Summary
哺乳动物中的卵子发生过程已知易出错, 特别是由于染色体 missegregation。本手稿描述了小鼠前期、中期 I 和 II. 期卵母细胞的染色质传播制备方法。这些基本技术允许研究整个哺乳动物卵子发生过程的染色质束缚蛋白和染色体形态学。
Abstract
染色质传播技术被广泛用于评估配子期间各种蛋白质的动态定位, 尤其是精子发生。这些技术允许在减数分裂事件中, 如同源染色体配对, 联会和 dna 修复的蛋白质和 dna 定位模式的可视化。虽然在文献中已经描述了一些协议, 但由于胚胎卵巢中减数分裂的时机成熟, 使用哺乳动物前期卵母细胞的一般染色质传播技术是有限的和困难的。比较而言, 前期精母细胞可以从具有较高产量的幼雄性小鼠身上收集, 而不需要进行显微解剖。然而, 由于幼睾丸减数分裂和减数分裂后生殖细胞的异质性, 在特定阶段很难获得纯同步的细胞群。在减数分裂的后期阶段, 对正在进行减数分裂 I (MI) 或减数分裂 II (产业部) 的卵母细胞进行评估是有利的, 因为成熟的卵母细胞可以从成年雌性小鼠身上收集, 并刺激恢复培养的减数分裂。在这里, 用伴随的视频演示, 描述了用胎儿、新生儿和成人卵巢解剖的卵母细胞进行减数分裂的染色质扩张制剂的方法。哺乳动物卵母细胞的染色体 missegregation 事件是频繁的, 特别是在 MI 期间。这些技术可以用来评估和描述不同的突变或环境暴露在卵子发生过程的不同阶段的影响。由于卵子发生过程和精子发生之间存在着明显的差异, 其中所描述的技术对于提高我们对哺乳动物卵子发生过程的认识和减数分裂过程中染色体和蛋白质动态的性二形特征是非常宝贵的。.
Introduction
在精子发生过程中, 在青春期开始和整个成年期的1中, 减数分裂生殖细胞的大的半同步波在睾丸中迅速和持续补充。与男性不同的是, 雌性的减数分裂只在胎儿发育期间开始。出生后, 卵母细胞在前期 I 期的长期 dictyate 阶段仍被逮捕, 并有完整的生发泡 (如: 核信封) 直到青春期。在青春期开始时, 卵母细胞的一个子集被周期性地选择来经历生长和成熟, 标志着减数分裂恢复的开始。完全生长的卵母细胞减数分裂的恢复表现为在一个称为生发泡破裂 (GVBD) 的过程中, 该方法的消失。卵母细胞随后进行染色体凝结和分离, 其次是极性体挤压。卵母细胞在进化到产业部后被逮捕, 并被刺激以完成受精后的第二和最后减数分裂。
女性生育力是高度依赖于减数分裂前期 I. 进展的成功。关键是形成一个物理联系之间的同源染色体称为交叉, 这是调解通过修复诱导 DNA 双链断裂 (DSBs) 通过交叉重组2。这个过程发生在一个动态富含蛋白质的脚手架的背景下, 称为联会复合体 (SC), 在同源染色体之间形成, 以促进它们的联会3。SC 是一种拉链状的三方结构, 由由中央区域蛋白质连接的两个平行的侧向元素组成, 在整个 DNA 修复过程中同系物在一起。在联会之前, 侧向元素的前体称为轴向元素, 在姐妹条染色单体之间形成。联会复杂的蛋白质, 如 SYCP2 和 SYCP3 形成轴向元素, colocalize 的姐妹-染色单体凝聚轴在早期前期。这些以后担当捆绑的站点为横向长丝蛋白质 SYCP1, 促进中央元素汇编和联会在被排列的同系物4之间。在小鼠卵母细胞中, 完整的联会是由20完全重叠的 SYCP3 和 SYCP1 伸展的存在所表明的, 它可以用染色质传播制剂进行可视化。联会是在进入粗线期 substage 后完成的, 由此, 注定要在同系物之间形成交叉的成熟分频者用 mutL 同源 (MLH1/3) 脂肪酸进行装饰, 以促进其精确处理5, 6, 7. 染色体 (SMC) 复合物的结构维护, 包括内聚力联合体、condensin 和 SMC5/6 复合体, 对于整个减数分裂过程中染色体动力学和结构的调控非常重要 8, 9, 10,11,12。总的来说, 这些事件确保了同源染色体在 SC 拆卸后与主轴两极的正确双向定位。
减数分裂细胞周期是一个强大的模型, 以检查不同的蛋白质在基因组维护的作用, 由于程序性诱导和后续修复 DNA DSBs。此外, 哺乳动物减数分裂也是研究表观遗传修饰和印迹13的相关模型。然而, 在技术上很难评估这些事件在女性减数分裂期间发生在胎儿和新生儿卵巢在哺乳动物 (图 1)。前期我可以分为 5 substages: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema 和 dictyate。在这里, 我们描述如何隔离和区分胎儿和新生儿的卵巢和睾丸 (图 2)。根据以前描述的方法, 本手稿还概述了一个协议 (步骤 1) 与视频演示准备女性减数分裂前期 I 染色质传播14,15,16,17.当与 immunolabelling 结合, 如步骤6-7 所述, 本协议对卵母细胞前期 I 事件进行详细的显微分析。
