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Genetics

क्रोमेटिन के लिए माउस Oocyte प्रगति के विश्लेषण के लिए प्रसार की तैयारी Metaphase द्वितीय के लिए चरण से

Published: February 26, 2018 doi: 10.3791/56736
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health
* These authors contributed equally

Summary

स्तनधारियों में Oogenesis के लिए त्रुटि प्रवण, विशेष रूप से गुणसूत्र अलगाव की वजह से जाना जाता है । इस पांडुलिपि का वर्णन क्रोमेटिन माउस चरण के लिए प्रसार तैयारी विधियों, metaphase मैं और द्वितीय मंचन अंडाणुओं । इन मौलिक तकनीक स्तनधारी oogenesis भर में क्रोमेटिन-बाउंड प्रोटीन और गुणसूत्र आकृति विज्ञान के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं ।

Abstract

क्रोमेटिन प्रसार तकनीक व्यापक रूप से gametogenesis के दौरान विभिन्न प्रोटीन के गतिशील स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, विशेष रूप से शुक्राणुजनन के लिए. इन तकनीकों जैसे मुताबिक़ गुणसूत्र बाँधना, synapsis और डीएनए की मरंमत के रूप में meiotic घटनाओं के दौरान प्रोटीन और डीएनए स्थानीयकरण पैटर्न के दृश्य के लिए अनुमति देते हैं । जबकि साहित्य में कुछ प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, स्तनधारी दौर अंडाणुओं का उपयोग कर सामान्य क्रोमेटिन प्रसार तकनीक सीमित हैं और भ्रूण अंडाशय में अर्धसूत्रीविभाजन दीक्षा के समय के कारण मुश्किल. इसकी तुलना में, चरण spermatocytes microdissection के लिए आवश्यकता के बिना उच्च पैदावार के साथ किशोर पुरुष चूहों से एकत्र किया जा सकता है । तथापि, यह किशोर और वयस्क वृषण में meiotic और पोस्ट-meiotic रोगाणु कोशिका आबादी के विविधता के कारण विशिष्ट चरणों में कोशिकाओं की एक शुद्ध सिंक्रनाइज़ जनसंख्या प्राप्त करने के लिए मुश्किल है । अर्धसूत्रीविभाजन के बाद के चरणों के लिए, यह अर्धसूत्रीविभाजन मैं (MI) या अर्धसूत्रीविभाजन द्वितीय (मिि) अंडाणुओं दौर से गुजर के आकलन करने के लिए लाभप्रद है, क्योंकि परिपक्व अंडाणुओं के समूहों वयस्क मादा चूहों से एकत्र किया जा सकता है और संस्कृति में अर्धसूत्रीविभाजन फिर से शुरू करने के लिए उत्तेजित । यहां, भ्रूण, नवजात और वयस्क अंडाशय से विच्छेदित अंडाणुओं का उपयोग कर meiotic क्रोमेटिन प्रसार की तैयारी के लिए तरीके साथ वीडियो प्रदर्शनों के साथ वर्णित हैं । स्तनधारी अंडाणुओं गुणसूत्र अलगाव की घटनाओं में लगातार कर रहे हैं, विशेष रूप से मील के दौरान । इन तकनीकों का मूल्यांकन करने के लिए और oogenesis के विभिंन चरणों के दौरान विभिंन उत्परिवर्तनों या पर्यावरण जोखिम के प्रभाव को चिह्नित किया जा सकता है । के रूप में वहां oogenesis और शुक्राणुजनन के बीच अलग मतभेद हैं, तकनीकों के भीतर वर्णित स्तनधारी oogenesis और dimorphic के दौरान गुणसूत्र और प्रोटीन गतिशीलता के यौन अर्धसूत्रीविभाजन सुविधाओं की हमारी समझ को बढ़ाने के लिए अमूल्य हैं .

Introduction

शुक्राणुजनन के दौरान, बड़े अर्द्ध meiotic रोगाणु कोशिकाओं के तुल्यकालिक तरंगों तेजी से कर रहे है और लगातार यौवन की शुरुआत में वृषण में मंगाया और वयस्कता में1भर । पुरुषों के विपरीत, महिलाओं में अर्धसूत्रीविभाजन केवल भ्रूण के विकास के दौरान शुरू की है । जंम के बाद, अंडाणुओं एक लंबे समय तक dictyate मैं एक बरकरार कीटाणु पुटिका (जीवी; परमाणु लिफाफा) यौवन तक के साथ दौर में गिरफ्तार रहना । यौवन की शुरुआत में, अंडाणुओं का एक सबसेट चक्रीय रूप से विकास और परिपक्वता से गुजरना करने के लिए चयनित कर रहे हैं, meiotic बहाली की दीक्षा अंकन. पूरी तरह से विकसित अंडाणुओं में Meiotic बहाली एक कीटाणु पुटिका टूटने (GVBD) के रूप में जाना जाता प्रक्रिया में जीवी के लापता होने से प्रकट होता है । oocyte तो गुणसूत्र संघनित्र और अलगाव, ध्रुवीय शरीर बाहर निकालना द्वारा पीछा किया जाता है । अंडाणुओं प्रगति पर मिि के लिए गिरफ्तार हो जाते है और निषेचन के बाद ही दूसरी और अंतिम meiotic विभाजन को पूरा करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं ।

महिला प्रजनन meiotic दौर मैं प्रगति की सफलता पर अत्यधिक निर्भर है । इस के लिए कुंजी chiasmata के रूप में जाना मुताबिक़ गुणसूत्रों के बीच एक शारीरिक संबंध का गठन है, जो प्रेरित डीएनए की मरंमत द्वारा मध्यस्थता है डबल कतरा टूटता (DSBs) अंतरराष्ट्रीय पुनर्संयोजन के माध्यम से2। यह प्रक्रिया एक गतिशील प्रोटीन से भरपूर synaptonemal परिसर (अनुसूचित जाति) के रूप में जाना जाता पाड़ के संदर्भ में होता है कि मुताबिक़ गुणसूत्रों के बीच रूपों उनके synapsis3की सुविधा के लिए । अनुसूचित जाति एक ज़िप-की तरह त्रिपक्षीय संरचना है कि दो समानांतर पार्श्व मध्य क्षेत्र प्रोटीन है कि चल रहे डीएनए की मरंमत भर में एक साथ homologs धारण द्वारा जुड़े तत्वों के होते हैं । synapsis करने से पहले, पार्श्व तत्वों के अग्रदूत, अक्षीय तत्व कहा जाता है, बहन chromatids के बीच रूप । Synaptonemal जटिल प्रोटीन जैसे SYCP2 और SYCP3 फार्म अक्षीय तत्व है कि जल्दी दौर के दौरान बहन-chromatid सामंजस्य कुल्हाड़ियों को colocalize । ये बाद में अनुप्रस्थ रेशा प्रोटीन, SYCP1, जो केंद्रीय तत्व विधानसभा और गठबंधन homologs4के बीच synapsis की सुविधा के लिए बाध्यकारी साइटों के रूप में सेवा करते हैं । माउस अंडाणुओं में, पूर्ण synapsis 20 पूरी तरह अतिव्यापी SYCP3 और SYCP1 फैला है, जो क्रोमेटिन प्रसार की तैयारी का उपयोग करके visualized किया जा सकता है की उपस्थिति से संकेत दिया है । Synapsis pachytene उपचरण में प्रवेश पर पूरा हो गया है, जिससे परिपक्व क्रॉसओवर कि homologs के बीच chiasmata फार्म के लिए किस्मत में है mutL homolog (MLH1/dimers के साथ सजाया जाता है उनके सटीक प्रसंस्करण को बढ़ावा देने के लिए5,6 , 7. गुणसूत्रों के संरचनात्मक रखरखाव (एसएमसी) परिसरों, cohesin, condensin सहित, और SMC5/6 परिसर, गुणसूत्र गतिशीलता और संरचना के विनियमन के लिए महत्वपूर्ण है अर्धसूत्रीविभाजन8भर में,9, 10,11,12. सामूहिक रूप से, इन घटनाओं के मुताबिक़ गुणसूत्रों के उचित द्वि-उंमुखीकरण को अनुसूचित जाति के निंनलिखित धुरी डंडे का विरोध करने के लिए सुनिश्चित करते हैं ।

