Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein neues Verfahren für die quantitative Darstellung der Komplexbildung des SNARE-Proteine, basierend auf Förster Resonance Energietransfer und Fluoreszenz Lifetime imaging-Mikroskopie ermöglicht.
Abstract
Lösliche N- Ethylmaleimide sensible Protein (NSF) Anlage Protein-Rezeptor (SNARE) Fusionsproteine sind der Schlüssel für Handel mit Membran, wie sie Membranfusion in eukaryotischen Zellen katalysieren. Die SNARE-Protein-Familie besteht aus ca. 36 verschiedenen Mitgliedern. Bestimmte intrazelluläre Transportwege sind durch bestimmte Gruppen von 3 oder 4 SNARE-Proteine, die somit auf die Besonderheiten und Treue des Handels mit Membran katalysiert. Allerdings ist die genaue Funktion des SNARE-Proteine zu studieren technisch anspruchsvoll weil SNAREs sind sehr reichlich und funktional überflüssig, mit den meisten SNAREs mit mehreren und überlappende Funktionen. In diesem Protokoll wird eine neue Methode zur Visualisierung von SNARE Komplexbildung in lebenden Zellen beschrieben. Diese Methode basiert auf der SNARE-Proteine C-Terminal mit fluoreszierenden Proteinen verschmolzen zum Ausdruck zu bringen und messen deren Zusammenspiel von Förster Resonance Energy transfer (FRET) mit Fluoreszenz Lifetime imaging-Mikroskopie (FLIM). Durch den Einbau der Fluoreszenz Lifetime Histogramme mit einem Mehrkomponenten Verfall Modell, ermöglicht FRET-FLIM (semi-) quantitativen Einschätzung des Bruchs des SNARE-Komplexbildung bei verschiedenen Vesikel. Dieses Protokoll um SNARE Komplexbildung an der Plasmamembran und Endosomal Fächern in Säugetieren Zelllinien und primäre Immunzellen zu visualisieren erfolgreich angewendet wurde, und kann leicht erweitert werden, um die SNARE-Funktionen auf anderen Organellen in studieren Tier-, Pflanzen- und Pilzzellen.
Introduction
Membran des Menschenhandels ist ein zentrales Merkmal der eukaryotischen Zellen, wo Membranvesikel Knospe aus aus ein Spender Organell zu verschieben und dann verschmelzen mit einem Ziel Organelle1,2. Mit Ausnahme von Mitochondrien sind all diese Membran Fusion Schritte durch Mitglieder der SNARE Protein Familie1,2katalysiert. Die SNARE-Protein-Familie besteht aus etwa 36 Mitglieder in Säugetierzellen und etwa 20 Mitglieder in Hefe2. SNARE-Proteine enthalten ein oder zwei ~ 52 Rückstände-Long, nativ unstrukturierte Regionen aufgerufen SNARE-Motive. SNARE-Proteine sind oft angebunden, um Membranen durch eine C-terminale transmembranen Helix1,2. Fallstricke können kategorisiert werden, basierend auf der zentralen Reststoffen tragen sie auf der SNARE-Komplex in Arginin (R) und Glutamin (Q) Schlingen1,2. Membranfusion wird durch das Zusammenspiel von 3 oder 4 cognate SNAREs angetrieben, die zusammen 4 SNARE-Motive und verteilen sich über den Donor und Akzeptor Membran1,2. Ein SNARE-Komplex besteht aus einem R-SNARE-Motiv und drei Q-SNARE-Motive (Qa, Qb und Qc genannt). Komplexbildung beginnt bei der N-Termini der SNARE-Motive, bilden eine so genannte Trans-SNARE-Komplex, und geht in Richtung der C-Termini, bilden eine enge α-helikale coiled-Coil Bundle bezeichnet eine Cis-SNARE-Komplex. Die Komplexbildung sogar eine einzelne Schlinge komplexe zieht der Donor und Akzeptor Membranen zusammen und überwindet die Energiebarriere für Membrane Fusion3.
Bestimmte Transportwege innerhalb der Zellen unterschiedliche SNARE-komplexe zuweisen ist oft technisch anspruchsvoll. Obwohl SNAREs eindeutig auf die Besonderheiten der Membran des Menschenhandels beitragen, sind sie promiscuous, funktional überflüssig, und ihre Funktionen überlappen1,2. Aus diesem Grund führen Störung Experimente gezielt SNAREs, z. B. durch gen-Knockout, RNA-Interferenz, die Einführung Antikörper zu blockieren oder mit löslichen SNARE-Fragmente als dominierende negative, häufig nicht klar Phänotypen wie andere 2,4Schlingen zu kompensieren. Darüber hinaus ist es schwierig, vorgelagerten Menschenhandel Veranstaltungen, spezielle Membran Fusion Schritte unterscheiden, weil mehrere Transport-Routen-2SNAREs beteiligt werden können. Lokalisierungs-Arbeiten von Schlingen durch Mikroskopie Ansätze, mit Immunolabeling oder genetische Fusion Reporter fluoreszierende Proteine, leiden, die: (i) Schlingen lokalisieren, mehrere Organellen, wie vermitteln sie oft mehrere Menschenhandel Schritte und (Ii) Ihre Lokalisierungen bedeuten nicht automatisch, dass sie funktional mit SNARE Komplexbildung befaßt sind. Zu guter Letzt SNARE-komplexe mit Immunopräzipitation Experimente unter Verwendung eines von den Schlingen als Köder und die anderen Schlingen als Ziele identifiziert werden können, aber dies erlaubt keine Zuordnung dieser komplexe spezifische Organellen oder Handelsrouten. So gibt es derzeit keine alternative Technik, SNARE-komplexe mit Organellen Auflösung zu visualisieren. Immunfluoreszenz ist nicht in der Lage, SNARE Interaktionen zu beweisen aber zeigen nur das Vorhandensein oder Fehlen von Co Lokalisierung, während Immunopräzipitation nur zeigen kann SNARE Interaktionen in der gesamten Zelle Bevölkerung aber nicht zuordnen der Organellen wo diese Wechselwirkungen auftreten.
