Summary
Oogenes hos däggdjur är känt för att vara felbenägna, särskilt på grund av kromosom missegregation. Detta manuskript beskriver kromatin sprida beredningsmetoder för mus profas, metafas I och II-iscensatt oocyter. Dessa grundläggande tekniker möjliggör studier av kromatin-bundna proteiner och kromosom morfologi i hela däggdjur oogenes.
Abstract
Kromatin spridning tekniker har använts att bedöma dynamisk localizationen av olika proteiner under könscellsbildning, särskilt för spermatogenesen. Dessa tekniker möjliggör visualisering av protein och DNA lokalisering mönster under meiotiska evenemang såsom homologa kromosom ihopkoppling, mås och DNA reparation. Medan några protokoll har beskrivits i litteraturen, är allmänna kromatin spridning tekniker använder däggdjur profas oocyter begränsad och svårt på grund av tidpunkten för meios inledande i fostrets äggstockarna. I jämförelse, kan profas spermatocyter samlas från juvenil hanmöss med högre avkastning utan behovet av lokalt. Det är dock svårt att få en ren synkroniserade population av celler i specifika stadier på grund av heterogenitet meiotiska och efter meiotiska bakteriecellen populationer i juvenil och adult testiklarna. För senare stadier av meios är det fördelaktigt att bedöma oocyter som genomgår meios jag (MI) eller meios II (MII), eftersom grupper av mogna äggceller kan samlas från vuxna kvinnliga möss och stimuleras för att återuppta meios i kultur. Här metoder för meiotiska kromatin sprida förberedelser använda oocyter från fostrets, dissekeras neonatal och vuxen äggstockarna beskrivs med tillhörande videodemonstrationer. Kromosom missegregation händelser i däggdjur oocyter är vanliga, särskilt under MI. Dessa tekniker kan användas för att bedöma och karakterisera effekterna av olika mutationer eller miljöexponering under olika stadier av oogenes. Eftersom det finns tydliga skillnader mellan oogenes och spermatogenes, är de tekniker som beskrivs inom ovärderlig för att öka vår förståelse av däggdjur oogenes och könsdimorfisk funktioner i kromosom och protein dynamics under meios .
Introduction
Under spermatogenes fylls stor semi-synkron vågor av meiotiska könsceller snabbt och kontinuerligt på i testiklarna vid uppkomsten av puberteten och under hela vuxenlivet1. I motsats till män initieras meios hos kvinnor enbart under fosterutvecklingen. Efter födseln, oocyter förbli greps i en långvarig dictyate skede av profas I med en intakt germinal vesikler (GV; kärn kuvert) fram till puberteten. På uppkomsten av puberteten, en delmängd av oocyter väljs cykliskt genomgå tillväxt och mognad, märkning inledandet av meiotiska återupptagande. Meiotiska återupptagande i fullvuxen oocyter manifesteras av försvinnandet av GV i en process som kallas germinal vesikler uppdelning (GVBD). Äggcellen genomgår sedan kromosom kondens och segregation, följt av polar kroppen extrudering. Oocyter bli arresterad vid progression till MII och stimuleras att slutföra andra och sista meiotiska divisionen endast efter befruktningen.
Kvinnlig fertilitet är starkt beroende av framgången av meiotiska profas jag progression. Nyckeln till detta är bildandet av en fysisk koppling mellan homologa kromosomer kallas de chiasmata, som medieras av reparation av inducerad DNA double strand breaks (DSBs) via crossover rekombination2. Denna process sker inom ramen för en dynamisk proteinrika byggnadsställning kallas komplexet synaptonemal (SC) som bildar mellan homologa kromosomer för att underlätta deras synapsis3. SC är en dragkedja-liknande tredelad struktur som består av två parallella laterala delar ansluten genom centrala regionen proteiner som håller homologs tillsammans under pågående DNA-reparation. Innan synapsis bildar prekursorer av de laterala element, kallas axiell element, mellan syster kromatider. Synaptonemal komplexa proteiner såsom SYCP2 och SYCP3 bildar axiella element som colocalize till syster-kromatida sammanhållning axlarna under tidig profas. Dessa senare utgöra bindande platser för proteinet tvärgående glödtråd, SYCP1, vilket underlättar central del montering och mås mellan justerad homologs4. I mus oocyter anges komplett synapsis av närvaron av 20 helt överlappande SYCP3 och SYCP1 sträckor, vilket kan visualiseras med hjälp av kromatin sprida preparat. Synapsis slutförs vid inträdet i pachytene undre fokalplanet, whereby mogen delningsfilter som är avsedda att bilda chiasmata mellan homologs är inredda med mutL homolog (MLH1/3) dimerer att främja deras korrekt bearbetning5,6 , 7. det strukturella underhållet av kromosomer (SMC) komplex, inklusive cohesin, condensin och SMC5/6-komplexet, är viktiga för regleringen av kromosom dynamics och struktur i hela meios8,9, 10,11,12. Sammantaget säkerställa dessa händelser korrekt bi-riktning av homologa kromosomer till motsatta spindeln polacker efter demontering av SC.