卵子发生过程是易出错的, 染色体 missegregation 事件在第一次减数分裂分裂期间代表最常见的来源的遗传疾病的后裔18, 19.在这篇手稿 (协议步骤 2) 中, 我们描述了一个协议, 其中从成年雌性小鼠的引物卵巢提取成熟的自已的牙分期卵母细胞。在支持条件下, 完全生长的卵母细胞在分离和培养后接受促黄体激素-独立恢复减数分裂20。在减数分裂恢复后, 卵母细胞在第二中期被拘捕。卵母细胞在中期 II 中仍被逮捕, 除非受精的.在步骤2–5中, 我们将以前报告的协议与视频演示相适应, 以描述如何收集、培养和准备用于染色质传播准备的 MI 和产业部卵母细胞21。这种染色质传播技术允许明确 immunolabelling 与染色体相关的蛋白质。此外, 该协议还可以用来区分二价和单叶染色体, 并可以进一步解决单亲姐妹条染色单体, 以促进评估卵母细胞的倍性。因此, 除了揭示减数分裂蛋白的定位模式外, 该协议还可以作为一个宝贵的工具, 以阐明在 MI 和产业部的染色体 missegregation 的潜在原因。
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Protocol
这里描述的所有方法都已得到约翰霍普金斯大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准。对野生型 C57BL/6J 小鼠进行了实验研究。
1. 采集胎儿或新生儿卵巢并制备前期染色质传播
- 提取胚胎在14.5–19.5 天后 coitum (dpc) 牺牲孕妇通过颈椎脱位或 CO2窒息根据 IACUC 的指导方针。
注: 产后1–5卵巢跳至步骤1.3。图 1总结了在不同胚胎和产后时代丰富的减数分裂前期阶段。 - 用无菌剪刀打开盆腹腔结核腔, 形成 V 形开口。解剖出母体子宫角, 将胚胎与胎盘分离, 并将胚胎移植到35毫米培养皿中, 含3毫升预热的1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS), 37 摄氏度。
注: 一个 fliptop 孵化器设置在37°c 可以用来保持温度。此外, 温度调节玻璃的阶段也可以用来维持温度在卵巢操作。 - 用3.5 英寸的手术剪刀, 根据 IACUC 的指导原则, 通过斩首牺牲胚胎或幼崽。在进一步解剖前, 将被斩首的胚胎或幼崽放置在预热的 PBS 中。
- 一次解剖一个胚胎或小狗在一个单独的35毫米培养皿中含有3毫升的预热 PBS 在37摄氏度。按图 2A-B中概述的, 沿胚胎后半部的腹中线进行切割, 沿前肢的前半部分, 并直接位于后肢和尾部的上方。
- 用3.5 英寸的手术剪刀打开腹部。使用细尖钳移位或移除肝脏和肠循环, 暴露卵巢在一个新的35毫米培养皿中含有3毫升的预热 PBS 在37摄氏度 (见指南在图 2B)。卵巢位于肾脏的下方和后面, 朝向腹膜腔的后壁 (图 2B-C)。在图 2D中提供了区分男性和女性性腺的指南。
注: 在最佳条件下, 在孕妇被牺牲后迅速解剖卵巢。 - 从每个母胎中取出两个卵巢, 使用一对细尖钳在解剖范围内, 并放置在手表眼镜或一个多井板, 其中包含0.5 至1.0 毫升预热 PBS 和维持在37摄氏度。
- 将每对卵巢放置在0.5 毫升的低萃取缓冲液中 (17 毫米柠檬酸三钠, 50 毫米蔗糖, 5 毫米 EDTA, 0.5 毫米, 30 毫米三盐酸, 蛋白酶抑制剂, pH 8.2) 在一个干净的手表玻璃或一个小井的9井板, 确保浸泡卵巢复合letely。孵育至少15分钟, 但不超过30分钟。
注: 在2小时内, 使低萃取缓冲器新鲜, 并使用。 - 在孵化期间, 使用疏水性屏障 PAP 笔, 在干净的玻璃 25 x 75 毫米2, 1 毫米厚的显微镜幻灯片上绘制两个 22 x 22 毫米2方块, 如图 3A所示。
注意: 幻灯片可以提前准备好。 - 吸管45–50µL 100 毫米蔗糖到干净的幻灯片和转移一对卵巢到下落。
- 使用两个27克针的尖端, 逗卵巢分开, 释放细胞进入蔗糖溶液。用镊子, 取出大块的卵巢, 并小心地将蔗糖溶液移出分散的细胞。
- 将40µL 固定液 (1% 多聚甲醛 (粉煤灰), 0.2% 洗涤剂 (参见材料表), pH 9.2) 放入准备好的幻灯片的每个正方形。用200µl 吸管尖端, 将固定液均匀地分布在滑动面上。
- 吸管20µL 的蔗糖混合到每个正方形的幻灯片包含固定。
注意: 这等同于每张幻灯片使用一对卵巢。 - 在室温下过夜, 在密闭潮湿的房间里孵化出滑梯。
注意: 夜间孵化可以在室温下 (12-15 小时) 左右。 - 打开房间盖, 让幻灯片完全风干。
- 在含有50毫升0.4% 润湿剂-PBS 解决方案 (参见材料表) 的 Coplin 罐子中, 清洗幻灯片2分钟, 风干, 然后进行 immunolabelling 协议 (步骤 6)。
注意: 可以将幻灯片存储在-80 摄氏度, 以便以后使用, 但这取决于感兴趣的蛋白质。为获得最佳结果, 请立即执行 immunolabelling 协议 (步骤 6)。
2. 中期 I 卵母细胞收集
- 为了最大限度地增加从每只老鼠分离出的窦卵泡的数量, 腹腔注射性成熟的处女雌性小鼠与5内孕母马的血清促性腺激素 (PMSG, 也称为马绒毛膜促性腺激素 (eCG))。