Um diese Einschränkung zu umgehen, wurde eine neuartige Methode, für die quantitative Darstellung der SNARE-komplexe in lebenden Zellen mit Organellen Auflösung vor kurzem von Verboogen Et Al. entwickelt. 5 diese Methode basiert auf den Ausdruck von Paaren von SNAREs mit spektral verschobenen fluoreszierende Proteine C-Terminal mit ihrer transmembranen Helices verschmolzen. Nach Abschluss der Membranfusion und Bildung eine Cis-SNARE Komplex, diese Fluorophore an die C-Termini von transmembranen Helices sind sofort zu einander gegenübergestellt. Die Fluorophore sind dann auch die Förster erreichbar (in der Regel < 5 nm), was im Bund von Grün verschoben Spender Fluorophor rot-verschoben Akzeptor Fluorophor5,6. ÄRGERN Sie sich Ergebnisse in abschrecken der Spender Fluorophor und eine erhöhte Emission von den Akzeptor Fluorophor, der aus der Verhältnisse der Donor und Akzeptor-Emission (ratiometrischen Bund) gemessen werden können. Allerdings ist ratiometrischen Bund zwischen zwei unterschiedlichen Molekülen, durch Fluoreszenz Übersprechen und verschiedenen Ebenen der Donor und Akzeptor Schlingen auf verschiedenen Organellen und unter den Zellen7,8eine Herausforderung. Bund kann auch aus der Fluoreszenz-Lebensdauer gemessen werden, die die Zeit zwischen der Erregung und die Emission eines Photons ist. Wenn der Spender Fluorophor seine Energie durch loslassen kann Bund, dieser konkurrierenden Prozessergebnisses in eine scheinbare Verkürzung der Fluoreszenz-Lebensdauer. Dies kann durch FLIM7,8gemessen werden. Lebenszeit FRET ist wesentlich robuster als ratiometrischen Bund zur Messung von Interaktionen zwischen zwei unterschiedlichen Molekülen, wie die Fluoreszenz-Lebensdauer eine intrinsische Eigenschaft einer Fluorophor ist und unempfindlich gegen seine Konzentration ist. Darüber hinaus ist Bund durch Approximation quantitativ, weil die Effizienz der Bund umgekehrt proportional zu der sechsten Potenz der Entfernung zwischen Donor und Akzeptor Fluorophore (im Wesentlichen eine Treppenfunktion). Daher ermöglicht durch den Einbau der Fluoreszenz Lifetime Histogramme mit einem zwei-Komponenten-Verfall-Modell von FLIM aufgezeichnet, Bund-FLIM für die (semi-) quantitative Schätzung des Anteils der SNARE Moleküle SNARE Komplexbildung5beteiligt.
Vor kurzem wurde dieser Bund-FLIM-Methode von Verboogen Et Al. verwendet SNARE Komplexbildung in primären dendritischen Zellen des Immunsystems5zu visualisieren. Es zeigte sich, dass bei der Begegnung mit einem pathogenen Reiz, dendritische Zellen umleiten ihrer Membran Menschenhandel begleitet von einer erhöhten Komplexbildner des R-SNARE Membran Vesikel-assoziierten Proteins (VAMP) 3 mit Qa-SNARE Syntaxin 4 speziell auf die Plasmamembran. Diese erhöhte SNARE Komplexbildung ist wahrscheinlich müssen die sekretorische erhöhte Kapazität für die Sekretion von inflammatorischen Zytokinen wie Interleukin-6-5erfüllen. Dieses Protokoll beschreibt die experimentellen Schritte für den Erwerb von FRET-FLIM-Daten für die Visualisierung und (semi-) quantitativen Messung der SNARE-komplexe.Es wird erklärt, wie man die ganze Zelle Fluoreszenz Lifetime Histogramme mit Mono - und Bi-Zerfall Exponentialfunktionen, wodurch die scheinbare Fluoreszenz-Lebensdauer als quantitative Schätzung auf SNARE Interaktionen zu passen. In diesem Protokoll die weit verbreiteten HeLa-Zelllinie wird als Beispiel verwendet, aber die Methode kann leicht erweitert werden, um die SNARE-komplexe in anderen eukaryotischen Zellen zu studieren.
Protocol
1. Vorbereitung der Proben Mikroskop
- Ausdruck der Qa-SNARE Syntaxin 4 mit mCitrine (Syntaxin 4-mCitrine; Spender Fluorophor) verschmolzen und die R-SNARE VAMP3 verschmolzen, mCherry (VAMP3-mCherry)
Hinweis: Andere Schlingen mit fluoreszierenden Proteinen verschmolzen, deren C-terminalen transmembranen Helices können auch verwendet werden. Statt mCitrine-mCherry kann auch andere Donor-Akzeptor-Paare von Spektral getrennte Fluorophore verwendet (z. B.GFP-YFP).- Wachsen Sie HeLa-Zellen und sich teilen Sie 900.000 HeLa-Zellen über drei 35 mm-Durchmesser Glasschalen unten geeignet für die Mikroskopie.