Meiotiska cellcykeln är en kraftfull modell för att undersöka olika proteiner i genomet underhåll tack vare programmerade induktion och efterföljande reparation av DNA DSBs roller. Dessutom är däggdjur meios också en relevant modell för studier av epigenetiska förändringar och imprinting13. Det är dock tekniskt svårt att bedöma dessa händelser under kvinnliga meios, som äger rum i fetal och neonatal äggstockarna hos däggdjur (figur 1). Profas jag kan delas in i 5 substages: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema och dictyate. Häri, beskriver vi hur man isolera och skilja mellan fetal och neonatal äggstockar och testiklar (figur 2). Anpassad från tidigare beskrivna metoder, Detta manuskript beskriver också ett protokoll (steg 1) med video demonstration för beredning av kvinnliga meiotiska profas jag kromatin sprider14,15,16,17 . När den kombineras med immunolabelling, som beskrivs i steg 6-7, detta protokoll möjliggör detaljerad Mikroskopisk analys av profas jag händelser i oocyter.
Oogenes är felbenägen och kromosom missegregation händelser under första meiotiska divisionen utgör den vanligaste källan till genetisk sjukdom i avkomma18,19. I detta manuskript (protokoll steg 2) beskriver vi ett protokoll där mogna GV-iscensatt oocyter som utvinns ur primade äggstockarna av vuxen honmöss. Stödjande villkor genomgå fullvuxen oocyter luteiniserande hormon-oberoende återupptagandet av meios efter isolering och kulturen20. Efter meiotiska återupptagande, oocyter framsteg genom meios I och sedan gripa vid metafas II. Oocyter förblir greps vid metafas II, såvida inte befruktade. I steg 2 – 5, anpassar vi tidigare rapporterade protokoll med video demonstration att beskriva hur man samlar in, kultur och förbereda MI och MII oocyter för kromatin sprida preparat21. Detta kromatin sprida teknik möjliggör tydlig immunolabelling av proteiner associerade med kromosomer. Dessutom detta protokoll kan också användas för att skilja mellan bivalent och univalent kromosomer och ytterligare kan lösa ensamstående syster kromatiderna att underlätta bedömning av äggcell ploiditeten. Därför, förutom avslöjande lokalisering mönster av meiotiska proteiner, detta protokoll kan också fungera som ett ovärderligt verktyg för att belysa potentiella orsaker till kromosom missegregation under MI och MII.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av Johns Hopkins University. Experimenten utfördes på vildtyp C57BL/6J möss.
1. avverkning Fetal- eller Neonatal äggstockarna och beredning av profas kromatin sprider
- För att extrahera embryon på 14,5 – 19,5 dagar post-intravenösa (dpc) offra de dräktiga honorna via cervikal dislokation eller CO2 kvävning enligt IACUC riktlinjer.
Obs: För postnatal dag 1 – 5 äggstockarna hoppa till steg 1.3. Figur 1 sammanfattar meiotiska profas stadierna berikad på olika embryonala och postnatal ålder. - Öppna den abdominopelvic kaviteten med steril sax, att göra en V-formad öppning. Dissekera sig moderns livmoder horn, separata embryon från moderkakan, och överföra embryon till 35 mm petriskålar innehållande 3 mL före värmde 1 x fosfat buffert saltlösning (PBS) vid 37 ° C.
Obs: En fliptop inkubator inställd vid 37 ° C kan användas för att hålla temperatur. Dessutom kan en temperaturreglerad glas arrangerar också användas att upprätthålla temperaturen under äggstock manipulation. - Med 3,5 tums kirurgisk sax, offra embryon eller valpar via halshuggning enligt IACUC riktlinjer. Placera avhuggna embryon eller ungar i förväg värmde PBS före ytterligare dissektion.
- Dissekera ett embryo eller en valp i taget i en separat 35 mm petriskål innehållande 3 mL före värmde PBS vid 37 ° C. Fortsätt genom att skära längs ventrala mittlinjen av den bakre halvan av embryot, längs den främre hälften under frambenen och direkt ovanför-bakbenen och svansen som beskrivs i figur 2A–B.
- Öppna buken med 3,5 tums kirurgisk sax. Med spetsig pincett förskjuter eller ta bort levern och slingor av tarm, utsätta äggstockarna i en ny 35 mm petriskål innehållande 3 mL före värmde PBS vid 37 ° C (se guide i figur 2B). Äggstockarna är belägna omedelbart under och bakom njurarna mot den bakre väggen i bukhålan (figur 2B–C). En guide för att skilja mellan manliga och kvinnliga könskörtlarna ges i figur 2D.
Obs: För optimala förhållanden, snabbt dissekera ut äggstockarna efter gravid kvinna offras. - Ta bort båda äggstockarna från varje kvinnlig fetus använder ett par spetsig pincett under en dissektion omfattning och plats i en klocka glasögon eller separata brunnar i en multi väl plåt innehållande 0,5-1,0 mL av pre värmde PBS och underhålla vid 37 ° C.
- Placera varje par av äggstockarna i 0,5 mL hypo-extraktion buffert (17 mM trinatrium citrat dihydrat, 50 mM sackaros, 5 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 30 mM Tris-HCl, proteashämmare, pH 8,2) i en ren urglas eller en liten väl 9-well platta, se till att fördjupa äggstockarna comp helt. Inkubera under minst 15 minuter, men inte mer än 30 min.
Obs: Gör hypo-extraktion buffert färska och Använd inom 2 h av DTT tillägg. - Under ruvningen, med en hydrofoba barriär PAP pen, rita två 22 x 22 mm2 rutor på ett rent glas 25 x 75 mm2, 1 mm tjock objektglas som visas i figur 3A.
Obs: Bilder kan vara beredda i förväg. - Pipettera 45 – 50 µL av 100 mM sackaros på ett rent objektglas och överföra ett par äggstockar till droppa.
- Använda skarpa ändarna av två 27 G nålar, retas äggstockarna isär för att släppa celler i sackaroslösning. Med pincett, ta bort stora bitar av äggstocken och noggrant Pipettera sackaroslösning för att skingra celler.