注: 为了获得最佳卵母细胞产量, 老鼠的年龄应该是1到3个月, 因为卵母细胞的数量随着年龄的增加而减少。要准备 PMSG, 溶于100毫升的无菌 PBS (5 U/0.1 毫升) 存储在600摄氏度的单使用整除数-20 µL 瓶5000。 - 44–48 h 后, 制备收集培养基, 最小必需培养基α (MEMα) 培养基, 辅以5% 胎牛血清 (血清) 和3毫克/毫升牛血清白蛋白 (BSA;MEMα/BSA/血清)。通过0.2 µm 孔过滤器消毒介质。醒酒在 5% CO2孵化器中, 将2.5 毫升的 MEMα/BSA/血清介质放入每只鼠标的一个玻璃盘中, 加热到37摄氏度。
注意: 其他商业上可用的收集和文化媒体 (M2 和 M16) 也经常使用。
注意: 我们建议将 5% CO2孵化器中的养殖菜肴一次性移除, 时间有限, 以尽量减少操作步骤中的环境空气暴露。 - 根据 IACUC 指导原则, 通过宫颈脱位或 CO2进行窒息, 牺牲小鼠。
- 用无菌剪刀打开盆腹腔结核腔, 形成大 V 形开口。用镊子, 将肠道移向老鼠头。定位每个子宫角;卵巢在肋骨笼的近端存在。使用解剖剪刀 (图 4), 用细钳握住输卵管, 并将脂肪切成卵巢。继续持有输卵管, 并与另一套罚款钳释放卵巢从囊和地方成收集皿含有 MEMα/BSA/血清。
注意: 在步骤1中, 必须将卵巢保持在37摄氏度, 并维持在 5% CO2。一个 fliptop 孵化器, 连接多达 5% CO2混合可用于允许最佳的维护温度和 CO2级别。另外, 在卵母细胞操作过程中, 还应使用温度调节玻璃舞台来保持温度。 - 使用1毫升注射器与27口径针 (或类似的大小), 释放卵卵母细胞复合物手动穿刺大窦卵泡。
- 在通过解剖显微镜观察时, 用嘴操作的玻璃吸管或毛细管, 或手操作的千分尺 (图 5) 来收集有时间的卵母细胞。只收集从窦卵泡释放的卵母细胞。µm 卵母细胞的直径约为 90. 可能会被2-3 层颗粒细胞包围, 总直径约为200µm。
- 在一个干净的手表玻璃或9井板中培养卵母细胞, 其中含有 MEMα/BSA/血清中的6小时, 在 5% CO2孵化器中达到中期 I 37 摄氏度。
- 继续执行步骤4。
3. 中期二 (产业部) 卵母细胞收集
- 为了最大限度地提高与每只老鼠分离的卵母细胞, 腹腔注射 5 PMSG 的性成熟的处女雌性小鼠。44–48 h 后, 腹腔注射5人绒毛膜促性腺激素 (hCG)。
注: 为了获得最佳卵母细胞产量, 老鼠的年龄应该是1到3个月, 因为卵母细胞的数量随着年龄的增加而减少。要准备 hCG, 溶解一瓶 1万 u 在200毫升 PBS (5 U/0.1 毫升)。存储在单使用整除数600µL 在-20 摄氏度。 - 12-14 小时后, 如上文步骤2.2 所述, 准备 MEMα/BSA/血清收集介质。
- 根据 IACUC 指导原则, 通过宫颈脱位或 CO2进行窒息, 牺牲小鼠。
- 用无菌剪刀打开盆腹腔结核腔, 形成大 V 形开口。用镊子, 将肠道移向老鼠头。定位每一个子宫角, 卵巢是存在近到肋骨笼。使用解剖剪刀 (图 4), 用细钳握住输卵管, 并将脂肪切成卵巢。然后将卵巢和输卵管移除, 放入含有 MEMα/BSA/血清培养基的收集皿中。
注意: 在步骤1和2中, 必须将卵巢保持在37摄氏度, 并维持在 5% CO2。一个 fliptop 孵化器, 连接多达 5% CO2混合可用于允许最佳的维护温度和 CO2级别。另外, 在卵母细胞操作过程中, 还应使用温度调节玻璃舞台来保持温度。 - 使用1毫升注射器与27克 (或相似的大小) 或锋利的钳, 撕毁一个洞在腹部的输卵管释放的产业部卵母细胞。
注意: 小心不要破坏壶腹中的卵母细胞。壶腹将出现肿胀和半透明, 使卵母细胞可见 (图 4)。 - 利用口腔操作的玻璃吸管或毛细管, 或手操作的千分尺 (图 5), 将输卵管的壶腹中的卵母细胞收获到一个新的盘子中。
- 继续执行步骤4。
4. 卵母细胞剥蚀和透明透明清除
- 在 MEMα培养基中制备300毫升的透明质酸酶, 辅以3毫克/毫升 BSA, 以观察玻璃中的掀卵母细胞 (2.5 毫升/小鼠), 并保持在37°c, 5% CO2。
注: 在1小时的准备后, 透明质酸酶的功效急剧下降。对于产业部卵母细胞, 不需要透明质酸酶治疗。 - 将卵母细胞卵丘细胞复合物暴露在 MEMα/BSA 中的透明质酸酶的300毫升/mL 中, 掀周围卵丘细胞的卵母细胞的3分钟。
注意: 不要超过3分钟接触透明质酸酶, 因为它会损害卵母细胞。 - 要清洗卵母细胞, 将卵母细胞转移到新鲜温暖的 MEMα/BSA 中菜。使用小口操作的玻璃吸管或毛细管 (略大于卵母细胞的直径, 大约90µm), 吸管的配合物上下完全分离卵丘细胞。在准备下一步时, 允许卵母细胞在孵化器中恢复。
- 温酸性 Tyrode 的溶液, MEMα/BSA, Waymouth 的介质到37°c (500 µL/小鼠)。放置300µL 在每个井小9井玻璃板材。
- 将5–10卵母细胞的透明透明 (ZP) 转移到 Tyrode 的溶液中。将卵母细胞暴露在溶液中只有30-45 秒。
注意: 太少暴露在溶液中不会完全去除 ZP, 这将防止卵母细胞爆裂和染色体传播。太多的暴露会伤害和杀死卵母细胞。观察 ZP 溶解在解剖显微镜下可以帮助优化暴露时间。