meiotic सेल साइकिल एक शक्तिशाली मॉडल के जीनोम में विभिन्न प्रोटीन की भूमिकाओं की जांच करने के लिए क्रमादेशित प्रेरण और बाद में डीएनए DSBs की मरंमत के कारण है । इसके अलावा, स्तनधारी अर्धसूत्रीविभाजन भी epigenetic संशोधनों के अध्ययन के लिए एक प्रासंगिक मॉडल और13अंकित है । हालांकि, यह महिला अर्धसूत्रीविभाजन, जो स्तनधारियों में भ्रूण और नवजात अंडाशय में जगह लेता है (चित्रा 1) के दौरान इन घटनाओं का आकलन करने के लिए तकनीकी रूप से मुश्किल है । leptonema, zygonema, pachynema, diplonema और dictyate: चरण मैं 5 उपस्तरों में विभाजित किया जा सकता है । इस के साथ साथ, हम वर्णन कैसे अलग करने के लिए और भ्रूण और नवजात अंडाशय और testes (चित्रा 2) के बीच भेद । पहले वर्णित विधियों से रूपांतरित, यह पांडुलिपि भी एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा (चरण 1) महिला meiotic की तैयारी के लिए वीडियो प्रदर्शन के साथ मैं क्रोमेटिन फैलता है14,15,16,17 . जब immunolabelling के साथ युग्मित, के रूप में 6-7 कदम में वर्णित है, इस प्रोटोकॉल की विस्तृत सूक्ष्म विश्लेषण में सक्षम बनाता है दौर मैं अंडाणुओं में घटनाओं ।

Oogenesis त्रुटि प्रवण है, और गुणसूत्र अलगाव की घटनाओं पहले meiotic विभाजन के दौरान18,19संतान में आनुवंशिक रोग का सबसे आम स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस पांडुलिपि (प्रोटोकॉल चरण 2) में, हम एक प्रोटोकॉल जिसमें परिपक्व जीवी-मंचन अंडाणुओं वयस्क मादा चूहों के प्रधानमंत्री अंडाशय से निकाले जाते है का वर्णन । सहायक शर्तों के तहत, पूरी तरह से बढ़ी अंडाणुओं luteinizing हार्मोन-अलगाव और संस्कृति के बाद अर्धसूत्रीविभाजन के स्वतंत्र बहाली से गुजरना20। meiotic बहाली के बाद, अंडाणुओं प्रगति अर्धसूत्रीविभाजन मैं, metaphase द्वितीय पर तो गिरफ्तारी के माध्यम से । अंडाणुओं metaphase द्वितीय में गिरफ्तार रहते हैं, जब तक निषेचित। चरण 2 – 5 में, हम पहले वीडियो प्रदर्शन के साथ रिपोर्ट प्रोटोकॉल अनुकूलित करने के लिए कैसे इकट्ठा करने के लिए का वर्णन करने के लिए, संस्कृति और क्रोमेटिन प्रसार की तैयारी के लिए MI और मिि अंडाणुओं तैयार21। इस क्रोमेटिन प्रसार तकनीक गुणसूत्रों के साथ जुड़े प्रोटीन की स्पष्ट immunolabelling के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल भी bivalent और univalent गुणसूत्रों के बीच अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और आगे oocyte ploidy के आकलन की सुविधा के लिए एकल बहन chromatids हल कर सकते हैं । इसलिए, meiotic प्रोटीन के स्थानीयकरण पैटर्न का खुलासा करने के अलावा, इस प्रोटोकॉल भी MI और मिि के दौरान गुणसूत्र अलगाव की elucidating संभावित कारणों के लिए एक अमूल्य उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं ।

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Protocol

यहां वर्णित सभी तरीकों को जॉंस हॉपकिंस विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है । प्रयोगों वंय प्रकार C57BL/6J चूहों पर प्रदर्शन किया गया ।

1. कटाई भ्रूण या नवजात अंडाशय और क्रोमेटिन के दौर की तैयारी फैलता है

  1. पर भ्रूण निकालने के लिए 14.5-19.5 दिनों के बाद coitum (डीपीसी) गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन या सह के माध्यम से गर्भवती महिलाओं बलिदान IACUC दिशा निर्देशों के अनुसार2 asphyxiation ।
    नोट: के लिए जन्मोत्तर दिन 1 – 5 अंडाशय को छोड़ चरण १.३ । चित्रा 1 अलग भ्रूण और प्रसव के बाद के युग में समृद्ध meiotic चरण चरणों संक्षेप ।
  2. खुले abdominopelvic गुहा बाँझ कैंची का उपयोग कर, एक वी के आकार का उद्घाटन कर रही है । मातृ गर्भाशय सींग बाहर काटना, अपरा से भ्रूण अलग, और ३५ mm पेट्री व्यंजन में स्थानांतरण भ्रूण ३७ डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गर्म 1x फास्फेट बफर खारा (पंजाब) के 3 मिलीलीटर युक्त ।
    नोट: ३७ डिग्री सेल्सियस पर स्थापित एक fliptop मशीन तापमान को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, एक तापमान विनियमित ग्लास स्टेज भी अंडाशय हेरफेर के दौरान तापमान बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  3. साथ ३.५ इंच सर्जिकल कैंची, बलिदान भ्रूण या decapitation के माध्यम से पिल्ले IACUC दिशा निर्देशों के अनुसार । आगे विच्छेदन से पहले पूर्व गर्म पंजाब में decapitated भ्रूण या पिल्ले प्लेस ।
  4. काटना एक अलग ३५ मिमी पेट्री डिश में एक समय में एक भ्रूण या पिल्ला-३७ डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गर्म पंजाब के 3 मिलीलीटर युक्त । भ्रूण के पीछे आधे के ventral midline साथ काटने से आगे बढ़ना, forelimbs के नीचे पूर्वकाल आधा और हिंद-अंग और पूंछ के रूप में सीधे ऊपर के साथ चित्रा 2aमें उल्लिखित-बी।
  5. ३.५ इंच सर्जिकल कैंची का उपयोग कर पेट खोलो । ठीक से इत्तला दे दी संदंश विस्थापन का उपयोग करना या जिगर और आंत्र के छोरों को दूर, ३७ डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गर्म पंजाब के 3 मिलीलीटर युक्त एक नया ३५ मिमी पेट्री डिश में अंडाशय को उजागर ( चित्रा बी2 में गाइड देखें). अंडाशय तुरंत नीचे स्थित है और पेरिटोनियल गुहा के पीछे की दीवार की ओर गुर्दे (चित्र बी-सी) के पीछे । पुरुष और महिला gonads के बीच अंतर के लिए एक गाइड चित्रा 2dमें प्रदान की जाती है ।
    नोट: इष्टतम स्थितियों के लिए, तेजी से बाहर काटना गर्भवती महिला के बाद अंडाशय का बलिदान दिया है ।
  6. प्रत्येक महिला भ्रूण से दोनों अंडाशय निकालें एक विच्छेदन क्षेत्र के तहत ठीक इत्तला दे दी संदंश की एक जोड़ी का उपयोग कर या एक घड़ी चश्मा या एक बहु अच्छी तरह से पूर्व गरम पंजाबियों की १.० मिलीलीटर से युक्त थाली के अलग कुओं में जगह और ३७ डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने के ।
  7. ०.५ मिलीलीटर hypo में अंडाशय के प्रत्येक जोड़ी प्लेस-निष्कर्षण बफर (17 मिमी trisodium साइट्रेट डाईहाइड्रेट, ५० मिमी सुक्रोज, 5 मिमी EDTA, ०.५ मिमी डीटीटी, 30 मिमी Tris-एचसीएल, छेड़ने वाला अवरोधक, पीएच ८.२) एक साफ देखने के गिलास या एक 9 अच्छी तरह से प्लेट के एक छोटे से अच्छी तरह से, अंडाशय में विसर्जित करने के लिए सुनिश्चित कर comp letely । से कम 15 मिनट के लिए मशीन, लेकिन कोई 30 से अधिक मिनट ।
    नोट: बनाओ hypo-निष्कर्षण बफर ताजा और डीटीटी अलावा के 2 एच के भीतर का उपयोग करें ।
  8. गर्मी के दौरान, एक hydrophobic बैरियर पीएपी पेन का उपयोग कर, एक साफ गिलास पर २ २२ x 22 मिमी 2 चौकों ड्रा 25 x ७५ mm 2, 1 मिमी मोटी माइक्रोस्कोप स्लाइड के रूप में चित्रा3 ए में दिखाया गया है ।
    नोट: स्लाइड समय से आगे तैयार किया जा सकता है ।
  9. पिपेट 45-50 µ एल के १०० mM सुक्रोज एक साफ स्लाइड पर और ड्रॉप करने के लिए अंडाशय की एक जोड़ी हस्तांतरण ।
  10. २ २७ जी सुई के तेज सिरों का उपयोग करना, सुक्रोज समाधान में कोशिकाओं को जारी करने के अलावा अंडाशय चिढ़ाते हैं । संदंश के साथ, अंडाशय के बड़े टुकड़ों को हटाने और कोशिकाओं को फैलाने के लिए ध्यान से पिपेट सुक्रोज समाधान ।
  11. स्थान निर्धारण समाधान के ४० µ l (1% paraformaldehyde (पीएफए), ०.२% डिटर्जेंट ( सामग्री तालिकादेखें), पीएच ९.२) तैयार स्लाइड के प्रत्येक वर्ग में । एक २०० µ एल पिपेट टिप के साथ, स्लाइड सतह पर समान रूप से निर्धारण समाधान फैल गया ।
  12. पिपेट से युक्त स्लाइड के प्रत्येक वर्ग पर सुक्रोज मिश्रण के 20 µ एल.
    नोट: यह स्लाइड प्रति अंडाशय की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए समानताएं ।
  13. कमरे के तापमान पर रातोंरात एक बंद आर्द्र कक्ष में स्लाइड की मशीन ।
    नोट: रातोंरात गर्मी कमरे के तापमान पर (12-15 बजे) के आसपास रेंज कर सकते हैं ।
  14. कक्ष का ढक्कन खोलें और स्लाइड को पूरी तरह से हवा-सूखा दें.
  15. एक Coplin जार में स्लाइड धो ०.४% गीला एजेंट के ५० मिलीलीटर-पंजाब के समाधान ( सामग्री की तालिकादेखें) 2 मिनट के लिए, हवा सूखी, और immunolabelling प्रोटोकॉल (चरण 6) के लिए आगे बढ़ना ।
    नोट: यह बाद में उपयोग के लिए स्लाइड पर-८० ° c संग्रहीत करने के लिए संभव हो सकता है, लेकिन यह ब्याज की प्रोटीन के आधार पर बदलता है । इष्टतम परिणामों के लिए तुरंत immunolabelling प्रोटोकॉल (चरण 6) के लिए आगे बढ़ना ।

