Summary
Oögenese bij zoogdieren is bekend dat zij vergissing-geneigd, met name als gevolg van chromosoom missegregation. Dit manuscript chromatine verspreid voorbereiding worden methoden beschreven voor muis profase, metafase I en II-geënsceneerde eicellen. Deze fundamentele technieken toestaan voor de studie van chromatine-gebonden eiwitten en chromosoom morfologie in zoogdieren oögenese.
Abstract
Chromatine verspreiding technieken hebben wijd gebruikt om te beoordelen van de dynamische lokalisatie van verschillende eiwitten tijdens geslachtscel, met name voor de spermatogenese. Deze technieken kunnen voor visualisatie van eiwitten en DNA lokalisatie patronen tijdens Meiotische evenementen zoals homologe chromosomen in paren rangschikken, synapsis en DNA-reparatie. Terwijl een aantal protocollen zijn beschreven in de literatuur, zijn algemene chromatine verspreiding technieken met behulp van zoogdieren profase eicellen beperkt en moeilijk te wijten aan de timing van meiose Inleiding in de foetale eierstokken. In vergelijking, kunnen de profase spermatocyten worden verzameld van jonge mannelijke muizen met een hogere opbrengst zonder de behoefte aan microdissection. Het is echter moeilijk te verkrijgen van een zuivere gesynchroniseerde bevolking van cellen in specifieke stadia als gevolg van de heterogeniteit van Meiotische en post Meiotische geslachtscellen populaties in de jeugd- en volwassen testis. Voor de latere fases van de meiose is het voordelig om te beoordelen van oöcyten ondergaan meiose I (MI) of meiose II (MII), omdat groepen van rijpe eicellen kunnen worden verzameld van volwassen vrouwelijke muizen en gestimuleerd om te hervatten meiose in cultuur. Hier, methoden voor Meiotische chromatine verspreid preparaten met behulp van oöcyten ontleed van foetale, Neonatale en volwassen eierstokken worden beschreven met begeleidende video demonstraties. Chromosoom missegregation gebeurtenissen in zoogdieren eicellen zijn frequent, met name tijdens MI. Deze technieken kunnen worden gebruikt om te beoordelen en karakteriseren van de effecten van verschillende mutaties of milieu posities tijdens de verschillende fasen van de oögenese. Aangezien er duidelijke verschillen zijn tussen de oögenese en spermatogenese, zijn de technieken beschreven binnen onschatbare waarde voor het vergroten van ons begrip van zoogdieren ooegenese en de seksueel dimorphic kenmerken van chromosoom en eiwit dynamiek tijdens de meiose .
Introduction
Tijdens de spermatogenese, zijn grote halfsynchrone golven van Meiotische kiemcellen snel en voortdurend bijgevuld in de testis bij het begin van de puberteit en volwassenheid1. In tegenstelling tot mannen, wordt meiose bij vrouwtjes geïnitieerd uitsluitend tijdens de foetale ontwikkeling. Na geboorte, eicellen blijven gearresteerd in een fase van de langdurige dictyate van de profase I met een intact germinal Vesikel (GV; nucleaire envelop) tot de puberteit. Bij het begin van de puberteit, een subset van eicellen worden cyclisch geselecteerd om het ondergaan van de groei en rijping, markering van de inleiding van Meiotische hervatting. Meiotische hervatting in volgroeide eicellen manifesteert zich door het verdwijnen van de GV in een proces dat bekend staat als germinal vesikel verdeling (GVBD). De oöcyt ondergaat vervolgens chromosoom condensatie en segregatie, gevolgd door polar lichaam extrusie. Eicellen op de progressie naar MII worden gearresteerd en worden gestimuleerd om te voltooien van de tweede en laatste Meiotische divisie alleen na de bevruchting.
Vrouwelijke vruchtbaarheid is sterk afhankelijk van het succes van Meiotische profase ik progressie. Sleutel tot dit is vorming van een fysieke koppeling tussen homologe chromosomen, bekend als de chiasmata, die wordt gemedieerd door reparatie van geïnduceerde DNA dubbele strand einden (DSBs) via crossover recombinatie2. Dit proces vindt plaats binnen de context van een dynamische eiwitrijke steiger bekend als het synaptonemal-complex (SC) die tussen homologe chromosomen vormt om hun synapsis3. De SC is een rits-achtige tripartiete structuur die bestaat uit twee parallelle laterale elementen met elkaar verbonden door regio Midden eiwitten die in het bezit van homologen samen gedurende de lopende DNA-herstel. Voorafgaand aan de synapsis vormen voorlopers van de laterale elementen, axiale elementen, genoemd tussen zuster chromatiden. Synaptonemal complex eiwitten zoals SYCP2 en SYCP3 vormen axiale elementen die colocalize aan de zuster-chromatide cohesie assen tijdens de vroege profase. Deze later dienen als bindend sites voor de dwarse gloeidraad eiwit, SYCP1, die centraal element vergadering en synapsis tussen de uitgelijnde homologen4vergemakkelijkt. In muis eicellen, wordt volledige synapsis aangegeven door de aanwezigheid van 20 volledig preparaten overlappende SYCP3 en SYCP1 stukken, die kunnen worden gevisualiseerd met behulp van chromatine verspreid. Synapsis is voltooid bij binnenkomst in de pachytene substage, waarbij de volwassen crossovers die bestemd zijn om te formulier chiasmata tussen homologen zijn versierd met mutL homolog (MLH1/3) Dimeren ter bevordering van hun nauwkeurige verwerking5,6 , 7. de structurele handhaving van de chromosomen (SMC) complexen, met inbegrip van cohesin, condensin en de SMC5/6 complex, zijn belangrijk voor de regulering van chromosoom dynamiek en structuur in de gehele meiose8,9, 10,11,12. Collectief, zorgen deze gebeurtenissen voor goede bi-richting van homologe chromosomen naar tegengestelde Polen van de spindel na demontage van de SC.
