Summary
Ce protocole décrit une nouvelle méthode permettant la visualisation quantitative de la formation d’un complexe de protéines SNARE, basée sur le transfert d’énergie Förster et durée de vie de fluorescence imaging microscopy.
Abstract
N- éthylmaléimide fusion sensible protéine (NSF) fixation protéine récepteur (SNARE) protéines solubles sont essentiels pour le trafic de la membrane, comme ils catalysent la fusion membranaire dans les cellules eucaryotes. La famille des protéines SNARE comprend environ 36 membres différents. Itinéraires de transport intracellulaires spécifiques sont catalysées par des ensembles spécifiques de 3 ou 4 protéines SNARE qui contribuent ainsi à la spécificité et la fidélité de la traite de la membrane. Toutefois, étudier la fonction précise des protéines SNARE est techniquement difficile, car les pièges sont très abondantes et fonctionnellement redondantes, avec collets plupart ayant multiples et le chevauchement des fonctions. Dans le présent protocole, est décrit une nouvelle méthode pour la visualisation de la formation du complexe SNARE dans des cellules vivantes. Cette méthode est basée sur exprimant des protéines SNARE fusionnés en position C-terminale de protéines fluorescentes et mesurer leurs interactions par l’énergie de résonance Förster transfert employant vie de fluorescence (FRET) imagerie microscopie (FLIM). En ajustant les histogrammes de durée de vie de fluorescence avec un modèle de décomposition multicomposants, frette-FLIM permet (semi-) estimation quantitative de la fraction de la formation du complexe SNARE à différentes vésicules. Ce protocole a été appliqué avec succès pour visualiser la formation du complexe SNARE à la membrane plasmique et à compartiments endosomale dans les lignées cellulaires de mammifères et des cellules immunitaires primaires et peut être facilement étendu pour étudier les fonctions de caisse claire aux autres organites dans animales, végétales et les cellules fongiques.
Introduction
Trafic de membrane est un élément central des cellules eucaryotes, où vésicules bourgeonnent hors d’un organite donneur et puis déplacez à et fusionnent avec une cible organelle1,2. À l’exception des mitochondries, toutes ces étapes de fusion de membrane sont catalysées par des membres des protéines SNARE famille1,2. La famille des protéines SNARE comprend environ 36 membres en cellules mammifères et environ 20 membres en levure2. Les protéines SNARE contiennent un ou deux ~ 52 résidus-long, nativement non structurées des régions, appelées SNARE-motifs. Les protéines SNARE sont souvent attachés aux membranes par des hélices transmembranaires1,C-terminal2. Pièges peuvent être classées basé sur les résidus des centrales qu’ils contribuent à la complexe SNARE en arginine (R) et glutamine (Q) collets1,2. Fusion membranaire est entraînée par l’interaction des 3 ou 4 pièges apparentés qui ensemble contribuent 4 SNARE-motifs et sont réparties entre le donneur et accepteur membrane1,2. Un complexe SNARE consistant en un motif de R-SNARE et trois motifs de Q-SNARE (appelés Qa, Qb et Qc). Formation d’un complexe commence aux extrémités N-terminales SNARE-motifs, formant un soi-disant trans-SNARE-complexe et se dirige vers les extrémités C-terminales, formant un faisceau serré de coiled-coil α-hélicoïdale appelé cis-SNARE-complexe. La formation d’un complexe de même un complexe unique SNARE fait glisser les membranes donneur et accepteur ensemble et permet de surmonter la barrière d’énergie pour membrane fusion3.