2. Metaphase I Oocyte संग्रह

  1. प्रत्येक माउस से अलग कोटरीय कूप की संख्या को अधिकतम करने के लिए, intraperitoneally गर्भवती घोड़ी सीरम गोनॉडोट्रॉफिन के 5 IU के साथ यौन परिपक्व कुंवारी मादा चूहों इंजेक्षन (PMSG, भी घोड़े chorionic गोनॉडोट्रॉफिन (ईसीजी) के रूप में जाना).
    नोट: इष्टतम oocyte उपज के लिए, चूहों उम्र के 1 से 3 महीने होना चाहिए, के रूप में काटा अंडाणुओं की संख्या उम्र के साथ कम हो जाएगा. PMSG तैयार करने के लिए, ५,००० IU के १०० मिलीलीटर में बाँझ पंजाबियों की बोतल भंग (5 U/0.1 मिलीलीटर) में स्टोर-20 ° c ६०० µ l के एकल उपयोग aliquots में ।
  2. 44 – 48 एच के बाद, संग्रह मध्यम, न्यूनतम आवश्यक मध्यम अल्फा (MEMα) मध्यम 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 3 मिलीग्राम/एमएल गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन के साथ पूरक तैयार (BSA; MEMα/BSA/FBS). एक ०.२ µm ताकना फिल्टर के माध्यम से मीडिया निष्फल । MEMα/BSA/FBS माध्यम के खिचड़ी भाषा २.५ एमएल एक 5% सह2 मशीन में माउस और गर्म करने के लिए ३७ ° c प्रति एक गिलास पकवान में ।
    नोट: अन्य संग्रह और संस्कृति मीडिया है कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं (M2 और M16) भी आमतौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं.
    चेतावनी: हम सीमित अवधि के लिए हेरफेर कदम के दौरान परिवेश हवा जोखिम को कम करने के लिए एक समय में 5% कं2 मशीन एक से संस्कृति व्यंजन को हटाने की सिफारिश ।
  3. IACUC दिशानिर्देशों के अनुसार सर्वाइकल विस्थापन या सह2 asphyxiation के माध्यम से चूहों को कुर्बान करें ।
  4. खुले abdominopelvic गुहा बाँझ कैंची का उपयोग कर, एक बड़े वी के आकार का उद्घाटन कर रही है । संदंश का प्रयोग, माउस के सिर की ओर आंतों को विस्थापित । प्रत्येक गर्भाशय हॉर्न का पता लगाएँ; अंडाशय रिब पिंजरे के समीपस्थ मौजूद हैं । ओवीडक्ट को ठीक संदंश के साथ पकड़ें और विच्छेदन कैंची (चित्रा 4) का उपयोग करके अंडाशय में फैट को बेहतर काटें. ओवीडक्ट पकड़ जारी रखने के लिए, और ठीक संदंश के एक और सेट के साथ बर्सा से अंडाशय रिलीज और MEMα/BSA/FBS माध्यम युक्त संग्रह पकवान में जगह है ।
    नोट: चरण 1 में के रूप में, यह ३७ डिग्री सेल्सियस पर अंडाशय रखना और 5% CO2पर बनाए रखने के लिए आवश्यक है । एक fliptop मशीन 5% सह2 मिश्रण करने के लिए झुका तापमान और सह2 स्तरों के इष्टतम रखरखाव के लिए अनुमति देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, एक तापमान विनियमित ग्लास स्टेज भी oocyte हेरफेर के दौरान तापमान बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
  5. एक 27-गेज सुई (या इसी तरह के आकार) के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग, मेघपुंज oocyte परिसरों मैंयुअल रूप से बड़े कोटरीय कूप puncturing जारी ।
  6. जबकि एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के माध्यम से देख, जीवी-मंचन अंडाणुओं एक मुंह से संचालित ग्लास पिपेट या केशिका, या एक हाथ से संचालित माइक्रोमीटर-सिरिंज (चित्रा 5) का उपयोग कर इकट्ठा । केवल कोटरीय कूप से जारी कर रहे है कि अंडाणुओं इकट्ठा । जीवी अंडाणुओं लगभग ९० µm. जीवी अंडाणुओं का व्यास है granulosa कोशिकाओं के 2-3 परतों से घिरा हो सकता है, और लगभग २०० µm का कुल व्यास है ।
  7. संस्कृति अंडाणुओं एक साफ घड़ी गिलास या एक 9 अच्छी तरह से MEMα/BSA/FBS माध्यम युक्त प्लेट में 6 ज के लिए ३७ ° c में एक 5% सह2 मशीन में पहुंच metaphase ।
  8. चरण 4 पर जाएं ।

