Summary
Oogenesi nei mammiferi sono noto per essere soggetta a errori, particolarmente dovuto malsegregazione di cromosoma. Questo manoscritto descrive metodi di preparazione di cromatina diffusa per profase mouse, metafase I e II-messa in scena di ovociti. Queste tecniche fondamentali consentono per lo studio della cromatina-proteine e morfologia del cromosoma in tutto mammiferi oogenesi.
Abstract
Tecniche di diffusione della cromatina sono stati ampiamente usati per valutare la localizzazione dinamica di varie proteine durante la gametogenesi, particolarmente per la spermatogenesi. Queste tecniche permettono per visualizzazione della proteina e modelli di localizzazione del DNA durante eventi meiotici quali cromosomi omologhi abbinamento, synapsis e riparazione del DNA. Mentre alcuni protocolli sono stati descritti nella letteratura, tecniche di diffusione generale della cromatina usando i oocytes profase mammiferi sono limitate e difficile dovuto i tempi di apertura di meiosi nelle ovaie fetali. In confronto, spermatociti profase possono essere raccolti da topi giovani maschi con rendimenti più alti senza l'esigenza di microdissection. Tuttavia, è difficile ottenere una popolazione pura sincronizzata delle cellule alle fasi specifiche a causa dell'eterogeneità delle popolazioni meiotica e post-meiotic delle cellule di germe nel testicolo giovanile e adulto. Per le successive fasi della meiosi, è vantaggioso per valutare gli ovociti che subiscono meiosi I (MI) o meiosi II (MII), perché gruppi di ovociti maturi possono essere raccolti da topi femminili adulti e stimolati per riprendere la meiosi nella cultura. Qui, metodi per le preparazioni di cromatina meiotica sviluppa usando i oocytes sezionato da fetale, neonatale e adulte ovaie sono descritti con dimostrazioni video di accompagnamento. Gli eventi di malsegregazione di cromosoma in mammiferi ovociti sono frequenti, specialmente durante MI. Queste tecniche possono essere utilizzate per valutare e caratterizzare gli effetti di mutazioni differenti o esposizioni ambientali durante le varie fasi dell'oogenesi. Come ci sono chiare differenze tra oogenesi e spermatogenesi, le tecniche descritte all'interno hanno un valore inestimabile per aumentare la nostra comprensione dell'oogenesi dei mammiferi e il sessualmente dimorphic caratteristiche delle dinamiche del cromosoma e della proteina durante la meiosi .
Introduction
Durante la spermatogenesi, grandi onde semisincrona meiotiche delle cellule di germe sono rapidamente e continuamente rifornite nel testicolo all'inizio della pubertà e durante l'età adulta1. In contrasto con i maschi, meiosi nelle femmine sono avviato esclusivamente durante lo sviluppo fetale. Dopo la nascita, gli ovociti rimangono arrestati in una fase prolungata dictyate di Profase I con un'intatto della vescicola germinale (GV; involucro nucleare) fino alla pubertà. Al momento della comparsa della pubertà, un sottoinsieme degli ovociti vengono selezionati ciclicamente a subire la crescita e la maturazione, segnando l'inizio della ripresa meiotica. Meiotica ripresa negli ovociti adulti si manifesta con la scomparsa del GV in un processo noto come rottura della vescicola germinale (GVBD). L'ovocita subisce quindi condensazione cromosomica e segregazione, seguita da estrusione corpo polare. Ovociti diventano arrestati sulla progressione di MII e sono stimolati per completare la divisione meiotica seconda e definitiva solo dopo la fecondazione.
Fertilità femminile è altamente dipendente dal successo della Profase Meiotica I progressione. Chiave di questo è la formazione di un collegamento fisico tra cromosomi omologhi, conosciuto come i chiasme, che è mediata dalla riparazione dell'indotto del DNA doppio filo (DSBs) tramite crossover ricombinazione2. Questo processo si verifica nel contesto di un'impalcatura proteico dinamico conosciuto come il complesso Sinaptonemale (SC) che si forma tra cromosomi omologhi per facilitare loro synapsis3. Lo SC è una struttura tripartita della chiusura lampo-come costituito da due elementi laterali paralleli collegati da proteine regione centrale che tiene gli omologhi insieme durante la riparazione del DNA in corso. Prima sinapsi, precursori degli elementi laterali, chiamati elementi assiali, formano tra la sorella cromatidi. Complesso Sinaptonemale proteine quali SYCP2 e SYCP3 formano elementi assiali che colocalize agli assi sorella-cromatidio coesione durante la profase precoce. Successivamente i servire come siti per la proteina del filamento trasversale, SYCP1, che facilita il montaggio di elemento centrale e sinapsi tra omologhi allineati4di legame. Nei oocytes del mouse, synapsis completa è indicata dalla presenza di 20 completamente sovrapposti tratti SYCP3 e SYCP1, che possono essere visualizzati utilizzando cromatina diffondere preparazioni. Synapsis è completato con l'entrata in sotto il tavolino di pachitene, per cui maturo crossover che sono destinati a chiasmata forma tra omologhi sono decorate con mutL dimeri di omologo (MLH1/3) per promuovere la loro accurata lavorazione5,6 , 7. la manutenzione strutturale dei complessi di cromosomi (SMC), tra cui coesina, condensin e il SMC5/6 complessi, sono importanti per la regolazione della dinamica di cromosoma e struttura durante meiosi8,9, 10,11,12. Collettivamente, questi eventi garantiscono bi-orientamento corretto di cromosomi omologhi a opposte pali dell'alberino dopo smontaggio della SC.
