Summary
哺乳類の卵形成がエラーを起こしやすい、染色体の紡錘のために特に知られています。この原稿は、マウス前期, クロマチンを広める準備方法をについて説明します中期私と卵母細胞の II 上演します。クロマチン結合蛋白質と哺乳類の卵形成過程で染色体の形態の研究を可能にするこれらの基本的なテクニック。
Abstract
クロマチン拡散技術は、配偶子、精子形成に特に様々 なタンパク質の動的局在を評価するために広く使用されています。これらのテクニックのシナプスと DNA 修復減数分裂において相同染色体対など中タンパク質と DNA の局在パターンの可視化を可能にします。いくつかのプロトコルは、文献に記載されている、哺乳類前期卵子を使用して一般的なクロマチン拡散技術が限られており、胎児の卵巣で減数分裂の開始のタイミングが難しい。比較では、前期の精母細胞はマイクロダイ セクションを必要とせずに高い利回りと少年の雄マウスから収集できます。しかし、少年と成人の精巣における減数分裂と後減数分裂生殖細胞集団の不均一性による特定の段階のセルの純粋な同期された人口を得ることが困難です。減数分裂の後の段階、卵母細胞成熟卵母細胞のグループは成熟雌マウスから収集および文化で減数分裂を再開する刺激できるので (mi) または減数分裂 II (MII) 減数分裂を受けてを評価すると便利です。ここでは、卵母細胞減数分裂クロマチンを広める準備法、胎児から新生児に解剖し、大人卵巣は、ビデオのデモを伴う説明。哺乳類卵母細胞の染色体紡錘イベントは、MI の間に特に頻繁に。行い卵形成の段階でさまざまな異なる突然変異や環境の露出の効果を特徴付けるこれらのテクニックを使用できます。内に記述された技術が減数分裂期哺乳類の卵形成過程の理解と染色体・ タンパク質ダイナミクスの性的に二形の機能を向上させる貴重なは配偶子形成の間の明確な相違点があると.
Introduction
精子、中に思春期と成人1発症時精巣生殖細胞の減数分裂の大波は準同期を急速に継続的に補充されます。男性とは対照的女性で減数分裂が胎児の発育中にのみ開始されます。誕生、次卵母細胞のまま前期の長期 dictyate 段階で逮捕された私は、そのまま卵核胞 (GV; 核膜) 思春期まで。思春期の発症時は、卵母細胞のサブセット周期的成長と成熟、減数分裂再開の開始をマークを受けることが選択されます。完全育てられた卵母細胞の減数分裂再開は胚胞崩壊 (GVBD) として知られているプロセスの GV の消失によって明示されます。卵母細胞は、染色体凝縮と極体押出続く分離を経る。卵母細胞は MII への進行時に逮捕になるし、が受精後にのみ 2 番目と最終的な減数分裂を完了する刺激されます。
雌の受胎は減数分裂前期の成功に大きく依存私進行。このための鍵は、物理的なリンケージを介したクロス オーバー組換え2を介して誘導の DNA 二重鎖切断 (Dsb) の修理 chiasmata として知られている相同染色体間の形成です。このプロセスは、そのシナプス3を容易にする相同染色体の間を形成する減数分裂 (SC) として知られている動的タンパク質豊富な足場のコンテキスト内で発生します。SC はジッパーのような三者構造中部の蛋白質によって接続されている 2 つの平行横要素から成る継続的な DNA 修理を通して一緒に同族体を保持しています。シナプス前、軸の要素と呼ばれる外側の要素の前駆体姉妹染色分け体を形成します。SYCP2 など SYCP3 減数分裂タンパク質は、初期前期中には姉妹染色分け体結束軸 colocalize 軸の要素を形成します。これらの後結合横フィラメント蛋白質、SYCP1 は、容易にアセンブリ中心的な要素と一直線に並べられた同族体4の間のシナプス部位として機能します。マウス卵母細胞の完全なシナプスによって示されます 20 の存在完全に準備を広げる重複 SYCP3 と SYCP1 のストレッチ、クロマチンを使用して視覚化することができます。シナプスが完了するという同族体間フォーム chiasmata を宛先とする成熟したクロス オーバーが飾られて mutL 相同物 (MLH1/3) ダイマーの正確な処理5,6を促進するために pachytene サブステージに入る時に,7. コヒーシン、コンデンシン、複雑な SMC5/6 など染色体 (SMC) 錯体の構造のメンテナンスが減数分裂8,9、全体構造と染色体ダイナミクスの制御のために重要 10、11,12。総称して、これらのイベントは紡錘体極次の SC の解体に反対する相同染色体の適切な双方向を確保します。
減数分裂の細胞周期は、ゲノム維持プログラム誘導と発癌の後続の修理のための様々 な蛋白質の役割について検討する強力なモデルです。さらに、哺乳類の減数分裂も、エピジェネティック修飾と刷り込み13の研究に関連するモデルです。ただし、女性減数分裂 (図 1) の哺乳類の胎児・新生児の卵巣で行われるこれらのイベントを評価するために技術的に困難です。前期 5 サブステージを分かれますことができます: leptonema、zygonema、pachynema、diplonema、dictyate。ここで、分離および胎児・新生児の卵巣と精巣 (図 2) を区別する方法をについて説明します。上記の方法から適応、この原稿も女性減数分裂前期の準備のためのビデオのデモとプロトコル (手順 1) の概要私クロマチン広がる14,15,16,17.このプロトコルにより前期の詳細なミクロ分析、immunolabelling、6-7 の手順で説明したようとつながれたとき私卵母細胞でのイベント。
卵はエラーを起こしやすいと第一減数分裂時に染色体紡錘イベントを表す子孫18,19の遺伝病の最も一般的なソース。本稿では (プロトコル手順 2)、GV 段の成熟した卵子を成熟雌マウスの発動を促された卵巣から抽出しプロトコルについて述べる.支持条件の下では、完全育てられた卵母細胞は黄体形成ホルモンに依存しない次の分離と培養20減数分裂の再開を受けます。減数分裂の再開後卵母細胞は減数分裂を経て進行し、中期 II で逮捕。卵母細胞は限り受精.中期 II で逮捕されました。手順 2-5、以前に報告されたプロトコルの収集、文化およびクロマチンを広める準備21MI と MII 卵子を準備する方法を説明するビデオ デモを適応させます。技術を広めるこのクロマチン染色体に関連付けられている蛋白質の明確な immunolabelling が可能です。さらに、このプロトコルし一価、二価染色体を区別するためにも使用できます、さらに単一の妹を解決できる卵母細胞の倍数性の評価を容易にする染色分け体。したがって、減数分裂タンパク質の局在パターンを明らかに加えこのプロトコルも MI と MII の間に染色体紡錘の潜在的な原因を解明するための非常に貴重なツールとして使用できます。