3. Metaphase II (मिि) Oocyte संग्रह

  1. प्रत्येक माउस से अलग अंडाणुओं को अधिकतम करने के लिए, intraperitoneally PMSG के 5 IU के साथ यौन परिपक्व कुंवारी मादा चूहों इंजेक्षन । 44-48 एच के बाद, intraperitoneally मानव chorionic गोनॉडोट्रॉफिन (एचसीजी) के 5 IU के साथ सुई ।
    नोट: इष्टतम oocyte उपज के लिए, चूहों उम्र के 1 से 3 महीने होना चाहिए, के रूप में काटा अंडाणुओं की संख्या उम्र के साथ कम हो जाएगा. एचसीजी तैयार करने के लिए, २०० एमएल पंजाब (5 यू/0.1 एमएल) में १०,००० यू की एक बोतल भंग । -20 डिग्री सेल्सियस पर ६०० µ एल के एकल उपयोग aliquots में स्टोर.
  2. 12-14 बजे के बाद, MEMα/BSA/FBS संग्रह माध्यम, चरण २.२, ऊपर में वर्णित के रूप में तैयार करें ।
  3. IACUC दिशानिर्देशों के अनुसार सर्वाइकल विस्थापन या सह2 asphyxiation के माध्यम से चूहों को कुर्बान करें ।
  4. खुले abdominopelvic गुहा बाँझ कैंची का उपयोग कर, एक बड़े वी के आकार का उद्घाटन कर रही है । संदंश का प्रयोग, माउस के सिर की ओर आंतों को विस्थापित । प्रत्येक गर्भाशय सींग का पता लगाएँ, अंडाशय रिब पिंजरे के समीपस्थ मौजूद हैं । ओवीडक्ट को ठीक संदंश के साथ पकड़ें और विच्छेदन कैंची (चित्रा 4) का उपयोग करके अंडाशय में फैट को बेहतर काटें. फिर अंडाशय और ओवीडक्ट और MEMα/BSA/FBS माध्यम युक्त संग्रह डिश में जगह निकालें ।
    नोट: चरण 1 और 2 में के रूप में, यह ३७ डिग्री सेल्सियस पर अंडाशय रखने के लिए और 5% सह पर बनाए रखना अनिवार्य है2. एक fliptop मशीन 5% सह2 मिश्रण करने के लिए झुका तापमान और सह2 स्तरों के इष्टतम रखरखाव के लिए अनुमति देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, एक तापमान विनियमित ग्लास स्टेज भी oocyte हेरफेर के दौरान तापमान बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
  5. एक 27 जी (या इसी तरह का आकार) या तेज संदंश के साथ एक 1 एमएल सिरिंज का प्रयोग, ओवीडक्ट के कलसा में एक छेद फाड़ कर मिि अंडाणुओं जारी करें ।
    नोट: कलसा में अंडाणुओं को नुकसान न हो इसके लिए सावधानी बरतें । कलसा सूजन और पारदर्शी दिखाई देगा ऐसी है कि अंडाणुओं (चित्रा 4) दिखाई दे रहे हैं ।
  6. फसल मिि से अंडाणुओं के कलसा से एक नई डिश में ओवीडक्ट के माध्यम से एक मुंह संचालित ग्लास पिपेट या केशिका, या एक हाथ से संचालित माइक्रोमीटर सिरिंज (चित्रा 5) का उपयोग कर ।
  7. चरण 4 पर जाएं ।

४. Oocyte Denuding व Zona Pellucida निर्मूलन

  1. तैयार ३०० IU/एमएल MEMα मध्यम में hyaluronidase के साथ पूरक 3 मिलीग्राम/एमएल BSA के लिए अंडाणुओं आसपास के मेघपुंज कोशिकाओं (२.५ मिलीलीटर/माउस) एक घड़ी ग्लास में, और रख ३७ ° c, 5% CO2।
    नोट: Hyaluronidase प्रभावकारिता तेजी से घटने के बाद 1 तैयारी के ज । त्यात मिि अंडाणुओं, hyaluronidase उपचार आवश्यक छैन ।
  2. बेनकाब oocyte-मेघपुंज सेल परिसरों के लिए ३०० IU/एमएल hyaluronidase MEMα/BSA में 3 मिनट के लिए आसपास के अंडाणुओं कोशिकाओं के नग्न मेघपुंज के लिए ।
    चेतावनी: hyaluronidase के लिए 3 मिनट के जोखिम से अधिक नहीं है, के रूप में यह अंडाणुओं नुकसान होगा ।
  3. अंडाणुओं को धोने के लिए अंडाणुओं को एक ताजा उष्ण MEMα/BSA मीडियम डिश पर ट्रांसफर करें । एक छोटे से मुंह का उपयोग-ग्लास पिपेट या केशिका (oocyte, जो लगभग ९० µm है के व्यास से थोड़ा बड़ा), परिसरों पिपेट ऊपर और नीचे करने के लिए पूरी तरह से मेघपुंज कोशिकाओं को अलग । अंडाणुओं को मशीन में ठीक करने की अनुमति दें, जबकि अगले कदम के लिए तैयारी ।
  4. उष्ण अम्लीय Tyrode का समाधान, MEMα/BSA, और Waymouth का मीडिया ३७ ° c (५०० µ l/ छोटे 9-अच्छी तरह से ग्लास प्लेटों के प्रत्येक कुआं में ३०० µ एल प्लेस ।
  5. Tyrode के समाधान में zona pellucida (जिला परिषद) अंतरण 5 – 10 अंडाणुओं को दूर करने के लिए । समाधान के लिए केवल 30-45 s के लिए अंडाणुओं बेनकाब ।
    नोट: समाधान के लिए बहुत कम जोखिम जिला परिषद पूरी तरह से दूर नहीं होगा, जो अंडाणुओं को फैलने से रोकने और गुणसूत्रों से रोक देगा । बहुत अधिक जोखिम को नुकसान होगा और oocyte को मार डालो । विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत भंग जिला परिषद देख जोखिम समय के अनुकूलन में सहायता कर सकते हैं.
    चेतावनी: का उपयोग ताजा है Tyrode समाधान महत्वपूर्ण है, के रूप में अपने समारोह उंर के साथ गिरावट आती है । जिला परिषद के समान पाचन सुनिश्चित करने के लिए इलाज अंडाणुओं के प्रत्येक समूह के लिए है Tyrode समाधान के एक ताजा अच्छी तरह से उपयोग करें ।
  6. जिला परिषद हटाने के तुरंत बाद, अंडाणुओं को गर्म MEMα में स्थानांतरित करके धो BSA/FBS माध्यम । इस वाश चरण को दोहराएं ।
    नोट: अंडाणुओं आसानी से एक साथ रहना होगा, के रूप में स्थानांतरित करते समय सावधान रहना होगा और कांच पिपेट या केशिका जिला परिषद को हटाने के बाद । पूर्व-गीला गिलास पिपेट या Waymouth के माध्यम में केशिका एक साथ चिपके हुए अंडाणुओं को कम करेगा ।
  7. स्थानांतरण और अंडाणुओं Waymouth के माध्यम में ३७ ° c में एक 5% सह2 मशीन में 30 मिनट के लिए ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं ।
  8. चरण 5 पर आगे बढ़ें ।