- Plats 40 µL fixativ lösning (1% PARAFORMALDEHYD (PFA), 0,2% tvättmedel (se Tabell för material), pH 9,2) i varje ruta av förberedda bilden. Med en 200 µl pipettspetsen, jämnt fixativ lösningen över bild ytan.
- Överför med pipett 20 µL av sackaros mixen på varje torget av bilden som innehåller fixativ.
Obs: Detta motsvarar använder ett par av äggstockarna per bild. - Inkubera bilder i en sluten fuktig kammare över natten i rumstemperatur.
Obs: Övernattning inkubationstiden kan variera runt (12-15 timmar) vid rumstemperatur. - Öppna kammare locket och låta bilderna ska lufttorka helt.
- Tvätta diabilder i en Coplin burk innehållande 50 mL 0,4% vätmedel-PBS lösning (se Tabell för material) i 2 min, lufttorka och vidare till immunolabelling protokoll (steg 6).
Obs: Det kan vara möjligt att lagra bilderna vid-80 ° C för senare användning, men detta varierar beroende på proteinet av intresse. För optimalt resultat omedelbart gå vidare till immunolabelling protokoll (steg 6).
2. metafas I äggcellen samling
- För att maximera antalet antral folliklar som isolerats från varje mus, intraperitonealt injicera könsmogna oskuld honmöss 5 IE av på gravida mare serum gonadotropin (PMSG, även känd som equine koriongonadotropin (EKG)).
Obs: För optimal äggcellen avkastning, möss bör 1 till 3 månader, som antalet oocyter skördas minskar med åldern. För att bereda PMSG, lös flaska 5000IE i 100 mL steril PBS (5 U/0.1 mL) butik i engångsbruk alikvoter av 600 µL vid-20 ° C. - Efter 44 – 48 h, förbereda samling medium, minsta nödvändiga medel alfa (MEMα) medel kompletteras med 5% fetalt bovint serum (FBS) och 3 mg/mL bovint serumalbumin (BSA; MEMΑ/BSA/FBS). Sterilisera media genom ett 0,2 µm porstorlek filter. Häll 2,5 mL av MEMα/BSA/FBS medium i en glasskål per mus och varm till 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
Obs: Andra samling och kultur media som är kommersiellt tillgängliga (M2 och M16) används också ofta.
Försiktighet: Vi rekommenderar att ta bort kultur rätter från 5% CO2 inkubatorn en i taget för tidsbegränsade att minimera luften exponering under manipulation steg. - Offra möss via cervikal dislokation eller CO2 kvävning enligt IACUC riktlinjer.
- Öppna den abdominopelvic kaviteten med steril sax, att göra en stor V-formad öppning. Med pincett, förskjuta tarmarna mot huvudet av musen. Lokalisera varje livmoderns horn; äggstockarna är närvarande proximalt bröstkorgen. Håller i äggledaren med fin pincett och skär det feta superior till äggstocken med dissektion sax (figur 4). Fortsätta att hålla i äggledaren, och med en annan uppsättning fina tången släpper äggstockarna från bursa och plats till samling maträtt som innehåller MEMα/BSA/FBS medium.
Obs: Som i steg 1, det är absolut nödvändigt att bevara äggstockarna vid 37 ° C och hålla på 5% CO2. En fliptop inkubator hugat till 5% CO2 mix kan användas för optimalt underhåll av temperatur och CO2 nivåer. Dessutom bör en temperaturreglerad glas arrangerar också användas att hålla temperatur under äggcellen manipulation. - Med en 1 mL spruta med en 27-gauge nål (eller liknande storlek), släppa cumulus äggcell komplex genom att manuellt punktera stora antral hårsäckarna.
- Medan du observerar genom dissektion Mikroskop, samla GV-iscensatt oocyter använder munnen manövrerade glas pipett eller kapillär eller en handmanövrerad mikrometer-spruta (figur 5). Bara samla oocyter som släpps från antral folliklar. GV oocyter har en diameter på cirka 90 µm. GV oocyter kan vara omgiven av 2-3 lager av granulosa celler, och har en total diameter på omkring 200 µm.
- Kultur oocyter i en ren urglas eller en 9-well platta som innehåller MEMα/BSA/FBS medium för 6 h att nå metafas jag vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
- Fortsätt till steg 4.
3. metafas II (MII) äggcellen samling
- För att maximera oocyter som isolerats från varje mus, intraperitonealt injicera könsmogna oskuld honmöss 5 IE av PMSG. Efter 44 – 48 h, intraperitonealt injicera 5 IE av humant koriongonadotropin (hCG).
Obs: För optimal äggcellen avkastning, möss bör 1 till 3 månader, som antalet oocyter skördas minskar med åldern. För att bereda hCG, lös en flaska 10.000 U i 200 mL PBS (5 U/0.1 mL). Lagra i engångsbruk alikvoter av 600 µL vid-20 ° C. - Efter 12-14 timmar, förbereda MEMα/BSA/FBS samling medium, som beskrivs i steg 2.2, ovan.
- Offra möss via cervikal dislokation eller CO2 kvävning enligt IACUC riktlinjer.
- Öppna den abdominopelvic kaviteten med steril sax, att göra en stor V-formad öppning. Med pincett, förskjuta tarmarna mot huvudet av musen. Lokalisera varje livmoderns horn, äggstockarna är närvarande proximalt bröstkorgen. Håller i äggledaren med fin pincett och skär det feta superior till äggstocken med dissektion sax (figur 4). Sedan ta bort äggstockarna och äggledaren och placera i samlingen maträtt som innehåller MEMα/BSA/FBS medium.