De Meiotische celcyclus is een krachtig model te onderzoeken van de rol van verschillende eiwitten in het genoom onderhoud als gevolg van de geprogrammeerde inductie en latere reparatie van DNA-DSBs. Zoogdieren meiose is bovendien ook een relevante model voor de studie van de epigenetische aanpassingen en inprenting13. Het is echter technisch moeilijk in te schatten van deze gebeurtenissen tijdens vrouwelijke meiose, die in de foetale en neonatale eierstokken bij zoogdieren (Figuur 1 plaatsvindt). Profase ik kan worden onderverdeeld in 5 substages: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema en dictyate. Hierin beschrijven we hoe u kunt isoleren en onderscheid maken tussen foetale en neonatale eierstokken en teelballen (Figuur 2). Aangepast van de eerder beschreven methoden, dit manuscript wordt ook uitgelegd welke een protocol (stap 1) met video demonstratie voor bereiding van vrouwelijke Meiotische profase ik chromatine verspreidt14,15,16,17 . Wanneer in combinatie met immunolabelling, zoals beschreven in stap 6-7, dit protocol maakt een gedetailleerde microscopische analyse van profase ik gebeurtenissen in eicellen.
Oögenese is foutgevoelig en chromosoom missegregation gebeurtenissen tijdens de eerste Meiotische verdeling vertegenwoordigen de meest voorkomende bron van genetische ziekte in nakomelingen18,19. In dit manuscript (protocol stap 2) beschrijven we een protocol waarin volwassen GV-geënsceneerde eicellen worden gewonnen uit primer eierstokken van volwassen vrouwelijke muizen. Ondersteunende voorwaarden ondergaan volgroeide eicellen luteïniserend hormoon-onafhankelijke hervatting van meiose na isolatie en cultuur20. Na de hervatting van het Meiotische, eicellen vooruitgang door middel van meiose I, dan arresteren op metafase II. Eicellen blijven gearresteerd op metafase II, tenzij bevrucht. In stap 2 – 5, passen we eerder gemeld protocollen met video demonstratie om te beschrijven hoe te verzamelen, cultuur en MI en MII eicellen voorbereiden chromatine verspreid preparaten21. Deze techniek verspreidt chromatine zorgt voor duidelijke immunolabelling van eiwitten die zijn gekoppeld aan de chromosomen. Bovendien, dit protocol kan ook worden gebruikt om te onderscheiden tussen bivalente en univalent chromosomen en één zus verder kan oplossen chromatiden ter vergemakkelijking van de beoordeling van de oöcyt ploïdie. Daarom, naast onthullend lokalisatie patronen van Meiotische eiwitten, dit protocol kan ook dienen als een instrument van onschatbare waarde voor het ophelderen van de mogelijke oorzaken van chromosoom missegregation tijdens MI en MII.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Johns Hopkins University. Experimenten werden uitgevoerd op wild-type C57BL/6J muizen.
1. het oogsten van foetale of neonatale eierstokken en voorbereiding van de profase chromatine verspreidt
- Om uit te pakken van de embryo's op 14,5 – 19.5 dagen opofferen post-coitum (dpc) de zwangere vrouwtjes via cervicale dislocatie of CO2 verstikking volgens IACUC richtlijnen.
Opmerking: voor postnatale dag die 1 – 5 eierstokken gaat u naar stap 1.3. Figuur 1 geeft een overzicht van de fasen van de Meiotische profase verrijkt op verschillende leeftijden van de embryonale en postnatale. - Open de holte van de abdominopelvic met behulp van steriele schaar, een V-vormige opening maken. Ontleden uit de maternale uteriene hoorn, scheiden van de embryo's van de placenta en embryo's Pipetteer in 35 mm petrischalen met 3 mL voorverwarmde 1 x fosfaat buffer zoutoplossing (PBS) bij 37 ° C.
Opmerking: Een fliptop incubator ingesteld bij 37 ° C kan worden gebruikt om temperatuur te houden. Daarnaast kan een temperatuur geregeld glas stadium ook worden gebruikt om temperatuur te houden tijdens de manipulatie van de eierstok. - Offeren met een 3,5 inch chirurgische schaar, embryo's of pups via onthoofding volgens IACUC richtlijnen. Onthoofde embryo's of pups in voorverwarmde PBS vóór verdere dissectie plaatsen.
- Ontleden van een embryo of pup op een moment in een aparte 35 mm petrischaal met 3 mL voorverwarmde PBS bij 37 ° C. Ga verder door te snijden langs de ventral midline van de achterste helft van het embryo, langs de voorste helft onder de voorpoten en direct boven de hind-ledematen en staart zoals aangegeven in figuur 2A-B.
- Open de buik met behulp van 3,5-inch chirurgische scharen. Met behulp van fine-tipped pincet verplaatsen of verwijderen van de lever en de lusjes van de darm, bloot de eierstokken in een petrischaal voor nieuwe 35 mm, met 3 mL voorverwarmde PBS bij 37 ° C (zie gids in figuur 2B). De eierstokken liggen direct onder en achter de nier naar de achterste muur van de peritoneale Holte (figuur 2B-C). Een gids voor het onderscheid tussen mannelijke en vrouwelijke geslachtsklieren wordt gegeven in figuur 2D.
Opmerking: Voor optimale omstandigheden, snel ontleden uit de eierstokken na zwangere vrouw wordt opgeofferd. - Verwijderen van beide eierstokken van elke vrouwelijke foetus met behulp van een paar van boete-tipped verlostang onder een dissectie toepassingsgebied en de plaats in een horloge glazen of aparte putten voor een multi goed plaat met 0,5 tot 1,0 mL voorverwarmde PBS en onderhouden bij 37 ° C.
- Elk paar van eierstokken plaats in 0,5 mL hypo-extractie buffer (17 mM Trinatriumcitraat citraat dihydraat, sacharose bevat 50 mM, 5 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 30 mM Tris-HCl, proteaseinhibitor, pH 8.2) in een schone horlogeglas of een klein putje van een 9-well plaat, ervoor zorgend om het onderdompelen van de eierstokken comp letely. Incubeer gedurende ten minste 15 minuten, maar niet meer dan 30 min.
Opmerking: Maak hypo-extractie buffer verse en gebruik binnen 2 uur van DTT toevoeging. - Tijdens de incubatie, met behulp van een hydrofobe barrière PAP pen, tekent u twee 22 x 22 mm2 vierkanten op een schone glas 25 x 75 mm2, 1 mm dik microscoopglaasje zoals weergegeven in figuur 3A.