Attribuant des complexes distincts de SNARE aux liaisons de transport spécifique dans les cellules est souvent techniquement difficile. Bien que les collets contribuent clairement à la spécificité de la membrane traite, sont-elles promiscuité, fonctionnellement redondantes, et leurs fonctions chevauchent1,2. Pour cette raison, expériences de perturbation ciblant les SNAREs, tels que par knock-out du gène, l’interférence ARN, l’introduction de bloquer les anticorps, ou avec des fragments SNARE solubles agissant comme dominants négatifs, fréquemment n’aboutissent pas à des phénotypes clairs que d’autres Collets compensent2,4. En outre, il est difficile de différencier les étapes de fusion membranaire spécifique d’événements traite en amont, parce que les pièges peuvent être impliqués dans plusieurs itinéraires de transport2. Les études de localisation de collets par microscopie approches, à l’aide d’immunomarquage ou fusion génétique aux protéines fluorescentes journaliste, souffrent de problèmes qui : (i) les collets localiser à plusieurs organites comme ils véhiculent souvent plusieurs étapes traite et (ii) leurs localisations ne signifient pas automatiquement qu'être fonctionnellement engagées dans la formation du complexe SNARE. Enfin, les complexes SNARE peuvent être identifiés à l’aide des expériences d’immunoprécipitation utilisant un des pièges comme appât et autres pièges comme cibles, mais cela ne permet pas l’affectation de ces complexes d’organites spécifiques ou des itinéraires de trafic. Ainsi, actuellement, il n’y a aucune autre technique pour visualiser des complexes SNARE avec résolution organellaire. Immunofluorescence n’est pas en mesure de prouver les interactions SNARE mais peut montrer seulement la présence ou l’absence de co-localisation, tandis qu’immunoprécipitation peut afficher uniquement les interactions SNARE dans toute population de cellules mais pas assignent les organites où ces des interactions se produisent.
Pour surmonter ces limitations, une nouvelle méthode permettant la visualisation quantitative des complexes SNARE au sein des cellules vivantes avec résolution organellaire a été récemment mis au point par Verboogen et al. 5 cette méthode repose sur l’expression des paires de pièges avec des protéines fluorescentes spectralement décalés fusionnées en position C-terminale à leurs hélices transmembranaires. À l’issue de la fusion membranaire et la formation d’un cis-caisse claire complexes, ces fluorophores aux extrémités C-terminales des hélices transmembranaires sont immédiatement juxtaposés les uns aux autres. Les fluorophores sont alors bien dans la distance de Förster (généralement < 5 nm) qui aboutiront à la frette de fluorophore donneur décalés dans le vert à l’accepteur décalée vers le rouge fluorophore5,6. Vous inquiétez pas résultats de piégeage de fluorophore donneur et une émission accrue du fluorophore accepteur qui peut être mesurée des rapports de l’émission du donneur et accepteur (ratiométrique frette). Cependant, ratiométrique FRET entre deux molécules différentes est difficile, en raison du niveau de la diaphonie et différents fluorescence du donneur et accepteur collets à différents organites et parmi les cellules7,8. FRETTE peut aussi être mesurée de la durée de vie de fluorescence, qui est le temps entre l’excitation et l’émission d’un photon. Si le fluorophore donneur peut libérer son énergie par vous inquiétez pas, ce résultat de processus concurrents dans un apparent raccourcissement de la durée de vie de fluorescence. Cela peut être mesuré par FLIM7,8. Durée de vie frette est beaucoup plus robuste que ratiométrique Frette pour mesurer les interactions entre deux molécules différentes, que la durée de vie de fluorescence est une propriété intrinsèque d’un fluorophore et est insensible à sa concentration. En outre, frette est par approximation quantitative, parce que l’efficacité du FRET est inversement proportionnelle à la sixième puissance de la distance entre les fluorophores donneur et accepteur (essentiellement une fonction en escalier). Par conséquent, en ajustant les histogrammes de durée de vie de fluorescence enregistrés par FLIM avec un modèle de décomposition de deux-composant, frette-FLIM permet l’estimation quantitative (semi-) de la fraction des molécules SNARE participé de formation du complexe SNARE5.
Récemment, il a utilisé cette méthode de la frette-FLIM par Verboogen et al. pour visualiser la formation du complexe SNARE en cellules dendritiques primaires du système immunitaire5. Il a été démontré que lorsqu’il rencontre un stimulus pathogène, cellules dendritiques rediriger leur membrane trafic accompagné d’un complexant accrue de la protéine de membrane vésiculaire associée à R-SNARE (VAMP) 3 avec la syntaxine Qa-SNARE 4 spécifiquement à la membrane plasmique. Cette formation accrue du complexe SNARE est probablement nécessaire pour répondre à la capacité de sécrétion accrue pour la sécrétion de cytokines inflammatoires tels que l’interleukine-6,5. Ce protocole décrit les étapes expérimentales nécessaires à l’acquisition de données de la frette-FLIM pour visualisation et (semi-) mesure quantitative des complexes SNARE.Il est expliqué comment adapter les histogrammes de durée de vie de fluorescence des cellules entières avec des fonctions de décroissance mono et bi-exponentielle, résultant dans la durée de vie de fluorescence apparent comme une estimation quantitative des interactions SNARE. Dans ce protocole, la ligne des cellules HeLa largement utilisé est utilisée à titre d’exemple, mais la méthode peut être facilement étendue pour l’étude des complexes SNARE dans d’autres cellules eucaryotes.