5. म० व मिि Oocyte क्रोमेटिन फैलता

  1. एक पीएपी पेन का प्रयोग, चित्रा 6Aमें दिखाया गया के रूप में ग्लास स्लाइड पर एक 11 x ४४ mm2 आयत ड्रा ।
  2. कोट निर्धारण की एक पतली परत के साथ स्लाइड (1% paraformaldehyde, ०.२% ट्राइटन-X १०० में एच2O, pH ९.२) pipetting १०० µ l द्वारा निर्धारण की स्लाइड पर और आगे और पीछे स्लाइड कमाल । अतिरिक्त निर्धारण से छुटकारा पाने के लिए स्लाइड टैप करें ।
  3. संभव के रूप में छोटे मीडिया के साथ एक छोटे से मुंह पिपेट सुई के साथ 5-10 अंडाणुओं के बीच उठाओ और निर्धारण के समाधान में स्लाइड के ऊपर 1 सेमी से अंडाणुओं जमा करते हुए निर्धारण-लेपित स्लाइड भर में एक पंक्ति में सुई खींचें । एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग कर यह सुनिश्चित करें कि अंडाणुओं जमा किया गया है और वे फट गया है यह कदम प्रदर्शन ।
    नोट: अंडाणुओं तुरंत स्लाइड पर फट चाहिए । ऊंचाई जिस पर अंडाणुओं जमा कर रहे है प्रभाव क्रोमेटिन की डिग्री फैल रही है । अधिक जानकारी के लिए चित्रा 6 में प्रतिनिधि परिणाम देखें ।
  4. क्रोमेटिन का पालन करने के लिए अनुमति देने के लिए रातोंरात एक बंद humidified कक्ष में कमरे के तापमान पर स्लाइड ।
  5. स्लाइड को पूरी तरह से एयर-ड्राई करने की अनुमति दें और एक Coplin जार में स्लाइड कुल्ला करें जिसमें ०.४% गीला एजेंट-H2, pH ८.० की ५० मिलीलीटर है ।
  6. चरण 6 पर आगे बढ़ें ।

6. Immunolabelling

  1. तालिका 1में वर्णित एंटीबॉडी कमजोर पड़ने वाले बफर (एडीबी) तैयार करें ।
  2. ५० एमएल वॉश बफर (पश्चिम बंगाल) समाधान (10% पंजाब में पतला एडीबी), और ५० एमएल पश्चिम बंगाल और ०.०५% डिटर्जेंट समाधान युक्त एक Coplin जार युक्त दो Coplin जार तैयार करें (उदा., २५० µ एल जोड़ने के लिए 10% डिटर्जेंट के ५० एमएल पश्चिम बंगाल) ।
  3. एक Coplin जार में 10 मिनट के लिए इस प्रोटोकॉल के खंड 1 और 5 में तैयार किए गए थे धो स्लाइड पश्चिम बंगाल के ५० मिलीलीटर युक्त ।
    चेतावनी: immunolabelling के दौरान किसी भी बिंदु पर स्लाइड्स को शुष्क न होने दें ।
  4. ५० एमएल पश्चिम बंगाल और ०.०५% डिटर्जेंट समाधान युक्त Coplin जार में 10 मिनट के लिए स्लाइड धो लें । फिर, शेष Coplin जार में स्लाइड को धो लें जिसमें 10 मिनट के लिए पश्चिम बंगाल समाधान की ५० मिलीलीटर है ।
  5. एडीबी में पतला चयनित प्राथमिक एंटीबॉडी के १०० µ एल के साथ अतिरिक्त तरल और कवर स्लाइड बंद टैप करें । एक बंद आर्द्र कक्ष में रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ।
    नोट: मशीन ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 से 3 बजे तक छोटा किया जा सकता है । coverslip या parafilm के साथ स्लाइड को कवर करके एंटीबॉडी (उदा., ५० µ l) के छोटे वॉल्यूम का उपयोग करें ।
  6. एक Coplin जार में कुल्ला स्लाइड ०.२% गीला एजेंट के ५० मिलीलीटर-पंजाबियों समाधान, पीएच ८.० ।
  7. चरण ६.२ के लिए ६.५ दोहराएँ ।
  8. एडीबी में पतला चयनित माध्यमिक एंटीबॉडी के १०० µ एल के साथ अतिरिक्त तरल और कवर स्लाइड बंद टैप करें । एक बंद आर्द्र कक्ष में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 से 2 बजे स्लाइड गर्मी ।
  9. Coplin जार में 10 मिनट के लिए 2 बार धो स्लाइड ०.२% गीला एजेंट-पंजाबियों समाधान, पीएच ८.० की ५० मिलीलीटर से युक्त ।
  10. Coplin जार में 5 मिनट के लिए स्लाइडें 2 बार धोएं ०.२% गीला एजेंट-H2O समाधान, pH ८.० की ५० मिलीलीटर ।

7. बढ़ते स्लाइड

  1. चरण 2 में तैयार क्रोमेटिन स्प्रेड के लिए, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1.5 µ g/mL) वाले बढ़ते माध्यम के १०० µ l को जोड़ें । के लिए MI और मिि क्रोमेटिन स्प्रेड चरण 5 में तैयार किया गया है, DAPI युक्त बढ़ते मध्यम (1.5 µ g/एमएल) के ५० µ l को जोड़ें । धीरे दाग दूर अतिरिक्त तरल ।
  2. एक 22 मिमी x ६० मिमी coverslip ऊपर और स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ सील पर रखें । प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मूल्यांकन तक 4 ° c या-20 डिग्री सेल्सियस पर एक स्लाइड बॉक्स में स्टोर.
    नोट: नेल पॉलिश के साथ सीलिंग से पहले अतिरिक्त बढ़ते माध्यम से छुटकारा पाने के लिए कवर स्लिप पर हल्के से टैप करें ।

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Representative Results

हम अंडाणुओं में meiotic गुणसूत्रों visualizing और आकलन के लिए दो तकनीकों का वर्णन किया है । पहली तकनीक भ्रूण और नवजात अंडाशय में चरण प्रगति का आकलन करने की ओर पूरा हो गया है । दौर क्रोमेटिन प्रसार की तैयारी अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान कई गतिशील प्रक्रियाओं visualizing गुणसूत्र बाँधना, synapsis और desynapsis, मुताबिक़ पुनर्संयोजन, और epigenetic गुणसूत्र remodeling सहित के लिए अविश्वसनीय रूप से मूल्यवान हैं । यहां, हम मजबूत दृश्य और C57BL/6J भ्रूण से काटा अंडाणुओं में अंतरराष्ट्रीय गठन के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए इस विधि की उपयोगिता का प्रदर्शन किया है ( चित्र 3बी और सी) । pachytene उपस्तर में कोशिकाओं के लिए समृद्ध करने के लिए, माउस भ्रूण १८.५ डीपीसी (चित्रा 1) में प्राप्त किया गया. दो प्रमुख pachytene के चरण की बानगी मैं homologs के बीच synapsis के पूरा कर रहे हैं, और homolog जोड़ी के प्रति सकारात्मक अंतरराष्ट्रीय कम से एक MLH1 के गठन/ homologs के बीच पूरा synapsis 20 अतिव्यापी SYCP3 और SYCP1 फैला की उपस्थिति के द्वारा प्रकट होता है । जंगली में विदेशी गठन की विशेषता-प्रकार अंडाणुओं हम immunolabeled क्रोमेटिन प्रसार एंटीबॉडी का उपयोग कि SYCP3, SYCP1 और MLH1 का पता लगाने की तैयारी, और दाग डीएनए DAPI का उपयोग कर । चित्र बी एक pachytene चरण oocyte, जो 27 MLH1 घावों की उपस्थिति के द्वारा सबूत है 20 पूरी तरह से इकट्ठे अनुसूचित जाति संरचनाओं के एक प्रतिनिधि छवि को दर्शाया गया है । वाइल्ड-टाइप अंडाणुओं में पाए जाने वाले MLH1-धनात्मक क्रॉसओवर की औसत संख्या 24 ± 3 (चित्र 3 c, N = 15 अंडाणुओं) थी । चित्रा 3d से पता चलता है SMC6 pericentromeric heterochromatin (PCH) क्षेत्र में समृद्ध और गुणसूत्र हथियारों के साथ, और MLH1 pachytene मंच पर अनुसूचित जाति के साथ वितरित घावों । चित्रा 3E एक pachytene मंचन oocyte जहां गुणसूत्र प्रसार की तैयारी उप इष्टतम था और व्यक्तिगत गुणसूत्रों, SYCP3, SMC6 और MLH1 के सटीक आकलन को रोकने के लिए अलग है चित्रित किया गया है । उप इष्टतम गुणसूत्र फैलता hypo में अंडाशय की मशीन-निष्कर्षण बफर बहुत लंबे समय के लिए है या नहीं के लिए पर्याप्त है जब देखा जा सकता है ।

