Summary
Oogenesis i pattedyr er kjent for å være utsatt for feil, spesielt på grunn av kromosom missegregation. Denne oppgaven beskriver chromatin spre forberedelse metoder for mus prophase, metaphase jeg og II-trinnvis oocytes. Disse grunnleggende teknikkene tillater for studier av chromatin-bundet proteiner og kromosom morfologi gjennom pattedyr oogenesis.
Abstract
Chromatin spredning teknikker har vært mye brukt til å vurdere den dynamiske lokaliseringen av under gametogenesis, spesielt for spermatogenesis. Disse teknikkene tillater for visualisering av protein og DNA lokalisering mønstre under meiotic hendelser som homologe kromosomer sammenkobling, Adept og DNA reparasjon. Mens noen protokoller har blitt beskrevet i litteraturen, er generelle chromatin spredning teknikker bruker pattedyr prophase oocytes begrenset og vanskelig på grunn av tidspunktet av meiose i fosterets eggstokkene. Til sammenligning kan prophase spermatocytes hentes fra unge mannlige mus med høyere avkastning uten behov for microdissection. Det er imidlertid vanskelig å få en ren synkronisert populasjon av celler på bestemte stadier på grunn av heterogenitet av meiotic og etter meiotic bakterie celle populasjoner i juvenile og voksen testikkel. Senere stadier av meiose er det en fordel å vurdere oocytes gjennomgår meiose jeg (MI) eller meiose II (MII), grupper av eldre oocytes kan være samlet inn fra voksne kvinnelige mus og stimuleres til å gjenoppta meiose i kultur. Her metoder for meiotic chromatin spre preparater med oocytes dissekert fra fosterets, neonatal og voksen eggstokkene er beskrevet med tilhørende video demonstrasjoner. Kromosom missegregation hendelser i pattedyr oocytes er hyppig, spesielt under MI. Disse teknikkene kan brukes til å vurdere og beskrive effekten av ulike mutasjoner eller miljømessige eksponeringer i ulike stadier av oogenesis. Som det er tydelige forskjeller mellom oogenesis og spermatogenesis, er teknikkene innen uvurderlig å øke vår forståelse av pattedyr oogenesis og dekket av hvit funksjonene i kromosom og protein dynamics under meiose .
Introduction
Under spermatogenesis, er store halvsynkron bølger av meiotic bakterie celler raskt og fortløpende fornyes i testikkel ved utbruddet av puberteten og hele voksenlivet1. I motsetning til menn startes meiose i kvinner utelukkende under fosterets utvikling. Etter fødselen, oocytes fortsatt arrestert i en langvarig dictyate fase av prophase med en intakt germinal vesicle (GV, kjernefysiske konvolutten) før puberteten. Ved utbruddet av puberteten, et delsett av oocytes er syklisk valgt å gjennomgå vekst og modning, merking initiering av meiotic gjenopptakelse. Meiotic gjenopptakelse i fully-grown oocytes er manifestert av forsvinningen av GV i en prosess kalt germinal vesicle nedbryting (GVBD). Oocyte gjennomgår deretter kromosom kondens og segregering, etterfulgt av polar kroppen ekstrudering. Oocytes bli arrestert på progresjon til MII og stimuleres til å fullføre den andre og siste meiotic divisjonen bare etter befruktning.
Kvinnelig fertilitet er svært avhengig av suksessen til meiotic prophase jeg progresjon. Nøkkelen til dette er dannelsen av en fysisk kobling mellom homologe kromosomer kjent som chiasmata, som er formidlet av reparasjon av indusert DNA dobbel-strand bryter (DSBs) via crossover rekombinasjon2. Dette skjer innenfor rammen av en dynamisk proteinrik stillaset kalles synaptonemal komplekset (SC) som danner mellom homologe kromosomer å lette deres Adept3. SC er en glidelås som tre struktur som består av to parallelle lateral elementer forbundet med sentrale regionen proteiner som holder homologs sammen gjennom pågående DNA-reparasjon. Før Adept danne forløpere for sideveis elementer, kalt aksial elementer, mellom søster chromatids. Synaptonemal kompleks proteiner som SYCP2 og SYCP3 danner aksial elementer som colocalize til søster-chromatid samhold aksene under tidlig prophase. Disse senere være bindende områder for tverrgående filament protein, SYCP1, som sentralt element montering og Adept mellom justert homologs4. I mus oocytes angis komplett Adept av tilstedeværelsen av 20 helt overlappende SYCP3 og SYCP1 strekninger, som kan visualiseres med chromatin spredt forberedelser. Adept er fullført ved inngåelse av pachytene substage, der modne overganger som skal sendes til skjemaet chiasmata mellom homologs er dekorert med mutL homolog (MLH1/3) dimers å fremme deres nøyaktige behandling5,6 , 7. strukturelle vedlikehold av kromosomer (SMC) komplekser, inkludert cohesin, condensin og SMC5/6 komplekse, er viktig for regulering av kromosom dynamikk og struktur gjennom meiose8,9, 10,11,12. Samlet sikre disse hendelsene riktig bi-retning av homologe kromosomer til motstridende spindel polakkene etter demontering av SC.