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Protocol
ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ジョンズ ・ ホプキンス大学のによって承認されています。野生型 c57bl/6 j マウスの実験を行った。
1. 収穫前期クロマチンの作製と胎児または新生児の卵巣に広がる
- 14.5-19.5 日のポストの coitum (dpc) で胚を抽出するには、頚部転位または CO2窒息 IACUC ガイドラインによると妊娠中の女性を犠牲に。
注: 生後 1-5 卵巣 1.3 のステップに進みます。図 1は、胎生期および出生後隔世で濃縮減数分裂前期段階をまとめたものです。 - V 字形の開口部を作る生殖不能のはさみを使って腹部骨盤腔を開きます。母体の子宮角を分析、胎盤から胚を分離・ リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) 37 ° C で x に予め温めておいた 1 の 3 mL を含む 35 mm のペトリ皿に胚を転送
注: 37 ° C で設定 fliptop インキュベーターは、温度を維持するために使用できます。さらに、温度調節されたガラス ステージは卵巣の操作中に温度を維持するためにも使用できます。 - 3.5 インチ手術ハサミ胚または IACUC ガイドラインに従って斬首を通して子犬を犠牲に。さらに郭清する前に予め温めておいた PBS に首のない胚または子犬を配置します。
- 37 ° C で予め温めておいた PBS の 3 mL を含む別の 35 ミリメートルのシャーレで一度に 1 つの胚または子犬を解剖します。前肢の下と後脚と尾図 2A-Bに記載されている上直接前方半分に沿って、胚の後部の半分の腹側正中線に沿って切断することによって進みます。
- 3.5 インチ手術用はさみを使って腹部を開きます。転置または肝臓や腸、37 ° C で予め温めておいた PBS の 3 mL を含む新しい 35 mm のペトリ皿に卵巣を公開のループを削除する細い鉗子を使用して (図 2 bにガイドを参照してください)。卵巣はすぐ下および腹腔内 (図 2 b-C) の後部壁に向かって腎臓の後ろにあります。男性と女性の生殖腺の差異化のためのガイドは、図 2 Dで提供しています。
注: 最適な条件の急速に解剖卵巣を妊娠中の女性が犠牲になる後。 - 郭清範囲と時計メガネの場所の下の細いピンセットのペアを使用して各女性胎児から両方の卵巣を削除または複数の井戸の別の井戸に予め温めておいた PBS の含む 0.5 〜 1.0 mL をプレートし 37 ° C で維持
- きれいな時計ガラスまたは卵巣 comp を浸すようにして 9 ウェル プレートの小さな井戸に、0.5 mL ハイポ抽出バッファー (17 mM クエン酸ナトリウム二水和物、ショ糖 50 ミリメートル、5 ミリメートルの EDTA、0.5 mM DTT、30 mM トリス-HCl、プロテアーゼ阻害剤、pH 8.2) に卵巣の各ペアを配置します。letely。しかし、少なくとも 15 分間、30 分以上を孵化させなさい。
注意: は、新鮮なハイポ抽出バッファーを作成し、DTT 添加の 2 時間以内の使用します。 - 疎水性障壁の PAP のペンを使って、インキュベーション中に図 3Aに示すように、きれいなガラス 25 x 75 mm2、1 mm 厚の顕微鏡スライド上 2 22 x 22 mm2の正方形を描画します。
注: スライドは、早めに準備することができます。 - きれいなスライドに 100 mM ショ糖の 45-50 μ L をピペットし、ドロップする卵巣の 1 つのペアを転送します。
- 2 つの 27 G 針の鋭い端を使用して、ショ糖液に細胞を放出する卵巣を離れてをいじめます。鉗子、卵巣の大きい部分を取り外し、慎重に細胞を分散させるためにショ糖溶液をピペットします。
- 固定液の場所 40 μ L (1% パラホルムアルデヒド (PFA)、0.2% 洗剤 (材料の表を参照)、pH 9.2) 準備されたスライドのそれぞれの正方形。200 μ l ピペット チップのスライド表面に固定液を均等に します。
- 定着剤を含むスライドのそれぞれの正方形の上にショ糖ミックスの 20 μ L をピペットします。
注: これは卵巣スライドごとの 1 つのペアを使用してに相当します。 - 一晩室温で湿気の多い密室でスライドを孵化させなさい。
注: 一晩インキュベートを範囲で指定できます (12-15 時間) 室温で。 - 室ふたを開き、完全に風乾するスライドを許可します。
- 0.4% 湿潤剤 PBS 溶液 50 mL を含む Coplin jar 内のスライドを洗う 2 min のため空気が乾燥、(材料の表を参照)、immunolabelling プロトコル (手順 6) に進んでください。
メモ: 後で使用するため-80 ° C でスライドを保存することがありますがこれは興味の蛋白質によって異なります。最適な結果を得るのためには、immunolabelling プロトコル (手順 6) にすぐを進みます。
2. 中期私採卵
- それぞれのマウスから分離したから胞状卵胞の数を最大にするには、5 IU 妊馬血清性腺刺激ホルモン (PMSG、として知られている馬絨毛性ゴナドトロピン (eCG)) の性的成熟の処女雌マウス腹腔内注入します。