Il ciclo cellulare meiotico è un potente modello per esaminare i ruoli delle varie proteine in manutenzione di genoma a causa dell'induzione programmata e la successiva riparazione di DNA DSBs. Inoltre, la meiosi dei mammiferi sono anche un modello rilevante per lo studio delle modificazioni epigenetiche e imprinting13. Tuttavia, è tecnicamente difficile valutare questi eventi durante la meiosi femminile, che si svolge nelle ovaie fetali e neonatali nei mammiferi (Figura 1). Profase I posso essere divisa in 5 sottostadi: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema e dictyate. Qui, descriviamo come isolare e distinguere tra fetale e neonatale ovaie e testicoli (Figura 2). Adattato da metodi precedentemente descritti, questo manoscritto delinea anche un protocollo (fase 1) con video dimostrativo per la preparazione di Profase Meiotica femmina ho cromatina si diffonde14,15,16,17 . Quando accoppiato con immunolabelling, come descritto nei passaggi 6-7, questo protocollo consente analisi microscopica dettagliata della Profase I eventi negli ovociti.
Oogenesi sono soggetta a errori ed eventi malsegregazione cromosoma durante la prima divisione meiotica rappresentano la fonte più comune di malattia genetica nella progenie18,19. In questo manoscritto (punto 2 del protocollo), descriviamo un protocollo in cui gli ovociti maturi in scena GV sono estratti da innescato ovaie di topi femminili adulti. In condizioni favorevoli, ovociti adulti subiscono luteinizing ormone-indipendente ripresa della meiosi seguendo l'isolamento e la coltura20. In seguito ripresa meiotica, ovociti progredire attraverso meiosi I, quindi arrestano in metafase II. Gli ovociti rimangono arrestati in metafase II, a meno che non fertilizzato. Nei passaggi 2-5, ci adattiamo protocolli precedentemente segnalati con video dimostrativo per descrivere come raccogliere, cultura e preparare gli ovociti MI e MII per cromatina diffusa preparazioni21. Questa tecnica di diffusione di cromatina consente immunolabelling chiaro di proteine associate con i cromosomi. Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato anche per distinguere tra cromosomi bivalenti e univalent e può ulteriormente risolvere single sorella cromatidi per facilitare la valutazione della ploidia degli ovociti. Pertanto, oltre a rivelare modelli di localizzazione delle proteine meiotiche, questo protocollo può anche servire come uno strumento prezioso per il delucidamento potenziali cause di malsegregazione cromosoma durante MI e MII.
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Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della Johns Hopkins University. Gli esperimenti sono stati eseguiti su topi C57BL/6J wild-type.
1. raccolta ovaie fetale o neonatale e preparazione della cromatina profase si diffonde
- Per estrarre gli embrioni a 14,5 – 19,5 giorni coitum dell'alberino (dpc) sacrificare le femmine incinte tramite dislocazione cervicale o CO2 asfissia secondo linee guida IACUC.
Nota: Per le ovaie postnatale giorno 1 – 5, passare al punto 1.3. Figura 1 riassume le fasi Profase Meiotica arricchite alle diverse età embrionale e post-natale. - Aprire la cavità abdominopelvic utilizzando forbici sterili, rendendo un'apertura a forma di V. Sezionare il corno uterino materno, separare gli embrioni dalla placenta e trasferire gli embrioni in 35mm di Petri contenente 3 mL di pre-riscaldato 1 x la soluzione salina tampone fosfato (PBS) a 37 ° C.
Nota: Un fliptop incubatore a 37 ° C può essere utilizzato per mantenere la temperatura. Inoltre, una fase di vetro temperatura regolata utilizzabile anche per mantenere la temperatura durante la manipolazione dell'ovaia. - Con forbici chirurgiche da 3,5 pollici, sacrificare embrioni o cuccioli tramite decapitazione secondo linee guida IACUC. Posto decapitati embrioni o cuccioli in PBS preriscaldata prima dell'ulteriore dissezione.
- Sezionare un embrione o cucciolo alla volta in una capsula Petri 35mm separato contenente 3 mL di PBS pre-riscaldato a 37 ° C. Procedere tagliando lungo la linea mediana ventrale della metà posteriore dell'embrione, lungo la metà anteriore sotto le zampe anteriori e direttamente sopra le arti posteriori e la coda come indicato in Figura 2A–B.
- Aprire l'addome utilizzando forbici chirurgiche da 3,5 pollici. Usando il forcipe punta fine spostare o rimuovere il fegato e le anse intestinali, esponendo le ovaie in un nuovo 35mm di Petri contenente 3 mL di PBS pre-riscaldato a 37 ° C (Vedi Guida in Figura 2B). Le ovaie si trovano immediatamente sotto e dietro il rene verso la parete posteriore della cavità peritoneale (Figura 2B–C). Una guida per la differenziazione tra maschio e femmina gonadi è fornita in Figura 2D.
Nota: Per condizioni ottimali, rapidamente sezionare le ovaie dopo donna incinta viene sacrificata. - Rimuovere entrambe le ovaie da ogni feto femminile usando un paio di pinze a punta fine sotto un ambito di dissezione e posto in una vetri da orologio o pozzetti separati di un multi-pozzo piastra da 0,5 a 1,0 mL di PBS preriscaldata e mantengono a 37 ° C.
- Posizionare ogni coppia delle ovaie in 0,5 mL di tampone hypo-estrazione (17mm citrato trisodico biidrato, saccarosio 50 mM, 5 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 30 mM Tris-HCl, inibitore della proteasi, pH 8.2) in un vetro da orologio pulito o un piccolo pozzo di una piastra 9, avendo cura di immergere il comp di ovaie completamente. Incubare per almeno 15 min, ma non più di 30 min.