Meiotic celle syklusen er en effektiv modell undersøke rollene som ulike proteiner i genomet vedlikehold programmert induksjon og etterfølgende reparasjon av DNA DSBs. Videre er pattedyr meiose også en aktuelle modell for studiet av epigenetic endringer og preging13. Men er det teknisk vanskelig å vurdere disse hendelsene under kvinnelige meiose, som finner sted i fosterlivet og neonatal eggstokkene hos pattedyr (figur 1). Prophase jeg kan deles inn i 5 substages: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema og dictyate. Her beskriver vi hvordan å isolere og skille mellom fosterets og neonatal eggstokker og testikler (figur 2). Tilpasset fra tidligere beskrevet metoder, dette manuskriptet også skisserer en protokoll (trinn 1) med video demonstrasjon for utarbeidelse av kvinnelige meiotic prophase jeg chromatin sprer14,15,16,17 . Når kombinert med immunolabelling, som beskrevet i trinn 6-7, denne protokollen gir detaljert mikroskopisk analyse av prophase jeg hendelser i oocytes.
Oogenesis er utsatt for feil, og kromosom missegregation hendelser i den første meiotic divisjonen representerer den vanligste kilden til genetisk sykdom i avkom18,19. I dette manuskriptet (protokollen trinn 2) beskriver vi en protokoll som modne GV-trinnvis oocytes trekkes ut fra primet eggstokkene voksne kvinnelige mus. Under støttende forhold gjennomgå fully-grown oocytes luteiniserende hormon-uavhengig gjenopptakelse av meiose etter isolasjon og kultur20. Etter meiotic gjenopptakelse, oocytes fremdrift gjennom meiose jeg og arrestere på metaphase II. Oocytes forblir arrestert på metaphase II, med mindre befruktet. I trinn 2 – 5: vi tilpasse tidligere rapportert protokoller med video demonstrasjon å beskrive hvordan å samle, kultur og forberede MI og MII oocytes chromatin spre forberedelser21. Denne chromatin spre teknikken gir klare immunolabelling proteiner tilknyttet kromosomer. Videre denne protokollen kan også brukes til å skille mellom bivalent og funksjonelle grupper som består kromosomer, og kan videre løse enkelt søster chromatids å lette vurdering av oocyte ploidy. Derfor, i tillegg til avsløre lokalisering mønstre av meiotic proteiner, denne protokollen kan også tjene som et uvurderlig verktøy for Klargjørende mulige årsaker til kromosom missegregation MI og MII.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Johns Hopkins University. Eksperimenter ble utført på vill-type C57BL/6J mus.
1. høsting fosterets eller Neonatal eggstokkene og forberedelse av Prophase Chromatin sprer seg
- For å pakke ut embryo 14.5-19,5 dager ofre innlegg-coitum (PPC) gravide kvinner via cervical forvridning eller CO2 kvelning i henhold IACUC retningslinjer.
NOTE For postnatal dag 1 – 5 eggstokkene hoppe til trinn 1.3. Figur 1 oppsummerer meiotic prophase stadier beriket på ulike embryonale og postnatal aldre. - Åpne abdominopelvic hulrom bruker sterilt saks, gjør en V-formet åpning. Dissekere ut mors livmor Hornet skille embryoene fra morkaken og overføre embryo til 35 mm petri retter som inneholder 3 mL forvarmes 1 x fosfat buffer saltvann (PBS) på 37 ° C.
Merk: En fliptop inkubator satt på 37 ° C kan brukes til å opprettholde temperaturen. I tillegg kan en temperatur regulert glass scene også brukes å opprettholde temperaturen i eggstokken manipulasjon. - Med 3,5-tommers kirurgisk saks, ofre embryo eller pups via halshogging ifølge IACUC retningslinjer. Plassere decapitated embryo eller pups i forvarmes PBS før videre disseksjon.
- Dissekere en embryo eller pup samtidig i en separat 35 mm Petriskål inneholder 3 mL forvarmes PBS på 37 ° C. Fortsett ved å kutte langs ventrale midtlinjen av bakre halvdel av embryoet, langs den fremre delen under forelimbs og direkte over bakbeina og hale som i figur 2A-B.
- Åpne magen med 3,5-tommers kirurgisk saks. Bruke tynn tang fortrenge eller fjerne leveren og ledd av tarm, utsette eggstokkene i en nye 35 mm Petriskål inneholder 3 mL forvarmes PBS på 37 ° C (se guide i figur 2B). Eggstokkene ligger like under og bak nyre mot den bakre veggen i bukhulen (figur 2B-C). En guide for å skille mellom mannlige og kvinnelige gonader finnes i figur 2D.
Merk: For optimal forhold, raskt dissekere ut eggstokkene når gravid kvinne er ofret. - Fjerne begge eggstokkene fra hver kvinnelig fetus med en tynn tang under en disseksjon omfang og sted i en se briller eller separat på en flere godt plate som inneholder 0.5 til 1.0 mL forvarmes PBS og opprettholde på 37 ° C.
- Plass hvert par av eggstokkene i 0,5 mL hypo-utvinning buffer (17 mM trisodium citrate dihydrate, 50 mM sukrose, 5 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 30 mM Tris-HCl, protease inhibitor, pH 8.2) i et rent se glass eller en liten godt av en 9-og plate, og pass på å fordype eggstokkene komp letely. Inkuber i minst 15 min, men ikke mer enn 30 min.
Merk: Gjør hypo-utvinning buffer frisk og bruk innen 2 t DTT tillegg. - Under inkubasjonen, bruke hydrofobe barriere PAP penn, tegne to 22 x 22 mm2 ruter på en ren glass 25 x 75 mm21 mm tykk microscope skyve som vist i figur 3A.
Merk: Lysbilder kan være forberedt på forhånd. - Pipetter 45 – 50 µL av 100 mM Sukrose på et rent lysbilde og overføre ett par eggstokkene til drop.
- Bruker den skarpe endene av to 27 G nåler, erte eggstokkene fra hverandre for å slippe celler i sukrose løsningen. Med pinsett, fjerne store deler av eggstokk og nøye Pipetter sucrose løsning for å spre celler.