注: 最適な卵の収量、マウス必要があります時代の 1 ~ 3 カ月収穫卵母細胞の数が年齢とともに減少します。PMSG を準備するには、溶解 5,000 IU の-20 ° C で 600 μ L の単回使用の因数で滅菌 PBS (5 U/0.1 mL) ストアの 100 mL ボトル - 44-48 時間後準備コレクション中、最小必須培地アルファ (MEMα) 培 5% ウシ胎児血清 (FBS) と 3 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA;MEMΑ/BSA/FBS)。0.2 μ m 孔フィルターを通してメディアを滅菌します。MEMα/BSA/FBS マウスごとの 1 つのガラス皿に中小 5% CO2インキュベーターで 37 ° C に暖かいの 2.5 mL をデカントします。
注: 他のコレクションや、市販 (M2 と M16) 文化メディアもよく使用されますように。
注意: 操作手順中に周囲の空気露出を最小限に抑えるために限られた期間のための時間で 1 つ 5% CO2インキュベーターから培養皿を削除することをお勧めします。 - 頚部転位または IACUC ガイドラインによると CO2窒息を介してマウスを犠牲に。
- 大規模な V 字形の開口部を作る生殖不能のはさみを使って腹部骨盤腔を開きます。マウスの頭に向かって腸鉗子を使用して、転置します。それぞれの子宮角; を検索します。卵巣は胸郭に近位現在します。微細鉗子で卵管を押し、解剖はさみ (図 4) を使用して卵巣に脂肪のスーペリアーをカットします。卵管を押しながら微細鉗子の別のセットの MEMα、BSA、FBS 媒体を含んでいるコレクションの皿に滑液包と場所から卵巣をリリースし続けます。
注: 手順 1、37 ° C で卵巣を維持し、5% CO2で維持することが不可欠です。温度と CO2のレベルの最適なメンテナンスを可能にするのには、5% CO2ミックスにフック fliptop インキュベーターを使用できます。さらに、温度調節されたガラス ステージは卵母細胞の操作中に温度を維持するためにも使用ください。 - 27 ゲージ針 (または同じようなサイズ) 1 mL 注射器を使用して手動で大きいから胞状卵胞を穿刺によって卵丘卵子複合体をリリースします。
- 解剖顕微鏡で観察しながら手動式マイクロメータ-シリンジ (図 5) または毛管、口運営ガラス ピペットを使用して GV 段卵母細胞を収集します。のみから胞状卵胞からリリースされている卵を収集します。GV 卵子は約 90 の直径を持つ μ m GV 卵母細胞顆粒膜細胞の 2-3 層に囲まれています可能性があり、合計約 200 μ m の直径を持ちます。
- きれいな時計ガラスまたは中期に到達する 6 時間 MEMα/BSA/FBS 媒体を含んでいる 9 ウェル プレートの卵母細胞を培養 5% CO2インキュベーターで 37 ° C で私。
- 手順 4 に進みます。
3. 中期 II (MII) 採卵
- それぞれのマウスから分離した卵母細胞を最大にするには、5 IU PMSG の性的に成熟した処女雌マウス腹腔内注入します。44-48 時間後 5 IU ひと絨毛性ゴナドトロピン (hCG) の腹腔内注入します。
注: 最適な卵の収量、マウス必要があります時代の 1 ~ 3 カ月収穫卵母細胞の数が年齢とともに減少します。HCG を準備する溶解ボトル 200 mL の PBS に 10,000 U (5 U/0.1 mL)。-20 ° C で 600 μ L の単回使用の因数で保存します。 - 12-14 時間後 2.2 の手順で上記のよう MEMα、BSA、FBS コレクション媒体を準備します。
- 頚部転位または IACUC ガイドラインによると CO2窒息を介してマウスを犠牲に。
- 大規模な V 字形の開口部を作る生殖不能のはさみを使って腹部骨盤腔を開きます。マウスの頭に向かって腸鉗子を使用して、転置します。それぞれの子宮角を見つけて、卵巣は現在の胸郭に近位。微細鉗子で卵管を押し、解剖はさみ (図 4) を使用して卵巣に脂肪のスーペリアーをカットします。卵巣と卵管を削除し、MEMα、BSA、FBS 媒体を含んでいるコレクションの皿に置きます。
注: 手順 1 と 2、37 ° C で卵巣を維持し、5% CO2で維持することが不可欠です。温度と CO2のレベルの最適なメンテナンスを可能にするのには、5% CO2ミックスにフック fliptop インキュベーターを使用できます。さらに、温度調節されたガラス ステージは卵母細胞の操作中に温度を維持するためにも使用ください。 - 27 G で 1 mL 注射器 (または同じようなサイズ) を使用してまたは鉗子をシャープ、MII 卵子を解放する卵管膨大部の穴を引き裂きます。
注: 膨大部で卵子を傷つけないように気をつけてください。卵子が表示されます (図 4)、乳頭が腫れて、半透明表示されます。 - 手動式マイクロメータ-シリンジ (図 5) または毛管、口運営ガラス ピペットを使用してコレクションの中新しい皿に MII 卵子卵管の膨大部を収穫します。
- 手順 4 に進みます。
4. 卵を denuding 基礎と透明帯除去
- MEMα 中 3 mg/ml BSA の裸に周囲の卵丘細胞 (2.5 mL/マウス) 37 ° c、5% CO2時計ガラスの卵母細胞に補われるヒアルロニダーゼの 300 IU/mL を準備します。
注: ヒアルロニダーゼ効果は準備の 1 時間後に大幅減少します。MII 卵子, ヒアルロニダーゼ治療は必要ではありません。 - 裸にする周囲の卵丘細胞卵母細胞に 3 分間 MEMα/BSA のヒアルロニダーゼ 300 IU/mL に卵子積雲細胞複合体を公開します。
注意: それは卵母細胞に損傷を与える、ヒアルロニダーゼへの 3 分露出を超えないようにします。 - 卵母細胞を洗って、卵母細胞を新鮮な温め MEMα/BSA の中皿に転送します。小さな口運営ガラス ピペットまたは毛細血管 (約 90 μ m は、卵母細胞の直径よりもわずかに大きい) を使用して、ピペットの複合体を上下の卵丘細胞を完全に分離します。次のステップを準備している間、インキュベーターで回復する卵を許可します。