Opmerking: Dia's kunnen tevoren bereid worden. - Pipetteer 45 – 50 µL van 100 mM sucrose op een schone dia en één paar eierstokken overbrengen in de druppel.
- Met behulp van de scherpe uiteinden van twee 27 G naalden, plagen de eierstokken uit elkaar om cellen in de sacharoseoplossing vrij te geven. Met een tang, verwijderen van grote stukken eierstok en zorgvuldig Pipetteer sacharoseoplossing cellen verspreiden.
- Plaats 40 µL van kleefpoeders oplossing (1% paraformaldehyde (PFA), 0,2% wasmiddel (Zie Tabel of Materials), pH 9.2) in elk vierkant van de voorbereide dia. Met een 200 µl pipette uiteinde, de kleefpoeders oplossing gelijkmatig verspreid over de dia oppervlak.
- Pipetteer 20 µL van de mix van sucrose op het elk plein van de dia met de fixeerspray.
Opmerking: Dit komt neer op het met behulp van een paar van eierstokken per dia. - Laat de dia's in een gesloten vochtige kamer 's nachts bij kamertemperatuur inwerken.
Opmerking: De incubatie van overnachting kan variëren rond (12-15 uur) bij kamertemperatuur. - Open het deksel van de kamer en laat de dia's volledig drogen.
- Wassen van de dia's in een pot van de Coplin met 50 mL 0,4% bevochtigingsmiddel-PBS oplossing (Zie Tabel of Materials) voor 2 min, droge lucht, en overgaan tot immunolabelling-protocol (stap 6).
Opmerking: Het mogelijk is om op te slaan van de dia's bij-80 ° C voor later gebruik, maar dit varieert afhankelijk van de proteïne van belang. Voor optimale resultaten onmiddellijk overgaan tot het immunolabelling-protocol (stap 6).
2. de metafase ik oöcyt collectie
- Het maximaliseren van het aantal follikelgroei follikels geïsoleerd van elke muis, intraperitoneally injecteren geslachtsrijpe Maagd vrouwelijke muizen met 5 IU van zwangere merrie serum gonadotrofinen (PMSG, ook bekend als paarden choriongonadotrofine (eCG)).
Opmerking: Voor optimale oöcyt opbrengst, muizen moeten 1 tot en met 3 maanden van leeftijd, zoals het aantal eicellen geoogst met de leeftijd dalen zal. Ter voorbereiding van PMSG, ontbinden fles van 5000 IU in 100 mL steriele PBS (5 U/0.1 mL) winkel in eenmalig gebruik aliquots van 600 µL bij-20 ° C. - Na 44-48 h, bereiden collectie medium, minimale essentiële middellange alpha (MEMα) medium aangevuld met 5% foetale runderserum (FBS) en 3 mg/mL bovien serumalbumine (BSA; MEMΑ/BSA/FBS). Steriliseren media door een filter van de porie 0,2 µm. Decanteren 2,5 mL van MEMα/BSA/FBS middellange in één glas schotel per muis en warme tot 37 ° C in een 5% CO2 incubator.
Opmerking: Andere collectie en voedingsbodems die commercieel beschikbaar zijn (M2 en M16) worden ook vaak gebruikt.
Let op: Wij raden cultuur gerechten uit de 5% CO2 incubator een tegelijk voor beperkte duur om te minimaliseren van omgevingslucht blootstelling tijdens manipulatie stappen verwijderen. - Offeren de muizen via cervicale dislocatie of CO2 verstikking volgens IACUC richtlijnen.
- Open de holte van de abdominopelvic met behulp van steriele schaar, maken een grote V-vormige opening. Met behulp van Tang, verdringen darmen naar het hoofd van de muis. Zoek elke baarmoeder hoorn; de eierstokken zijn presenteren proximale aan de ribbenkast. Houd het oviduct met fijne pincet en snijd de dikke superior tot de eierstok met behulp van de dissectie schaar (Figuur 4). Blijven de oviduct houd, en met een andere set van fijn verlostang release het vruchtbeginsel van de slijmbeurs en de plaats in collectie schotel met MEMα/BSA/FBS medium.
Opmerking: Net als in stap 1 is het noodzakelijk om te houden van de eierstokken bij 37 ° C en zorg ervoor dat u 5% CO2. Een fliptop incubator vastgehaakt aan 5% CO2 mix kan worden gebruikt om te zorgen voor optimaal onderhoud van temperatuur en CO2 niveaus. Daarnaast moet een temperatuur geregeld glas stadium ook worden gebruikt om temperatuur te houden tijdens de oöcyt manipulatie. - Cumulus oöcyt complexen met behulp van een injectiespuit 1 mL met een 27-gauge naald (of vergelijkbare grootte), vrijgeven door de grote follikelgroei follikels handmatig te prikken.
- Met inachtneming van door een Microscoop dissectie, verzamelen GV-geënsceneerde eicellen met capillaire, een mond bediende glazen pipet of met een handbediende micrometer-spuit (Figuur 5). Alleen ophalen eicellen die zijn uitgebracht follikelgroei follikels. GV eicellen hebben een diameter van ongeveer 90 GV eicellen µm. kan worden omringd door 2-3 lagen van granulosa cellen, en hebben een totale diameter van ongeveer 200 µm.
- Cultuur van de eicellen in een schone horlogeglas of een 9-well plaat met MEMα/BSA/FBS medium voor 6 h te bereiken metafase ik bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator.
- Ga verder met stap 4.
3. de metafase-II (MII) oöcyt collectie
- Maximaliseren van oöcyten geïsoleerd van elke muis, intraperitoneally injecteren geslachtsrijpe Maagd vrouwelijke muizen met 5 IU van PMSG. Na 44-48 h, intraperitoneally injecteren met 5 IU van humaan choriongonadotrofine (hCG).
Opmerking: Voor optimale oöcyt opbrengst, muizen moeten 1 tot en met 3 maanden van leeftijd, zoals het aantal eicellen geoogst met de leeftijd dalen zal. Ter voorbereiding van hCG, het ontbinden van een fles van 10.000 U in 200 mL PBS (5 mL van de U/0.1). Opslaan in eenmalig gebruik aliquots van 600 µL bij-20 ° C. - Na 12-14 uur, door MEMα/BSA/FBS collectie medium, te bereiden zoals beschreven in stap 2.2, hierboven.