- Sted 40 µL etappe, den stabiliserende løsning (1% paraformaldehyde (PFA), 0,2% vaskemiddel (se Tabell for materiale), pH 9.2) til hver firkant forberedt på lysbildet. Med 200 µl pipette tips, spre etappe, den stabiliserende løsningen jevnt over lysbildet overflaten.
- Pipetter 20 µL av sukrose miksen på hver kvadratet av lysbildet som inneholder bindemiddel.
Merk: Dette tilsvarer to par eggstokkene per lysbilde. - Inkuber lysbildene i et lukket fuktig kammer over natten i romtemperatur.
Merk: Den natten inkubering kan variere rundt (12-15 timer) ved romtemperatur. - Åpne kammeret lokket og la lysbildene for å air-dry helt.
- Vask lysbilder i en Coplin glasset som inneholder 50 mL av 0,4% wetting agent-PBS løsning (se Tabell for materiale) i 2 minutter, lufttørke og videre til immunolabelling protokollen (trinn 6).
Merk: Det kan være mulig å lagre lysbilder ved-80 ° C for senere bruk, men dette varierer avhengig av protein av interesse. For optimale resultater videre umiddelbart til immunolabelling protokollen (trinn 6).
2. metaphase jeg Oocyte samling
- For å maksimere antall Boas follikler isolert fra hver mus, intraperitoneally injisere kjønnsmoden jomfru kvinnelige mus med 5 IE gravid mare's serum gonadotropin (PMSG, også kjent som equine choriongonadotropin (eCG)).
Merk: For optimal oocyte avkastning, mus bør være 1 å 3 måneder gammel, som antall oocytes høstet reduseres med alderen. For å forberede PMSG, oppløse flaske 5000 IU i 100 mL steril PBS (5 U/0.1 mL) butikk i engangs dele 600 µL på 20 ° C. - Etter 44 – 48 h, forberede samling medium, minimum viktig middels alpha (MEMα) middels med 5% fosterets bovin serum (FBS) og 3 mg/mL bovin serum albumin (BSA; MEMΑ/BSA/FBS). Sterilisere media gjennom et 0,2 µm pore filter. Dekanter 2,5 mL av MEMα/BSA/FBS medium i ett glass rett per musen og varmt 37 ° c i en 5% CO2 inkubator.
Merk: Andre samlingen og kultur medier som er kommersielt tilgjengelig (M2 og M16) er også ofte brukt.
Forsiktig: Vi anbefaler fjerne kultur retter fra 5% CO2 inkubator én om gangen for begrenset varighet å minimere luft eksponering i manipulasjon trinnene. - Ofre musene via cervical forvridning eller CO2 kvelning i henhold IACUC retningslinjer.
- Åpne abdominopelvic hulrom bruker sterilt saks, gjør en stor V-formet åpning. Ved hjelp av pinsett, fortrenge tarmen mot hodet av musen. Finn hver livmor horn; eggstokkene er presentere proksimale til ribbe buret. Hold oviduct med fine tang og klippe fettet superior til eggstokken med disseksjon saks (Figur 4). Fortsett å holde oviduct, og med et annet sett av fine tang slippe eggstokken fra bursa og sted inn i samling tallerken med MEMα/BSA/FBS medium.
Merk: Som i trinn 1 er det viktig å holde eggstokkene på 37 ° C og opprettholde på 5% CO2. En fliptop inkubator koblet til 5% CO2 blanding kan brukes å tillate for optimalt vedlikehold av temperatur og CO2 -nivåer. I tillegg bør en temperatur regulert glass fase også brukes til å opprettholde temperaturen under oocyte manipulasjon. - Med en 1 mL sprøyte med en 27-gauge p (eller samme størrelse), slipper cumulus oocyte komplekser av manuelt punktering store Boas follikler.
- Mens observere gjennom disseksjon mikroskop, samle GV-trinnvis oocytes bruker en munn-opererte glass pipette eller kapillær eller en hånd-opererte mikrometer-sprøyte (figur 5). Bare samle oocytes som utgis fra Boas follikler. GV oocytes har en diameter på ca 90 µm. GV oocytes kan være omgitt av 2-3 lag av granulosa celler, og totalt rundt 200 μm i diameter.
- Kultur oocytes i en ren se glass eller en 9-og plate inneholder MEMα/BSA/FBS middels 6 h nå metaphase jeg 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
- Fortsett med trinn 4.
3. metaphase II (MII) Oocyte samling
- For å maksimere oocytes isolert fra hver mus, intraperitoneally injisere kjønnsmoden jomfru kvinnelige mus med 5 IE PMSG. Etter 44 – 48 h, intraperitoneally injisere med 5 IE av humant choriongonadotropin (hCG).
Merk: For optimal oocyte avkastning, mus bør være 1 å 3 måneder gammel, som antall oocytes høstet reduseres med alderen. For å forberede hCG, oppløse en flaske 10.000 U i 200 mL PBS (5 U/0.1 mL). Lagre i engangs dele 600 µL på 20 ° C. - Etter 12-14 timer, forberede MEMα/BSA/FBS samling medium, som beskrevet i trinn 2.2, ovenfor.
- Ofre musene via cervical forvridning eller CO2 kvelning i henhold IACUC retningslinjer.
- Åpne abdominopelvic hulrom bruker sterilt saks, gjør en stor V-formet åpning. Ved hjelp av pinsett, fortrenge tarmen mot hodet av musen. Finne hver livmor horn, eggstokkene er presentere proksimale til ribbe buret. Hold oviduct med fine tang og klippe fettet superior til eggstokken med disseksjon saks (Figur 4). Deretter fjerne eggstokken og oviduct og plasser i samlingen tallerken med MEMα/BSA/FBS medium.