Protocol
1. préparation des échantillons, Microscope
- Expression de la syntaxine Qa-SNARE 4 fondues à mCitrine (syntaxine 4-mCitrine ; fluorophore donneur) et le R-SNARE VAMP3 fondue à mCherry (VAMP3-mCherry)
Remarque : Autres pièges avec des protéines fluorescentes fondues à leurs hélices transmembranaires C-terminal peuvent également être utilisés. Au lieu de mCitrine-mCherry, d’autres paires donneur-accepteur de fluorophores spectralement séparés peuvent également être utilisé (p. ex., PCP-YFP).- La croissance de cellules HeLa et diviser les 900 000 cellules HeLa sur trois 35 mm de diamètre verre bas des plats adaptés pour la microscopie.
Remarque : En principe, le présent protocole peut être adapté pour d’autres types de cellules eucaryotes et les plats de microscopie.- Maintenir les cultures de cellules HeLa dans T75 flacons 10 ml d’hyperglycémie Dulbecco de milieu Eagle modification (DMEM), additionné de 10 % de sérum de veau foetal (FCS) et 1 antibiotique-antimycosiques (contenant l’amphotéricine B, la pénicilline et la streptomycine) à 37 ° C et 5 % CO 2 dans un incubateur de culture cellulaire.
- Reconstituer le milieu deux fois par semaine et fractionner les cellules 01:10 une fois par semaine ou quand les cellules atteignent 85-90 % confluency aux nouveaux flacons T75 (500 000 cellules/fiole, en moyenne).
- Enlevez le DMEM et lavez les monocouches de HeLa deux fois avec 8 mL de stérile saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 3 min.
- Retirer le PBS et ajouter 2 mL de PBS avec l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 2 mM.
- Incuber les cellules pendant 5 min à 37 ° C et 5 % de CO2 dans l’incubateur de culture cellulaire et agiter ensuite doucement le flacon pour séparer les cellules HeLa du fond de la fiole.
- Débusquer les cellules avec 10 mL de milieu, transférer la suspension dans un tube de 15 mL et retirer une quantité de 10 µL de comptage.
- Diluer l’aliquote de 1:1 avec la tache bleu trypan 0,4 % et compter les cellules avec un Bürker hémocytomètre9.
Remarque : Compter deux 4 x 4 places et le nombre de cellules multiple de 10 000 le nombre de cellules/mL. - Après les cellules, prendre 900 000 cellules du tube de 15 mL, divisez-les sur les plats de fond 3 verre (Voir l’étape 1.1.1) et se préparer pour la transfection.
- Transfecter les cellules par électroporation10 (voir la Table des matières) avec syntaxine 4-mCitrine construct (donneur seulement, échantillon #1), syntaxine 4-mCitrine ainsi que VAMP3-mCherry (échantillon #2) et la syntaxine 3 fondue à la fois mCitrine et mCherry () Exemple #3).
Remarque : Les autres méthodes de transfection de cellules peuvent également être utilisée11. Le tandem échantillon #3 est un contrôle positif pour l’estimation la plus courte durée de vie prévisible (c.-à-d., frette prévisible maximale).
- La croissance de cellules HeLa et diviser les 900 000 cellules HeLa sur trois 35 mm de diamètre verre bas des plats adaptés pour la microscopie.
- Culture de que cellules pour la nuit en hyperglycémie DMEM fourni avec 10 % de FCS et 1 % antibiotique-antimycosiques à 37 ° C, avec 5 % de CO2 dans un incubateur de culture cellulaire.