- Offeren de muizen via cervicale dislocatie of CO2 verstikking volgens IACUC richtlijnen.
- Open de holte van de abdominopelvic met behulp van steriele schaar, maken een grote V-vormige opening. Met behulp van Tang, verdringen darmen naar het hoofd van de muis. Zoek elke baarmoeder hoorn, de eierstokken zijn presenteren proximale aan de ribbenkast. Houd het oviduct met fijne pincet en snijd de dikke superior tot de eierstok met behulp van de dissectie schaar (Figuur 4). Daarna verwijderen van de eierstok en oviduct en plaats in de collectie schotel met MEMα/BSA/FBS medium.
Opmerking: Net als in stap 1 en 2 is het noodzakelijk om te houden van de eierstokken bij 37 ° C en zorg ervoor dat u 5% CO2. Een fliptop incubator vastgehaakt aan 5% CO2 mix kan worden gebruikt om te zorgen voor optimaal onderhoud van temperatuur en CO2 niveaus. Daarnaast moet een temperatuur geregeld glas stadium ook worden gebruikt om temperatuur te houden tijdens de oöcyt manipulatie. - Met behulp van een spuit van 1 mL met een 27 G (of een vergelijkbare grootte) of scherpe pincet, een gat in de Papil van het oviduct vrij de MII eicellen te scheuren.
Opmerking: Wees voorzichtig niet te beschadigen de eicellen in de ampul. De ampul verschijnt gezwollen en doorschijnende zodanig dat de eicellen zichtbaar (Figuur 4 zijn). - Oogst MII eicellen van de Papil van het oviduct in een nieuwe schotel met collectie medium met een mond bediende glazen pipet of capillaire, met een hand bediende micrometer-spuit (Figuur 5).
- Ga verder met stap 4.
4. oöcyt leegvissen en Zona zitten verwijdering
- Bereiden 300 IU/mL hyaluronidase in MEMα medium aangevuld met 3 mg/mL, BSA denude eicellen van omringende cumulus cellen (2,5 mL/muis) in een horlogeglas, en blijven bij 37 ° C, 5% CO2.
Opmerking: Hyaluronidase werkzaamheid sterk vermindert na 1 h van voorbereiding. Voor MII eicellen is hyaluronidase behandeling niet vereist. - Bloot oöcyt-cumulus cel complexen tot 300 IU/mL van hyaluronidase in MEMα/BSA gedurende 3 minuten aan denude eicellen van de omringende cellen van cumulus.
Let op: Overschrijd niet 3 min blootstelling aan hyaluronidase, zoals het beschadigt de eicellen. - Wassen van de eicellen, eicellen overbrengen in een vers opgewarmd MEMα/BSA middellange schotel. Met behulp van een kleine mond bediende glazen pipet of capillaire (iets groter dan de diameter van de oöcyt, die ongeveer 90 µm), de complexen Pipetteer omhoog en omlaag als u wilt volledig loskoppelen van de cumulus cellen. Toestaan dat de eicellen te herstellen in de incubator terwijl de voorbereiding van de volgende stap.
- Warme zure Tyrode oplossing, MEMα/BSA en Waymouth de media tot 37 ° C (500 µL/muis). Plaats 300 µL in elk putje van kleine 9-well glasplaten.
- Pipetteer 5-10 eicellen in Tyrode de oplossing als u wilt verwijderen van de zona zitten (ZP). Bloot de eicellen voor slechts 30-45 s aan de oplossing.
Opmerking: Te weinig blootstelling aan de oplossing zal niet de ZP volledig verwijderen, die zal voorkomen dat de eicellen barsten en chromosomen zich verder verspreidt. Teveel blootstelling zal beschadigen en doden van de oöcyt. Kijken naar het ZP Los onder de Microscoop dissectie kan helpen in het optimaliseren van de blootstellingstijd.
Let op: Het gebruik van verse Tyrode de oplossing is kritisch, naarmate de functie met de leeftijd afneemt. Gebruik een verse putje van Tyrode de oplossing voor elke groep van eicellen behandeld om uniforme vertering van de ZP. - Wassen onmiddellijk na verwijdering van de ZP, de eicellen door de overdracht in verwarmde MEMα/BSA/FBS medium. Herhaal deze stap wassen.
Opmerking: Wees voorzichtig bij het overbrengen, zoals eicellen gemakkelijk aan elkaar plakken zal en aan de glazen pipet of capillaire volgende verwijdering van het ZP. Vooraf bevochtigen de glazen pipet of viscometerbuizen in hun Waymouth van medium zal het minimaliseren van oöcyten steken samen. - Overdracht en laat de eicellen te herstellen gedurende 30 minuten in de Waymouth medium bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator.
- Ga verder met stap 5.
5. MI en MII oöcyt chromatine Spreads
- Met behulp van een pen van de PAP, een rechthoek 11 x 44 mm2 op het glasplaatje zoals weergegeven in figuur 6A.
- Jas van de dia met een dunne laag fixeer (1% paraformaldehyde, 0,2% Triton-X 100 H2O, pH 9.2) door pipetteren 100 µL van fixeerspray op de dia en de dia heen en weer schommelen. Tik op de dia om zich te ontdoen van overtollige fixeerspray.
- Tussen 5-10 eicellen met een kleine mond Pipetteer naald met als weinig media mogelijk halen en sleep de naald in een lijn over de dia fixeerspray beklede tijdens het storten van de eicellen vanaf 1 cm boven de dia in de kleefpoeders oplossing. Voer deze stap met behulp van een Microscoop dissectie om ervoor te zorgen dat de eicellen zijn nedergelegd en dat hebben ze barsten.
Opmerking: De eicellen moeten onmiddellijk barstte op de dia. De hoogte waarop de eicellen zijn gedeponeerd effect de mate van de chromatine verspreiden. Zie representatieve resultaten in Figuur 6 voor meer informatie. - Incubeer dia's bij kamertemperatuur in een gesloten bevochtigde kamer 's nachts om de chromatine te houden.
- Laat de dia's volledig drogen en spoel van dia's in een pot van de Coplin met 50 mL 0,4% bevochtigingsmiddel-H2O, pH 8,0.
- Ga verder met stap 6.