Merk: Som i trinn 1 og 2 er det viktig å holde eggstokkene på 37 ° C og opprettholde på 5% CO2. En fliptop inkubator koblet til 5% CO2 blanding kan brukes å tillate for optimalt vedlikehold av temperatur og CO2 -nivåer. I tillegg bør en temperatur regulert glass fase også brukes til å opprettholde temperaturen under oocyte manipulasjon. - Bruker en 1 mL sprøyte med en 27 G (eller samme størrelse) eller skarpe tang, rive et hull i ampulla av oviduct å løslate MII-oocytes.
Merk: Pass på ikke å skade oocytes i ampulla. Ampulla vises hovne og gjennomsiktig slik at oocytes er synlig (Figur 4). - Høste MII oocytes fra ampulla i oviduct i en ny rett med samling medium bruker en munn-opererte glass pipette eller kapillær eller en hånd-opererte mikrometer-sprøyte (figur 5).
- Fortsett med trinn 4.
4. oocyte Denuding og Zona Pellucida fjerning
- Forberede 300 IU/mL av hyaluronidase i MEMα medium med 3 mg/mL BSA til denude oocytes i omkringliggende cumulus celler (2.5 mL/mus) i en se glass, og holde på 37 ° C, 5% CO2.
Merk: Hyaluronidase effekten avtar kraftig etter 1 h forberedelser. MII oocytes er hyaluronidase behandling ikke nødvendig. - Utsett oocyte-cumulus celle komplekser til 300 IU/mL av hyaluronidase i MEMα/BSA for 3 min til denude oocytes i omkringliggende cumulus celler.
Forsiktig: Ikke overstige 3 min eksponering for hyaluronidase, som det vil skade oocytes. - Å vaske oocytes, overføre oocytes til en frisk varmet MEMα/BSA middels parabolen. Bruker en liten munn-opererte glass pipette eller kapillær (litt større enn diameteren på oocyte, som er ca 90 µm), Pipetter komplekser opp og ned for å fullstendig fjerne cumulus cellene. Tillat oocytes gjenopprette i inkubator mens forbereder neste trinn.
- Varme og sure Tyrode løsning, MEMα/BSA og Waymouth's media 37 ° c (500 µL/mus). Sted 300 µL i hver brønn av små 9-vel glassplater.
- Hvis du vil fjerne zona pellucida (ZP) overføre 5-10 oocytes Tyrodes løsning. Utsett oocytes bare 30-45 r løsningen.
Merk: For lite eksponering for løsningen vil ikke fjerne ZP helt, som hindrer oocytes sprekker og kromosomene sprer seg. Mye eksponering vil skade og drepe oocyte. Se ZP oppløses under disseksjon mikroskopet kan hjelpe i optimalisere eksponeringstid.
Advarsel: Bruker ferske Tyrode løsning er avgjørende som dens funksjon avtar med alderen. Bruk en frisk godt Tyrodes løsning for hver oocytes behandlet for å sikre ensartet fordøyelsen av ZP. - Umiddelbart etter ZP fjerning, vask oocytes ved å overføre til varmet MEMα/BSA/FBS medium. Repeter dette vask.
Merk: Vær forsiktig når du overfører, som oocytes vil lett holde sammen og glass pipette eller kapillær følgende fjerning av ZP. Pre wetting glass pipette eller kapillær i Waymouth's medium vil redusere oocytes henger sammen. - Overføre og la oocytes gjenopprette i 30 minutter i Waymouth's medium på 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
- Fortsett med trinn 5.
5. MI og MII Oocyte Chromatin oppslag
- Bruke en PAP, tegne et 11 x 44 mm2 rektangel på objektglass som vist i figur 6A.
- Pels lysbildet med et tynt lag av bindemiddel (1% paraformaldehyde, 0,2% Triton-X 100 H2O, pH 9.2) av pipettering 100 µL av bindemiddel på lysbildet og rocking lysbildet frem og tilbake. Trykk på lysbildet for å bli kvitt overflødig bindemiddel.
- Plukk opp mellom 5-10 oocytes med en liten munn pipette nål med som liten media som mulig og dra nålen i en linje over bindemiddel-belagt lysbildet mens innskudd oocytes fra 1 cm over lysbildet inn i etappe, den stabiliserende løsningen. Utføre dette trinnet bruke disseksjon mikroskop for å sikre at oocytes har blitt satt og at de har sprekker.
Merk: Oocytes skulle briste umiddelbart på lysbildet. Høyden hvor oocytes er avsatt effekten graden av chromatin sprer seg. Se representant resultater i figur 6 for ytterligere detaljer. - Inkuber lysbilder ved romtemperatur i et lukket fuktet kammer over natten å tillate chromatin å følge.
- Gi lysbildene air-dry helt og skyll lysbilder i en Coplin glasset som inneholder 50 mL av 0,4% wetting agent-H2O, pH 8.0.
- Fortsett med trinn 6.
6. Immunolabelling
- Forberede antistoff fortynning bufferen (ADB) beskrevet i tabell 1.
- Forberede to Coplin rystelser som inneholder 50 mL av buffer (WB) vaskeløsning (10% ADB fortynnet i PBS), og en Coplin glasset som inneholder 50 mL WB og 0,05% rengjøringsmiddel (f.ekslegge 250 µL av 10% vaskemiddel til 50 mL WB).
- Vask lysbildene som ble utarbeidet i delen 1 og 5 av denne protokollen for 10 min i en Coplin glasset som inneholder 50 mL av WB.