Nota: Fare tampone di hypo-estrazione fresco e utilizzare entro 2 ore DTT aggiunta. - Durante l'incubazione, utilizzando una penna PAP barriera idrofoba, è possibile disegnare due 22x22 mm2 quadrati in un bicchiere pulito 25 x 75 mm2, vetrino da microscopio spessore 1 mm come mostrato in Figura 3A.
Nota: Diapositive possono essere preparati prima del tempo. - 45 – 50 µ l di saccarosio di 100 mM su un vetrino pulito e trasferire una coppia delle ovaie per la discesa.
- Utilizzando l'estremità tagliente di due aghi 27 G, prendere in giro le ovaie a pezzi per rilasciare cellule nella soluzione di saccarosio. Con una pinza, rimuovere pezzi grossi dell'ovaia e Pipettare attentamente la soluzione di saccarosio per disperdere le cellule.
- Posto 40 µ l di soluzione fissante (1% paraformaldeide (PFA), 0,2% detergente (Vedi Tabella materiali), pH 9.2) in ogni quadrato del vetrino preparato. Con una punta di pipetta 200 µ l, distribuire la soluzione fissante uniformemente sopra la superficie di scorrimento.
- Pipettare 20 µ l della miscela saccarosio sulla ogni piazza della diapositiva contenente il fissativo.
Nota: Questo equivale a usare un paio di ovaie per ogni diapositiva. - Incubare i vetrini in una camera umida chiusa durante la notte a temperatura ambiente.
Nota: L'incubazione overnight possa oscillare intorno ai (12-15 ore) a temperatura ambiente. - Aprire il coperchio e lasciare i vetrini asciugare completamente.
- Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin contenente 50 mL di soluzione imbibente-PBS 0,4% (Vedi Tabella materiali) per 2 min, lasciare asciugare all'aria e procedere al protocollo immunolabelling (passaggio 6).
Nota: È possibile memorizzare le diapositive a-80 ° C per un uso successivo, ma questo varia a seconda della proteina di interesse. Per ottenere risultati ottimali procedere immediatamente al protocollo immunolabelling (passaggio 6).
2. metafase ho raccolta degli ovociti
- Per massimizzare il numero di follicoli antrali isolato da ogni mouse, iniettare intraperitonealmente topi femminili vergini sessualmente maturi con 5 UI di gonadotropina del siero di cavalla gravida (PMSG, gonadotropina corionica conosciuto anche come equina (eCG)).
Nota: Per una resa ottimale degli ovociti, topi dovrebbero essere 1 a 3 mesi di età, come il numero di ovociti raccolti diminuirà con l'età. Per preparare PMSG, sciogliere bottiglia di 5.000 UI in 100 mL di PBS sterile (5ml U/0.1) Store in aliquote monouso di 600 µ l a-20 ° C. - Dopo 44 – 48 h, preparare il supporto di collezione, minimo essenziale medio alfa (MEMα) supplementato con 5% siero bovino fetale (FBS) e 3 mg/mL di sieroalbumina bovina (BSA; MEMΑ/BSA/FBS). Sterilizzare media attraverso un filtro di pori di 0,2 µm. Decantare 2,5 mL MEMα/BSA/FB medio in un piatto di vetro per topo e calda a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 .
Nota: Altri raccolta e terreni di coltura che sono commercialmente disponibili (M2 e M16) sono inoltre comunemente usati.
Attenzione: Si consiglia di rimuovere le piastre di coltura dall'incubatrice2 CO 5% uno alla volta per una durata limitata minimizzare l'esposizione all'aria ambiente durante le fasi di manipolazione. - Sacrificare i topi tramite dislocazione cervicale o CO2 asfissia secondo linee guida IACUC.
- Aprire la cavità abdominopelvic utilizzando forbici sterili, facendo una grande apertura a forma di V. Usando il forcipe, spostare intestini verso la testa del mouse. Individuare ogni corno uterino; le ovaie sono presenti prossimale per la gabbia toracica. Tenere l'ovidotto con una pinzetta e tagliare il grasso superiore all'ovaia usando le forbici per dissezione (Figura 4). Continuare a tenere l'ovidotto e con un altro set di una pinzetta rilasciare ovaia dalla bursa e posto in un piatto di raccolta contenente mezzo MEMα/BSA/FBS.
Nota: Come nel passaggio 1, è fondamentale per mantenere le ovaie a 37 ° C e mantenere al 5% CO2. Un incubatore di fliptop collegato al 5% CO2 mix utilizzabile per consentire il mantenimento ottimale della temperatura e i livelli di CO2 . Inoltre, una fase di vetro temperatura regolata dovrebbe essere utilizzata anche per mantenere la temperatura durante la manipolazione degli ovociti. - Usando una siringa da 1 mL con un ago 27 gauge (o dimensioni simili), rilasciare complessi ovocita cumulo perforando manualmente i grandi follicoli antrali.
- Osservando attraverso un microscopio di dissezione, raccogliere i oocytes GV-organizzato utilizzando una pipetta di vetro bocca-operati o capillare o una manuale micrometro-siringa (Figura 5). Raccogliere solo gli ovociti che vengono rilasciati da follicoli antrali. Gli ovociti GV hanno un diametro di circa 90 µm. GV ovociti possono essere circondati da 2-3 strati di cellule della granulosa e hanno un diametro totale di circa 200 µm.
- Cultura di ovociti in un vetro da orologio pulito o una piastra 9-pozzetti contenenti MEMα/BSA/FBS mezzo per 6 h raggiungere la metafase I a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 .
- Procedere al passaggio 4.
3. metafase II (MII) ovocita collezione
- Per massimizzare gli ovociti isolati da ogni mouse, iniettare intraperitonealmente topi femminili vergini sessualmente maturi con 5 IU di PMSG. Dopo 44 – 48 h, iniettare per via intraperitoneale con 5 UI di gonadotropina corionica umana (hCG).