Hinweis: Grundsätzlich kann dieses Protokoll für andere eukaryotic Zelle Arten und Mikroskopie Gerichte angepasst werden.- Pflegen HeLa Zellkulturen in T75 Fläschchen mit 10 mL hohe Glukose Dulbecco's geändert Eagle Medium (DMEM), ergänzt um 10 % fetalen Kälberserum (FCS) und 1 % Antibiotikum Antimykotikums (mit Amphotericin B, Penicillin und Streptomycin) bei 37 ° C und 5 % CO 2 in einer Zelle Kultur Inkubator.
- Ergänzen das Medium zweimal in der Woche und die Zellen 01:10 aufgeteilt, einmal pro Woche oder wenn die Zellen erreichen 85-90 % confluency zu neuen T75 Fläschchen (500.000 Zellen/Kolben, im Durchschnitt).
- Entfernen Sie der DMEM und waschen Sie HeLa Monolagen zweimal mit 8 mL sterile Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) für 3 min.
- Entfernen der PBS und 2 mL PBS mit 2 mM Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA).
- Die Zellen für 5 min bei 37 ° C und 5 % CO2 in Zelle Kultur Inkubator inkubieren und anschließend leicht schütteln der Flasche HeLa-Zellen von der Unterseite des Kolbens zu trennen.
- Spülen Sie die Zellen mit 10 mL des Mediums, übertragen Sie die Aussetzung an eine 15 mL Tube und entfernen Sie eine 10 µL Aliquot für die Zählung zu.
- Verdünnen Sie die Aliquote 1:1 mit 0,4 % Trypan blau Fleck und zählen Sie die Zellen mit einer Bürker Hemocytometer9.
Hinweis: Zählen Sie zwei 4 x 4 Quadrate und mehrere Zellzahl von 10.000 für die Anzahl der Zellen/mL. - Nach Zelle zählen, nehmen 900.000 Zellen aus der 15 mL Tube, teilen Sie sie über die 3 unteren Glasschalen (siehe Schritt 1.1.1), und bereiten Sie zur Transfektion.
- Die Zellen durch Elektroporation10 transfizieren (siehe Tabelle der Materialien) mit Syntaxin-4-mCitrine-Konstrukt (Spender nur, Sample #1), Syntaxin 4-mCitrine zusammen mit VAMP3-mCherry (Sample #2) und Syntaxin 3 verschmolzen, mCitrine und mCherry () Beispiel #3).
Hinweis: Andere Zelle Transfektion Methoden können auch gebrauchte11sein. Das Tandem-Konstrukt in Probe #3 ist eine Positivkontrolle für die Schätzung der kürzesten Lebensdauer vorhersehbaren (d.h.maximal erwartete Bund).
- Wachsen Sie HeLa-Zellen und sich teilen Sie 900.000 HeLa-Zellen über drei 35 mm-Durchmesser Glasschalen unten geeignet für die Mikroskopie.
- Kultur, die die Zellen im hohen Glukose DMEM mit 10 % FCS und 1 % Antibiotikum Antimykotikums bei 37 ° C mit 5 % CO2 in eine Zelle Kultur Inkubator versorgt über Nacht.
- Aspirieren DMEM und waschen Sie die Zellen einmal mit live Cell imaging Medium (140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, pH = 7,4, mOsm = 300; sehen Sie Tabelle der Materialien) für 2 min und legen Sie anschließend die Zellen in frischen Bildgebung Medium.
2. Aufzeichnung der FLIM Daten
- Ort Beispiel #2 unter dem Zeitbereich FLIM confocal Mikroskop mit einem gepulsten Anregungsquelle für die Spender Fluorophor (d.h., mCitrine) und zeitaufgelöste Datenerfassung. Halten Sie die Zellen bei 37 ° C mit einer beheizten Bühne.
Hinweis: Die confocal Mikroskop in diesem Protokoll verwendeten ist ausgestattet mit einem 63 X 1.20 NA Wasser eintauchen Ziel, ein weißes Licht Pulslaser (80 MHz Taktung, < 100 Ps Pulsdauer), ein Photon Multiplikator Schlauch (PMT) und ein Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC ) System (siehe Tabelle der Materialien für spezifische Setup verwendet). Andere FLIM-Mikroskope werden auch gebrauchten (z.B.Single-Photon Avalanche Dioden (SPAD) statt PMTs, Einzel-Wellenlänge gepulste Laser anstelle eines Weißlicht-gepulste Laser). - Wählen Sie eine Zelle mit sichtbarer Ausdruck der mCitrine und mCherry-Label SNARE-Proteine und zeichnen ein konfokale Bild von 256 × 256 Pixel mit gleichzeitiger Anregung der beiden Fluorophore vor jeder Messung FLIM. Ein Pixel-Schritt von ca. 2-fach kleiner als die Beugung räumlichen Auflösung des Mikroskops begrenzt (~ 200 nm) eingesetzt werden. Für mCitrine begeistern Sie bei 516 nm und sammeln Emission von 521-565 nm; für mCherry bei 610 nm und sammeln Emission von 613-668 nm begeistern.