- 酸性タイロード液、MEMα/BSA、37 ° c (500 μ L/マウス) Waymouth のメディアを温めます。小さな 9 よくガラス プレートの各ウェルに場所 300 μ L。
- 透明帯 (ZP) を削除するには、タイロード液に 5-10 卵を転送します。ソリューションにのみ 30-45 秒の卵母細胞を公開します。
注: ソリューションにはあまりにもほとんど露出は削除されません、ZP 完全に破裂と広がってから染色体の卵子を回避します。あまりにも多くの露出は損傷し、卵母細胞を殺します。解剖顕微鏡の下で ZP ディゾルブを見て露出時間の最適化に役立ちます。
注意: は新鮮なタイロード液を使用してその機能が年齢とともに低下として重要です。ZP の制服消化できるように卵母細胞のグループごとにタイロード液の新鮮な井戸を使用します。 - ZP 除去後すぐに温めた MEMα/BSA/FBS 媒体に転送することによって卵子を洗います。このステップを繰り返します。
注: は、転送、卵子が一緒に固執する簡単に、ガラス ピペットまたは ZP の毛細血管除去に注意してください。前ぬれガラス ピペットまたは Waymouth の中の毛細血管と、一緒に付着卵が最小限になります。 - 転送でき、Waymouth の中 5% CO2インキュベーターで 37 ° C で 30 分の回復する卵。
- 手順 5 に進みます。
5. MI と MII 卵母細胞クロマチン スプレッド
- PAP のペンを使用すると、図 6 aに示すように、スライド ガラスに 11 x 44 mm2矩形を描きます。
- 定着剤の薄層を使用してスライドをコート (0.2% 1% パラホルムアルデヒド H2O、pH 9.2 トリトン X 100) のスライドに固定液 100 μ L を分注して、前後のスライドを揺動します。過剰な定着剤を取り除くためにスライドをタップします。
- できるだけ小さなメディアとして付いている小さな口ピペット針と 5-10 卵のピックアップ、固定液にスライド上 1 cm から卵子を堆積しながら定着剤コーティング スライド間でラインに針をドラッグします。卵母細胞が寄託されていること、彼らが破裂するため解剖顕微鏡を使用してこの手順を実行します。
注: 卵母細胞は、スライドにすぐにバーストする必要があります。卵子が、高さは、クロマチンの広がりの程度の影響を堆積させた。詳細についてはさらに図 6に代表的な結果を参照してください。 - スライド閉じた加湿チャンバー内で一晩に従うクロマチンを許可する室温で孵化させなさい。
- 完全に風乾し、リンスし、0.4% 湿潤剤 H2O、pH 8.0 の 50 mL を含む Coplin jar でスライドするスライドを許可します。
- 手順 6 に進みます。
6. Immunolabelling
- 表 1に示す抗体希釈バッファー (ADB) を準備します。
- 洗浄バッファー (WB) 溶液 (10 %pbs で希釈した ADB)、50 mL を格納した 2 つの Coplin jar と 50 mL WB と 0.05% 中性洗剤溶液を含む 1 つの Coplin jar の準備 (例えば、50 mL WB に 10% 洗剤の 250 μ L を追加)。
- WB の 50 mL を含む 1 つの Coplin jar のセクション 1 と 10 分のこのプロトコルの 5 で準備されたスライドを洗います。
注意: 任意の時点で immunolabelling の中にドライ スライドを聞かせてはいけません。 - Coplin jar 含む 50 mL WB と 0.05% 中性洗剤溶液に 10 分間スライドを洗います。10 分間 WB 溶液 50 mL を含む残り Coplin jar 内のスライドを洗います。
- ADB で希釈した選択された一次抗体の 100 μ L で余分な液体とカバーのスライドをタップします。4 ° c 密閉湿気の多い室内で一晩インキュベートします。
注: インキュベーションは、3 に 2 を短縮できる時間 37 ° C でCoverslip やパラフィルムでスライドを覆うことによって抗体 (例えば、50 μ L) のより小さいボリュームを使用します。 - 0.2% 湿潤剤 PBS 溶液、pH 8.0 50 mL を含む Coplin jar にスライドをすすぐ。
- 6.5 6.2 の手順を繰り返します。
- ADB で希釈した選択した二次抗体の 100 μ L で余分な液体とカバーのスライドをタップします。スライド 2 に 1 を孵化させなさい 37 ° c 湿度の高い密室での時間。
- 2 回の Coplin jar 0.2% 湿潤剤 PBS 溶液、pH 8.0 50 mL を含む 10 分スライドを洗います。
- 2 回 0.2% 湿潤剤 H2O 溶液、pH 8.0 50 mL を含む Coplin jar ファイルで 5 分用のスライドを洗います。
7. マウント スライド
- 手順 2 で準備、前期クロマチンのスプレッド 4', 6-diamidino-2-phenylindole を含むメディアをマウントの 100 μ L を追加 (DAPI、1.5µg/mL)。MI と MII のクロマチンのスプレッドの準備手順 5 は、DAPI を含むメディアをマウントの 50 μ L を追加 (1.5µg/mL)。そっと離れて余分な液体をしみ。
- 上 22 mm × 60 mm coverslip を置き、クリアのマニキュアをシールします。蛍光顕微鏡による評価まで 4 ° C または-20 ° C のスライド ボックスに格納します。
注: カバー スリップに軽くマニキュアでシーリングする前に余分なマウント中の解消をするをタップします。
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Representative Results