6. Immunolabelling
- Bereiden de antilichaam verdunning buffer (ADB) beschreven in tabel 1.
- Bereiden van twee Coplin potten met 50 mL wassen (WB) bufferoplossing (10% ADB verdund in PBS), en één Coplin jar met 50 mL WB en 0,05% schoonmaakmiddel (b.v.250 µL van 10% wasmiddel toevoegen aan 50 mL WB).
- Wassen van de dia's die werden opgesteld in sectie 1 en 5 van dit protocol gedurende 10 minuten in een Coplin pot met 50 mL WB.
Let op: Laat niet de dia's drogen op elk gewenst moment tijdens de immunolabelling. - Wassen van de dia's gedurende 10 minuten in de Coplin jar met 50 mL WB en 0,05% schoonmaakmiddel. Vervolgens wassen de dia's in de resterende Coplin jar met 50 mL WB oplossing voor 10 min.
- Tik uit overtollige vloeistof en dekking dia met 100 µL van geselecteerde primaire antilichamen verdund in ADB. Incubeer bij 4 ° C's nachts in een gesloten vochtige kamer.
Opmerking: Incubatie kan worden verkort tot 2 tot 3 uur bij 37 ° C. Gebruik kleinere volumes van antilichaam (b.v., 50 µL) door die betrekking hebben op de dia met een dekglaasje aan of parafilm. - Spoel de dia's in een pot van de Coplin met 50 mL 0,2% bevochtigingsmiddel-PBS oplossing, pH 8,0.
- Herhaal stap 6.2 tot 6.5.
- Tik uit overtollige vloeistof en dekking dia met 100 µL van geselecteerde secundaire antilichamen verdund in ADB. Incubeer de dia's 1 tot en met 2 uur bij 37 ° C in een gesloten vochtige kamer.
- Dia's 2 keer gedurende 10 minuten in Coplin potten met 50 mL 0,2% bevochtigingsmiddel-PBS oplossing, pH 8,0 wassen.
- Dia's 2 keer gedurende 5 min. in potten van de Coplin met 50 mL 0,2% bevochtigingsmiddel-H2O-oplossing, pH 8,0 wassen.
7. montage dia 's
- Voor profase chromatine spreads bereid in stap 2, voeg 100 µL van montage medium met 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1.5µg / mL). Voor MI en MII chromatine bereid in stap 5 verspreidt, voeg 50 µL van montage medium met DAPI (1.5µg / mL). Zachtjes vlek weg overtollige vocht.
- Plaats een dekglaasje 22 mm x 60 mm aan op bovenkant en verzegel met duidelijke nagellak. Bewaren in een dia doos bij 4 ° C of -20 ° C tot beoordeling via fluorescentie microscopie.
Opmerking: Kraan licht op cover slip te ontdoen van overtollige montage medium voor afdichting met nagellak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wij hebben twee technieken voor het visualiseren en beoordeling van Meiotische chromosomen in eicellen beschreven. De eerste techniek wordt verzorgd naar profase progressie in embryonale en neonatale eierstokken te beoordelen. Profase chromatine verspreiding preparaten zijn ongelooflijk waardevol voor het visualiseren van tal van dynamische processen tijdens meiose, met inbegrip van de chromosomen in paren rangschikken, synapsis en desynapsis, homologe recombinatie, en epigenetische chromosoom remodeling. Hier, we hebben aangetoond dat het nut van deze methode voor robuuste visualisatie en kwantitatieve analyse van crossover vorming in eicellen geoogst uit C57BL/6J embryo's (figuur 3B en 3 C). Om te verrijken voor cellen in de pachytene substage, zijn muis embryo's bij 18.5 dpc (Figuur 1) opgehaald. Twee belangrijke kenmerken van de substage van de pachytene van de profase I zijn de voltooiingvan synapsis tussen homologen, en de vorming van ten minste één MLH1/3-positieve crossover per homolog paar. Volledige synapsis tussen homologen manifesteert zich door de aanwezigheid van 20 overlappende SYCP3 en SYCP1 strekt zich uit. Te karakteriseren crossover vorming in wild-type eicellen we immunolabeled profase chromatine verspreid preparaten met behulp van antilichamen die sporen van SYCP3, SYCP1 en MLH1, en DNA met behulp van de DAPI gekleurd. Figuur 3B beeldt een representatief beeld van een pachytene stadium oöcyt, die uit de aanwezigheid van 27 MLH1 foci verdeeld langs 20 volledig geassembleerd SC structuren blijkt. Het gemiddelde aantal MLH1-positieve crossovers aangetroffen in wild-type eicellen was 24 ±3 (Figuur 3 C, N = 15 eicellen). Figuur 3D geeft SMC6 op de pericentromeric heterochromatin (PCH) regio en langs de armen chromosoom verrijkt en MLH1 foci verspreid langs de SC pachytene stadium. Figuur 3E beeldt een pachytene geënsceneerd oöcyt waar de verspreiding van de chromosoompreparaten was suboptimaal en afzonderlijke chromosomen zijn te onderscheiden, voorkomen van accurate beoordeling van SYCP3, SMC6 en MLH1. Sub-optimale chromosoom spreads kunnen worden waargenomen wanneer incubatie van de eierstokken in hypo-extractie buffer is te lang of niet voor lang genoeg.
De tweede techniek beschreven kan worden gebruikt ter beoordeling van de chromatine morfologie in eicellen na Meiotische hervatting (figuur 6B-D). Eiwit lokalisatie, evenals ploïdie, kan gemakkelijk worden beoordeeld, mogelijke oorzaken van chromosoom segregatie fouten bloot. Figuur 6B beeldt een MI oöcyt tonen 20 chromosomen en duidelijke centromeer en pericentromeric heterochromatin kleuring. Figuur 6 c is een ingezoomde afbeelding waar topoisomerase IIα (TOPOII) langs de armen chromosoom en de PCH kan worden gezien. Figuur 6D toont een MII oöcyt waar gepaarde zuster chromatiden kunnen worden onderscheiden door chromosoom en centromeer morfologie. Veelvoorkomende fouten gezien wanneer het proberen van deze techniek bevatten eicellen niet barsten wanneer vrijgegeven op de dia PFA beklede, evenals chromosomen verspreiding te ver uit elkaar (figuur 6E–F). Als de ZP is niet volledig verwijderd, blijft de chromosomen gekoppeld aan het klosje, zijn zoals aangegeven in Figuur 6 sexies. Als de eicellen te hoog uit de PFA beklede dia worden verwijderd, kunnen de chromosomen te ver uit elkaar zoals afgebeeld in figuur 6Fworden gespreid.