- Aspirer DMEM et laver les cellules avec moyen d’imagerie de cellules vivantes (140 mM NaCl, KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, pH 2,5 mM = 7,4, mOsm = 300 ; voir Table des matières) pendant 2 min et ensuite placer les cellules dans l’imagerie fraîche milieu.
2. enregistrement des données FLIM
- Place échantillon #2 sous un microscope confocal de domaine temporel FLIM avec une source d’excitation puisée pour le fluorophore donneur (par exemple, mCitrine) et d’acquisition de données de résolution temporelle. Garder les cellules à 37 ° C avec une platine chauffante.
Remarque : La microscopie confocale utilisée dans le présent protocole est équipée d’un objectif à immersion d’eau 63 X 1.20 NA, un laser pulsé de lumière blanc (80 MHz pulsation, < durée d’impulsion de 100 ps), un tube de multiplicateur de photon (PMT) et un Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC ) système (voir la Table des matières pour une configuration spécifique utilisée). Autres microscopes FLIM peuvent également être utilisé (p. ex., diodes de single-photon avalanche (SPAD) au lieu de PMT, simple-longueur d’onde des lasers pulsés au lieu d’une lumière blanche lasers à impulsions). - Sélectionnez une cellule avec l’expression visible de la mCitrine et des protéines SNARE marquées mCherry et enregistrer une image confocale de 256 × 256 pixels avec excitation simultanée des deux fluorophores avant chaque mesure de FLIM. Une étape de pixel d’environ 2 fois plus petite que la diffraction limitée la résolution spatiale du microscope (~ 200 nm) doit être utilisé. Pour mCitrine, exciter à 516 nm et recueillir des émissions de 521-565 nm ; pour mCherry, exciter à 610 nm et collecter leurs émissions de 613-668 nm.
Remarque : Ne pas position de l’avion d’imagerie trop près au fond du plat (dans ~ 2 distance µm), comme cela se traduira par un pic de réflexion dans l’histogramme de durée de vie de fluorescence. Excitation simultanée des fluorophores donneur et accepteur est préférable, car cela permet de surmonter le problème potentiel du mouvement de l’échantillon. Cependant, excitation séquentielle peut être utilisée aussi bien. - Enregistrement d’une image FLIM en cliquant sur Exécuter FLIM avec l’image FLIM étant enregistrée avec les mêmes dimensions et la résolution spatiale comme l’image confocale enregistrée à l’étape 2.2. Enregistrer les photons de l’image au moins 50 000 pour l’analyse FLIM cellule entière, ou au moins 400 photons/pixel. Seulement exciter le fluorophore donneur de mCitrine et pas mCherry accepteur fluorophore et ainsi excite à 516 nm et collecter leurs émissions de 521-565 nm.
- Répétez les étapes 2.1 à 2.3 pour plusieurs cellules et pour les autres échantillons #1 (donneur seulement) et échantillon #3 (la construction du tandem de mCitrine-mCherry).
- Enregistrer une fonction de réaction de l’instrument (IRF). Syntonisez le monochromateur du détecteur d’émission à la longueur d’onde d’excitation (p. ex., record d’émission de 510 à 550 nm) et ensuite enregistrer une image FLIM avec le retour de diffusion d’une lamelle de verre propre en cliquant sur le bouton Exécuter FLIM. Utilisez la même longueur d’onde d’excitation (516 nm) et laser de puissance utilisé pour enregistrer les données de la cellule à pas 2.1 à 2.4.
Remarque : Si plusieurs pics sont visibles dans l’IRF ou si les monochromateurs d’émission ne peut être à l’écoute, l’IRF peut également être mesurée avec une solution de colorant fluorescent avec durée de vie ultra rapide, par exemple par extinction de la fluorescence d’un colorant organique en saturée aqueux solution d’iodure de potassium. En outre, il n’est pas strictement requis pour enregistrer un IRF, parce que la pente de décroissance des histogrammes de fluorescence peut être équipée sans déconvolution de la Fri. Cependant, l’IRF permet de corriger pour les caractéristiques de chronométrage du détecteur de photons utilisés et ce qui rend les ajustements des histogrammes durée de vie de plus précis.
3.Conversion des enregistrements Photon aux Images FLIM
- Téléchargez et installez le logiciel de conversion du PT32ICS5.