Forsiktig: Ikke la lysbildene tørr når som helst under immunolabelling. - Vask lysbilder for 10 min i Coplin glasset som inneholder 50 mL WB og 0,05% såpevann. Deretter vaskes lysbildene i gjenværende Coplin glasset som inneholder 50 mL av WB løsning for 10 min.
- Trykk ut overflødig væske og dekke lysbildet med 100 µL av valgte primære antistoffer fortynnet i ADB. Ruge på 4 ° C over natten i et lukket fuktig kammer.
Merk: Inkubasjon kan forkortes til 2 til 3 timer på 37 ° C. Bruk mindre mengder antistoff (f.eks, 50 µL) ved å dekke lysbildet med en dekkglassvæske eller parafilm. - Skyll lysbilder i en Coplin glasset som inneholder 50 mL av 0,2% wetting agent-PBS løsning, pH 8.0.
- Gjenta 6.2 til 6.5.
- Trykk ut overflødig væske og dekke lysbildet med 100 µL av valgte sekundære antistoffer fortynnet i ADB. Inkuber lysbildene 1 til 2 timer på 37 ° C i en lukket fuktig kammer.
- Vask lysbilder 2 ganger for 10 min i Coplin glass som inneholder 50 mL av 0,2% wetting agent-PBS løsning, pH 8.0.
- Vask lysbildene 2 ganger i 5 min i Coplin glass som inneholder 50 mL av 0,2% wetting agent-H2O løsning, pH 8.0.
7. montering lysbilder
- Prophase chromatin sprer seg i trinn 2, legge 100 µL av montering medium som inneholder 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1.5µg / mL). For MI og MII chromatin sprer seg forberedt i trinn 5, legge 50 µL av montering medium som inneholder DAPI (1.5µg / mL). Forsiktig blot bort overflødig væske.
- Plasser en 22 x 60 mm dekkglassvæske på toppen og forsegle med klart neglelakk. Lagre i en lysbilde 4 ° C eller 20 ° C til vurdering via fluorescens mikroskopi.
Merk: Trykk lett på cover slip kvitt overflødig montering medium før tetting med neglelakk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har beskrevet to teknikker for å visualisere og vurdere meiotic kromosomer i oocytes. Den første teknikken er rettet mot vurdere prophase progresjon i embryonale og neonatal eggstokkene. Prophase chromatin spredning forberedelser er utrolig verdifull for å visualisere mange dynamisk prosesser under meiose, inkludert kromosom sammenkobling, Adept og desynapsis, homologe rekombinasjon, og epigenetic kromosom remodeling. Her har vi vist nytten av denne metoden for robust visualisering og kvantitativ analyse av crossover formasjon i oocytes høstet fra C57BL/6J embryo (figur 3B og 3 C). For å berike for cellene i pachytene substage, ble mouse embryoer hentet på 18,5 dpc (figur 1). To store kjennetegnene av pachytene substage av prophase jeg er fullføringen av Adept mellom homologs, og dannelsen av minst ett MLH1/3-positiv krysskabel per homolog par. Komplett Adept mellom homologs er manifestert av tilstedeværelsen av 20 overlappende SYCP3 og SYCP1 strekker seg. Å karakterisere crossover formasjon i vill-type oocytes vi immunolabeled prophase chromatin spre forberedelser ved hjelp av antistoffer som SYCP3, SYCP1 og MLH1, og farget DNA ved hjelp av DAPI. Figur 3B viser et representativt bilde av en pachytene scenen oocyte, noe som er dokumentert av tilstedeværelsen av 27 MLH1 foci fordelt langs 20 ferdigmonterte SC strukturer. Gjennomsnittlig antall MLH1-positive overganger i vill-type oocytes var 24 ±3 (Figur 3 C, N = 15 oocytes). Figur 3D viser SMC6 beriket regionen pericentromeric heterochromatin (PCH) og langs kromosom armene og MLH1 foci fordelt langs SC på pachytene scenen. Figur 3E viser en pachytene iscenesatt oocyte der kromosom spredning Underarbeidet sub-optimal og personlige kromosomer er utvisket, forebygge nøyaktig vurdering av SYCP3, SMC6 og MLH1. Sub-optimale kromosom oppslag kan observeres når inkubering av eggstokkene hypo-utvinning buffer er for lenge eller ikke for lenge nok.
Den andre metoden beskrevet kan brukes til å vurdere chromatin morfologi i oocytes etter meiotic Gjenopptagelse (figur 6BD). Protein lokalisering, samt ploidy, kan lett bli vurdert, utsette mulige årsaker kromosomet segregering feil. Figur 6B viser en MI oocyte viser 20 kromosomer, og fjern centromere og pericentromeric heterochromatin flekker. Figur 6C er et zoomet bilde hvor topoisomerase IIα (TOPOII) kan sees langs kromosom armene og PCH. Figur 6D viser en MII oocyte der sammenkoblede søster chromatids kan skilles av kromosom og centromere morfologi. Vanlige feil sett når denne teknikken inkluderer oocytes ikke sprengning når utgitt på PFA-belagt lysbildet, samt kromosomene sprer seg for langt fra hverandre (figur 6E-F). Hvis ZP ikke er fjernet, forblir kromosomene tilknyttet spindelen, som vist i figur 6E. Hvis oocytes slippes for høyt fra PFA-belagt lysbilde, kan kromosomene spres for langt fra hverandre som vist i figur 6F.