Figuur 1: Meiotische profase tijdlijn tijdens vrouwelijke embryonale en neonatale ontwikkeling. Blauwe contouren aangeven populaties van specifieke profase sub fase kiemcellen (leptotene, zygotene, pachytene en diplotene/dictyate fasen) waargenomen tijdens de embryonale en neonatale ontwikkeling. Verhoging van donker blauwe kleur geeft aan het tijdstip waarop de specifieke profase sub fase meer overvloedig wordt. Dit cijfer werd aangepast van referentie2. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: eierstok extractie van embryo's en neonatale vrouwelijke pups. (A, B) De eerste snede (1) worden boven de voorpoten het embryo op het kruispunt van de hoofd/nek onmiddellijk na het ophalen van de maternale uteriene hoorn onthoofden. De tweede snede (2) gebeurt langs de ventral midline van de achterste helft van het embryo, gevolgd door insnijdingen langs de voorste helft onder de voorpoten (3). Een eindmontage is gemaakt voor het verwijderen van de achterste ledematen en de staart (4). (A) frontale mening schematische voorstelling van dissectie bezuinigingen voor isolatie van de eierstokken van vrouwelijke pups. (B) kant weergave schematische voorstelling van dissectie bezuinigingen voor isolatie van eierstokken met relatieve posities van de inwendige organen. Regio's die worden weergegeven in licht rode omvatten de lever en de darmen, die tijdens de dissectie worden verwijderd. De dorsale muur en bijbehorende organen staan in licht blauw. Dit gebied omvat de eierstokken, die zijn gekoppeld aan de inferieure Polen van de nieren aan de bovenkant van de baarmoeder-hoorn. (C) schematische Budva dorsale muur van embryo na verwijdering van de lever en de darmen. (D) schematische weergave van morfologische verschillen tussen mannelijke en vrouwelijke geslachtsklieren op ongeveer 15-18 dpc. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: vertegenwoordiger profase chromatine verspreid preparaten. (A) glazen schuif schema voor profase chromatine verspreid preparaten. Zwarte vierkante contouren vertegenwoordigen vloeibare blocker pen omtrekken. (B, C) Representatieve beelden en kwantificering van crossover vorming in wild-type pachytene stadium eicellen met behulp van de profase chromatine verspreid bereidingswijzen beschreven in stap 1. (B) chromatine spreads werden uitgevoerd met behulp van eierstokken fromC57BL/6J muis embryo's geïsoleerd op 18.5 dpc. Chromatine spreads waren immunolabeled met antistoffen tegen het eiwit laterale element SC SYCP3 (rood), en de SC centraal element eiwit SYCP1 (magenta), MLH1 (groen, crossover gebeurtenis marker) en DAPI (blauw, DNA). Schaal bar = 10 µm. (C) Dot perceel van MLH1 foci verspreid telt 15 pachytene stadium chromatine verkregen preparaten. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie. (D, E) vergelijking van optimale (D) en sub-optimale (E) profase verspreid preparaten, respectievelijk. Chromatine spreads waren immunolabeled met antilichamen tegen SMC6 (rood), MLH1 (groen), en SYCP3 (blauw). Schaal bar = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: schema van volwassen ovarium. Dit diagram toont de anatomie van de volwassen muis eierstok, oviduct, ampul en baarmoeder. Muis eierstokken moeten worden verwijderd door zorgvuldige insnijding van ligamenten de eierstokken verbinden met de inferieure Polen van de nieren, en de achterste muur van de buik. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: afbeeldingen van mond bediende glazen pipet, glazen viscometerbuizen en handbediende micrometer-spuit gebruikt voor de manipulatie van de oöcyt. (A) de glazen pipet oöcyt manipulator bestaat uit de volgende onderdelen in volgorde: mondstuk, latex buis (3.2 mm binnendiameter (ID) x 6,4 mm buitendiameter (OD)), 1 mL pipet uiteinde, latex buis (6,4 mm ID x 11.1 mm OD) en glazen pipet van Pasteur. Het einde van de glazen pipet van Pasteur is verwarmd boven een vlam en uiteindelijk trok naar het maken van een schone-tipped einde (figuur 5A1). (B) de glazen capillaire oöcyt manipulator bestaat uit de volgende onderdelen in volgorde: mondstuk, 0,45 µm filter (optioneel), latex buis (3.2 mm ID x 6,4 mm OD), 1 mL pipet uiteinde, latex buis (6,4 mm ID x 11.1 mm OD) en 70 µl glazen viscometerbuizen. De glazen capillaire buisjes zijn verwarmd boven een vuur in het midden en trok in tegengestelde richtingen maken twee haarvaten met fijne omver te werpen uiteinden (figuur 5B1). (C) de handbediende micrometer-spuit bestaat uit de volgende onderdelen in volgorde: Mitutoyo 150-208 micrometer hoofd (midden grootte, 0-1 "variëren, 0,001" afstuderen), 5 mL spuit, latex buis (3.2 mm ID x 6,4 mm OD), 1 mL pipet tip, latex tubing (6,4 mm ID x 11.1 mm OD), 1 mL pipet tip en een 83 x 0,5 mm2 gel laden tip. Het hoofd van de 150-208 micrometer Mitutoyo wordt stevig in de spuit 5 mL (figuur 5C1) ingevoegd. Om ervoor te zorgen dat de gel laden tip is vastgemaakt veilig, de aansluitende 1 mL Pipet is tip (figuur 5C2) knippen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: vertegenwoordiger metafase I en II oöcyt chromatine verspreid preparaten. (A) Slide schematische voor metafase I en II oöcyt chromatine verspreiding preparaten. Eicellen (cirkels) vrijgegeven via de mond bediende glazen pipet of viscometerbuizen in een rechte lijn (naar aanleiding van de pijl). Overzicht van de zwarte rechthoek voorstelt vloeibare blocker