Hinweis: Verwenden Sie nicht die Position der Abbildungsebene zu nah an den Boden der Schale (innerhalb von ~ 2 µm-Abstand), da dies in einer Reflexion-Spitze in der Fluoreszenz-Lebensdauer-Histogramm führt. Simultane Anregung von Donor und Akzeptor Fluorophore wird bevorzugt, da dadurch das potentielle Problem der Probe Bewegung zu überwinden. Sequentielle Anregung kann jedoch auch verwendet werden. - Datensatz ein FLIM Bild per Mausklick Ausführen FLIM FLIM Bild mit den gleichen Dimensionen und räumliche Auflösung als die konfokale Bild aufgezeichnet wird bei Schritt 2.2 aufgezeichnet. Zeichnen Sie die Bild mindestens 50.000 Photonen für ganze FLIM Zellanalyse oder mindestens 400 Photonen/Pixel. Nur die mCitrine Spender Fluorophor und nicht die mCherry Akzeptor Fluorophor begeistern, und somit bei 516 nm und sammeln Emission von 521-565 nm begeistern.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.3 für mehrere Zellen und für die anderen Sample #1 (nur Spender) und Sample #3 (mCitrine-mCherry-Tandem-Konstrukt).
- Zeichnen Sie eine Instrument-Response-Funktion (IRF). Tune den Monochromator Emission Detektor zur Anregung Wellenlänge (z.B. Rekord Emission von 510-550 nm) und zeichnen Sie ein FLIM-Bild mit der Streuung zurück aus einem sauberen Glas Deckglas durch Anklicken der Schaltfläche Ausführen FLIM. Verwenden Sie die gleiche Erregung Wellenlänge (516 nm) und laser-macht, wie für die Aufnahme der Zellendaten Schritte 2.1-2.4.
Hinweis: Wenn mehrere Gipfel in der IRF sichtbar sind oder die Emission Monochromatoren optimiert werden können, kann der IRF auch mit einer Lösung aus Fluoreszenzfarbstoff mit ultraschnellen Lebensdauer zum Beispiel gemessen werden durch Fluoreszenzlöschung von organischer Farbstoff in eine gesättigte wässrige Lösung von Kaliumjodid. Darüber hinaus ist es nicht unbedingt erforderlich eine IRF, aufzeichnen, weil Zerfall Hang der Fluoreszenz Histogramme auch ohne Entfaltung der IRF montiert werden kann. Jedoch ein IRF ermöglicht, um die Timing-Eigenschaften von der Photon-Detektor verwendet zu korrigieren und dadurch macht die Passungen der Lebensdauer Histogramme genauer.
3.Umwandlung der Photon-Aufnahmen, FLIM Bilder
- Downloaden Sie und installieren Sie die PT32ICS Umwandlung Software5.
Hinweis: Die Lebensdauer-Daten können auch von anderer Software, einschließlich Software von verschiedenen Herstellern Mikroskop analysiert werden. - Konfigurieren Sie die PT32ICS-Software.
- Legen Sie die Größe auf 256 × 256 Pixel Bildgröße über Einstellungen | Größe.
- Stellen Sie den Kanal 2 über Einstellungen | Größe.
Hinweis: Der Kanal der mCitrine Emission ist ausschließlich abhängig von der Konfiguration des Mikroskops. Ein falscher Kanal führt ein FLIM-Bild mit keine Photonen (d.h., schwarzes Bild) und als Ergebnis eine leere "LifetimeTable.txt"-Datei. Der richtige Kanal erkennbar durch Versuch und Irrtum. - Ausgabe auf ImageJ (Xyz) festgelegt (oder TRI2 (Xyt)) für die Erzeugung von FLIM Bilder (Schritt 3.4).
- Drücken Sie Konvertieren und laden Sie ein oder mehrere Photon Spuren (.pt3 Dateien). Um mehrere Photon Spuren auszuwählen, halten Sie die Strg -Taste gedrückt.
Hinweis: Die neuere 64-Bit-.ptu-Format kann auch umgewandelt werden. - Stellen Sie sicher, dass die PT32ICS-Software generiert die folgenden Dateien in demselben Ordner wie dem pt3-Dateien gespeichert werden: ein Photon Stapel pro .pt3 Photon Spur in Image Cytometry standard-Format (.ics), eine Bitmap-Datei pro .pt3 Photon Spur (BMP), eine Textdatei pro Conversion (_Report.txt), das Informationen über die Photon-Statistiken (d.h. die Anzahl der Photonen in jeder .pt3 Photon Ablaufverfolgung, die zeitliche Auflösung des Detektors) und eine zweite Textdatei pro Conversion (_LifetimeTable.txt), enthält die Summe Fluoreszenz Lifetime Histogramme in tabulatorgetrennte Format für jede .pt3-Photon-Spur.
Hinweis: Die .ics-Datei kann für einzelne Pixel passend um FLIM Bilder, zum Beispiel mit TRI2 Software12,13 oder SLIM Kurvenanpassung Bibliothek in Fidschi ImageJ14,15erzeugen verwendet werden. Diese Datei auch Phasor Analyse16, zum Beispiel mit der Zeit Gated Phasor Plugin für Fidschi von Spechron einsetzbar. Die Bitmap-Datei enthält keine Lebensdauer-Informationen. Die zweite Text-Datei ist für die gesamte Zelle FLIM Analyse in Schritt 4 verwendet.