可視化し、卵母細胞の減数分裂期染色体を評価する 2 つの方法を説明しました。最初のテクニックは、胎生期および新生児の卵巣に前期の進行を評価への仕出し料理します。前期クロマチン普及準備、減数分裂、染色体、シナプスのペアリングを含む多数の動的プロセスを可視化するため非常に貴重な desynapsis、相同組換えと染色体のエピジェネティックな改造します。ここでは、このメソッド堅牢な可視化のためのユーティリティと c57bl/6 j 胚から採取した卵母細胞におけるクロス オーバー形成の定量的解析を行った (図 3 b と3 C)。Pachytene サブステージ内のセルの豊かにするには、マウス胚は 18.5 dpc (図 1) で取得されました。2 つの主要な認刻極印前期の pachytene サブステージの私は、同族体と相同物ペアあたり少なくとも 1 つ MLH1/3-肯定的なクロス オーバーの形成とシナプスの完了。同族体間の完全なシナプスが 20 SYCP3 の重複の存在によって明示され、SYCP1 を伸ばします。クロス オーバーにおける野生型卵母細胞を特徴付ける我々 カルビンディン抗体前期クロマチン SYCP3、SYCP1、MLH1、検出抗体を用いた製剤の普及し、DAPI を使用して DNA を染色します。図 3 bは、20 完全に組み立てられた SC 構造に沿って分布 27 MLH1 巣の存在によって証明される pachytene のステージ卵細胞の代表的なイメージを示しています。野生型卵母細胞で検出された MLH1 肯定的なクロス オーバーの平均数は 24 ± 3 (図 3 C, N = 15 卵母細胞)。図 3 D SMC6 濃縮 pericentromeric ヘテロクロマチン (PCH) 地域と染色体腕に沿って、MLH1 巣 pachytene 段階で SC に沿って分布を示しています。図 3E SYCP3、SMC6、MLH1 の正確な評価を防止するステージング pachytene 卵子染色体の普及準備されたサブ最適な個々 の染色体は区別されることを示しています。サブ最適な染色体のスプレッドは、ハイポ抽出バッファーで卵巣の孵化が長すぎるためまたはない長くのため十分な観察できます。
記載されている 2 番目の方法は、卵母細胞の減数分裂再開 (図 6B-d)、次にクロマチン形態を評価するために使用できます。倍数性と同様、蛋白質のローカリゼーション、簡単に評価できます、染色体分離エラーの潜在的な原因を公開します。図 6B 20 染色体を示す MI 卵子を示していて、セントロメアと pericentromeric ヘテロクロマチン染色クリアします。図 6は、染色体腕と PCH 沿いトポイソメラーゼ IIα (トポイソメラーゼ) を見ることができる拡大した画像です。図 6は、MII 卵子を示しています、一対の姉妹染色分け体は動原体および染色体の形態で区別できます。この手法をしようとしたときに見られる一般的なエラーには、PFA コーティング スライドに解放されたときと同様、染色体があまりにも遠く離れて (図 6 e-F) を拡散しない破裂卵母細胞が含まれます。ZP は完全に削除されていない場合、染色体は図 6 eで示すように、主軸に関連付けられたままになります。卵母細胞は、高すぎる PFA コーティング スライドから削除されます、染色体は図 6 階に描かれているあまりにも遠く離れて分散できます。
図 1: 女性の胎児・新生児の開発中に減数分裂前期タイムライン。青の輪郭は、特定前期サブステージ生殖細胞 (leptotene、zygotene、pachytene、および diplotene/dictyate ステージ) 胎生期および新生児の開発中に観察の人口を示します。濃い青の色の増加特定の前期のサブステージがより豊かになるタイミングを示します。この図は、参考2から適応されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 卵巣胚および新生女性の子犬から抽出。(B)母体の子宮角から取得後すぐに頭/首の接合部で胎児の首をはねるに前肢上記 (1) の最初のカットしました。(2) の 2 番目のカットは、前肢 (3) 下前方の半分に沿って切開後、胚の後部の半分の腹側正中線に沿って行われます。最後のカットは、後肢と尾 (4) 除去のものです。(A)正面ビュー模式図女性の子犬から卵巣の分離解剖カット。(B)内臓の相対的な位置と卵巣の分離の郭清カットの模式図のビューを側。赤い光に示されている地域には、肝臓と腸は、解剖時に削除されますが含まれます。背壁と関連する臓器がライトで表示されます青。この地域には、卵巣、子宮角の上部に腎臓の下極に接続されているが含まれています。(C)肝臓と腸の除去に続いて胚の背側の壁の正面の模式図。約 15-18 dpc で男性と女性の生殖腺の形態学的違いの模式図(D) 。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 代表的な前期クロマチンを広める準備します。(A) ガラス前期クロマチンを広める準備のために回路図をスライドさせます。黒正方形のアウトラインは、液体ブロッカー ペン アウトラインを表します。(B、C)代表的な画像と野生型 pachytene ステージ卵母細胞前期クロマチンを使用してクロス オーバー形成の定量化手順 1 で説明した製法を広げます。 (B) クロマチン スプレッドを 18.5 dpc の卵巣 fromC57BL/6 j マウス胚の分離を使用して行った。クロマチン スプレッドは SC 横要素タンパク質 SYCP3 (赤) と SC の中心的な要素タンパク質 SYCP1 (マゼンタ)、MLH1 抗体とカルビンディン抗体 (緑、クロス オーバー イベント マーカー) と DAPI (青, DNA).スケール バー = 10 μ m. (C) ドット プロット MLH1 巣の数 15 pachytene ステージ クロマチンから得られた拡散準備。エラーバーは標準偏差を表します。最適 (D) と (E) 前期の最適の (D, E) の比較、それぞれの準備の 。クロマチン スプレッドされた抗体 (緑)、SMC6 (赤)、MLH1 とカルビンディン抗体そして SYCP3 (青)。スケール バー = 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 成体卵巣の模式図.この図では、成体マウスの卵巣、卵管、膨大部、子宮の解剖学を示しています。