NOTE : Les données de durée de vie peuvent également être analysées par d’autres logiciels, y compris des logiciels provenant de plusieurs fournisseurs de microscope. - Configurer le logiciel de PT32ICS.
- Définir la taille à la taille de l’image pixel de 256 × 256 via paramètres | Taille.
- Régler le canal à 2 via les paramètres de | Taille.
Remarque : Le canal de l’émission de mCitrine est exclusivement tributaire de la configuration du microscope. Une mauvaise chaîne se traduira par une image FLIM avec aucun photons (c'est-à-direnoir image) et par conséquent un vide « LifetimeTable.txt »-fichier. Le canal approprié peut être identifié par essais et erreurs. - La valeur de sortie pour ImageJ (xyz) (ou TRI2 (xyt)) pour générer des images FLIM (étape 3.4).
- Appuyer sur convertir et charger une ou plusieurs traces de photon (fichiers .pt3). Pour sélectionner plusieurs traces de photon, maintenez la touche Ctrl enfoncée.
NOTE : Le nouveau format de .ptu 64 bits peut aussi être converti. - S’assurer que le logiciel PT32ICS génère les fichiers suivants dans le même dossier qu’où sont enregistrés les fichiers pt3 : une pile de photon par .pt3 trace de photon en format standard d’image cytometry (.ics), fichier d’une image bitmap par .pt3 trace de photon (.bmp), un fichier texte par conversion (_Report.txt) contenant des informations sur les statistiques de photons (c'est-à-dire, le nombre de photons dans chaque trace de photon de .pt3, la résolution de temps du détecteur) et un second fichier texte par conversion (_LifetimeTable.txt) contenant le total histogrammes durée de vie de fluorescence au format délimité par des tabulations pour chaque trace de photon .pt3.
Remarque : Le fichier .ics peut servir de pixel unique afin de générer des images FLIM, par exemple avec TRI2 logiciel12,13 ou la courbe SLIM bibliothèque dans ImageJ Fidji14,15. Ce fichier peut également être utilisé pour phaseur analyse16, par exemple avec le plugin de temps Gated phaseur pour Fidji du Spechron. Le fichier bitmap ne contient aucune information de durée de vie. Le deuxième fichier de texte est utilisé pour l’analyse FLIM de germes entiers à l’étape 4.
4. fixation des histogrammes de durée de vie de Fluorescence pour l’analyse des cellules entières FLIM
Remarque : Cette étape (déconvoluée raccord de l’IRF) nécessite de logiciel capable de raccord déconvoluée. Montage les pentes des histogrammes de fluorescence sans déconvolution de l’IRF peut être fait avec d’autres logiciels aussi bien.
- Ouvrez le programme de logiciel d’analyse de données capable de s’intégrer déconvolution (Table des matières) et importer le fichier texte contenant l’histogramme pour chaque trace de photon (_LifetimeTable.txt) via fichier | Importation | Simple ASCII.
- Réorganiser la table telle que l’IRF est dans la deuxième colonne de la table (en utilisant le copier / coller). Placer l’IRF dans la deuxième colonne B regard les valeurs de temps dans la première colonne A.
- Déterminer la qualité des traces enregistrées photon en sélectionnant toutes les colonnes en appuyant sur Ctrl + A et en sélectionnant parcelle | MultiPanel | panneau de 9. Ne pas analyser les traces de photons avec une crête de haute réflexion (Figure 4F).
- Sélectionnez toutes les colonnes contenant les histogrammes de contrôle de la qualité de vie qui seront montés ainsi que de l’IRF dans la colonne B en utilisant Ctrl -clés et chargement le montage non linéaire via analyse | Montage | Ajustement de la courbe non linéaire | Ouvrez la boîte de dialogue.
- Charger la fonction fit déconvoluée (disponible dans le fichier complémentaire 1) en ajoutant cette fonction dans le logiciel d’analyse (par l’intermédiaire de catégorie | Définies par l’utilisateur | Fonction | Ajouter). Sélectionnez le fichier fit fonction « FLIM_convoluted_IRF.fdf ». Cette fonction s’adapte les histogrammes de durée de vie de fluorescence avec une fonction de décroissance exponentielle mono déconvolutée avec la Fri (c.-à-d., la deuxième colonne B dans le tableau) (équation 1) :
(Équation 1)
avec t le temps, τ la fluorescence apparente à vie, A l’amplitude et y0 l’offset.