4. Montage der Fluoreszenz-Lebensdauer-Histogramme für die Whole-Cell FLIM Analyse
Hinweis: Dieser Schritt (deconvoluted Befestigung der IRF) erfordert Software, die deconvoluted Montage. Montage der Piste der Fluoreszenz Histogramme ohne Entfaltung der IRF kann mit anderer Software erfolgen.
- Öffnen der Daten Analyse-Software-Programm in der Lage, passend mit Dekonvolution (Table of Materials) und importieren Sie die Textdatei mit dem Histogramm für jedes Photon Trace (_LifetimeTable.txt) über Datei | Import | Einzelne ASCII.
- In der Tabelle zu reorganisieren, so dass die IRF in der zweiten Spalte der Tabelle (über Kopieren und Einfügen). Legen Sie die IRF in der zweiten Spalte B neben die Zeitwerte in die erste Spalte A.
- Entscheiden über die Qualität der aufgezeichneten Photon Spuren durch Auswahl von alle Spalten durch Drücken von Strg + A und Grundstück auswählen | Multi-Panel | 9 Panel. Photon-Spuren mit einer hohen Reflexion Spitze (Abb. 4F) nicht analysieren.
- Wählen Sie alle Spalten, in denen die qualitätsgesicherte Lebensdauer Histogramme, die neben der IRF in Spalte B mit Strg ausgestattet werden Schlüssel und Laden der nicht-linearen Montage über Analyse | Montage | Nicht-lineare Kurve Fit | Im Dialog.
- Deconvoluted Fit-Funktion (erhältlich in der ergänzenden Datei 1) zu laden, indem Sie die Analyse-Software diese Funktion hinzufügen (über Kategorie | Benutzerdefinierte | Funktion | Fügen Sie). Wählen Sie die Fit Funktionsdatei "FLIM_convoluted_IRF.fdf". Diese Funktion passt die Fluoreszenz Lifetime Histogramme mit einer Mono-exponentiellen Zerfall-Funktion mit der IRF (d. h., die zweite Spalte in der Tabelle B) deconvoluted (Gleichung 1):
(Gleichung 1)
mit t die Zeit τ die scheinbare Fluoreszenz Lifetime, A die Amplitude und y0 Offset.
Hinweis: Eine weitere Möglichkeit ist die Lebensdauer Histogramme mit einem Bi-Fit Exponentialfunktion (Gleichung 2) passen:
(Gleichung 2)
Durch die Festsetzung der Lebensdauer der langsamen Komponente (τ1), die einzige Bedingung des Spenders (Schritt 1.1.2: Sample #1) und dass der schnellen Komponente (τ2) zu den Tandem-Konstrukt (Sample #3), dies ermöglicht die Schätzung des Anteils der SNARE-Proteine im Komplex (F) von der Amplituden der langsamen (A1) und schnelle Komponenten (A2; siehe Diskussion; ( Gleichung 3):
(Gleichung 3)
Die Fit-Funktionsdatei für deconvoluted Bi-exponentielle Anpassung "FLIM_convoluted_IRF_biexp.fdf" gibt es in ergänzende Datei 2. - Wählen Sie ausgestattet Kurven | X-Datentyp genauso wie als Eingabedaten.
Hinweis: Dadurch wird das entsprechende X-Achsenskalierung der angepassten Kurven. - Passen Sie die Kurven durch drücken passen.
Hinweis: Wird die Passform zu konvertieren und "Berichtsbogen" mit eine Tabelle mit der Fluoreszenz-Lebensdauer, Offsets und Amplituden im Array zu erzeugen. Es wird auch ein Datenblatt mit der angepassten Kurven und die Residuen der Passung generieren.
(Gleichung 1)
(Gleichung 2)
(Gleichung 3)Representative Results
Das Grundprinzip des Tests zur Messung der SNARE Interaktionen von FRET-FLIM ist in Abbildung 1dargestellt. Die C-Termini von den transmembranen Helices cognate SNARE-Proteine sind mit ein paar spektral verschobenen fluoreszierende Proteine (z.B., mCitrine und mCherry) verschmolzen. Die Bildung einer Cis-SNARE Komplex auf Membrane Fusion Ergebnisse in dieser fluoreszierende Proteine immer sofort zu einander gegenübergestellt und ärgern. Abbildung 2 zeigt repräsentative konfokale Bilder von HeLa-Zellen mit dem Ausdruck Eindringmittel beschriftet SNARE-Proteine. Angezeigt eine Zelle Syntaxin 4-mCitrine (Spender Fluorophor) mit VAMP3-mCherry (Akzeptor Fluorophor), zum Ausdruck bringen, sowie Kontrolle der Zellen mit dem Ausdruck nur die Syntaxin-4-mCitrine-Konstrukt (Spender nur; ohne Bund) und Syntaxin 3 verschmolzen, beide mCitrine und mCherry im Tandem (maximale erwartete Bund). Abbildung 3 zeigt die begleitenden Fluoreszenz-Lebensdauer und FLIM Bilder erzeugt durch den Einbau der Lebensdauer Histogramme der einzelnen Pixel mit Mono-exponentiellen Zerfall Funktionen (Abb. 3A–B) und Bi-exponentiellen Zerfall Funktionen ( Abbildung 3 - ( D). Abbildung 4A zeigt die IRF unser Setup zurück Streuung von ein Mikroskop-Deckglas gemessen. In Abbildung 4 b–E, repräsentative Fluoreszenz Lifetime Histogramme der ganzen Zelle FLIM Analyse zusammen mit begleitenden Passform sind Kurven für Mono-exponentiellen Zerfall Funktionen dargestellt. Abbildung 4F zeigt ein Fluoreszenz-Lebensdauer-Histogramm eines Experiments zu nahe an die Oberfläche der Glasabdeckung Mikroskop abgebildet ein prominenter Reflexion Peak führt. Abbildung 4 zeigt ein Lebenszeit-Histogramm mit Vertreter mit einer Bi-exponentiellen Zerfall Funktion passen.