Nota: Per una resa ottimale degli ovociti, topi dovrebbero essere 1 a 3 mesi di età, come il numero di ovociti raccolti diminuirà con l'età. Per preparare hCG, sciogliere una bottiglia di 10.000 U in 200 mL di PBS (5ml U/0.1). Conservare in varie porzioni monouso di 600 µ l a-20 ° C. - Dopo 12-14 ore, preparare mezzo di raccolta MEMα/BSA/FBS, come descritto al punto 2.2, sopra.
- Sacrificare i topi tramite dislocazione cervicale o CO2 asfissia secondo linee guida IACUC.
- Aprire la cavità abdominopelvic utilizzando forbici sterili, facendo una grande apertura a forma di V. Usando il forcipe, spostare intestini verso la testa del mouse. Le ovaie sono presenti prossimale per la gabbia toracica, individuare ogni corno uterino. Tenere l'ovidotto con una pinzetta e tagliare il grasso superiore all'ovaia usando le forbici per dissezione (Figura 4). Quindi rimuovere l'ovaia e l'ovidotto e porre nel piatto di raccolta contenente mezzo MEMα/BSA/FBS.
Nota: Come nei passaggi 1 e 2, è fondamentale per mantenere le ovaie a 37 ° C e mantenere al 5% CO2. Un incubatore di fliptop collegato al 5% CO2 mix utilizzabile per consentire il mantenimento ottimale della temperatura e i livelli di CO2 . Inoltre, una fase di vetro temperatura regolata dovrebbe essere utilizzata anche per mantenere la temperatura durante la manipolazione degli ovociti. - Utilizzando una siringa da 1 mL con un 27 G (o dimensioni simili) o sharp forcipe, strappare un buco nel ampulla di ovidotto per rilasciare gli ovociti MII.
Nota: Fare attenzione a non danneggiare gli ovociti in ampulla. Ampulla apparirà gonfio e traslucido, tale che gli ovociti sono visibili (Figura 4). - Raccogliere gli ovociti MII dal ampulla dell'ovidotto in un piatto nuovo con medium collezione facendo uso di una pipetta di vetro bocca-operati o capillare o una manuale micrometro-siringa (Figura 5).
- Procedere al passaggio 4.
4. ovocita denudamento e rimozione di Zona Pellucida
- Preparare 300 IU/mL di ialuronidasi in medium MEMα completate con 3 mg/mL BSA a impoverire gli ovociti delle circostanti cellule del cumulo (2,5 mL/topo) in un vetro da orologio e mantenere a 37 ° C, 5% CO2.
Nota: L'efficacia dell'ialuronidasi diminuisce acutamente dopo 1 h di preparazione. Per ovociti MII, ialuronidasi trattamento non è necessario. - Esporre i complessi delle cellule ovocita-cumulo a 300 IU/mL di ialuronidasi in MEMα/BSA per 3 min a impoverire gli ovociti delle circostanti cellule del cumulo.
Attenzione: Non superare 3 min di esposizione all'ialuronidasi, poiché potrebbe danneggiare gli ovociti. - Per lavare gli ovociti, trasferimento ovociti in un fresco riscaldato piatto medio MEMα/BSA. Utilizzando una pipetta di vetro bocca-operati o capillare (leggermente più grande rispetto al diametro dell'ovocita, che è circa 90 µm), pipettare i complessi su e giù per staccare completamente le cellule del cumulo. Consentire gli ovociti recuperare nell'incubatrice mentre si prepara per il prossimo passo.
- Soluzione di caldo acida Tyrode, MEMα/BSA e media di Waymouth a 37 ° C (500 µ l/topo). Posto 300 µ l in ogni pozzetto di lastre di vetro 9-Pozzo piccolo.
- Per rimuovere la zona pellucida (ZP) trasferire 5 – 10 ovociti in soluzione di Tyrode. Esporre gli ovociti per solo 30-45 s alla soluzione.
Nota: Esposizione troppo poco alla soluzione non rimuoverà la ZP completamente, che impedirà gli ovociti da scoppio e cromosomi da spalmare. Troppa esposizione danneggiare e uccidere l'ovocita. Guardando la dissolvenza di ZP sotto il microscopio di dissezione può aiutare a ottimizzare il tempo di esposizione.
Attenzione: Utilizzando la soluzione di Tyrode fresco è critica, come sua funzione diminuisce con l'età. Utilizzare un pozzo fresco della soluzione di Tyrode per ogni gruppo di ovociti trattati per assicurare uniforme digestione della ZP. - Immediatamente dopo la rimozione di ZP, lavare gli ovociti trasferendo in medio MEMα/BSA/FBS riscaldato. Ripetere questo passaggio di lavaggio.
Nota: Fare attenzione durante il trasferimento, come gli ovociti attaccherà facilmente insieme e la pipetta di vetro o capillare segue la rimozione della ZP. La pipetta di vetro o capillare in mezzo di Waymouth di prebagnatura ridurrà ovociti attaccare insieme. - Trasferire e consentire gli ovociti recuperare per 30 minuti nel mezzo di Waymouth a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 .
- Procedere al passaggio 5.
5. MI e MII ovocita della cromatina si diffonde
- Utilizzando una penna PAP, disegnare un rettangolo di2 11 x 44 mm su vetrino come mostrato in Figura 6A.
- Ricoprire il vetrino con un sottile strato di fissativo (1% paraformaldeide, 0,2% Triton-X100 in H2O, pH 9.2) di Pipettare 100 µ l di fissativo sulla diapositiva e dondolo avanti e indietro la diapositiva. Tocca la diapositiva per sbarazzarsi di fissativo in eccesso.