Obs: Som i steg 1 och 2, det är absolut nödvändigt att bevara äggstockarna vid 37 ° C och hålla på 5% CO2. En fliptop inkubator hugat till 5% CO2 mix kan användas för optimalt underhåll av temperatur och CO2 nivåer. Dessutom bör en temperaturreglerad glas arrangerar också användas att hålla temperatur under äggcellen manipulation. - Använda en 1 mL spruta med en 27 G storlek (eller liknande) eller vassa pincetten, Riva ett hål i ampulla av den äggledaren att släppa MII oocyterna.
Obs: Var noga med att inte skada oocyterna i ampulla. Ampulla visas svullna och genomskinlig så att oocyterna är synlig (figur 4). - Skörda MII oocyter från ampulla av äggledaren in i en ny maträtt med samling medium använder munnen manövrerade glas pipett eller kapillär eller en handmanövrerad mikrometer-spruta (figur 5).
- Fortsätt till steg 4.
4. äggcell Denuding och Zona Pellucida borttagning
- Förbereda 300 IE/mL av hyaluronidas i MEMα medium kompletteras med 3 mg/mL BSA att beröva oocyter av omgivande cumulus celler (2,5 mL/mus) i ett urglas, och håll vid 37 ° C, 5% CO2.
Obs: Hyaluronidas effekt minskar kraftigt efter 1 h av preparatet. För MII oocyter krävs hyaluronidas behandling inte. - Exponera äggcell-cumulus cell komplex 300 IE/ml av hyaluronidas i MEMα/BSA för 3 min att beröva oocyter av omgivande cumulus celler.
Försiktighet: Överskrid inte 3 minuters exponering mot hyaluronidas, eftersom det kan skada oocyterna. - Att tvätta oocyterna, överföra oocyter till en fräsch värmde MEMα/BSA medium maträtt. Använder en liten mun manövrerade glas pipett eller kapillär (något större än diametern på den äggcellen, som är cirka 90 µm), pipett komplexen upp och ner för att helt koppla loss cumulus cellerna. Tillåta oocyterna återställa i inkubatorn samtidigt förbereda för nästa steg.
- Varma sura Tyrodes lösning, MEMα/BSA och Waymouth's media till 37 ° C (500 µL/mus). Plats 300 µL i varje brunn liten 9-väl glasplattor.
- För att ta bort zona pellucida (ZP) över 5 – 10 oocyter till Tyrodes lösning. Exponera oocyterna för endast 30-45 s till lösningen.
Obs: För lite exponering för lösningen kommer inte bort ZP helt, vilket förhindrar att oocyterna sprack och kromosomerna från att spridas. För mycket exponering kommer att skada och döda i äggcellen. Titta på den ZP lös under mikroskopet dissektion kan stöd i optimera exponeringstid.
Försiktighet: Med färska Tyrodes lösning är kritisk, eftersom dess funktion avtar med åldern. Använda en färsk väl Tyrodes lösning för varje grupp av oocyter behandlas så att enhetliga rötning av ZP. - Omedelbart efter ZP borttagning, tvätta oocyterna genom att överföra till värmde MEMα/BSA/FBS medium. Upprepa detta tvätta.
Var försiktig när du överför, som oocyterna kommer enkelt hålla ihop och glas pipett eller kapillär följande avlägsnande av ZP. Pre vätning av glas pipett eller kapillär i Waymouth's medium kommer att minimera oocyter som klibbar ihop. - Överför och tillåta oocyterna återställa i 30 minuter i Waymouth's medium vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
- Fortsätt till steg 5.
5. MI och MII äggcellen kromatin sprider
- Använda en PAP-penna, rita en 11 x 44 mm2 rektangel i glas-bilden som visas i figur 6A.
- Päls i bilden med ett tunt lager av fixativ (1% paraformaldehyd, 0,2% Triton-X 100 H2O, pH 9,2) av Pipettera 100 µL av fixativ in i bilden och gunga glida fram och tillbaka. Tryck på bilden för att bli av med överflödigt fixativ.
- Plocka upp mellan 5-10 oocyter med en liten mun pipett nål med som lite media som möjligt och dra nålen i en linje över fixativ-belagd bilden samtidigt deponerar oocyterna från 1 cm ovanför bilden i fixativ lösning. Utför det här steget med dissektion Mikroskop för att säkerställa att oocyterna har deponerats och att de har spruckit.
Obs: Oocyterna bör sprack omedelbart på bilden. Höjden som oocyterna är deponerade påverkar graden av kromatin spridning. Se representativa resultat i figur 6 för ytterligare information. - Odling av objektglas i rumstemperatur i en sluten fuktig kammare över natten att tillåta kromatinet att följa.
- Låt bilderna ska lufttorka helt och skölj diabilder i en Coplin burk innehållande 50 mL 0,4% vätmedel-H2O, pH 8,0.
- Fortsätt till steg 6.
6. Immunolabelling
- Förbereda den antikropp förtunningsbuffert (ADB) beskrivs i tabell 1.
- Förbered två Coplin-burkar innehållande 50 mL (WB) tvättbuffertlösning (10% ADB utspätt i PBS) och en Coplin-burk innehållande 50 mL WB och 0,05% rengöringslösning (t.ex., tillsätt 250 µL 10% tvättmedel i 50 mL WB).
- Tvätta de bilder som var förberedda i avsnitt 1 och 5 i detta protokoll i 10 min i en Coplin-burk innehållande 50 mL WB.