Remarque : Une autre option consiste à adapter les histogrammes à vie avec une bi-ajustement exponentielle (équation 2) :
(Équation 2)
En fixant la durée de vie de la composante lente (τ1) à la seule condition de donateurs (étape 1.1.2 : échantillon #1) et que de la composante rapide (τ2) à la construction de tandem (échantillon #3), cela permet d’estimer la fraction de Protéines SNARE dans complexe (F) d’amplitudes des composantes rapides (A2; voir Discussion; et lente (A1) Équation 3) :
(Équation 3)
Le fichier de fonction ajustement pour raccord bi-exponentielle déconvoluée « FLIM_convoluted_IRF_biexp.fdf » est disponible dans le dossier complémentaire 2. - Sélectionnez monté courbes | X Type de données comme même comme données d’entrée.
Remarque : Cela se traduira par l' approprié x-axe graduation des courbes ajustées. - Ajuster les courbes en appuyant sur la forme.
Remarque : Cela convertira l’ajustement et générer une « feuille de rapport » dans le tableau avec un tableau contenant les durées de vie de fluorescence, décalages et amplitudes. Il générera également une feuille de données avec les courbes ajustées et les résidus de l’ajustement.
(Équation 1)
(Équation 2)
(Équation 3)Representative Results
La raison d’être de l’essai pour la mesure des interactions SNARE par frette-FLIM est illustré à la Figure 1. Les extrémités C-terminales des hélices transmembranaires des apparentés protéines SNARE sont fusionnées à une paire de spectralement décalés protéines fluorescentes (p. ex., mCitrine et mCherry). La formation d’un cis-caisse claire complexes sur les résultats de fusion membranaire dans ces protéines fluorescentes devenant immédiatement juxtaposés les uns aux autres et vous inquiétez pas. La figure 2 montre les images confocales représentant des cellules HeLa exprimant des protéines SNARE fluorescent marquées. Montré une cellule expriment la syntaxine 4-mCitrine (fluorophore donneur) avec VAMP3-mCherry (accepteur fluorophore), ainsi que des conditions de contrôle des cellules exprimant uniquement la syntaxine 4-mCitrine construct (donneur seulement ; aucune frette) et syntaxine 3 fondues à deux mCitrine et mCherry en tandem (FRET prévisible maximale). La figure 3 montre les images FLIM générées en ajustant les histogrammes de durée de vie de chaque pixel avec fonctions de décroissance exponentielle-mono (Figure 3 a–B) et (décroissance exponentielle-bi) fonctions et accompagnement durée de vie de fluorescence Figure 3 - D). Figure 4 a montre la Fri de notre installation mesurée par la diffusion d’une lamelle couvre-objet microscope arrière. Figure 4 b–E, histogrammes vie représentatif de fluorescence de la cellule entière analyse FLIM avec accompagnement fit courbes pour des fonctions de décroissance exponentielle-mono sont divulgués. Figure 4F montre un histogramme fluorescent de durée de vie d’une expérience imagé trop près de la surface de la vitre de couverture de microscope, ce qui entraîne un pic de réflexion important. La figure 4 montre un histogramme de la durée de vie représentant dotée d’une fonction de décroissance exponentielle-bi.