pen omtrek. (B, C) Optimale-metafase ik chromatine verspreid voorbereiding. Metafase ik chromosomen werden gekleurd met DAPI (blauw, DNA), en immunolabeled voor CEN (groen, kinetochoor/centromeer marker). Schaal bars = 10 µm. (B) antilichamen tegen Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20) werden gebruikt voor het etiketteren van pericentromeric heterochromatin (PCH). (C) antilichamen tegen Topoisomerase IIα (TOPOII) werden gebruikt om de label van de PCH en chromosoom assen. (D) optimale-metafase II chromatine verspreid voorbereiding. Metafase II chromosomen werden gekleurd met DAPI (blauw, DNA), en immunolabeled voor CEN (groen) en Histone H4 (di-methyl K20, tri-methyl K20) op het etiket van de PCH. Schaal bar: 10µm. (E, F) slechte metafase ik chromatine verspreid preparaten. Chromosomen werden gekleurd met DAPI (blauw, DNA), en immunolabeled voor CEN (groen) en de Meiotische cohesin component, REC8. Schaal bars = 10 µm (E) een oöcyt dat niet na vrijlating op dia PFA-gecoat barsten deed. (F) chromosomen die te ver uit elkaar waren verspreid. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Item | Bedrag | Eindconcentratie |
| 1 x PBS | 50 mL | 1 x |
| BSA | 1,5 g | 3% (m/v) |
| Paard Serum | 5 mL | 10% (v/v) |
| 10% wasmiddel (Zie Tabel van materialen) in PBS |
250 ΜL | 0,05% (v/v) |
Tabel 1: Recept van de buffer (ADB) van de verdunning van antilichaam. ADB bewaren bij 4 ° C of bij-20 ° C aanwezige voorraden bevriezen als het maken van grotere hoeveelheden. ADB besmet kunt raken, dus zorg ervoor dat goede aseptische technieken worden gebruikt en de oplossing voor besmetting vóór elk gebruik beoordelen. Kleinere hoeveelheden van ADB kunnen ook bereid worden om te minimaliseren van verontreiniging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Chromatine verspreiding preparaten kunnen onderzoekers chronologisch studeren vrouwelijke zoogdieren meiose en de dynamische lokalisatie van eiwitten die betrokken zijn. De embryonale en neonatale chromatine spreads zorgen voor nauwe analyse van de gebeurtenissen in de gehele Meiotische profase. Metafase I en II metafase chromatine spreads kunnen worden gebruikt om te onderscheiden van één zuster chromatiden van gepaarde zusters en gepaarde homologe chromosomen, evenals ploïdie beoordelen. Ter vergelijking: het protocol hier beschreven kan nuttig zijn in vergelijking met hele oöcyt immunolabelling, die vaak produceert hoge niveaus van achtergrond signaal dat de resolutie van chromatine-gebonden eiwitten vermindert. Bovendien vertegenwoordigen de chromatine verspreiding technieken een aantrekkelijk alternatief voor levende cellen imaging, waarvoor een grote investering van tijd en gespecialiseerde apparatuur.
Embryonale en neonatale eierstokken kunnen moeilijk te vinden en te halen. Het is raadzaam om zorgvuldig uitpakken van alle andere organen en materiaal naast de nieren in een aparte schaal met PBS voordat op zoek naar de eierstokken, en met behulp van een verse schotel van PBS voor elk embryo/pup (figuur 2B). Als de embryo/pup mannelijk is, zullen de testis te onderscheiden door de zaadvormende vorming, evenals de locatie van de geslachtsklieren (figuur 2D). Als mannelijke embryo's ontwikkelen, zullen de testikels naar de penis, steeds grotere ovale afdalen.
De oöcyt chromatine verspreid techniek vereist beheersing van de oöcyt verzamelen en manipuleren met behulp van mond bediende glazen pipet of capillair. Het is raadzaam het beoefenen van de mond pipet beheersen alvorens dit protocol uit te voeren. Trekken van de juiste maat glazen pipet/viscometerbuizen voor collectie en leegvissen van oöcyten zal kans op succes en efficiëntie toenemen door het minimaliseren van de tijd eicellen buiten de incubator ook zoals in de Tyrode de oplossing zijn. Correcte timing voor ZP verwijdering is uiterst belangrijk voor het welslagen van deze methode. Als de eicellen worden ge¨ uncubeerd in Tyrode de oplossing een onvoldoende hoeveelheid tijd, zal de ZP niet volledig verwijderd worden. Hiermee voorkomt u dat de eicellen efficiënt uiteenspatten op de dia, zoals te zien is in Figuur 6 sexies. Echter als de eicellen worden geïncubeerd in Tyrode de oplossing te lang, oöcyt kwaliteit en downstream immunofluorescentie kleuring zal worden ernstig gecompromitteerd. Het is raadzaam de eicellen onder een microscoop om te bepalen van het exacte tijdstip de ZP in Tyrode de oplossing oplost te kijken. Slechts 5-10 eicellen tegelijk aan Tyrode de oplossing toe te voegen zal het minimaliseren van overmatige blootstelling. Als de eicellen te hoog boven de PFA beklede dia worden vrijgegeven, kunnen de chromosomen te ver uit elkaar (figuur 6F) worden verspreid. Optimale resultaten zijn gevonden toen eicellen 1 cm boven de dia zijn vrijgegeven. Andere factoren die de resultaten kunnen belemmeren zijn langdurige blootstelling aan lagere CO2 niveaus in de lucht tijdens de oöcyt manipulatie stappen. Hierdoor pH schommelingen in de media die schadelijk voor de kwaliteit van de oöcyt zijn en is herkenbaar door progressieve kleurverandering van de media van de oranje-rood tot roze. De buffercapaciteit van de media ook vermindert na verloop van tijd; we raden daarom niet met behulp van de media die is opgeslagen (4 ° C) voor langer dan 1 week. M2 medium, dat geen CO2 vereist te worden gebufferd, wordt vaak gebruikt als een alternatief.