दूसरी तकनीक वर्णित अंडाणुओं निंनलिखित meiotic (चित्रा घमण्ड-डी) में क्रोमेटिन आकृति विज्ञान का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रोटीन स्थानीयकरण, साथ ही ploidy, आसानी से मूल्यांकन किया जा सकता है, गुणसूत्र अलगाव त्रुटियों के संभावित कारणों को उजागर । चित्रा घमण्ड 20 गुणसूत्रों और स्पष्ट centromere और pericentromeric heterochromatin धुंधला दिखा एक एमआई oocyte दर्शाया गया है । चित्रा 6C एक ज़ूम छवि है, जहां चतुर्थ तोपोइसोमेरसे IIα (TOPOII) गुणसूत्र हथियार और PCH साथ देखा जा सकता है । चित्रा 6D एक मिि oocyte जहां युग्मित बहन chromatids गुणसूत्र और centromere आकृति विज्ञान द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है दर्शाया गया है । आम त्रुटियों को देखा जब इस तकनीक के प्रयास में शामिल नहीं अंडाणुओं फट जब पीएफए-लेपित स्लाइड पर जारी है, साथ ही साथ बहुत दूर तक फैल गुणसूत्रों (चित्रा 6E-च) । यदि जिला परिषद पूरी तरह से नहीं हटाया जाता है, गुणसूत्रों धुरी से जुड़े रहेंगे, के रूप में चित्रा6E में दिखाया गया है । यदि अंडाणुओं को पीएफए-लेपित स्लाइड से बहुत अधिक गिराया जाता है, तो गुणसूत्रों को बहुत दूर तक फैलाया जा सकता है, जैसा कि चित्र 6Fमें दिखाया गया है ।

Figure 1
चित्रा 1: महिला भ्रूण और नवजात विकास के दौरान Meiotic दौर समयरेखा । ब्लू आकृति विशिष्ट दौर उप चरण रोगाणु कोशिकाओं की आबादी का संकेत (leptotene, zygotene, pachytene, और diplotene/dictyate चरणों) भ्रूण और नवजात विकास के दौरान मनाया । गहरे नीले रंग को बढ़ाना उस समय को इंगित करता है, जिस पर विशिष्ट चरण उप-चरण अधिक प्रचुर मात्रा में हो जाता है. यह आंकड़ा संदर्भ2से अनुकूलित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: भ्रूण और नवजात महिला पिल्ले से अंडाशय निष्कर्षण । (A, B) पहली कटौती (1) forelimbs के ऊपर किया जाता है के लिए सिर पर भ्रूण decapitate/तुरंत मातृ गर्भाशय सींग से पुनर्प्राप्ति पर जंक्शन/ दूसरी कटौती (2) भ्रूण के पीछे आधे के ventral midline के साथ किया जाता है, forelimbs (3) के नीचे पूर्वकाल आधे के साथ चीरा के बाद । एक अंतिम कटौती हिंद अंगों और पूंछ (4) को हटाने के लिए किया जाता है । (क) ललाट देखने महिला पिल्ले से अंडाशय के अलगाव के लिए विच्छेदन में कटौती की योजनाबद्ध । (ख) पक्ष देखें आंतरिक अंगों के सापेक्ष पदों के साथ अंडाशय के अलगाव के लिए विच्छेदन में कटौती की योजनाबद्ध । प्रकाश लाल रंग में दिखाए गए क्षेत्रों जिगर और आंतों, जो विच्छेदन के दौरान हटा रहे हैं शामिल हैं । पृष्ठीय दीवार और जुड़े अंगों को हल्के नीले रंग में दिखाया गया है । इस क्षेत्र में अंडाशय शामिल हैं, जो गर्भाशय के सींग के ऊपर स्थित गुर्दे के अवर ध्रुवों से जुड़े होते हैं. (ग) जिगर और आंतों को हटाने के बाद भ्रूण की पृष्ठीय दीवार के ललाट योजनाबद्ध देखें । (घ) लगभग 15-18 डीपीसी में पुरुष और महिला gonads के बीच रूपात्मक मतभेदों के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि दौर क्रोमेटिन प्रसार की तैयारी । (क) गिलास स्लाइड क्रोमेटिन प्रसार तैयारी के लिए चरण के लिए योजनाबद्ध । ब्लैक स्क्वायर रूपरेखा तरल अवरोधक कलम रूपरेखा का प्रतिनिधित्व करते हैं । (B, C) प्रतिनिधि छवियों और वंय-प्रकार pachytene चरण में अंतरराष्ट्रीय गठन की ठहराव चरण 1 में वर्णित क्रोमेटिन प्रसार तैयारी विधियों का उपयोग अंडाणुओं । ( ख) क्रोमेटिन फैलता अंडाशय fromC57BL/6J माउस भ्रूण १८.५ डीपीसी में पृथक का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया । क्रोमेटिन फैलता अनुसूचित जाति पार्श्व तत्व प्रोटीन SYCP3 (लाल) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ immunolabeled थे, और अनुसूचित जाति के केंद्रीय तत्व प्रोटीन SYCP1 (रानी), MLH1 (हरा, अंतरराष्ट्रीय घटना मार्कर), और DAPI (नीला, डीएनए) । स्केल बार = 10 µm. (ग) MLH1 घावों के डॉट प्लाट 15 pachytene स्टेज क्रोमेटिन स्प्रेड तैयारियों से प्राप्त होते हैं । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । ( घ, ङ) इष्टतम (घ) की तुलना और उप-इष्टतम (ङ) दौर प्रसार की तैयारी, क्रमशः. क्रोमेटिन फैलता SMC6 (लाल), MLH1 (हरा), और SYCP3 (नीला) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ immunolabeled थे । स्केल बार = 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: वयस्क अंडाशय के योजनाबद्ध आरेख. यह आरेख वयस्क माउस अंडाशय, ओवीडक्ट, कलसा और गर्भाशय के एनाटॉमी को दर्शाया गया है । माउस अंडाशय गुर्दे के अवर डंडे, और पेट के पीछे की दीवार को अंडाशय को जोड़ने के बंधन की सावधान चीरा द्वारा हटाया जाना चाहिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: मुंह की छवियां ग्लास पिपेट, ग्लास केशिका और हाथ संचालित माइक्रोमीटर-oocyte हेरफेर के लिए इस्तेमाल सिरिंज । (क) कांच पिपेट oocyte जोड़तोड़ अनुक्रम में निंनलिखित घटकों से बना है: मुंह टुकड़ा, लेटेक्स टयूबिंग (३.२ मिमी इनर व्यास (आईडी) x ६.४ मिमी बाहरी व्यास (आयुध डिपो)), 1 मिलीलीटर पिपेट टिप, लेटेक्स टयूबिंग (६.४ मिमी आईडी x ११.१ मिमी आयुध डिपो) और ग्लास पाश्चर पिपेट । कांच पाश्चर पिपेट के अंत में एक लौ पर गर्म किया गया है और अंत के लिए एक ठीक इत्तला दे दी अंत (चित्र 5 ए1) बनाने के लिए खींच लिया । (ख) कांच केशिका oocyte जोड़तोड़ अनुक्रम में निंनलिखित घटकों से बना है: मुंह टुकड़ा, ०.४५ µm फ़िल्टर (वैकल्पिक), लेटेक्स टयूबिंग (३.२ मिमी आईडी एक्स ६.४ मिमी आयुध डिपो), 1 मिलीलीटर पिपेट टिप, लेटेक्स टयूबिंग (६.४ मिमी आईडी एक्स ११.१ मिमी आयुध डिपो) और ७० µ एल ग्लास केशिका । ग्लास केशिका ट्यूबों केंद्र में एक लौ पर गर्म कर रहे है और विपरीत दिशाओं में खींच लिया ठीक इत्तला दे दी समाप्त होता है (चित्रा 5B1) के साथ दो केशिकाएं बनाने के लिए । (ग) हाथ से संचालित माइक्रोमीटर-सिरिंज अनुक्रम में निम्नलिखित घटकों से बना है: Mitutoyo 150-208 माइक्रोमीटर सिर (मध्यम आकार, 0-1 "रेंज, ०.००१" स्नातक), 5 मिलीलीटर सिरिंज, लेटेक्स टयूबिंग (३.२ मिमी आईडी एक्स ६.४ मिमी आयुध डिपो), 1 मिलीलीटर पिपेट टिप, लेटेक्स टयूबिंग (६.४ मिमी आईडी x ११.१ मिमी आयुध डिपो), 1 मिलीलीटर पिपेट टिप और एक ८३ x ०.५ mm2 जेल लोड टिप । Mitutoyo 150-208 माइक्रोमीटर सिर मजबूती से 5 मिलीलीटर सिरिंज (चित्रा 5C1) में डाला जाता है । यह सुनिश्चित करने के लिए जेल लोड हो रहा है टिप सुरक्षित रूप से बांधा है, जोड़ने 1 मिलीलीटर पिपेट टिप काट रहा है (चित्रा 5C2) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: प्रतिनिधि metaphase मैं और द्वितीय oocyte क्रोमेटिन प्रसार की तैयारी । (क) metaphase मैं और द्वितीय oocyte क्रोमेटिन प्रसार तैयारियों के लिए स्लाइड योजनाबद्ध । अंडाणुओं (हलकों) के माध्यम से जारी मुंह संचालित ग्लास पिपेट या केशिका एक सीधी रेखा में (तीर का पालन) । काला आयत बाह्यरेखा तरल अवरोधक पेन बाह्यरेखा का प्रतिनिधित्व करता है । (ख, ग) इष्टतम metaphase क्रोमेटिन प्रसार गर्ने तयारी गरिएको हो । Metaphase मैं गुणसूत्रों DAPI (नीला, डीएनए), और केंद्र के लिए immunolabeled (ग्रीन, kinetochore/centromere मार्कर) के साथ दाग थे । स्केल बार्स = 10 µm. (B) हिस्टोन H4 (di मिथाइल K20, tri मिथाइल K20) के खिलाफ एंटीबॉडी का प्रयोग pericentromeric heterochromatin (PCH) लेबल करने के लिए किया जाता है । (ग) चतुर्थ तोपोइसोमेरसे IIα (TOPOII) के खिलाफ एंटीबॉडी के लिए PCH और गुणसूत्र कुल्हाड़ियों लेबल इस्तेमाल किया गया । (घ) श्रेष्ठतम metaphase द्वितीय क्रोमेटिन प्रसार तयारी । Metaphase द्वितीय गुणसूत्रों DAPI (नीला, डीएनए), और immunolabeled के लिए केंद्र (ग्रीन), और हिस्टोन H4 (di-मिथाइल K20, त्रिकोणीय मिथाइल K20) के लिए PCH लेबल के साथ दाग थे । स्केल बार: 10 µm. (E, F) बेचारा metaphase मैं क्रोमेटिन फैलाने की तैयारी. गुणसूत्रों DAPI (नीला, डीएनए), और केंद्र के लिए immunolabeled (हरा) और meiotic cohesin घटक, REC8 के साथ दाग थे । स्केल बार्स = 10 µm (E) एक oocyte जो पीएफए-लेपित स्लाइड पर रिलीज़ होने पर नहीं फट पाई । (च) गुणसूत्रों कि बहुत दूर अलग फैल गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