Abbildung 1: Schema der Begründung zur Visualisierung von SNARE-komplexe durch Bund. (A) Strukturmodell des neuronalen SNAREs (Protein-Datenbank 3HD717) Membran Vesikel-assoziierten Proteins (VAMP) 2 (blau; (R), Syntaxin 1 (rot; Qa-SNARE), und SNAP25 (grün; enthält sowohl ein Qb und Qc-SNARE-Motiv). Dem C-Terminus des transmembranen Helix von Syntaxin-1 ist an mCitrine (Spender Fluorophor, Protein-Datenbank-3DQ1-18) konjugiert. Dem C-Terminus des transmembranen Helix VAMP2 ist an mCherry (Akzeptor Fluorophor, Protein-Datenbank 2H5Q19) konjugiert. (B) Regelung der SNARE vermittelte Membranfusion Bund führt. Nach der Membranfusion durch Bildung einer Cis-SNARE-komplexe, die Schlingen werden sofort miteinander wodurch Bund gegenübergestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Ausdruck der SNARE-Proteine mit fluoreszierenden Proteinen verschmolzen. Erste Spalte: Spender Fluorophor, begeistert von 516 nm. Zweiten Spalte: Akzeptor Fluorophor, aufgeregt bei 610 nm. (A) Spender nur Zustand. Repräsentative konfokale Bild einer HeLa-Zelle mit dem Ausdruck Syntaxin 4-mCitrine (Spender Fluorophor; grün zusammenführen). Der Akzeptor-Kanal (zweite Spalte) zeigt die Fluoreszenz Übersprechen. (B) negativ-Kontrolle (ohne Bund). Repräsentative konfokale Bild einer HeLa-Zelle mit dem Ausdruck sowohl Syntaxin 4-mCitrine mit VAMP3-mCherry (Akzeptor Fluorophor; Magenta zusammenführen). (C) Positivkontrolle (maximale erwartete Bund). Repräsentatives konfokale Bild einer HeLa-Zelle mit dem Ausdruck des Syntaxin-3-mCitrine-mCherry-Tandems zu bauen. Beachten Sie, das das Fluoreszenzsignal des mCitrine und der mCherry signalisiert wird nicht vollständig überlappen, wahrscheinlich aufgrund einer geringeren Widerstand der mCitrine zu lysosomalen Abbau im Vergleich zu mCherry (siehe Diskussion). BF: Hellfeld. Skalieren Sie Bars, 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: FLIM Bilder von SNARE Komplexbildung. (A) repräsentative Lebensdauer Fluoreszenzbilder der Zellen, die in Abbildung 2dargestellt. Die Bilder wurden durch Umwandlung der Photon-Spuren von einem TCSPC-System (.pt3) aufgenommen, das Bild Cytometry standard (.ics) mit der PT32ICS Software generiert. Einzelnes Pixel ausgestattet Fluoreszenz-Lebensdauer, die Bilder dann generiert wurden mit der TRI2 Software12,13 mit Schwellwerte von 15-100 % Intensität, 7 Pixel binning kreisförmigen und Monoexponential passenden Algorithmus (Marquardt). Die Farbe zeigt die durchschnittliche scheinbare fluoreszierende Lebensdauer. (B) FLIM Bilder wo Lebensdauer Fluoreszenzbilder (siehe Schalttafel A) mit der Fluoreszenz-Intensität von der mCitrine Spender Fluorophor (siehe Abbildung 2) verwickelt waren. Die Faltung erfolgte mit Fidschi ImageJ mit einem maßgeschneiderten Makro (siehe Tabelle der Materialien). (C) Fluoreszenz-Lebensdauer und FLIM Bilder der HeLa-Zelle mit dem Ausdruck Syntaxin 4-mCitrine und VAMP3-mCherry, aus Platten A-B, aber jetzt mit der passenden mit Bi-exponentiellen Zerfall Kurven (mit Lebenszeiten, die fest mit der Kontrolle Bedingungen; siehe Schritt 4,4 In -Protokoll). Die Pixelfarben zeigen die geschätzte Fraktionen F von Syntaxin 4 im Komplex mit VAMP3 (Gleichung 3). (D) passen wie zentrale B, jedoch für die Bi-exponentiell. Die Faltung erfolgte mit Fidschi ImageJ mit einem maßgeschneiderten Makro (siehe Tabelle der Materialien). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: ganze Zelle FLIM Analyse. (A) die Instrument-Response-Funktion (IRF) des Setups. Die IRF wurde mittels der zurück Streuung auf die Glas-Wasser-Grenzfläche (mit einer sauberen Mikroskopie Glasschale mit Wasser) gemessen.(B–E) Ganze Zelle Leben Histogramme für die Zellen, die in Abbildung 2 und Abbildung 3gezeigt. In den Bildern alle Photonen wurden zusammengefasst. Die Kurven wurden mit der IRF deconvoluted und ausgestattet mit Mono-exponentiellen Zerfall Funktionen (Gleichung 1). Für diese Zellen stammen von 2,82 Fluoreszenz Lebenszeiten ns (mit dem Ausdruck nur Syntaxin 4-mCitrine; Spender nur zentrale B-Zellen), 2,09 ns (Zellen, die zusammen mit dem Ausdruck Syntaxin 4-mCitrine mit VAMP3-mCherry; C-Panel) und 2,08 ns (Zellen, die mit dem Ausdruck der Syntaxin 3- mCitrine-mCherry-Tandem zu bauen; maximale erwartete Bund Kontrolle; Panel D). Die Inlays zeigen die gleichen Grafiken, aber jetzt mit logarithmischer Skalierung der y-Achse. E zeigt eine Überlagerung der Verfall Kurven Platten B-D. (F) Beispiel für ein Histogramm fluoreszierende Lebensdauer aufgezeichnet zu nah an der Oberfläche des Mikroskop-Deckglas. Daraus resultiert eine große Reflexion Spitze (dargestellt durch die gelben schraffierte Fläche). (G) befestigt wie Panel C, aber jetzt mit einer Bi-exponentiellen Zerfall Kurve mit Lebenszeiten passend die Kontrolle Bedingungen (siehe Punkt 4.4 im Protokoll). Die Amplituden der schnell (A1) und langsam(2)Komponenten waren 14.42 und 0,01, beziehungsweise, was zu einem geschätzten Bruchteil der SNAREs in komplexen F 0.99 (Gleichung 3). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Datei 1. Funktionsdatei FLIM_convoluted_IRF Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Datei 2. Funktionsdatei FLIM_convoluted_IRF_biexp Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.
