit anti-Rec8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | Dilution factor- 1:10,000 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11057 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-21202 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-31573 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11004 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo-Fisher Scientific | A-11013 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11011 | Dilution factor- 1:500 |
References
- Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
- Keeney, S. Spo11 and the Formation of DNA Double-Strand Breaks in Meiosis. Genome Dyn Stab. 2, 81-123 (2008).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), (2015).
- Vries, F. A., et al. Mouse Sycp1 functions in synaptonemal complex assembly, meiotic recombination, and XY body formation. Genes Dev. 19 (11), 1376-1389 (2005).
- Baker, S. M., et al. Involvement of mouse Mlh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13 (3), 336-342 (1996).
- Lipkin, S. M., et al. Meiotic arrest and aneuploidy in MLH3-deficient mice. Nat Genet. 31 (4), 385-390 (2002).
- Kolas, N. K., et al. Localization of MMR proteins on meiotic chromosomes in mice indicates distinct functions during prophase I. J Cell Biol. 171 (3), 447-458 (2005).
- Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS Journal. 282 (13), 2426-2443 (2015).
- Lee, J. Roles of Cohesin and Condensin in Chromosome Dynamics During Mammalian Meiosis. J. Reprod Dev. 59 (5), 431-436 (2013).
- Verver, D. E., Hwang, G. H., Jordan, P. W., Hamer, G. Resolving complex chromosome structures during meiosis: versatile deployment of Smc5/6. Chromosoma. 125 (1), 15-27 (2016).
- Hopkins, J., et al. Meiosis-specific cohesin component, Stag3 is essential for maintaining centromere chromatid cohesion, and required for DNA repair and synapsis between homologous chromosomes. PLoS Genet. 10 (7), e1004413 (2014).
- Hwang, G., et al. SMC5/6 is required for the formation of segregation-competent bivalent chromosomes during meiosis I in mouse oocytes. Development. 144 (9), 1648-1660 (2017).
- Kota, S. K., Feil, R. Epigenetic transitions in germ cell development and meiosis. Dev Cell. 19 (5), 675-686 (2010).
- Taketo, T. Microspread ovarian cell preparations for the analysis of meiotic prophase progression in oocytes with improved recovery by cytospin centrifugation. Methods Mol Biol. 825 (1), 173-181 (2012).
- Sun, X., Cohen, P. E. Studying recombination in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 1-18 (2013).
- Kim, J. H., Ishiguro, K., Kudo, N., Watanabe, Y. Studying meiosis-specific cohesins in mouse embryonic oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 47-57 (2013).
- Susiarjo, M., Rubio, C., Hunt, P. Analyzing mammalian female meiosis. Methods Mol Biol. 558, 339-354 (2009).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Hum Mol Genet. 16, R203-R208 (2007).
- Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs In vivo and In vitro: I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
- Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 203-212 (2013).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