Varning: Låt inte bilderna torka när som helst under immunolabelling. - Tvätta bilderna i 10 min i Coplin burk innehållande 50 mL WB och 0,05% rengöringslösning. Tvätta sedan, bilder i de återstående Coplin-burk innehållande 50 mL WB lösning i 10 min.
- Tryck ut överflödig vätska och täcker bilden med 100 µL av valda primära antikroppar utspätt i ADB. Inkubera vid 4 ° C över natten i en sluten fuktig kammare.
Obs: Inkubation kan förkortas till 2 till 3 timmar vid 37 ° C. Använd mindre volymer av antikropp (t.ex., 50 µL) av täcker bilden med ett täckglas eller parafilm. - Skölj diabilder i en Coplin burk innehållande 50 mL 0,2% vätmedel-PBS lösning, pH 8,0.
- Upprepa steg 6,2 till 6.5.
- Tryck ut överflödig vätska och täcker bilden med 100 µL av valda sekundära antikroppar utspätt i ADB. Odling av objektglas 1 till 2 timmar vid 37 ° C i en sluten fuktig kammare.
- Tvätta objektglas 2 gånger för 10 min i Coplin burkar innehållande 50 mL 0,2% vätmedel-PBS lösning, pH 8,0.
- Tvätta objektglas 2 gånger för 5 min i Coplin burkar innehållande 50 mL 0,2% vätmedel-H2O lösning, pH 8,0.
7. montering diabilder
- För profas kromatin sprider bereddes i steg 2, tillsätt 100 µL av monteringsmedium innehållande 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI, 1.5µg / mL). För MI och MII kromatin sprider beredda i steg 5, tillsätt 50 µL av monteringsmedium innehållande DAPI (1.5µg / mL). Försiktigt torka bort överflödig vätska.
- Placera ett 22 mm x 60 mm täckglas på toppen och försegla med genomskinligt nagellack. Förvara i en bild låda vid 4 ° C eller -20 ° C tills bedömning via fluorescensmikroskopi.
Obs: Tryck lätt på täckglas för att bli av med Överflödigt monteringsmedium innan tätning med nagellack.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har beskrivit två tekniker för att visualisera och bedöma meiotiska kromosomer i oocyter. Den första tekniken är tillgodoses mot bedömningen av profas progression i embryonala och neonatal äggstockarna. Profas kromatin spridning preparat är otroligt värdefulla för att visualisera många dynamiska processer under meios, inklusive kromosom ihopkoppling, mås och desynapsis, homolog rekombination och epigenetiska kromosom remodeling. Här, vi har visat nyttan av denna metod för robust visualisering och kvantitativ analys av crossover formation i oocyter skördas från C57BL/6J embryon (figur 3B och 3 C). För att berika för celler i pachytene undre fokalplanet, hämtades musembryon på 18,5 dpc (figur 1). Två viktiga kännetecken av pachytene undre fokalplanet av profas I är slutförandet av synapsis mellan homologs och bildandet av minst en MLH1 3-positiva crossover per homolog par. Komplett synapsis mellan homologs manifesteras genom närvaron av 20 överlappande SYCP3 och SYCP1 sträckor. Att karakterisera crossover formation i vildtyp oocyter vi immunolabeled profas kromatin sprida förberedelser använda antikroppar att upptäcka SYCP3, SYCP1 och MLH1 och målat DNA använder DAPI. Figur 3B skildrar en representativ bild av ett pachytene skede äggcellen, som framgår av förekomsten av 27 MLH1 foci fördelade längs 20 färdigmonterad SC strukturer. Det genomsnittliga antalet MLH1-positiv delningsfilter upptäcks i vildtyp oocyter var 24 ±3 (figur 3 C, N = 15 oocyter). Figur 3D visar SMC6 berikad på regionen pericentromeric Heterokromatin (PCH) och längs med kromosomen armarna och MLH1 foci fördelade längs SC i pachytene skede. Figur 3E skildrar en pachytene iscensatt äggcell där kromosom spridning preparatet var suboptimal och enskilda kromosomer är oskiljbara, förhindra korrekt bedömning av SYCP3, SMC6 och MLH1. Suboptimal kromosom sprider kan observeras när inkubering av äggstockarna i hypo-extraktion buffert räcker för länge eller inte för länge.
Den andra tekniken som beskrivs kan användas för att bedöma kromatin morfologi i oocyter efter meiotiska återupptagande (figur 6B-D). Protein lokalisering, liksom ploiditeten, kan enkelt bedömas, exponera potentiella orsaker till kromosom segregation fel. Figur 6B skildrar en MI äggcellen visar 20 kromosomer och rensa Centromeren och pericentromeric Heterokromatin färgning. Figur 6 c är en zoomad bild där topoisomeras IIα (TOPOII) kan ses längs med kromosomen armarna och PCH. Figur 6 d skildrar en MII äggcellen där kopplade syster kromatiderna kan särskiljas genom kromosom och centromer morfologi. Vanliga fel sett när du försöker denna teknik inkluderar oocyter som inte spricker när de släpps in i PFA-belagd bilden, liksom kromosomer sprider sig alltför långt ifrån varandra (figur 6E–F). Om ZP inte tas bort helt, förblir kromosomerna associerade till spindeln, som visas i figur 6E. Om oocyterna släpps för högt från PFA-belagd bilden, kan kromosomerna spridas alltför långt isär som avbildas i figur 6F.