- Pick up tra 5-10 ovociti con un ago di pipetta piccola bocca con come mezzi piccoli come possibile e trascinare l'ago in una linea attraverso la diapositiva rivestite con fissativo mentre depositando gli ovociti da 1 cm sopra il vetrino nella soluzione fissante. Eseguire questo passaggio utilizzando un microscopio di dissezione per garantire che gli ovociti sono stati depositati e che essi hanno scoppiato.
Nota: Gli ovociti dovrebbero scoppiare immediatamente sulla diapositiva. L'altezza alla quale gli ovociti vengono depositati impatto il grado di diffusione della cromatina. Vedere risultati rappresentativi nella Figura 6 per ulteriori dettagli. - Incubare i vetrini a temperatura ambiente in una camera umidificata chiusa durante la notte per consentire la cromatina di aderire.
- Lasciare i vetrini asciugare completamente e sciacquare i vetrini in una vaschetta di Coplin contenente 50 mL di 0,4% imbibente-H2O, pH 8.0.
- Procedere al passaggio 6.
6. Immunolabelling
- Preparare il tampone di diluizione di anticorpo (ADB) descritto nella tabella 1.
- Preparare due vasetti di Coplin contenente 50 mL di soluzione di lavaggio tampone (WB) (10% ADB diluito in PBS) e uno di Coplin contenente 50 mL di WB e 0,05% di soluzione detergente (ad esempio, aggiungere 250 µ l di 10% detergente 50ml WB).
- Lavare le diapositive che sono state preparate nella sezione 1 e 5 del presente protocollo per 10 min in una vaschetta di Coplin contenente 50 mL di WB.
Attenzione: Non lasciate che le diapositive asciutto in qualsiasi punto durante il immunolabelling. - Lavare i vetrini per 10 min nel Coplin jar contenente 50ml WB e 0,05% di soluzione detergente. Quindi, lavare i vetrini nel restante di Coplin contenente 50 mL di soluzione di WB per 10 min.
- Tocca Disattiva diapositiva in eccesso di liquido e copertura con 100 µ l di anticorpi primari selezionati diluito in ADB. Incubare a 4 ° C durante la notte in una camera umida chiusa.
Nota: L'incubazione può essere ridotto a 2-3 ore a 37 ° C. Utilizzare volumi più piccoli dell'anticorpo (ad es., 50 µ l) coprendo il vetrino con un vetrino coprioggetto o parafilm. - Sciacquare i vetrini in una vaschetta di Coplin contenente 50 mL di soluzione di 0,2% imbibente-PBS, pH 8.0.
- Ripetere i passaggi da 6,2 e 6,5.
- Tocca Disattiva diapositiva in eccesso di liquido e copertura con 100 µ l di anticorpi secondari selezionati diluito in ADB. Incubare i vetrini 1 a 2 ore a 37 ° C in una camera umida chiusa.
- Lavare i vetrini 2 volte per 10 min in vasetti di Coplin contenente 50 mL di soluzione di 0,2% imbibente-PBS, pH 8.0.
- Lavare i vetrini 2 volte per 5 min in vasetti di Coplin contenente 50 mL di soluzione imbibente-H2O di 0,2%, pH 8.0.
7. montaggio vetrini
- Per profase della cromatina spread preparato nel passaggio 2, aggiungere 100 µ l di mezzo di montaggio contenente 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1.5µg / mL). Per cromatina MI e MII si diffonde preparato nel passaggio 5, aggiungere 50 µ l di mezzo di montaggio contenente DAPI (1.5µg / mL). Asciugare delicatamente il liquido in eccesso assente.
- Porre un coprivetrino 22 x 60 mm sulla parte superiore e sigillare con smalto trasparente. Conservare in una scatola di diapositiva a 4 ° C o -20 ° C fino alla valutazione tramite microscopia a fluorescenza.
Nota: Toccare leggermente il coprioggetto per sbarazzarsi di mezzo di montaggio in eccesso prima di sigillare con smalto.
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Representative Results
Abbiamo descritto due tecniche per visualizzare e valutare i cromosomi meiotici negli ovociti. La prima tecnica è adatta per valutare la progressione della profase in ovaie embrionale e neonatale. Profase della cromatina diffusione preparazioni sono incredibilmente utili per la visualizzazione di numerosi processi dinamici durante la meiosi, tra cui cromosoma abbinamento, synapsis e desynapsis, ricombinazione omologa e rimodellamento epigenetico del cromosoma. Qui, abbiamo dimostrato l'utilità di questo metodo per visualizzazione robusto e analisi quantitativa della formazione di crossover in ovociti ottenute da embrioni di C57BL/6J (Figura 3B e 3C). Per arricchire per le celle in sotto il tavolino di pachitene, embrioni del mouse sono stati recuperati a 18,5 dpc (Figura 1). Due importanti caratteristiche principali sotto il tavolino di pachitene della Profase I sono il completamento di synapsis tra omologhi e la formazione di almeno un crossover di MLH1/3-positivo al paio omologo. Synapsis completa tra omologhi si manifesta con la presenza di 20 sovrapposti SYCP3 e SYCP1 si estende. A caratterizzare la formazione di crossover in ovociti di selvaggio-tipo abbiamo immunolabeled profase cromatina diffondere preparati usando gli anticorpi che rilevano SYCP3, SYCP1 e MLH1 e macchiato del DNA utilizzando DAPI. Figura 3B raffigura un'immagine rappresentativa di un ovocita di fase pachitene, che testimonia la presenza di 27 MLH1 fuochi distribuiti lungo 20 strutture SC completamente assemblate. Il numero medio dei crossover di MLH1-positivo rilevato in ovociti di selvaggio-tipo era 24 ± 3 (Figura 3 C, N = 15 ovociti). Figura 3D Mostra SMC6 arricchita alle regione pericentromerica eterocromatina (PCH) e lungo le braccia del cromosoma e i fuochi di MLH1 distribuiti lungo la SC presso il pachitene. 3E figura raffigura un ovocita di pachitene in scena dove la preparazione di diffusione di cromosoma era sub-ottima e singoli cromosomi sono indistinguibili, impedendo la valutazione esatta del SYCP3, SMC6 e MLH1. Cromosomici sub-ottimale possono essere osservate quando l'incubazione delle ovaie nel buffer hypo-estrazione è troppo a lungo o non a lungo abbastanza.