マウス卵巣、腎臓の下極と腹部の後壁に卵巣を接続する靭帯の慎重な切開で除去されるべき。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 口運営ガラス ピペット、ガラス管、手動式マイクロメータ シリンジ卵母細胞操作用の画像。(A)ガラス ピペットマニピュレーター卵母細胞は次のコンポーネントのシーケンスで構成される: マウスピース、ラテックス チューブ (3.2 mm 内径 (ID) x 6.4 mm 外径 (OD))、1 mL ピペット チップ、ラテックス チューブ (11.1 mm 外径 x 6.4 mm ID)、ガラス パスツール ピペット。細いエンド (図 5 a1) を作成に炎で加熱されてパスツール ピペット ガラスの端に、端を引っ張った。(B)ガラス キャピラリー卵母細胞マニピュレーターはシーケンスの次のコンポーネントで構成: マウスピース、0.45 μ m フィルター (オプション)、ラテックス チューブ (外径 φ 6.4 mm x 3.2 mm ID)、1 mL ピペット チップ、ラテックス チューブ (11.1 mm 外径 x 6.4 mm ID)、70 μ のガラス管。ガラス毛細管は中心の炎で加熱され、先端両端の細い (図 5 b1) を持つ 2 つの毛細血管を作成する反対の方向に引っ張ら。(C)マイクロメータ シリンジを手で操作はシーケンス内の次のコンポーネントで構成: ミツトヨ マイクロ メーター 150-208 頭 (ミドルサイズ、0-1」の範囲は、0.001"卒業)、5 mL 注射器、ラテックス チューブ (外径 φ 6.4 mm x 3.2 mm ID)、1 mL ピペット チップ、ラテックス チューブ(11.1 mm 外径 x 6.4 mm ID)、1 mL ピペット チップと 83 × 0.5 mm2ゲルの読み込みヒント。ミツトヨ マイクロ メーター 150-208 頭しっかりと、5 mL シリンジ (図 51) に挿入されます。ヒントはゲルの読み込みヒントが安全に接続 1 mL ピペットを固定されていることを確認するには、(図 5の2) がカットされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 代表的な中期私と第二次卵母細胞クロマチンを広める準備。(A)私と第二次卵母細胞クロマチン普及準備中期の概略図をスライドさせます。卵 (円) 口運営ガラス ピペットまたは (矢印に続く) 直線で毛細血管を介してリリースします。黒の四角形のアウトラインは、液体ブロッカー ペン アウトラインを表します。(B, C)最適な中期私クロマチンを広める準備。中期私 CEN (緑、動原体/セントロメア マーカー) DAPI (青, DNA) とカルビンディン抗体染色による染色体。スケール バー = 10 μ m. (B) H4 ヒストン抗体 (ジ メチル トリ メチル K20、K20) pericentromeric ヘテロクロマチン (PCH) のラベルに使われました。(C)抗体トポイソメラーゼ IIα (トポイソメラーゼ) に対しては、PCH と染色体軸のラベルに使用されました。(D)最適な中期 II クロマチンを広める準備。CEN (緑)、およびヒストン H4 DAPI (青, DNA) とカルビンディン抗体染色された中期 II の染色体 (ジメチル K20、トリ メチル K20) PCH にラベルを付ける。スケール バー: 10 μ m. (E, F)貧しい中期私クロマチンを広める準備。染色体染色 DAPI (青, DNA) と CEN (緑) のカルビンディン抗体 REC8 減数分裂コヒーシン コンポーネントと.スケール バー = 10 μ m (E)を PFA コーティング スライド リリース時に烈しなかった卵。あまりにも遠く離れて広がった(F)染色体。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 項目 | 量 | 最終濃度 |
| 1x PBS | 50 mL | 1 x |
| BSA | 1.5 g | 3% (w/v) |
| ウマ血清 | 5 mL | 10% (v/v) |
| 10% 洗剤 (を参照してください。 材料の表)PBS で |
250 Μ L | 0.05% (v/v) |
表 1:抗体希釈バッファー (ADB) レシピ。4 ° C で ADB を格納またはより多くの数量を作る場合、-20 ° C で株を凍結します。ADB は、汚染になることができる、ように良い無菌技術が使用され、各使用前に汚染のためのソリューションを評価してください。ADB の小さい因数は、汚染を最小限に抑えるためにも用意できます。
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Discussion
クロマチン普及準備は、年代順に女性哺乳類減数分裂とタンパク質の動的局在の研究に研究を許可します。胎児・新生児のクロマチン スプレッド行事が減数分裂前期の綿密な分析を可能にします。中期私と中期 II クロマチン スプレッドを使用と単一の妹を区別できますから染色分け体一対姉妹と一対の相同染色体倍数性の評価と同様。比較では、ここで説明したプロトコルできる有利な頻繁クロマチン結合タンパク質の分解能を減少させるバック グラウンド信号の高レベルを生成する全体卵母細胞 immunolabelling と比較しています。さらに、クロマチン拡散技術は、時間と専門的な機器の大規模な投資を必要とする生細胞イメージングに魅力的な代替手段を表しています。
胎児・新生児の卵巣を検索し、抽出することは困難にすることができます。他のすべての臓器と卵巣を検索し、(図 2 b) 胚/子犬の PBS の新鮮な料理を使用する前に PBS を含む別の皿に腎臓以外にも材料を慎重に抽出をお勧めします。胚/子犬が男性の精巣は細管形成と生殖腺 (図 2 D) の位置によって区別されます。男性の胚の開発として、精巣はより大きく、楕円形になって、ペニスに向かって降下します。