注意: 使用新鲜 Tyrode 的解决方案是至关重要的, 因为它的功能随着年龄的推移而下降。对每组卵母细胞使用 Tyrode 的新鲜井, 以确保 ZP 的均匀消化。 - ZP 清除后, 立即将卵母细胞转移到温暖的 MEMα/BSA/血清中。重复这个洗涤步骤。
注意: 转移时要小心, 因为卵母细胞会很容易地粘在一起, 然后移除 ZP 后的玻璃吸管或毛细管。预润湿的玻璃吸管或毛细管在 Waymouth 的培养基将减少卵母细胞粘在一起。 - 在 5% CO2孵化器中, 转移并允许卵母细胞在 Waymouth 的培养基中以37摄氏度恢复30分钟。
- 继续执行步骤5。
5. MI 和产业部卵母细胞染色质传播
- 使用 PAP 笔, 在玻璃幻灯片上绘制一个 11 x 44 mm2矩形, 如图 6A所示。
- 将滑块的薄层固定 (1% 多聚甲醛, 0.2% 海卫-X 100 在H2 O, pH 9.2) 通过吹打100µL 固定在幻灯片上, 来回摇晃滑动。点击幻灯片以摆脱多余的固定器。
- 在5-10 卵母细胞之间拿起一个小口吸管针与尽可能小的媒体, 并拖动针在一条线横跨固定涂层的幻灯片, 同时把卵母细胞从1厘米以上的幻灯片到固定解决方案。使用解剖显微镜执行此步骤, 以确保卵母细胞已沉积, 并已爆裂。
注意: 卵母细胞应立即爆裂在幻灯片上。卵母细胞沉积的高度影响染色质的传播程度。有关详细信息, 请参见图 6中的代表结果。 - 夜间在密闭的湿润室中孵化出室温, 允许染色质粘附。
- 允许幻灯片完全风干, 并在含有50毫升0.4% 润湿剂-H2O、pH 8.0 的 Coplin 罐子中冲洗幻灯片。
- 继续执行步骤6。
6. Immunolabelling
- 准备表 1中描述的抗体稀释缓冲 (ADB)。
- 准备两个 Coplin 罐, 其中包含50毫升的洗涤缓冲液 (10% 亚行稀释在 PBS), 一个含有50毫升和0.05% 洗涤剂溶液的 Coplin 罐子 (例如, 添加250µL 的10% 洗涤剂到50毫升)。
- 将本协议1和5节中准备的幻灯片洗净10分钟, 其中一 Coplin 罐子中含有50毫升的世界银行。
注意: 不要让幻灯片在 immunolabelling 期间的任何时刻干燥。 - 在含有50毫升和0.05% 洗涤剂溶液的 Coplin 罐中, 清洗幻灯片10分钟。然后, 在剩余的 Coplin 罐子中洗掉包含50毫升的10分钟的工务解决方案的幻灯片。
- 用100µL 在亚行稀释的选择的原发抗体, 轻拍多余的液体和覆盖滑动。在封闭潮湿的室内一夜之间孵化4摄氏度。
注: 孵化可以缩短到2到3小时, 在37摄氏度。用盖玻片或 parafilm 覆盖幻灯片, 使用较小数量的抗体(例如、50µL)。 - 在含有50毫升0.2% 润湿剂-PBS 溶液, pH 8.0 的 Coplin 罐子中冲洗幻灯片。
- 重复步骤6.2 到6.5。
- 用100µL 稀释在亚行中的二次抗体, 利用多余的液体和覆盖滑动。孵化1到2小时的幻灯片在37°c 在一个封闭的潮湿的房间。
- 在含有50毫升0.2% 润湿剂-PBS 溶液, pH 值8.0 的 Coplin 罐子中, 2 次清洗幻灯片10分钟。
- 在含有50毫升0.2% 润湿剂-H2O 溶液, pH 8.0 的 Coplin 罐子中, 2 次清洗幻灯片5分钟。
7. 安装滑轨
- 在步骤2中制备的前期染色质扩散, 添加100µL 的安装培养基, 含 4 ', 6-diamidino-2-苯基吲哚 (DAPI, 1.5µg/毫升)。对于在步骤5中制备的 MI 和产业部染色质扩散, 添加50µL 包含 DAPI (1.5µg/毫升) 的安装介质。轻轻地涂抹过量的液体。
- 将22毫米 x 60 毫米盖玻片放在顶部, 用透明指甲油封住。在4°c 或-20 °c 的幻灯片框中存储, 直到通过荧光显微镜进行评估。
注: 轻敲盖板滑动, 以消除多余的安装介质, 然后用指甲油密封。
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Representative Results
我们描述了两种方法来可视化和评估卵母细胞减数分裂染色体。第一种技术是评估胚胎和新生儿卵巢的前期进展。前期染色质传播制剂对于在减数分裂过程中可视化许多动态过程非常有价值, 包括染色体配对、联会和 desynapsis、同源重组和表观遗传染色体重塑。在这里, 我们已经证明了这种方法的效用, 以稳健的可视化和定量分析的交叉形成卵母细胞从 C57BL/6J 胚胎 (图 3B和 3C)。为了丰富粗线期 substage 中的细胞, 在 18.5 dpc(图 1) 中检索到了小鼠胚胎。前期 I 粗线期 substage 的两个主要特征是同系物之间的联会的完成, 以及每 MLH1/3-positive 对的至少一个同源交叉的形成。同系物之间的完整联会表现为20重叠的 SYCP3 和 SYCP1 伸展的存在。为描述野生型卵母细胞交叉形成的特点, 我们 immunolabeled 的前期染色质传播制剂使用抗体检测 SYCP3, SYCP1 和 MLH1, 并染色 DNA 使用 DAPI。图 3B描述了一个粗线期阶段卵母细胞的代表性图像, 这是由20个完全组装的 SC 结构分布的27个 MLH1 病灶所证明的。在野生型卵母细胞中检测到的 MLH1-positive 分频的平均数量为24±3 (图 3C, N = 15 卵母细胞)。图 3D显示了在 pericentromeric 染色质 (PCH) 区域和沿染色体臂上丰富的 SMC6, 以及在粗线期阶段沿 SC 分布的 MLH1 焦点。图 3E描述了一个粗线期的分阶段卵母细胞, 在这种情况下, 染色体展开准备是亚优的, 而单个染色体是不区分的, 无法准确评估 SYCP3、SMC6 和 MLH1。当卵巢在低萃取缓冲中孵化时间过长或不够长时, 可以观察到亚优染色体的传播。