Discussion
Dieses Protokoll zeigt den Einsatz des Bund-FLIM zur Visualisierung der SNARE Interaktionen zwischen Syntaxin 4 und VAMP3 in lebenden HeLa-Zellen. Syntaxin-4 ist ein QS-SNARE-Protein überwiegend Ortung bei der Plasmamembran wo vermittelt es Exozytose1,2,20,21. VAMP3 ist ein R-SNARE die bezeichnet man hauptsächlich um zur Wiederverwertung Endosomal Fächer zu finden und vermittelt handeln in anderen Endosomen sowie hinsichtlich der Plasmamembran1,2,20. Jedoch kann der Bund-FLIM-Assay für das Studium anderer SNARE-Proteine leicht angepasst werden. Die einzige Bedingung ist, dass diese Fallstricke eine C-terminalen transmembrane Helix, enthalten das ist der Fall für die meisten SNARE-Proteine durch weit1,2. Darüber hinaus kann das hier beschriebene Protokoll zur Visualisierung der SNARE-komplexe in eukaryotischen Zelltypen jeglicher Art, einschließlich Pflanzen und Hefe angepasst werden. In diesem Protokoll wird die Verkürzung der Fluoreszenz-Lebensdauer von Spender-Fluorophor als ein gewisses Maß an Bund verwendet. Als einen komplementären Ansatz die Lebensdauer der Akzeptor Fluorophor könnte untersucht werden, da die sensibilisierte Emission verursacht eine deutliche Anstieg Phase tritt die eindeutige Beweis, dass Resonanz-Energie-Transfer bietet.
Derzeit, die Bund-FLIM-Technik, SNARE-komplexe in lysosomalen Fächer zu visualisieren möglicherweise nicht. Für das Syntaxin-3-mCitrine-mCherry-Tandem-Konstrukt mCherry Fluoreszenz oft mehr kumulierten in einer Juxtanuclear Gegend, finden Sie das lysosomale Fächer wahrscheinlich entspricht, während das mCitrine-Signal häufiger in die zelluläre ist Peripherie-5. Eine ähnliche Juxtanuclear Ansammlung von mCherry im Vergleich zu mCitrine wurde beobachtet, wenn die gleichen SNARE-Proteine verschmolzen diese fluoreszierenden Proteinen Co ausgedrückt5waren. Lysosomen zeichnen sich durch einen extrem niedrigen pH-Wert (< 4) und eine hohe Aktivität der proteolytischen Enzyme. Die Juxtanuclear Ansammlung von mCherry ist wahrscheinlich durch einen höheren Widerstand von der mCherry-Fluorophor lysosomalen Abbau im Vergleich zu den mCitrine-Fluorophor verursacht. Es ist nicht durch pH-Wert-abschrecken der mCitrine, da Juxtanuclear Ansammlung von mCherry auch bei der Fixierung der Zellen5 tritt. So die Bund-FLIM Technik unterschätzt die Höhe der Bund in den Juxtanuclear (lysosomalen) Regionen und dazu müssten andere fluoreszierende Reporter-Proteine, die die harten Bedingungen in das Lumen der Lysosomen zu überleben.