Figur 1: Meiotic prophase tidslinjen under kvinnelige embryonale og neonatal utvikling. Blå profilene angir bestander av bestemte prophase sub scenen bakterie celler (leptotene, zygotene, pachytene og diplotene/dictyate fase) observert under embryonale og neonatal utvikling. Økende mørk blå farge indikerer tidsberegningen for bestemte prophase sub scenen blir mer rikelig. Dette tallet ble tilpasset fra referanse2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: eggstokk utvinning fra embryo og neonatal kvinnelige pups. (A, B) Det første kuttet (1) er laget over forelimbs å halshugge embryoet i hode/nakke krysset umiddelbart etter henting fra mors livmor Hornet. Det andre kuttet (2) gjøres langs ventrale midtlinjen av bakre halvdel av fosteret, etterfulgt av snitt langs den fremre delen nedenfor forelimbs (3). Et siste kutt er laget for fjerning bakbeina og hale (4). (A) Frontal Vis skjematisk disseksjon kutt for isolering av eggstokkene fra kvinnelige pups. (B) Side visning skjematisk disseksjon kutt for isolering av eggstokkene med relative posisjoner av indre organer. Områder vises i lys rød inkluderer leveren og innvoller som fjernes under disseksjon. Dorsal veggen og tilknyttede organer vises i lys blå. Denne regionen omfatter eggstokkene, som er knyttet til dårligere polakkene av nyrer øverst til livmor horn. (C) Frontal skjematisk visning av dorsal veggen av embryoet etter fjerning av leveren og tarmen. (D) skjematisk fremstilling av morfologiske forskjellene mellom mannlige og kvinnelige gonader på ca 15-18 dpc. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representative prophase chromatin spre forberedelser. (A) Glass skyve skjematisk for prophase chromatin spredt forberedelser. Svart kvadrat skisserer representerer flytende blokkering penn disposisjoner. (B, C) Representant bilder og kvantifisering av crossover formasjon i vill-type pachytene scenen oocytes bruker prophase chromatin spre forberedelse-metodene som er beskrevet i trinn 1. (B) Chromatin-oppslag ble utført med eggstokkene fromC57BL/6J mouse embryoer isolert på 18,5 dpc. Chromatin oppslag var immunolabeled med antistoffer mot SC lateral element protein SYCP3 (rød) og SC sentralt element protein SYCP1 (magenta), MLH1 (grønn, crossover hendelsesmarkør) og DAPI (blå, DNA). Skala bar = 10 µm. (C) Dot tomten av MLH1 foci teller fra 15 pachytene scenen chromatin spre forberedelser. Feilfelt representerer standardavvik. (D, E) sammenligning av optimal (D) og sub-optimale (E) prophase spredt preparater, hhv. Chromatin oppslag var immunolabeled med antistoffer mot SMC6 (rød), MLH1 (grønn), og SYCP3 (blå). Skala bar = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: skjematisk diagram av voksen eggstokk. Dette diagrammet viser anatomi av voksen mus eggstokken, oviduct, ampulla og livmoren. Musen eggstokkene bør fjernes ved forsiktig innsnitt av leddbånd koble eggstokkene til dårligere polakkene av nyrer og bakre veggen av magen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: bilder av munn-opererte glass Pipetter, glass kapillære og hånd-opererte mikrometer-sprøyte brukes for oocyte manipulasjon. (A) glass pipette oocyte manipulatoren består av følgende komponenter i rekkefølge: munnstykket, latex tubing (3,2 mm indre diameter (ID) x 6,4 mm ytre diameter (OD)), 1 mL pipette tips, latex tubing (6,4 mm ID x 11,1 mm OD) og glass Pasteur pipette. Slutten av glasset Pasteur pipette er oppvarmet over varme og til slutt trakk opprette en tynn slutt (figur 5A1). (B) glass kapillær oocyte manipulatoren består av følgende komponenter i rekkefølge: munnstykket, 0,45 µm filter (valgfritt), latex tubing (3,2 mm ID x 6,4 mm OD), 1 mL pipette tips, latex tubing (6,4 mm ID x 11,1 mm OD) og 70 µl glass kapillær. Kapillær BILLEDRØR er oppvarmet over en flamme i sentrum og trakk i motsatt retninger for å lage to kapillærene med fine tippet ender (figur 5B1). (C) hånd-opererte mikrometer-sprøyten består av følgende komponenter i rekkefølge: Mitutoyo 150-208 mikrometer hodet (midt-størrelse, 0-1 "rekkevidde, 0,001" eksamen), 5 mL sprøyte, latex tubing (3,2 mm ID x 6,4 mm OD), 1 mL pipette tips, latex tubing (6,4 mm ID x 11,1 mm OD), 1 mL pipette tips og en 83 x 0,5 mm2 gel lasting tips. Mitutoyo 150-208 mikrometer hodet er ordentlig satt i 5 mL sprøyte (figur 5C1). For å sikre gel lasting spissen er festet ordentlig, koble 1 mL pipette er tipset skåret (figur 5C2). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Representative metaphase jeg og II oocyte chromatin spre forberedelser. (A) skyve skjematisk for metaphase jeg og II oocyte chromatin spredning forberedelser. Oocytes (sirkler) utgitt via munnen-opererte glass pipette eller kapillær i en rett linje (etter pilen). Svart rektangel disposisjon representerer flytende blokkering penn disposisjon. (B, C) Optimale metaphase jeg chromatin spre forberedelse. Metaphase jeg kromosomene var farget med DAPI (blå, DNA) og immunolabeled for CEN (grønn, kinetochore/centromere markør). Skalere barer = 10 µm. (B) antistoffer mot Histone H4 (di metyl K20, tri-metyl K20) ble brukt til å merke pericentromeric heterochromatin (PCH). (C) antistoffer mot Topoisomerase IIα (TOPOII) ble brukt til å merke PCH og kromosom aksene. (D) optimale metaphase II chromatin spre forberedelse. Metaphase II kromosomene var farget med DAPI (blå, DNA) og immunolabeled for CEN (grønn) og Histone H4 (di-metyl K20, tri-metyl K20) for å merke PCH. Skala bar: 10µm. (E, F) dårlig metaphase jeg chromatin spre forberedelser. Kromosomene var farget med DAPI (blå, DNA), og immunolabeled for CEN (grønn) og komponenten meiotic cohesin, REC8. Skalere barer = 10 µm (E) en oocyte som ikke sprekker ved løslatelse på PFA-belagt lysbilde. (F) kromosomene som ble spredt for. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Element | Beløp | Siste konsentrasjon |
| 1 x PBS | 50 mL | 1 x |
| BSA | 1,5 g | 3% (w/v) |
| Hest Serum | 5 mL | 10% (v/v) |
| 10% vaskemiddel (se Tabell av materialer) i PBS |
250 ΜL | 0,05% (v/v) |
Tabell 1: Antistoffer fortynning buffer (ADB) oppskrift. Lagre ADB på 4 ° C eller fryse aksjer på 20 ° C hvis gjør større mengder. ADB kan bli forurenset, så sørg for at gode aseptiske teknikker brukes, og vurdere løsningen for forurensning før bruk. Mindre dele ADB kan også hjelpe deg å redusere forurensning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Chromatin spredning forberedelser tillate forskere å studere kronologisk kvinnelige pattedyr meiose og den dynamiske lokaliseringen av proteiner involvert. Embryonale og neonatal chromatin oppslag gir omfattende analyse av arrangementer gjennom meiotic prophase. Metaphase jeg og metaphase II chromatin oppslag kan brukes til å skille enkelt søster chromatids fra sammenkoblet søstre og sammenkoblede homologe kromosomer, samt vurdere ploidy. Sammenligning kan protokollen beskrevet her være fordelaktig forhold til hele oocyte immunolabelling, som ofte gir høye nivåer av bakgrunn signal som reduserer oppløsningen for chromatin-bundet proteiner. Videre representerer chromatin spredning teknikker et attraktivt alternativ til live-celle bildebehandling, som krever en stor investering av tid og spesialisert utstyr.
Embryonale og neonatal eggstokkene kan være vanskelig å finne og ekstra. Vi anbefaler nøye utdrager alle andre organer og materiale i tillegg nyrene i en egen tallerken med PBS før etter eggstokkene, og bruker en fersk rett av PBS for hver embryoet/valp (figur 2B). Hvis embryoet/pup er mannlig, være testikkel gjenkjennelig tubule dannelsen samt plasseringen av gonader (figur 2D). Som mannlig embryo utvikle, vil testiklene stige mot penis, bli større og ovale.
Oocyte chromatin spre teknikken krever beherskelse av oocyte samlingen og manipulasjonen munn-opererte glass pipette eller kapillær. Vi anbefaler praktisere kontrollere munnen pipette før du utfører denne protokollen. Trekke av passende størrelse glass pipette/kapillær for samling og denuding oocytes vil øke sjansene for suksess og effektivitet ved å minimere tid oocytes er utenfor inkubator også som det Tyrode løsning. Riktig tidspunkt for ZP fjerning er svært viktig for suksessen til denne metoden. Hvis oocytes er ruges i Tyrodes løsning for en tilstrekkelig mengde tid, fjernes ZP ikke helt. Dette hindrer at oocytes sprengning effektivt på lysbildet, som kan ses i figur 6E. Men hvis oocytes er ruges i Tyrodes løsning for lenge, vil oocyte kvalitet og nedstrøms immunofluorescence flekker bli alvorlig svekket. Vi anbefaler å se oocytes under et mikroskop for å fastslå nøyaktig tid ZP oppløses i Tyrodes løsning. Legge til bare 5-10 oocytes om gangen til Tyrodes løsning vil redusere overdreven eksponering. Hvis oocytes slippes for høyt over PFA-belagt lysbildet, kan kromosomene spres for langt fra hverandre (figur 6F). Optimale resultater er funnet når oocytes utgis 1 cm over lysbildet. Andre faktorer som kan hindre resultater er langvarig eksponering for redusert CO2 -nivåer i luften i oocyte manipulasjon trinnene. Dette fører pH svingninger i media som er skadelig for oocyte kvalitet, og er tilsynelatende av progressiv fargeendring av media fra orange-rød til rosa. Den bufring kapasiteten også reduseres over tid; Derfor anbefaler vi ikke bruke medier som er lagret (4 ° C) lenger enn en uke. M2 medium, som ikke krever CO2 skal bufres, brukes vanligvis som et alternativ.