卵母細胞クロマチンを広める手法には、採卵と口運営ガラス ピペットまたは毛細管を使用して操作の習得が必要です。このプロトコルを実行する前に口の中のピペットを制御する練習をお勧めします。コレクションの適切なサイズのガラス ピペット/キャピラリーを引っ張ってくると卵を denuding 基礎と、卵子が、タイロード液のように同様にインキュベーター外時間を最小限に抑えることによって、成功と効率性のチャンスが増加します。ZP 除去の適切なタイミングは、このメソッドの成功にとって非常に重要です。卵母細胞は、時間の不足量タイロード液でインキュベートされ、ZP は完全に削除されません。これは卵母細胞が図 6 eで見ることができる、スライドで、効率的に破裂することを防止します。ただし、卵子が長すぎるためタイロード液培養、卵品質と下流の免疫組織染色法が厳しく損なわれます。ZP はタイロード液に溶解する正確な時刻を確認する顕微鏡下で卵子を見てお勧めします。タイロード液に一度にのみ 5-10 卵を追加すると、過度の露出が最小限になります。卵子が PFA コーティング スライド上高すぎるリリースされた染色体によってあまりにも遠く離れて (図 6 階) に広げることができます。卵母細胞が 1 cm スライド上を解放されると、最適な結果が見つかります。結果を妨げることができる他の要因は卵母細胞操作手順中に周囲の空気低下の CO2レベルへの長期暴露を含めます。これは卵の品質に有害であるメディアの pH 変動を引き起こし、オレンジがかった赤からメディアの進歩的な色の変化で明らかであるピンク色に。メディアのバッファリング能力も時間とともに減少します。したがって、1 週間よりも長く (4 ° C) に保存されているメディアを使用してはお勧めしません。M2 媒体 CO2バッファーを必要としない、通常の代替として使用されます。
クロマチンを広める準備の制限のセルのネイティブ コンテキスト内でクロマチンの可視化の欠乏であります。核以外の細胞材料を視覚化することはできませんし、紡錘体形成を評価できません。したがって、他の方法は、双極性のスピンドルにまとめられモノ極軸22モナス トロール治療後全体卵 immunolabelling などのクロマチン スプレッドに加えて卵形成を評価するために使用できます。これにより、姉妹染色分け体のセルのコンテキスト内で評価されます。総称して、ここで説明するクロマチンを広める方法はクロマチンの形態と染色体の倍数性新規遺伝子および突然変異体マウス モデルにおける卵形成全体を評価するために簡単に適用できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は日の出 (R01GM11755) に P.W.J、g. h. と j. h. 訓練助成フェローシップ国立がん研究所 (NIH) (CA009110) からサポートされていた
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Quality Biological | 119-069-161 | |
| 60 mm x 15 mm petri dishes | Denville | T1106 | |
| 35mm x 12mm petri dishes | Denville | T1103 | |
| Fine forceps | VWR | 300-050 | |
| Micro dissection scissors | Ted Pella | 1340 | |
| Dissecting scissors, sharp tip, 41/2" | VWR | 82027-578 | |
| Watch glass square 1 5/8 | Carolina Biological Supply Company | 742300 | Autoclave before each use |
| Sucrose | Sigma | S8501 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Sigma | S1804 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 646563 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| 50x Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in) | Becton, Dickinson (BD) | 309623 | |
| Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick) | Thermo | 3063-002 | |
| Super PAP pen, large (liquid blocker) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| 16% Paraformaldehyde aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Detergent in manuscript |
| Immuno stain moisture chamber | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Coplin jars | Fisher | 08-815 | |
| Photo-flo 200 | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 74257 | Wetting agent in manuscript |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | G4877 | Store aliquots at -20C |
| Human chorionic gonadotropin (HCG) | Sigma | C0434 | Store aliquots at -20C |