Figur 1: meiotiska profas tidslinje under kvinnliga embryonala och neonatala utvecklingen. Blå konturer indikera befolkningar av specifika profas sub scenen könsceller (leptotene, zygotene, pachytene och diplotene/dictyate stadier) observerats under embryonal-och neonatal. Ökande mörkblå färg indikerar tidpunkten då specifika profas sub scenen blir rikligare. Denna siffra var anpassad från referens2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: äggstock utvinning från embryon och neonatal kvinnliga pups. (A, B) Det första snittet (1) görs över frambenen att halshugga embryot i huvud och hals korsningen omedelbart efter hämtning från moderns livmoder hornet. Andra snittet (2) görs längs ventrala mittlinjen av den bakre halvan av embryot, följt av snitt längs den främre hälften under frambenen (3). En slutavverkning görs för borttagning av bakbenen och svansen (4). (A) Frontal se Schematisk bild av dissektion nedskärningar för isolering av äggstockar från kvinnliga pups. (B) sida se Schematisk bild av dissektion nedskärningar för isolering av äggstockarna med relativa positioner av inre organ. Regionerna visas i ljus röd inkluderar levern och tarmarna, som tas bort under dissektion. Den dorsala väggen och associerade organ visas i ljus blå. Denna region innehåller äggstockarna, som är kopplade till sämre polerna av njurarna överst i livmoderns horn. (C) Frontal Schematisk vy av dorsala väggen av embryot efter avlägsnande av lever och tarmar. (D) Schematisk bild av morfologiska skillnader mellan manliga och kvinnliga könskörtlarna på cirka 15 – 18 dpc. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa profas kromatin sprida preparat. (A) glas Skjut Schematisk för profas kromatin fördelat preparat. Svarta fyrkantiga konturer representerar flytande blockerare penna konturer. (B, C) Representativa bilder och kvantifiering av crossover formation i vildtyp pachytene skede oocyter använder profas kromatin sprida beredningsmetoder som beskrivs i steg 1. (B) kromatin sprider utfördes med äggstockar fromC57BL/6J musembryon isolerade på 18,5 dpc. Kromatin sprider var immunolabeled med antikroppar mot SC laterala element proteinet SYCP3 (röd) och SC centralbeståndsdel proteinet SYCP1 (magenta), MLH1 (grön, crossover händelse markör) och DAPI (blå, DNA). Skalstapeln = 10 µm. (C) Dot plot av MLH1 foci räknas som erhållits från 15 pachytene skede kromatin sprida preparat. Felstaplar representera standardavvikelse. (D, E) jämförelse av optimal (D) och suboptimala (E) profas sprida preparat, respektive. Kromatin sprider var immunolabeled med antikroppar mot SMC6 (röd), MLH1 (grön), och SYCP3 (blå). Skalstapeln = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: Schematisk bild av vuxen äggstock. Det här diagrammet illustrerar anatomi vuxen mus äggstock, äggledaren, ampulla och livmodern. Mus äggstockarna ska tas bort genom försiktig anskärning av ligament ansluta äggstockarna till underlägsna polackerna i njurarna, och den bakre väggen i buken. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: bilder av munnen manövrerade glas pipett, glas kapillär och handdrivna mikrometer-sprutan används för äggcell manipulation. (A) glas pipett äggcellen manipulatorn består av följande komponenter i sekvens: munstycke, latex slangar (3,2 mm innerdiameter (ID) x 6,4 mm ytterdiameter (OD)), 1 mL pipettspetsen, latex slangar (6,4 mm ID x 11,1 mm OD) och glas Pasteur-pipett. I slutet av glaset Pasteur-pipett har upphettats över en låga och slutet drog till skapa en spetsig ände (figur 5A1). (B) glas kapillär äggcellen manipulatorn består av följande komponenter i sekvens: munstycke, 0,45 µm filter (valfritt), latex slangar (3,2 mm ID x 6,4 mm OD), 1 mL pipettspetsen, latex slangar (6,4 mm ID x 11,1 mm OD) och 70 µl glas kapillär. De kapillära glasrör är uppvärmda över en eld i mitten och drog i motsatta riktningar att skapa två kapillärer med fina lutad ändar (figur 5B1). (C) den handdrivna mikrometer-sprutan består av följande komponenter i sekvens: Mitutoyo 150-208 mikrometer huvud (mitten storlek, 0-1 ”sortiment, 0,001” avläggande av examen), 5 mL spruta, latex slangar (3,2 mm ID x 6,4 mm OD), 1 mL pipettspetsen, latex slangar (6,4 mm ID x 11,1 mm OD), 1 mL pipettspetsen och en 83 x 0,5 mm2 gel lastning spets. Mitutoyo 150-208 mikrometer huvudet är ordentligt isatt i 5 mL sprutan (figur 5 c1). För att säkerställa gel lastning spetsen fästs ordentligt, den anslutande 1 mL pipetten klipps tip (figur 5 c2). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: representativa metafas I och II äggcellen kromatin sprida preparat. (A) Skjut Principschema för metafas I och II äggcellen kromatin spridning preparat. Oocyter (cirklar) befriaren via munnen manövrerade glas pipetten eller kapillär i en rak linje (efter pilen). Svart rektangel disposition representerar flytande blockerare penna kontur. (B, C) Optimal metafas jag kromatin sprida förberedelse. Metafas jag kromosomer var fläckade DAPI (blå, DNA), och immunolabeled för CEN (grön, Kinetochor/centromer markör). Skala barer = 10 µm. (B) antikroppar mot Histon H4 (di-metyl K20, tri methyl K20) användes för att märka pericentromeric Heterokromatin (PCH). (C) antikroppar mot topoisomeras IIα (TOPOII) användes för att märka PCH och kromosom axlarna. (D) Optimal metafas II kromatin sprida förberedelse. Metafas II kromosomer var fläckade DAPI (blå, DNA), och immunolabeled för CEN (grön) och Histon H4 (di-metyl K20, tri-metyl K20) för att märka PCH. Skalstapeln: 10µm. (E, F) dålig metafas jag kromatin sprida preparat. Kromosomer var fläckade av DAPI (blå, DNA), och immunolabeled för CEN (grön) och komponenten meiotiska cohesin, REC8. Skala barer = 10 µm (E) en äggcell som inte spricker vid övergång till PFA-belagd-bilden. (F) kromosomer som spreds alltför långt ifrån varandra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Objekt | Belopp | Slutlig koncentration |
| 1 x PBS | 50 mL | 1 x |
| BSA | 1,5 g | 3% (w/v) |
| Häst Serum | 5 mL | 10% (v/v) |
| 10% tvättmedel (se Tabell över material) i PBS |
250 ΜL | 0,05% (v/v) |
Tabell 1: Antikropp utspädning buffert (ADB) recept. Lagra ADB vid 4 ° C eller frysa bestånd vid-20 ° C om att göra större kvantiteter. ADB kan kontamineras, så se till att bra aseptisk teknik används och bedöma lösningen för kontaminering före varje användning. Mindre portioner av ADB kan också vara beredd att minimera kontaminering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kromatin spridning preparat kan forskare studera kronologiskt kvinnliga däggdjur meios och dynamiska localizationen av proteinerna som är inblandade. De embryonala och neonatal kromatin sprider möjliggör nära analys av händelser under hela meiotiska profas. Metafas jag och metafas II kromatin sprider kan användas för att skilja ensamstående syster kromatiderna från Parade systrar och Parade homologa kromosomer, samt bedöma ploiditeten. Som jämförelse kan av protokollet som beskrivs här vara fördelaktiga jämfört med hela äggcell immunolabelling, som ofta ger höga nivåer av bakgrund signal som minskar upplösningen av kromatin-bundna proteiner. Dessutom utgör kromatin spridning tekniker ett attraktivt alternativ till live-cell imaging, som kräver en stor investering av tid och specialutrustning.
Embryonala och neonatal äggstockarna kan vara svårt att hitta och extrahera. Vi rekommenderar att försiktigt extrahera alla andra organ och material förutom njurarna i en separat skål som innehåller PBS innan söker äggstockarna, och använder en ny maträtt PBS för varje embryo/pup (figur 2B). Om den embryo/pup är manlig, blir testiklarna urskiljbara genom tubuli bildandet samt placeringen av gonader (figur 2D). Som manliga embryon utvecklas, kommer testiklarna ner mot penis, blir större och ovala.
Äggcellen kromatin sprida teknik kräver behärskning av äggcell insamling och manipulation med munnen manövrerade glas pipett eller kapillär. Vi rekommenderar att öva styra munnen pipetten innan du utför detta protokoll. Dra rätt storlek glas pipett/kapillären för samling och denuding oocyter ökar chanserna för framgång och effektivitet genom att minimera tiden oocyter är utanför inkubatorn såväl som i den Tyrodes lösning. Rätt timing för ZP borttagning är oerhört viktigt för att lyckas med denna metod. Om oocyterna inkuberas i Tyrodes lösning för en otillräcklig mängd tid, försvinner i ZP inte helt. Detta förhindrar att oocyterna spricker effektivt i bilden, som kan ses i figur 6E. Dock om oocyterna inkuberas i Tyrodes lösning för länge, kommer äggcell kvalitet och nedströms immunofluorescens färgning att allvarligt äventyras. Vi rekommenderar att titta oocyterna under ett mikroskop för att avgöra den exakta tidpunkten ZP upplöser i Tyrodes lösning. Du lägger till bara 5 – 10 oocyter i taget Tyrodes lösningen kommer att minimera överdriven exponering. Om oocyterna släpps för högt ovanför bilden PFA-belagd, kan kromosomerna spridas alltför långt ifrån varandra (figur 6F). Optimalt resultat hittas när oocyter släpps 1 cm ovanför bilden. Andra faktorer som kan hindra resultat inkluderar långvarig exponering för minskade CO2 nivåer i luften under äggcellen manipulation steg. Detta orsakar pH svängningar i media som är skadliga för äggcell kvalitet, och framgår av progressiva färgförändring av media orange-röd till rosa. Buffertkapacitet media också minskar över tid. Vi rekommenderar därför inte med media som har varit lagrade (4 ° C) längre än 1 vecka. M2 medium, som inte kräver CO2 buffras, används ofta som ett alternativ.