所描述的第二种技术可用于评估减数分裂恢复后卵母细胞的染色质形态学 (图 6B-d)。蛋白质的定位, 以及倍性, 可以很容易地评估, 揭露潜在的原因染色体分离错误。图 6B描述了一个 MI 卵母细胞, 显示20条染色体, 清除着丝粒和 pericentromeric 染色质染色。图 6C是一个缩放图像, 可沿染色体臂和 PCH 看到拓扑异构酶 IIα (TOPOII)。图 6D描述了一个由染色体和着丝粒形态学区分成对姐妹条染色单体的产业部卵母细胞。当尝试此技术时, 常见的错误包括卵母细胞未爆裂, 当释放到粉煤灰涂层的幻灯片上, 以及染色体传播太远 (图 6E-F)。如果未完全删除 ZP, 则染色体将保持与主轴相关联, 如图 6E所示。如果卵母细胞从粉煤灰涂层的滑块中跌落得太高, 染色体就会像图 6F中所描述的那样分散得太远。
图 1: 女性胚胎和新生儿发育过程中的减数分裂前期时间线.蓝色轮廓显示胚胎和新生儿发育过程中观察到的特定前期子阶段生殖细胞 (细线期、偶线期、粗线期和 diplotene/dictyate 阶段) 的种群。深蓝色的增加表明了特定前期子阶段变得更加丰富的时间。此数字由引用2进行了调整。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 从胚胎和新生雌性幼崽中提取卵巢。(A、B)第一切口 (1) 是在前肢之上, 在从母体子宫角上提取后立即在头/颈部交界处斩首胚胎。第二切口 (2) 是沿着胚胎后半部的腹中线进行, 其次是沿前肢 (3) 前半部分的切口。最后切开为切除后肢和尾巴 (4)。(A)对从雌性幼崽中分离卵巢的解剖切口进行的正面视图示意图。(B)侧面视图解剖切口的示意图, 用于隔离卵巢和内部器官的相对位置。以浅红色显示的区域包括肝脏和肠道, 在解剖过程中切除。背壁和相关器官以浅蓝色显示。这个地区包括卵巢, 它附着在子宫角顶端的肾脏的下两极。(C)切除肝脏和肠道后胚胎背壁的正面示意图。(D)在大约 15–18 dpc 中雄性和雌性性腺形态差异的示意图表示。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 代表性的前期染色质传播准备.(A) 用于前期染色质传播准备的玻璃滑动示意图。黑色方形轮廓表示液体阻挡笔轮廓。(B、C)粗线期阶段卵母细胞交叉形成的代表性图像及定量方法在步骤1中描述的前期染色质传播制备法。( B) 染色质传播是使用 18.5 dpc 分离的卵巢 fromC57BL/6J 小鼠胚胎进行的。染色质传播 immunolabeled 与抗体对 sc 侧元蛋白 SYCP3 (红色), 和 sc 中央元素蛋白 SYCP1 (洋红), MLH1 (绿色, 交叉事件标记), DAPI (蓝色, DNA)。缩放条 = 10 µm (C) 从15粗线期阶段染色质传播制剂获得的 MLH1 灶计数点图。误差线表示标准偏差。( d, E) 分别比较最佳 (d) 和次优 (E) 前期传播准备。染色质传播 immunolabeled 与抗体对抗 SMC6 (红色), MLH1 (绿色), 和 SYCP3 (蓝色)。缩放条 = 10 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 成人卵巢的示意图.该图描述了成年小鼠卵巢、输卵管、壶腹和子宫的解剖。小鼠卵巢应通过仔细切开韧带, 将卵巢连接到肾脏的下极和腹部的后壁。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 用于卵母细胞操作的口操作玻璃吸管、玻璃毛细管和手操作千分尺的图像。(A)玻璃吸管卵母细胞机械手按顺序由以下组件组成: 口片, 乳胶管 (3.2 毫米内径 (ID) x 6.4 毫米外径 (OD)), 1 毫升吸管尖端, 乳胶管 (6.4 毫米 ID x 11.1 毫米 OD) 和玻璃巴斯德吸管。玻璃巴斯德吸管的末端被加热了在火焰和末端拉扯创造一个精尖的末端 (图 5A1)。(B)玻璃毛细管卵母细胞机械手按顺序由以下组件组成: 口片, 0.45 µm 过滤器 (可选), 乳胶管 (3.2 毫米 ID x 6.4 毫米外径), 1 毫升吸管尖端, 乳胶管 (6.4 毫米 ID x 11.1 毫米 OD) 和70µl 玻璃毛细管。玻璃毛细管在火焰的中心加热, 并在相反的方向拉, 以创建两个细尖端的毛细血管 (图 5B1)。