| PYREX Spot Plates with nine concave cavities | Fisher | 13-748B | Autoclave before each use |
| Glass capillary | Fisher | 22260943 | For making oocyte collection needles |
| Brand Parafilm M | Sigma | BR701501 | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5B | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5D | For making oocyte collection needles |
| Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing | Sigma | A5177-5EA | For making oocyte collection needles |
| Mitutoyo micrometer head | Mituoyo | 150-208 | For making oocyte collection needles |
| Syringe 5 mL | BD Biosciences | 309646 | For making oocyte collection needles |
| Syringe filter 0.45 μm filter | Corning | 431220 | For making oocyte collection needles |
| Glass Pasteur Pipette 5 3/4" | Fisher | 13-678-6A | For making oocyte collection needles |
| 83 x 0.5 mm pipette tip | Denville | P3080 | For making oocyte collection needles |
| α-MEM | Invitrogen | 11415049 | |
| Waymouth's media | Life Technologies | 11220035 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | A3160602 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3311 | For oocyte culture media |
| 500ml filter units 0.22um | Denville | F5227 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Tyrode’s solution | Sigma | T1788 | Store aliquots at -20C |
| Horse serum | Sigma | H-1270 | For ADB/wash buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A1470 | For ADB/wash buffer |
| VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope cover slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear nail polish | Amazon | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Mouse anti-MLH1 | Life Technologies | MA5-15431 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti-SYCP1 | Life Technologies | PA1-16763 | Dilution factor- 1:1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | Dilution factor- 1:50 |
| Human anti-centromere protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti- TOPOII | Abcam | ab109524 | Dilution factor- 1:100 |
| Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20) | Abcam | ab78517 | Dilution factor- 1:500 |
| Rabbit anti-Rec8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | Dilution factor- 1:10,000 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11057 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-21202 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-31573 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11004 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo-Fisher Scientific | A-11013 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11011 | Dilution factor- 1:500 |
References
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