En begränsning till kromatin sprida preparat är bristen på visualisering av kromatinet inom infödda ramen för cellen. Cellulära material utanför kärnan inte kan visualiseras och spindeln bildandet kan inte bedömas. Därför kan andra metoder användas för att bedöma oogenes förutom kromatin sprider, såsom hela äggcell immunolabelling efter monastrol behandling, som kollapsar bipolära spindeln i en mono-polar spindeln22. Detta tillåter syster kromatiderna bedömas inom ramen för cellen. Kollektivt, kan kromatin sprida metoderna som beskrivs här lätt tillämpas för att bedöma kromatin morfologi och kromosom ploiditeten hela oogenes i romanen genmanipulerad och muterade musmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete var stöds av NIGMS (R01GM11755) till P.W.J och ett utbildning bevilja stipendium från National Cancer Institute (NIH) (CA009110) att G.H. och J.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Quality Biological | 119-069-161 | |
| 60 mm x 15 mm petri dishes | Denville | T1106 | |
| 35mm x 12mm petri dishes | Denville | T1103 | |
| Fine forceps | VWR | 300-050 | |
| Micro dissection scissors | Ted Pella | 1340 | |
| Dissecting scissors, sharp tip, 41/2" | VWR | 82027-578 | |
| Watch glass square 1 5/8 | Carolina Biological Supply Company | 742300 | Autoclave before each use |
| Sucrose | Sigma | S8501 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Sigma | S1804 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 646563 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| 50x Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in) | Becton, Dickinson (BD) | 309623 | |
| Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick) | Thermo | 3063-002 | |
| Super PAP pen, large (liquid blocker) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| 16% Paraformaldehyde aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Detergent in manuscript |
| Immuno stain moisture chamber | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Coplin jars | Fisher | 08-815 | |
| Photo-flo 200 | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 74257 | Wetting agent in manuscript |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | G4877 | Store aliquots at -20C |
| Human chorionic gonadotropin (HCG) | Sigma | C0434 | Store aliquots at -20C |
| PYREX Spot Plates with nine concave cavities | Fisher | 13-748B | Autoclave before each use |
| Glass capillary | Fisher | 22260943 | For making oocyte collection needles |
| Brand Parafilm M | Sigma | BR701501 | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5B | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5D | For making oocyte collection needles |
| Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing | Sigma | A5177-5EA | For making oocyte collection needles |
| Mitutoyo micrometer head | Mituoyo | 150-208 | For making oocyte collection needles |
| Syringe 5 mL | BD Biosciences | 309646 | For making oocyte collection needles |
| Syringe filter 0.45 μm filter | Corning | 431220 | For making oocyte collection needles |
| Glass Pasteur Pipette 5 3/4" | Fisher | 13-678-6A | For making oocyte collection needles |
| 83 x 0.5 mm pipette tip | Denville | P3080 | For making oocyte collection needles |
| α-MEM | Invitrogen | 11415049 | |
| Waymouth's media | Life Technologies | 11220035 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | A3160602 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3311 | For oocyte culture media |
| 500ml filter units 0.22um | Denville | F5227 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Tyrode’s solution | Sigma | T1788 | Store aliquots at -20C |
| Horse serum | Sigma | H-1270 | For ADB/wash buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A1470 | For ADB/wash buffer |
| VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope cover slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear nail polish | Amazon | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Mouse anti-MLH1 | Life Technologies | MA5-15431 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti-SYCP1 | Life Technologies | PA1-16763 | Dilution factor- 1:1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | Dilution factor- 1:50 |
| Human anti-centromere protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti- TOPOII | Abcam | ab109524 | Dilution factor- 1:100 |
| Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20) | Abcam | ab78517 | Dilution factor- 1:500 |
| Rabbit anti-Rec8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | Dilution factor- 1:10,000 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11057 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-21202 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-31573 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11004 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo-Fisher Scientific | A-11013 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11011 | Dilution factor- 1:500 |
References
- Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
- Keeney, S. Spo11 and the Formation of DNA Double-Strand Breaks in Meiosis. Genome Dyn Stab. 2, 81-123 (2008).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), (2015).
- Vries, F. A., et al. Mouse Sycp1 functions in synaptonemal complex assembly, meiotic recombination, and XY body formation. Genes Dev. 19 (11), 1376-1389 (2005).
- Baker, S. M., et al. Involvement of mouse Mlh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13 (3), 336-342 (1996).
- Lipkin, S. M., et al. Meiotic arrest and aneuploidy in MLH3-deficient mice. Nat Genet. 31 (4), 385-390 (2002).
- Kolas, N. K., et al. Localization of MMR proteins on meiotic chromosomes in mice indicates distinct functions during prophase I. J Cell Biol. 171 (3), 447-458 (2005).
- Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS Journal. 282 (13), 2426-2443 (2015).
- Lee, J. Roles of Cohesin and Condensin in Chromosome Dynamics During Mammalian Meiosis. J. Reprod Dev. 59 (5), 431-436 (2013).
- Verver, D. E., Hwang, G. H., Jordan, P. W., Hamer, G. Resolving complex chromosome structures during meiosis: versatile deployment of Smc5/6. Chromosoma. 125 (1), 15-27 (2016).
- Hopkins, J., et al. Meiosis-specific cohesin component, Stag3 is essential for maintaining centromere chromatid cohesion, and required for DNA repair and synapsis between homologous chromosomes. PLoS Genet. 10 (7), e1004413 (2014).
- Hwang, G., et al. SMC5/6 is required for the formation of segregation-competent bivalent chromosomes during meiosis I in mouse oocytes. Development. 144 (9), 1648-1660 (2017).
- Kota, S. K., Feil, R. Epigenetic transitions in germ cell development and meiosis. Dev Cell. 19 (5), 675-686 (2010).
- Taketo, T. Microspread ovarian cell preparations for the analysis of meiotic prophase progression in oocytes with improved recovery by cytospin centrifugation. Methods Mol Biol. 825 (1), 173-181 (2012).
- Sun, X., Cohen, P. E. Studying recombination in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 1-18 (2013).
- Kim, J. H., Ishiguro, K., Kudo, N., Watanabe, Y. Studying meiosis-specific cohesins in mouse embryonic oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 47-57 (2013).
- Susiarjo, M., Rubio, C., Hunt, P. Analyzing mammalian female meiosis. Methods Mol Biol. 558, 339-354 (2009).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Hum Mol Genet. 16, R203-R208 (2007).
- Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs In vivo and In vitro: I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
- Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 203-212 (2013).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