आइटम राशि अंतिम एकाग्रता
1x पंजाब ५० एमएल 1x
bsa 1.5 ग्राम 3% (w/
हार्स सीरम 5 मिलीलीटर 10% (v/
10% डिटर्जेंट (देखें
 सामग्री की तालिका) पंजाब में		 २५० μL ०.०५% (वि. वि./

तालिका 1: एंटीबॉडी कमजोर पड़ने बफर (एडीबी) नुस्खा । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर एडीबी या-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक फ्रीज अगर बड़ी मात्रा में बना रही है । एडीबी दूषित हो सकता है, इसलिए सुनिश्चित करें कि अच्छा अपूतित तकनीक का उपयोग किया जाता है और प्रत्येक उपयोग करने से पहले संदूषण के लिए समाधान का आकलन करें । एडीबी के छोटे aliquots भी प्रदूषित को कम करने के लिए तैयार किया जा सकता है ।

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Discussion

क्रोमेटिन प्रसार की तैयारी के लिए शोधकर्ताओं ने महिला स्तनधारी अर्धसूत्रीविभाजन और शामिल प्रोटीन के गतिशील स्थानीयकरण का अध्ययन करने की अनुमति । भ्रूण और नवजात क्रोमेटिन फैलता meiotic दौर भर में घटनाओं के करीब विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं । Metaphase मैं और Metaphase द्वितीय क्रोमेटिन स्प्रेड बहनों और युग्मित मुताबिक़ गुणसूत्रों से एकल बहन chromatids भेद करने के लिए, साथ ही ploidy का आकलन किया जा सकता है । तुलना करके, प्रोटोकॉल यहां वर्णित पूरे oocyte immunolabelling है, जो अक्सर पृष्ठभूमि संकेत है कि क्रोमेटिन-बाध्य प्रोटीन के समाधान को कम कर देता है के उच्च स्तर का उत्पादन की तुलना में लाभप्रद हो सकता है । इसके अलावा, क्रोमेटिन प्रसार तकनीक लाइव सेल इमेजिंग, जो समय और विशेष उपकरणों की एक बड़ी निवेश की आवश्यकता के लिए एक आकर्षक विकल्प का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

भ्रूण और नवजात अंडाशय का पता लगाने और निकालने के लिए मुश्किल हो सकता है । हम सावधानी से अंडाशय के लिए खोज करने से पहले पंजाबियों से युक्त एक अलग पकवान में गुर्दे के अलावा अन्य सभी अंगों और सामग्री निकालने की सिफारिश, और प्रत्येक भ्रूण के लिए पंजाब के एक ताजा पकवान का उपयोग कर/ यदि भ्रूण/पिल्ला पुरुष है, वृषण tubule गठन के साथ ही gonads (चित्रा 2d) के स्थान के द्वारा अलग किया जाएगा । जैसे-जैसे पुरुष भ्रूण का विकास होता है, testes लिंग की ओर उतरना होगा, बड़ा और अंडाकार बनने का आकार.