(C)手动千分尺注射器由以下组件依次组成: 日本三丰150-208 微米头 (中间大小, 0-1 "范围, 0.001" 毕业), 5 毫升注射器, 乳胶管材 (3.2 毫米 ID x 6.4 毫米 OD), 1 毫升吸管尖端, 乳胶管材(6.4 毫米 ID x 11.1 毫米外径), 1 毫升吸管尖端和 83 x 0.5 毫米2凝胶加载尖端。日本三丰150-208 微米头被牢固地插入5毫升注射器(图 5C 1).为确保凝胶加载尖端牢固固定, 连接1毫升吸管尖端被切断 (图 5C2)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 代表中期 I 和 II. 卵母细胞染色质传播制剂。(A)中期 I 和 II. 卵母细胞染色质传播制剂的滑动示意图。卵母细胞 (圆形) 通过嘴操作的玻璃吸管或毛细血管在一条直线 (跟随箭头) 释放。黑色矩形轮廓表示液体阻挡笔轮廓。(B、C)最佳中期 i. 染色质传播制剂。中期 I 染色体染色 DAPI (蓝色, DNA) 和 immunolabeled (绿色, 动粒/着丝粒标记)。刻度条 = 10 µm. (B)对组蛋白 H4 (di 甲基 K20、三甲基 K20) 的抗体用于标记 pericentromeric 染色质 (PCH)。(C)针对拓扑异构酶 IIα (TOPOII) 的抗体用于标记 PCH 和染色体轴。(D)最佳中期二级染色质传播制剂。中期 II 染色体染色的 DAPI (蓝色, DNA) 和 immunolabeled (绿色) 和组蛋白 H4 (二甲基 K20, 三甲基 K20), 以标签的 PCH。刻度条: 10µm. (E, F)可怜的中期 I 染色质传播制剂。染色体染色的 DAPI (蓝色, DNA) 和 immunolabeled (绿色) 和减数分裂内聚力联合体成分, REC8。缩放条 = 10 µm (E)一个卵母细胞在释放到粉煤灰涂层的滑动时没有爆裂。分布太远的(F)染色体。请单击此处查看此图的较大版本.
| 项目 | 量 | 最终浓度 |
| 1x PBS | 50毫升 | 1x |
| 波塞军 | 1.5g | 3% (w/v) |
| 马血清 | 5毫升 | 10% (v/v) |
| 10% 洗涤剂 (参见 材料表)在 PBS |
250 ul | 0.05% (v/v) |
表 1:抗体稀释缓冲器 (亚行) 配方.将亚行储存在4摄氏度或冻结库存-20 摄氏度, 如果使更多的数量。亚行可能会受到污染, 因此确保使用良好的无菌技术, 并在每次使用之前评估污染的解决方案。较小的亚行整除数也可以为减少污染做好准备。
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Discussion
染色质传播制剂允许研究人员按时间顺序研究雌性哺乳动物的减数分裂和相关蛋白质的动态定位。胚胎和新生儿染色质的传播允许密切分析整个减数分裂前期的事件。中期 I 和中期 II. 染色质传播可用于区分单亲姐妹条染色单体和配对同源染色体, 以及评估倍性。相比之下, 这里描述的协议可以比整个卵母细胞 immunolabelling 更有利, 它经常产生高水平的背景信号, 从而降低了染色质绑定蛋白的分辨率。此外, 染色质传播技术代表了一个有吸引力的替代活细胞成像, 这需要大量的时间和专门设备的投资。
胚胎和新生儿卵巢可能很难找到和提取。我们建议仔细提取除肾脏以外的所有其他器官和材料在一个单独的菜包含 PBS 之前寻找卵巢, 并使用一个新鲜的 PBS 为每个胚胎/幼崽 (图 2B)。如果胚胎/幼犬是男性, 睾丸将被区分的小管形成和性腺的位置 (图 2D)。随着雄性胚胎的发育, 睾丸会向小弟弟下降, 变得更大, 呈椭圆形。
卵母细胞染色质传播技术需要掌握的卵母细胞收集和操作使用口操作的玻璃吸管或毛细管。我们建议在执行此协议之前, 练习控制口吸管。拉适当大小的玻璃吸管/毛细管收集和剥蚀卵母细胞将增加成功和效率的机会, 最大限度地减少时间卵母细胞在孵化器之外, 以及在 Tyrode 的解决方案。正确的 ZP 去除时间对于这种方法的成功非常重要。如果卵母细胞在 Tyrode 的溶液中孵化了足够的时间, ZP 将不会被完全删除。这样可以防止卵母细胞在幻灯片上有效地爆裂, 如图 6E所示。然而, 如果卵母细胞在 Tyrode 的溶液中孵化太长时间, 卵母细胞质量和下游免疫荧光染色将会受到严重损害。我们建议在显微镜下观察卵母细胞, 以确定 ZP 在 Tyrode 溶液中溶解的确切时间。一次只添加5–10卵母细胞到 Tyrode 的解决方案将减少过度暴露。如果卵母细胞在粉煤灰涂层的滑块上方释放得太高, 则染色体可以分散得太远 (图 6F)。当卵母细胞在幻灯片上方释放1厘米时, 会发现最佳结果。其他可能阻碍结果的因素包括: 在卵母细胞操作步骤期间, 环境空气中的 CO2水平持续减少。这会导致介质中 pH 值的波动对卵母细胞质量造成不利影响, 而且通过从橙色到粉红色的媒介的渐进颜色变化明显可见。媒体的缓冲容量也随时间而减少;因此, 我们不建议使用已存储 (4 °c) 超过1周的介质。M2 介质 (不要求 CO2进行缓冲) 通常用作替代方法。