Bund-FLIM im Prinzip ermöglicht eine (semi-) quantitative Abschätzung der Bruchteil der SNAREs in Komplex5. Wie wir in diesem Protokoll erklärt, erfordert dies den Einbau von Fluoreszenz Lifetime Histogramme mit Doppel-exponentiellen Zerfall Funktionen (Gleichung 2), wo die Amplitude der schnellen Komponente ist in komplexen (proportional zu dem Anteil der SNAREs ( Gleichung 3). Diese Armatur mit einem zwei-Komponenten-Modell ist jedoch technisch anspruchsvoll. Armatur mit mehreren freien Anpassungsparameter (zwei Fluoreszenz-Lebensdauer und zwei Amplituden) erfordert eine sehr große Anzahl von Photonen, zumal die Parameter einander beeinflussen und kleine Fehler in der Lebenszeit die Amplituden und Vice betrifft umgekehrt. Um diese Anpassung Probleme zu überwinden, die Fluoreszenz-Lebensdauer der langsamen Komponente auf die Lebensdauer der Geber einzige Bedingung (d. h.keine FRET; nur mCitrine vorhanden) fixiert werden können und zu konstruieren, die der schnellen Komponente auf die Lebensdauer der Tandem) maximale erwartete FRET). Allerdings sollte dies auch mit Sorgfalt, interpretiert werden, da die Fluoreszenz-Lebensdauer möglicherweise nicht identisch mit diesen Staaten Kontrolle und können aus mehreren Gründen (Self abschrecken, Dipol-Orientierung, Variationen in der Mikroumgebung) abweichen. In der Nähe mehrere SNARE-komplexe (< 10 nm) kann Ergebnis im Abstand-abhängige FRET, das gleiche Prinzip, mit dem Bund als "molekulare Herrscher", verwendet werden kann aber in diesem Fall verdeckt die Quantifizierung der SNARE-komplexe. Darüber hinaus ist eine quantitative Schätzung nicht immer sinnvoll, weil die beschrifteten SNAREs mit endogenen (unbeschriftete) Schlingen konkurrieren. Infolgedessen ist die Expression des mCherry-Label SNARE eine ausschlaggebende Faktor für den Anteil Bund5. Aufgrund dieser Vorbehalte empfiehlt es sich, die fluoreszierende Lebensdauer Histogramme mit einer Mono-exponentiellen Zerfall Funktion (Gleichung 1) passen. Dies hat den Vorteil, dass es keiner kein-priori Kenntnisse über die Lebensdauer und die daraus resultierende scheinbare durchschnittliche fluoreszierende Lebensdauer ein solides Maß für SNARE Komplexbildner5 bietet.
Dennoch, wird erwartet, dass quantitative FRET-FLIM Bildgebung von Zweikomponenten-Modelle potente zukünftige Anwendungen haben wird. SNARE-Kodierung Gene innerhalb der Chromosomen können mit fluoreszierenden Reporter Proteine, zum Beispiel durch CRISPR/CAS9 fusioniert werden. Dies führt in der fluoreszierenden Etikettierung von endogenen SNARE-Proteine mit endogenen Proteingehalte und keinen Hintergrund der unbeschrifteten SNAREs und ermöglicht damit eine sinnvolle quantitative Schätzung des Anteils der SNARE-komplexe durch Bund-FLIM. Während der Ausdruck endogenen SNAREs könnte sein ziemlich niedrig und geben relativ niedrige fluoreszierende Signale, es wird erwartet, dass eine ausreichende Anzahl von Photonen, vor allem für die ganze Zelle FLIM eingeholt werden kann (die nur ein paar 1.000 Photonen erfordert). Darüber hinaus können diese Bund-FLIM-Messungen mit empfindlicher Avalanche Photodiode Detektoren durchgeführt werden, auch in höheren Fluoreszenz-Signale und bessere Photon Statistiken führt.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von einem Hypatia Stipendium der Radboud University Medical Center, ein Career Development Award von der Human Frontier Science Program, die Gravitation Programm 2013 von der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO; unterstützt. ICI-024.002.009), ein VIDI gewähren von NWO (ALW VIDI 864.14.001) und einem Starting Grant vom European Research Council (ERC) siebten Rahmenprogramms der Europäischen Union (Grant Agreement Nummer 336479).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid DNA 'syntaxin 4-mCitrine' | Addgene | ID 92422 | Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP). |
| Plasmid DNA 'VAMP3-mCherry' | Addgene | ID 92423 | Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP). |
| Plasmid DNA 'syntaxin 3-mCitrine-mCherry' | Addgene | ID 92426 | Positive control for maximum achievable FRET. |
| Hela cells | |||
| 35 mm glass bottom dishes | Willco Wells | HBST-3522 | Other live cell imaging chambers will work as a substitute |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco, Life Technologies | 31966-021 | |
| Fetal calf serum | Greiner Bio-one | 758093 | |
| Antibiotic-antimycotic solution | Gibco, Life Technologies | 15240-062 | Pen/Strep will work as a substitute |
| Live cell imaging medium | Thermo Fisher Scientific | A14291DJ | Any other live cell imaging solution will work, as long as fluorescence from the medium is prevented |
| Leica SP8 confocal microscope with a 63x 1.20 NA water immersion objective | Leica | SP8 | Other confocal microscopes capable of time-domain FLIM can also be used |
| Pulsed white light laser | Leica | SP8 | Other pulsed laser sources can also be used |
| Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system | PicoQuant | PicoHarp 300 | |
| PT32ICS conversion software | Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com | ||
| data analysis software programme capable of deconvolution | Originlabs | OriginPro 2016 | |
| Fiji ImageJ | |||
| Custom-made Fiji ImageJ macro for convolution of FLIM image with Intensity | Fiji ImageJ | Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com | |
| Bürker Haemocytometer | VWR | 630-1541 | |
| HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| PBS | B Braun Melsungen AG | 362 3140 | |
| EDTA 2 mM | Merck | 108417 | CAS: 60-00-4 |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-one | 188271 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | 93595 | CAS: 72-57-1 |
| NEON cell electroporation device | Thermo Fisher Scientific | MPK5000S |
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