La seconda tecnica descritta può essere utilizzata per valutare la morfologia della cromatina negli ovociti ripresa meiotica (Figura 6B-D). La localizzazione della proteina, come pure la ploidia, facilmente valutabili, esponendo le possibili cause di errori di segregazione del cromosoma. Figura 6B raffigura un ovocita MI risultati 20 cromosomi e chiaro del centromero e macchiatura di eterocromatina pericentromerica. Figura 6 è un'immagine ingrandita dove topoisomerasi IIα (TOPOII) possono essere visto lungo i bracci del cromosoma e il PCH. Figura 6 raffigura un ovocita MII dove accoppiata sorella cromatidi si possono distinguere dalla morfologia del cromosoma e del centromero. Errori comuni visualizzati quando si tenta di questa tecnica sono gli ovociti non scoppio quando rilasciato nella diapositiva di PFA-rivestito, come pure i cromosomi diffusione troppo distanti fra loro (Figura 6E–F). Se la ZP non viene rimosso completamente, i cromosomi rimarrà associati al mandrino, come mostrato in Figura 6E. Se gli ovociti sono sceso troppo in alto dalla diapositiva rivestite con PFA, i cromosomi possono essere sparso troppo distanti come raffigurato nella Figura 6F.
Figura 1: Profase Meiotica timeline durante lo sviluppo embrionale e neonatale femminile. Contorni blu indicano le popolazioni profase specifici sub-fase delle cellule di germe (leptotene, zigotene, pachitene e fasi di diplotene/dictyate) osservate durante lo sviluppo embrionale e neonatale. Aumentante di colore blu scuro indica i tempi in cui la sub-fase profase specifico diventa più abbondante. Questa figura è stata adattata da riferimento2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: estrazione dell'ovaia da embrioni e cuccioli femminili neonatali. (A, B) Il primo taglio (1) è fatta sopra le zampe anteriori per decapitare l'embrione alla giunzione testa/collo immediatamente dopo il recupero dal corno uterino materno. Il secondo taglio (2) avviene lungo la linea mediana ventrale della metà posteriore dell'embrione, seguita da incisioni lungo la metà anteriore sotto le zampe anteriori (3). Un taglio finale è fatto per la rimozione, le zampe e la coda (4). (A) schema elettrico vista frontale di dissezione tagli per l'isolamento delle ovaie da femminili cuccioli. (B) schema elettrico vista laterale dei tagli di dissezione per isolamento delle ovaie con posizioni relative degli organi interni. Regioni mostrate nella luce rosse includono il fegato e intestino, che vengono rimossi durante la dissezione. La parete dorsale e gli organi associati vengono visualizzati in luce blu. Questa regione comprende le ovaie, che sono collegate ai poli inferiori dei reni nella parte superiore del corno uterino. (C) vista frontale schematica della parete dorsale dell'embrione dopo rimozione del fegato e dell'intestino. (D) rappresentazione schematica delle differenze morfologiche tra maschio e femmina gonadi in circa 15 – 18 dpc. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: cromatina rappresentante profase diffusa preparazioni. (A) vetro diapositiva schematico per diffusione della cromatina profase i preparativi. Profili quadrati neri rappresentano liquido bloccante penna contorni. (B, C) Immagini rappresentative e quantificazione della formazione di crossover in ovociti di selvaggio-tipo pachitene fase utilizzando della cromatina profase sviluppa metodi di preparazione descritte nel passaggio 1. Si sparge della cromatina (B) sono state effettuate usando ovaie embrioni del mouse fromC57BL/6J isolati a 18,5 dpc. Cromatina spread erano immunolabeled con gli anticorpi contro la proteina di elemento laterale SC SYCP3 (rosso) e la proteina di elemento centrale SC SYCP1 (magenta), MLH1 (verde, marcatore di eventi crossover) e DAPI (blu, DNA). Barra della scala = 10 µm. (C) Dot plot dei fuochi MLH1 conteggi ottenuti dalla cromatina di fase pachitene 15 diffondere preparazioni. Barre di errore rappresentano la deviazione standard. (D, E) confronto di ottimale (D) e sub-ottimale (E) profase diffusa preparazioni, rispettivamente. Cromatina spread immunolabeled con gli anticorpi contro SMC6 (rosso), MLH1 (verde) e SYCP3 (blu). Barra della scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: diagramma schematico dell'ovaia adulto. Questo diagramma illustra l'anatomia dell'ovaia di topo adulto, ovidotto, ampolla e utero. Ovaie di mouse dovrebbero essere rimosso da un'attenta incisione dei legamenti le ovaie come collegare i poli inferiori dei reni e la parete posteriore dell'addome. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: immagini di pipetta di vetro bocca-operati, capillare di vetro e manuali micrometro-siringa utilizzata per la manipolazione degli ovociti. (A) il manipolatore di ovocita pipetta di vetro è composto dei seguenti componenti in sequenza: boccaglio, tubazione del lattice (diametro interno (ID) di 3,2 mm x 6,4 mm di diametro esterno (OD)), punta della pipetta 1ml, tubazione del lattice (6,4 mm ID x 11,1 mm di diametro) e vetro pipetta Pasteur. Alla fine del vetro pipetta Pasteur è stato riscaldato sopra una fiamma e alla fine ha tirato per creare un'estremità appuntita (Figura 5A1). (B) il manipolatore di ovocita capillare di vetro è composto dei seguenti componenti in sequenza: boccaglio, 0.45 µm filtro (opzionale), tubi in lattice (3,2 mm ID x 6,4 mm di diametro), punta della pipetta 1ml, tubazione del lattice (6,4 mm ID x 11,1 mm di diametro) e capillare di vetro 70 µ l. I tubi capillari di vetro sono riscaldati a fuoco al centro e tirati in direzioni opposte per creare due capillari con estremità punta fine (figura 5B1). (C) manuali micrometro-siringa è composta dei seguenti componenti in sequenza: testa 150-208 micrometri Mitutoyo (formato, 0-1 centrale "gamma, 0.001" laurea), siringa da 5 mL, tubazione del lattice (3,2 mm ID x 6,4 mm di diametro), punta della pipetta 1ml, tubazione del lattice (6,4 mm ID x 11,1 mm di diametro), punta della pipetta da 1 mL e una punta di caricamento di 83 x 0,5 mm2 gel. La testa di 150-208 micrometri Mitutoyo sia inserita saldamente la siringa da 5 mL (5 di figura1). Per assicurarsi che la punta di caricamento del gel è fissata saldamente, la pipetta 1ml collegamento punta è tagliata (5 di figura2). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: metafase rappresentante ho e cromatina dell'oocita II sviluppa preparati. (A) Slide schematico per metafase I e II dell'ovocita della cromatina diffusione preparati. Ovociti (cerchi) rilasciati tramite pipetta di vetro bocca-operati o capillare in linea retta (seguendo la freccia). Contorno del rettangolo nero rappresenta liquido bloccante penna contorno. (B, C) Metafase ottimale ho cromatina diffusa preparazione. Metafase I cromosomi sono stati macchiati con DAPI (blu, DNA) e immunolabeled al CEN (marcatura verde, cinetocore/centromero). Barre di scala = 10 µm. (B) gli anticorpi contro istone H4 (di metile K20, tri metil K20) sono stati usati per etichettare eterocromatina pericentromerica (PCH). (C) anticorpi contro topoisomerasi IIα (TOPOII) sono stati utilizzati per etichettare gli assi PCH e cromosoma. (D) della cromatina ottimale metafase II diffusa preparazione. Cromosomi in metafase II sono stati macchiati con DAPI (blu, DNA) e immunolabeled al CEN (verde) e istone H4 (di-metil K20, tri-metil K20) per etichettare il PCH. Barra della scala: 10 µm. (E, F) poveri metafase ho cromatina diffusa preparazioni. I cromosomi sono stati macchiati con DAPI (blu, DNA) e immunolabeled al CEN (verde) e il componente di coesina meiotica, REC8. Barre di scala = 10 µm (E) un ovocita che non ha fatto scoppiare al momento del rilascio su vetrino rivestiti in PFA. (F) cromosomi che sono stati sparsi troppo distanti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Elemento | Importo | Concentrazione finale |
| 1x PBS | 50 mL | 1 x |
| BSA | 1,5 g | 3% (p/v) |
| Siero equino | 5 mL | 10% (v/v) |
| 10% detersivo (Vedi Tabella materiali) in PBS |
250 ΜL | 0,05% (v/v) |
Tabella 1: Ricetta di buffer (ADB) di anticorpo diluizione. ADB, conservare a 4 ° C o congelare scorte a-20 ° C se rendendo più grandi quantità. ADB può essere contaminato, quindi assicuratevi di buone tecniche asettiche sono utilizzati e valutare la soluzione per la contaminazione prima di ogni utilizzo. Più piccole aliquote di ADB possono essere preparate anche per minimizzare la contaminazione.
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Discussion
Cromatina diffusione preparati permettono ai ricercatori di studiare cronologicamente femmina mammiferi meiosi e la localizzazione dinamica delle proteine coinvolte. Gli spread di cromatina embrionale e neonatale consentono analisi di eventi durante la profase meiotica. Metafase I e metafase II cromatina spread può essere utilizzato per distinguere single sorella cromatidi da accoppiato cromosomi omologhi appaiati e sorelle così come valutare ploidia. In confronto, il protocollo descritto qui può essere vantaggioso rispetto al immunolabelling intero ovocita, che spesso produce alti livelli di segnale di fondo che riduce la risoluzione delle proteine della cromatina associato. Inoltre, tecniche di diffusione della cromatina rappresentano un'alternativa attraente per imaging di cellule vive, che richiede un grande investimento di tempo e di attrezzature specializzate.
Ovaie embrionale e neonatale possono essere difficile da individuare ed estrarre. Si consiglia di estrarre con cura tutti gli altri organi e materiale oltre i reni in un piatto separato contenente PBS prima di cercare per le ovaie e utilizzando un piatto fresco di PBS per ogni embrione/pup (Figura 2B). Se l'embrione/pup è maschio, testicolo saranno distinguibile dalla formazione del tubulo, nonché la posizione delle gonadi (Figura 2D). Come sviluppano gli embrioni maschii, i testicoli scenderà verso il pene, diventando più grande di forma ovale.