En begrensning chromatin spre preparater er mangelen på visualisering av chromatin i cellen opprinnelige kontekst. Mobilnettet materiale utenom kjernen kan visualiseres og spindel formasjon kan ikke vurderes. Andre metoder kan derfor brukes til å vurdere oogenesis i tillegg til chromatin sprer seg, som hele oocyte immunolabelling etter monastrol behandling, som skjuler bipolare spindelen i en mono-polar spindel22. Dette gjør søster chromatids å bli vurdert innenfor rammen av cellen. Samlet kan chromatin spre metodene beskrevet her lett brukes for å vurdere chromatin morfologi og kromosom ploidy gjennom oogenesis i romanen transgene og mutant musen modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIGMS (R01GM11755) til P.W.J og en trening grant fellowship fra National Cancer Institute (NIH) (CA009110) G.H. og J.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Quality Biological | 119-069-161 | |
| 60 mm x 15 mm petri dishes | Denville | T1106 | |
| 35mm x 12mm petri dishes | Denville | T1103 | |
| Fine forceps | VWR | 300-050 | |
| Micro dissection scissors | Ted Pella | 1340 | |
| Dissecting scissors, sharp tip, 41/2" | VWR | 82027-578 | |
| Watch glass square 1 5/8 | Carolina Biological Supply Company | 742300 | Autoclave before each use |
| Sucrose | Sigma | S8501 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Sigma | S1804 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 646563 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| 50x Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in) | Becton, Dickinson (BD) | 309623 | |
| Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick) | Thermo | 3063-002 | |
| Super PAP pen, large (liquid blocker) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| 16% Paraformaldehyde aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Detergent in manuscript |
| Immuno stain moisture chamber | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Coplin jars | Fisher | 08-815 | |
| Photo-flo 200 | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 74257 | Wetting agent in manuscript |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | G4877 | Store aliquots at -20C |
| Human chorionic gonadotropin (HCG) | Sigma | C0434 | Store aliquots at -20C |
| PYREX Spot Plates with nine concave cavities | Fisher | 13-748B | Autoclave before each use |
| Glass capillary | Fisher | 22260943 | For making oocyte collection needles |
| Brand Parafilm M | Sigma | BR701501 | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5B | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5D | For making oocyte collection needles |
| Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing | Sigma | A5177-5EA | For making oocyte collection needles |
| Mitutoyo micrometer head | Mituoyo | 150-208 | For making oocyte collection needles |
| Syringe 5 mL | BD Biosciences | 309646 | For making oocyte collection needles |
| Syringe filter 0.45 μm filter | Corning | 431220 | For making oocyte collection needles |
| Glass Pasteur Pipette 5 3/4" | Fisher | 13-678-6A | For making oocyte collection needles |
| 83 x 0.5 mm pipette tip | Denville | P3080 | For making oocyte collection needles |
| α-MEM | Invitrogen | 11415049 | |
| Waymouth's media | Life Technologies | 11220035 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | A3160602 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3311 | For oocyte culture media |
| 500ml filter units 0.22um | Denville | F5227 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Tyrode’s solution | Sigma | T1788 | Store aliquots at -20C |
| Horse serum | Sigma | H-1270 | For ADB/wash buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A1470 | For ADB/wash buffer |
| VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope cover slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear nail polish | Amazon | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Mouse anti-MLH1 | Life Technologies | MA5-15431 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti-SYCP1 | Life Technologies | PA1-16763 | Dilution factor- 1:1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | Dilution factor- 1:50 |
| Human anti-centromere protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti- TOPOII | Abcam | ab109524 | Dilution factor- 1:100 |
| Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20) | Abcam | ab78517 | Dilution factor- 1:500 |
| Rabbit anti-Rec8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | Dilution factor- 1:10,000 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11057 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-21202 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-31573 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11004 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo-Fisher Scientific | A-11013 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11011 | Dilution factor- 1:500 |
References
- Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
- Keeney, S. Spo11 and the Formation of DNA Double-Strand Breaks in Meiosis. Genome Dyn Stab. 2, 81-123 (2008).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), (2015).
- Vries, F. A., et al. Mouse Sycp1 functions in synaptonemal complex assembly, meiotic recombination, and XY body formation. Genes Dev. 19 (11), 1376-1389 (2005).
- Baker, S. M., et al. Involvement of mouse Mlh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13 (3), 336-342 (1996).
- Lipkin, S. M., et al. Meiotic arrest and aneuploidy in MLH3-deficient mice. Nat Genet. 31 (4), 385-390 (2002).
- Kolas, N. K., et al. Localization of MMR proteins on meiotic chromosomes in mice indicates distinct functions during prophase I. J Cell Biol. 171 (3), 447-458 (2005).
- Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS Journal. 282 (13), 2426-2443 (2015).
- Lee, J. Roles of Cohesin and Condensin in Chromosome Dynamics During Mammalian Meiosis. J. Reprod Dev. 59 (5), 431-436 (2013).
- Verver, D. E., Hwang, G. H., Jordan, P. W., Hamer, G. Resolving complex chromosome structures during meiosis: versatile deployment of Smc5/6. Chromosoma. 125 (1), 15-27 (2016).
- Hopkins, J., et al. Meiosis-specific cohesin component, Stag3 is essential for maintaining centromere chromatid cohesion, and required for DNA repair and synapsis between homologous chromosomes. PLoS Genet. 10 (7), e1004413 (2014).
- Hwang, G., et al. SMC5/6 is required for the formation of segregation-competent bivalent chromosomes during meiosis I in mouse oocytes. Development. 144 (9), 1648-1660 (2017).
- Kota, S. K., Feil, R. Epigenetic transitions in germ cell development and meiosis. Dev Cell. 19 (5), 675-686 (2010).
- Taketo, T. Microspread ovarian cell preparations for the analysis of meiotic prophase progression in oocytes with improved recovery by cytospin centrifugation. Methods Mol Biol. 825 (1), 173-181 (2012).
- Sun, X., Cohen, P. E. Studying recombination in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 1-18 (2013).
- Kim, J. H., Ishiguro, K., Kudo, N., Watanabe, Y. Studying meiosis-specific cohesins in mouse embryonic oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 47-57 (2013).
- Susiarjo, M., Rubio, C., Hunt, P. Analyzing mammalian female meiosis. Methods Mol Biol. 558, 339-354 (2009).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Hum Mol Genet. 16, R203-R208 (2007).
- Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs In vivo and In vitro: I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
- Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 203-212 (2013).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