对染色质传播制剂的限制是在细胞的本机语境中缺乏对染色质的可视化。细胞核外的蜂窝材料不能被可视化, 不能评估纺锤体的形成。因此, 其他方法可以用来评估卵子发生过程除了染色质传播, 如整个卵母细胞 immunolabelling 后 monastrol 治疗, 这将双极性主轴折叠成单极性主轴22。这使得修女条染色单体在细胞的上下文中被评估。总的来说, 这里描述的染色质传播方法可以很容易地用于评估在卵子发生过程的染色形态学和染色体倍性在新的转基因和突变小鼠模型。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了研究院 (R01GM11755) 到 p.w. J 以及由国家癌症研究所 (CA009110) 向伦理和兰伯特提供的培训补助金奖学金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Quality Biological | 119-069-161 | |
| 60 mm x 15 mm petri dishes | Denville | T1106 | |
| 35mm x 12mm petri dishes | Denville | T1103 | |
| Fine forceps | VWR | 300-050 | |
| Micro dissection scissors | Ted Pella | 1340 | |
| Dissecting scissors, sharp tip, 41/2" | VWR | 82027-578 | |
| Watch glass square 1 5/8 | Carolina Biological Supply Company | 742300 | Autoclave before each use |
| Sucrose | Sigma | S8501 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Sigma | S1804 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 646563 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| 50x Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in) | Becton, Dickinson (BD) | 309623 | |
| Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick) | Thermo | 3063-002 | |
| Super PAP pen, large (liquid blocker) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| 16% Paraformaldehyde aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Detergent in manuscript |
| Immuno stain moisture chamber | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Coplin jars | Fisher | 08-815 | |
| Photo-flo 200 | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 74257 | Wetting agent in manuscript |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | G4877 | Store aliquots at -20C |
| Human chorionic gonadotropin (HCG) | Sigma | C0434 | Store aliquots at -20C |
| PYREX Spot Plates with nine concave cavities | Fisher | 13-748B | Autoclave before each use |
| Glass capillary | Fisher | 22260943 | For making oocyte collection needles |
| Brand Parafilm M | Sigma | BR701501 | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5B | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5D | For making oocyte collection needles |
| Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing | Sigma | A5177-5EA | For making oocyte collection needles |