oocyte क्रोमेटिन प्रसार तकनीक oocyte संग्रह और मुंह का उपयोग हेरफेर के स्वामित्व की आवश्यकता है ग्लास पिपेट या केशिका । हम इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन से पहले मुंह पिपेट को नियंत्रित अभ्यास की सलाह देते हैं । संग्रह और denuding अंडाणुओं के लिए उचित आकार ग्लास पिपेट/केशिका खींच सफलता और दक्षता के समय अंडाणुओं के बाहर है मशीन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से Tyrode के समाधान में है की संभावना में वृद्धि होगी । जिला परिषद हटाने के लिए सही समय इस विधि की सफलता के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है । यदि अंडाणुओं समय की एक अपर्याप्त राशि के लिए Tyrode समाधान में मशीन हैं, जिला परिषद पूरी तरह से हटा नहीं होगा । यह अंडाणुओं को स्लाइड पर कुशलतापूर्वक फटने से रोकता है, जैसा आरेख 6Eमें देखा जा सकता है । हालांकि, अगर अंडाणुओं बहुत लंबे समय के लिए है Tyrode समाधान में मशीन हैं, oocyte गुणवत्ता और बहाव इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला गंभीर रूप से समझौता किया जाएगा । हम एक खुर्दबीन के नीचे अंडाणुओं देखने के लिए सही समय जिला परिषद Tyrode के समाधान में घुल निर्धारित करने की सलाह देते हैं । Tyrode के समाधान के लिए एक समय में केवल 5-10 अंडाणुओं जोड़ना अत्यधिक जोखिम को कम करेगा । यदि अंडाणुओं को पीएफए-लेपित स्लाइड के ऊपर बहुत अधिक जारी किया जाता है, तो गुणसूत्रों को बहुत दूर तक फैलाया जा सकता है (चित्र 6F) । अंडाणुओं स्लाइड के ऊपर 1 सेमी जारी कर रहे हैं जब इष्टतम परिणाम पाए जाते हैं । अंय कारकों है कि परिणाम में बाधा oocyte हेरफेर कदम के दौरान परिवेशी हवा में सह2 स्तर की कमी के लिए लंबे समय तक निवेश शामिल कर सकते हैं । यह मीडिया है कि oocyte गुणवत्ता के लिए हानिकारक हैं में पीएच उतार चढ़ाव का कारण बनता है, और नारंगी लाल से गुलाबी करने के लिए मीडिया के प्रगतिशील रंग परिवर्तन से स्पष्ट है । मीडिया की बफ़रिंग क्षमता भी समय के साथ कम हो जाती है; इसलिए, हम 1 सप्ताह से अधिक समय के लिए (4 ° c) संग्रहीत किया गया है जो मीडिया का उपयोग करने की अनुशंसा नहीं करते हैं । M2 माध्यम है, जो2 की आवश्यकता नहीं है बफर किया जा करने के लिए, सामांयतः एक विकल्प के रूप में प्रयोग किया जाता है ।

क्रोमेटिन प्रसार की तैयारी के लिए एक सीमा कोशिका के मूल संदर्भ के भीतर क्रोमेटिन के दृश्य की कमी है । नाभिक के बाहर सेलुलर सामग्री visualized नहीं किया जा सकता है और धुरी गठन का आकलन नहीं किया जा सकता है । इसलिए, अंय तरीकों क्रोमेटिन फैलता है, जैसे monastrol उपचार के बाद पूरे oocyte immunolabelling के रूप में oogenesis का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो एक मोनो-ध्रुवीय धुरी में द्वि-ध्रुवीय धुरी गिर22। इससे सिस्टर chromatids का संदर्भ कक्ष के भीतर ही मूल्यांकन हो पाता है । सामूहिक रूप से, क्रोमेटिन प्रसार विधियों यहां वर्णित आसानी से उपंयास ट्रांसजेनिक और उत्परिवर्ती माउस मॉडल में oogenesis भर में क्रोमेटिन आकृति विज्ञान और गुणसूत्र ploidy का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम NIGMS (R01GM11755) द्वारा पी. डब्ल्यू. जे. और राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (NIH) (CA009110) से G.H. और J.H. को एक प्रशिक्षण अनुदान फेलोशिप द्वारा समर्थित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 Quality Biological 119-069-161
60 mm x 15 mm petri dishes Denville T1106
35mm x 12mm petri dishes Denville T1103
Fine forceps VWR 300-050
Micro dissection scissors Ted Pella 1340
Dissecting scissors, sharp tip, 41/2" VWR 82027-578
Watch glass square 1 5/8 Carolina Biological Supply Company 742300 Autoclave before each use
Sucrose Sigma S8501
Trisodium Citrate Dihydrate Sigma S1804
EDTA Sigma E6758
Trizma Base Sigma T1503
1,4-Dithiothreitol (DTT) Sigma 646563 Add to hypotonic buffer immediately before use
50x Protease Inhibitor Roche 11873580001 Add to hypotonic buffer immediately before use
Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in) Becton, Dickinson (BD) 309623
Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick) Thermo 3063-002
Super PAP pen, large (liquid blocker) Electron Microscopy Sciences (EMS) 71310
16% Paraformaldehyde aqueous Electron Microscopy Sciences (EMS) 15710
Triton X-100 Sigma T8787 Detergent in manuscript
Immuno stain moisture chamber Evergreen 240-9020-Z10
Coplin jars Fisher 08-815
Photo-flo 200 Electron Microscopy Sciences (EMS) 74257 Wetting agent in manuscript
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) Sigma G4877 Store aliquots at -20C
Human chorionic gonadotropin (HCG) Sigma C0434 Store aliquots at -20C
PYREX Spot Plates with nine concave cavities Fisher 13-748B Autoclave before each use
Glass capillary Fisher 22260943 For making oocyte collection needles
Brand Parafilm M Sigma BR701501 For making oocyte collection needles
Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter) Fisher 14-178-5B For making oocyte collection needles
Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter) Fisher 14-178-5D For making oocyte collection needles
Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing Sigma A5177-5EA For making oocyte collection needles
Mitutoyo micrometer head Mituoyo 150-208 For making oocyte collection needles
Syringe 5 mL BD Biosciences 309646 For making oocyte collection needles
Syringe filter 0.45 μm filter Corning 431220 For making oocyte collection needles
Glass Pasteur Pipette 5 3/4" Fisher 13-678-6A For making oocyte collection needles
83 x 0.5 mm pipette tip Denville P3080 For making oocyte collection needles
α-MEM Invitrogen 11415049
Waymouth's media Life Technologies 11220035
Fetal bovine serum Fisher A3160602
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A3311 For oocyte culture media
500ml filter units 0.22um Denville F5227
Hyaluronidase Sigma H3506
Tyrode’s solution Sigma T1788 Store aliquots at -20C
Horse serum Sigma H-1270 For ADB/wash buffer
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A1470 For ADB/wash buffer
VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI Vector Labs H-1200
Microscope cover slides (22mmx60mm) Fisher 12-544-G
Clear nail polish Amazon N/A
Name Company Catalog Number Comments
Microscopes
SteREO Discovery.V8 Zeiss 495015-0001-000
Observer Z1 Zeiss
Name Company Catalog Number Comments
Primary Antibodies
Mouse anti-MLH1 Life Technologies MA5-15431 Dilution factor- 1:100
Rabbit anti-SYCP1 Life Technologies PA1-16763 Dilution factor- 1:1000
Goat anti-SCP3 Santa Cruz sc-20845 Dilution factor- 1:50
Human anti-centromere protein Antibodies Incorporated 15-235 Dilution factor- 1:100
Rabbit anti- TOPOII Abcam ab109524 Dilution factor- 1:100
Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20) Abcam ab78517 Dilution factor- 1:500
Rabbit anti-Rec8 Courtesy of Dr. Karen Schindler N/A Dilution factor- 1:10,000
Name Company Catalog Number Comments
Secondary Antibodies
Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate Thermo-Fisher Scientific A-11057 Dilution factor- 1:500
Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate Thermo-Fisher Scientific A-21202 Dilution factor- 1:500
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate Thermo-Fisher Scientific A-31573 Dilution factor- 1:500
Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate Thermo-Fisher Scientific A-11004 Dilution factor- 1:500
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo-Fisher Scientific A-11013 Dilution factor- 1:500
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate Thermo-Fisher Scientific A-11011 Dilution factor- 1:500

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References

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जेनेटिक्स इश्यू १३२ Oocyte अर्धसूत्रीविभाजन क्रोमेटिन स्प्रेड oogenesis गुणसूत्र पृथक्करण इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी aneuploidy
क्रोमेटिन के लिए माउस Oocyte प्रगति के विश्लेषण के लिए प्रसार की तैयारी Metaphase द्वितीय के लिए चरण से
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Hwang, G. H., Hopkins, J. L., Jordan, P. W. Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II. J. Vis. Exp. (132), e56736, doi:10.3791/56736 (2018).

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