Een beperking aan de voorbereiding van de chromatine verspreid is het ontbreken van visualisatie van de chromatine binnen de oorspronkelijke context van de cel. Celmateriaal buiten de kern niet kan worden gevisualiseerd en spindel vorming kan niet worden beoordeeld. Daarom kunnen andere methoden worden gebruikt ter beoordeling van de oögenese naast chromatine spreads, zoals hele oöcyt immunolabelling na de monastrol behandeling, die de bi-polaire spindel in een mono-polaire spindel22 stort. Hierdoor zuster chromatiden worden beoordeeld in het kader van de cel. Collectief, kunnen de hier beschreven methoden van de chromatine verspreid gemakkelijk worden toegepast om te beoordelen van de chromatine morfologie en chromosoom ploïdie hele ooegenese in Roman transgene en mutant Muismodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door NIGMS (R01GM11755) te P.W.J en door een opleiding subsidie fellowship van het National Cancer Institute (NIH) (CA009110), G.H. en J.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Quality Biological | 119-069-161 | |
| 60 mm x 15 mm petri dishes | Denville | T1106 | |
| 35mm x 12mm petri dishes | Denville | T1103 | |
| Fine forceps | VWR | 300-050 | |
| Micro dissection scissors | Ted Pella | 1340 | |
| Dissecting scissors, sharp tip, 41/2" | VWR | 82027-578 | |
| Watch glass square 1 5/8 | Carolina Biological Supply Company | 742300 | Autoclave before each use |
| Sucrose | Sigma | S8501 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Sigma | S1804 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 646563 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| 50x Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in) | Becton, Dickinson (BD) | 309623 | |
| Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick) | Thermo | 3063-002 | |
| Super PAP pen, large (liquid blocker) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| 16% Paraformaldehyde aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Detergent in manuscript |
| Immuno stain moisture chamber | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Coplin jars | Fisher | 08-815 | |
| Photo-flo 200 | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 74257 | Wetting agent in manuscript |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | G4877 | Store aliquots at -20C |
| Human chorionic gonadotropin (HCG) | Sigma | C0434 | Store aliquots at -20C |
| PYREX Spot Plates with nine concave cavities | Fisher | 13-748B | Autoclave before each use |
| Glass capillary | Fisher | 22260943 | For making oocyte collection needles |
| Brand Parafilm M | Sigma | BR701501 | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5B | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5D | For making oocyte collection needles |
| Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing | Sigma | A5177-5EA | For making oocyte collection needles |
| Mitutoyo micrometer head | Mituoyo | 150-208 | For making oocyte collection needles |
| Syringe 5 mL | BD Biosciences | 309646 | For making oocyte collection needles |
| Syringe filter 0.45 μm filter | Corning | 431220 | For making oocyte collection needles |
| Glass Pasteur Pipette 5 3/4" | Fisher | 13-678-6A | For making oocyte collection needles |
| 83 x 0.5 mm pipette tip | Denville | P3080 | For making oocyte collection needles |
| α-MEM | Invitrogen | 11415049 | |
| Waymouth's media | Life Technologies | 11220035 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | A3160602 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3311 | For oocyte culture media |
| 500ml filter units 0.22um | Denville | F5227 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Tyrode’s solution | Sigma | T1788 | Store aliquots at -20C |
| Horse serum | Sigma | H-1270 | For ADB/wash buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A1470 | For ADB/wash buffer |
| VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope cover slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear nail polish | Amazon | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Mouse anti-MLH1 | Life Technologies | MA5-15431 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti-SYCP1 | Life Technologies | PA1-16763 | Dilution factor- 1:1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | Dilution factor- 1:50 |
| Human anti-centromere protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti- TOPOII | Abcam | ab109524 | Dilution factor- 1:100 |
| Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20) | Abcam | ab78517 | Dilution factor- 1:500 |
| Rabbit anti-Rec8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | Dilution factor- 1:10,000 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11057 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-21202 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-31573 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11004 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo-Fisher Scientific | A-11013 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11011 | Dilution factor- 1:500 |
References
- Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
- Keeney, S. Spo11 and the Formation of DNA Double-Strand Breaks in Meiosis. Genome Dyn Stab. 2, 81-123 (2008).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), (2015).
- Vries, F. A., et al. Mouse Sycp1 functions in synaptonemal complex assembly, meiotic recombination, and XY body formation. Genes Dev. 19 (11), 1376-1389 (2005).
- Baker, S. M., et al. Involvement of mouse Mlh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13 (3), 336-342 (1996).
- Lipkin, S. M., et al. Meiotic arrest and aneuploidy in MLH3-deficient mice. Nat Genet. 31 (4), 385-390 (2002).
- Kolas, N. K., et al. Localization of MMR proteins on meiotic chromosomes in mice indicates distinct functions during prophase I. J Cell Biol. 171 (3), 447-458 (2005).
- Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS Journal. 282 (13), 2426-2443 (2015).
- Lee, J. Roles of Cohesin and Condensin in Chromosome Dynamics During Mammalian Meiosis. J. Reprod Dev. 59 (5), 431-436 (2013).
- Verver, D. E., Hwang, G. H., Jordan, P. W., Hamer, G. Resolving complex chromosome structures during meiosis: versatile deployment of Smc5/6. Chromosoma. 125 (1), 15-27 (2016).
- Hopkins, J., et al. Meiosis-specific cohesin component, Stag3 is essential for maintaining centromere chromatid cohesion, and required for DNA repair and synapsis between homologous chromosomes. PLoS Genet. 10 (7), e1004413 (2014).
- Hwang, G., et al. SMC5/6 is required for the formation of segregation-competent bivalent chromosomes during meiosis I in mouse oocytes. Development. 144 (9), 1648-1660 (2017).
- Kota, S. K., Feil, R. Epigenetic transitions in germ cell development and meiosis. Dev Cell. 19 (5), 675-686 (2010).
- Taketo, T. Microspread ovarian cell preparations for the analysis of meiotic prophase progression in oocytes with improved recovery by cytospin centrifugation. Methods Mol Biol. 825 (1), 173-181 (2012).
- Sun, X., Cohen, P. E. Studying recombination in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 1-18 (2013).
- Kim, J. H., Ishiguro, K., Kudo, N., Watanabe, Y. Studying meiosis-specific cohesins in mouse embryonic oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 47-57 (2013).
- Susiarjo, M., Rubio, C., Hunt, P. Analyzing mammalian female meiosis. Methods Mol Biol. 558, 339-354 (2009).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Hum Mol Genet. 16, R203-R208 (2007).
- Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs In vivo and In vitro: I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
- Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 203-212 (2013).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