| Mitutoyo micrometer head | Mituoyo | 150-208 | For making oocyte collection needles |
| Syringe 5 mL | BD Biosciences | 309646 | For making oocyte collection needles |
| Syringe filter 0.45 μm filter | Corning | 431220 | For making oocyte collection needles |
| Glass Pasteur Pipette 5 3/4" | Fisher | 13-678-6A | For making oocyte collection needles |
| 83 x 0.5 mm pipette tip | Denville | P3080 | For making oocyte collection needles |
| α-MEM | Invitrogen | 11415049 | |
| Waymouth's media | Life Technologies | 11220035 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | A3160602 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3311 | For oocyte culture media |
| 500ml filter units 0.22um | Denville | F5227 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Tyrode’s solution | Sigma | T1788 | Store aliquots at -20C |
| Horse serum | Sigma | H-1270 | For ADB/wash buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A1470 | For ADB/wash buffer |
| VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope cover slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear nail polish | Amazon | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Mouse anti-MLH1 | Life Technologies | MA5-15431 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti-SYCP1 | Life Technologies | PA1-16763 | Dilution factor- 1:1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | Dilution factor- 1:50 |
| Human anti-centromere protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti- TOPOII | Abcam | ab109524 | Dilution factor- 1:100 |
| Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20) | Abcam | ab78517 | Dilution factor- 1:500 |
| Rabbit anti-Rec8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | Dilution factor- 1:10,000 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11057 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-21202 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-31573 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11004 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo-Fisher Scientific | A-11013 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11011 | Dilution factor- 1:500 |
References
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