L'ovocita cromatina diffusa tecnica richiede la padronanza di raccolta degli ovociti e manipolazione usando la pipetta di vetro bocca-operati o capillare. Si consiglia di praticare la pipetta di bocca di controllo prima di eseguire questo protocollo. Tirando la pipetta/capillare di vetro a dimensioni adeguate per la raccolta e denudamento ovociti aumenterà le probabilità di successo e l'efficienza riducendo al minimo tempo di ovociti sono all'esterno dell'incubatrice anche come soluzione di Tyrode. Tempistica corretta per la rimozione di ZP è estremamente importante per il successo di questo metodo. Se gli ovociti vengono incubati in soluzione di Tyrode per una quantità insufficiente di tempo, la ZP non verrà rimosso completamente. Ciò impedisce di scoppio in modo efficiente sulla diapositiva, come si può vedere in Figura 6Egli ovociti. Tuttavia, se gli ovociti vengono incubati in soluzione di Tyrode per troppo tempo, la qualità degli ovociti e colorazione di immunofluorescenza a valle sarà gravemente compromessa. Si consiglia di guardare gli ovociti sotto un microscopio per determinare l'ora esatta della ZP si dissolve in soluzione di Tyrode. Aggiungendo solo 5 – 10 ovociti per volta alla soluzione di Tyrode riduce al minimo l'esposizione eccessiva. Se gli ovociti vengono rilasciati troppo alto sopra la diapositiva rivestiti in PFA, i cromosomi possono essere sparso troppo distanti fra loro (Figura 6F). Risultati ottimali si trovano quando gli ovociti vengono rilasciati 1 cm sopra la diapositiva. Altri fattori che possono ostacolare i risultati includono l'esposizione prolungata a livelli in diminuzione di2 CO nell'aria ambiente durante le fasi di manipolazione degli ovociti. Ciò causa le fluttuazioni di pH dei media che sono dannose per la qualità degli ovociti ed è evidente dal cambiamento di colore progressivo dei media dal rosso-arancio al rosa. La capacità tampone dei media anche diminuisce nel tempo; Pertanto, si consiglia di non utilizzando mezzi di comunicazione che è stato conservato (4 ° C) per più di 1 settimana. Mezzo di m2, che non richiede di CO2 per essere memorizzati nel buffer, è comunemente usato come un'alternativa.
Una limitazione ai preparativi della cromatina diffusa è la mancanza di visualizzazione della cromatina all'interno del contesto nativo della cella. Materiale cellulare di fuori del nucleo non può essere visualizzati e mandrino formazione non può essere valutata. Di conseguenza, altri metodi utilizzabile per valutare oogenesi oltre alle diffusioni della cromatina, come intero ovocita immunolabelling dopo trattamento di monastrol, che collassa il mandrino bi-polare in un mono-polare mandrino22. In questo modo la sorella cromatidi per essere valutata nel contesto della cella. Collettivamente, i metodi di cromatina diffusa qui descritti possono essere facilmente applicati per valutare ploidy di morfologia e cromosoma della cromatina in tutto oogenesi in modelli murini transgenici e mutante novello.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da NIGMS (R01GM11755) a P.W.J e da una borsa di sovvenzione di formazione dal National Cancer Institute (NIH) (CA009110) di G.H. e J.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Quality Biological | 119-069-161 | |
| 60 mm x 15 mm petri dishes | Denville | T1106 | |
| 35mm x 12mm petri dishes | Denville | T1103 | |
| Fine forceps | VWR | 300-050 | |
| Micro dissection scissors | Ted Pella | 1340 | |
| Dissecting scissors, sharp tip, 41/2" | VWR | 82027-578 | |
| Watch glass square 1 5/8 | Carolina Biological Supply Company | 742300 | Autoclave before each use |
| Sucrose | Sigma | S8501 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Sigma | S1804 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 646563 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| 50x Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in) | Becton, Dickinson (BD) | 309623 | |
| Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick) | Thermo | 3063-002 | |
| Super PAP pen, large (liquid blocker) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| 16% Paraformaldehyde aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Detergent in manuscript |
| Immuno stain moisture chamber | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Coplin jars | Fisher | 08-815 | |
| Photo-flo 200 | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 74257 | Wetting agent in manuscript |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | G4877 | Store aliquots at -20C |
| Human chorionic gonadotropin (HCG) | Sigma | C0434 | Store aliquots at -20C |
| PYREX Spot Plates with nine concave cavities | Fisher | 13-748B | Autoclave before each use |
| Glass capillary | Fisher | 22260943 | For making oocyte collection needles |
| Brand Parafilm M | Sigma | BR701501 | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5B | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5D | For making oocyte collection needles |
| Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing | Sigma | A5177-5EA | For making oocyte collection needles |
| Mitutoyo micrometer head | Mituoyo | 150-208 | For making oocyte collection needles |
| Syringe 5 mL | BD Biosciences | 309646 | For making oocyte collection needles |
| Syringe filter 0.45 μm filter | Corning | 431220 | For making oocyte collection needles |
| Glass Pasteur Pipette 5 3/4" | Fisher | 13-678-6A | For making oocyte collection needles |
| 83 x 0.5 mm pipette tip | Denville | P3080 | For making oocyte collection needles |
| α-MEM | Invitrogen | 11415049 | |
| Waymouth's media | Life Technologies | 11220035 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | A3160602 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3311 | For oocyte culture media |
| 500ml filter units 0.22um | Denville | F5227 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Tyrode’s solution | Sigma | T1788 | Store aliquots at -20C |
| Horse serum | Sigma | H-1270 | For ADB/wash buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A1470 | For ADB/wash buffer |
| VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope cover slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear nail polish | Amazon | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Mouse anti-MLH1 | Life Technologies | MA5-15431 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti-SYCP1 | Life Technologies | PA1-16763 | Dilution factor- 1:1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | Dilution factor- 1:50 |
| Human anti-centromere protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti- TOPOII | Abcam | ab109524 | Dilution factor- 1:100 |
| Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20) | Abcam | ab78517 | Dilution factor- 1:500 |
| Rabbit anti-Rec8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | Dilution factor- 1:10,000 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11057 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-21202 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-31573 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11004 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo-Fisher Scientific | A-11013 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11011 | Dilution factor- 1:500 |
References
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