Figure 1 : schéma de la raison d’être de visualisation complexes SNARE par FRET. (A) modèle de structure de la protéine de membrane vésiculaire associée à collets (protéine de base de données 3HD717) neuronale (VAMP) 2 (bleu ; R), syntaxine 1 (rouge ; Qa-SNARE) et SNAP25 (vert ; contient les deux un motif Qb - et Qc-SNARE). L’extrémité C-terminale de l’hélice transmembranaire de la syntaxine-1 se sont réuni à mCitrine (fluorophore donneur ; protéine de base de données 3DQ118). L’extrémité C-terminale de la hélice transmembranaire de VAMP2 est conjugué à la mCherry (accepteur fluorophore ; protéine de base de données 2H5Q19). (B) régime de SNARE médiée par fusion membranaire, aboutissant à la frette. Après la fusion membranaire par formation d’un cis-complexe SNARE, les embûches sont immédiatement juxtaposés les uns aux autres, aboutissant à la frette. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Expression de protéines SNARE fusionnée à protéines fluorescentes. Première colonne : fluorophore donneur, excité à 516 nm. Deuxième colonne : accepteur fluorophore, excité à 610 nm. (A) donneur seulement condition. Image confocale représentative d’une cellule HeLa exprimant la syntaxine 4-mCitrine (fluorophore donneur ; vert en fusion). Le canal de l’accepteur ((deuxième colonne) indique la fluorescence diaphonie. (B) témoin négatif (sans frette). Image confocale représentative d’une cellule HeLa exprimant les deux syntaxine 4-mCitrine avec VAMP3-mCherry (accepteur fluorophore ; magenta en fusion). (C) contrôle positif (FRET prévisible maximale). Construction d’image confocale représentative d’une cellule HeLa exprimant la syntaxine 3-mCitrine-mCherry tandem. Notez que le signal de fluorescence de la mCitrine et la mCherry des signaux n’est pas complètement chevauchement, probablement en raison d’une faible résistance de mCitrine à la dégradation lysosomiale comparée à mCherry (voir la section « Discussion »). BF : champ lumineux. Échelle de barres, de 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : images FLIM de formation du complexe SNARE. (A) images de vie représentatif de fluorescence des cellules illustrés à la Figure 2. Les images ont été générés par la première conversion les traces de photons enregistrés par un système TCSPC (.pt3) à la norme image cytometry (.ics) en utilisant le logiciel PT32ICS. Seul pixel muni de durée de vie de fluorescence images étaient ensuite générés à l’aide la TRI2 logiciel12,13 avec seuil de 15 à 100 % d’intensité, 7 pixel binning circulaire et de l’algorithme d’ajustement monoexponentielle (Marquardt). La couleur indique la durée de vie du fluorescente apparente moyenne. (B), FLIM images où les images de durée de vie de fluorescence (indiqué sur le panneau A) ont été compliquées avec les intensités de fluorescence du fluorophore donneur mCitrine (voir Figure 2). Le produit de convolution s’est déroulée avec ImageJ Fidji à l’aide d’une macro sur mesure (voir Table des matières). (C) durée de vie de Fluorescence et d’images FLIM de la cellule HeLa exprimant la syntaxine 4-mCitrine et VAMP3-mCherry de panneaux A-B, mais maintenant avec raccord avec des courbes de décroissance exponentielle-bi (avec des durées de vie fixes les conditions de contrôle ; voir étape 4,4 po Protocol). Les couleurs des pixels indiquent les fractions estimées F de la syntaxine 4 complexe avec VAMP3 (équation 3). (D) identique au groupe B, mais pour le bi-exponentielle bon. Le produit de convolution s’est déroulée avec ImageJ Fidji à l’aide d’une macro sur mesure (voir Table des matières). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : toute cellule analyse FLIM. (A) la fonction de réponse d’instrument (IRF) de l’installation. L’IRF a été mesurée avec le retour de la diffusion sur l’interface verre-eau (à l’aide d’un plat de microscopie de verre propre contenant de l’eau).(B–E) Toute cellule histogrammes à vie pour les cellules illustrés à la Figure 2 et Figure 3. On a regroupé tous les photons présents dans les images. Les courbes ont été déconvolutés avec l’IRF et équipés de fonctions de décroissance exponentielle-mono (équation 1). Pour ces cellules, les durées de vie de fluorescence ont été obtenues de 2,82 ns (cellules exprimant la syntaxine seul 4-mCitrine ; donneur seulement ; panneau B), 2.09 ns (cellules exprimant conjointement syntaxine 4-mCitrine avec VAMP3-mCherry ; panneau C) et 2,08 ns (les cellules exprimant la syntaxine 3 - mCitrine-mCherry tandem construire ; contrôle FRET prévisible maximal ; panneau D). Les incrustations montrent les mêmes graphiques, mais maintenant, avec la mise à l’échelle logarithmique de l’axe y. Panneau E montre une superposition de la courbe de décroissance des panneaux B.-D. (F) exemple d’un histogramme de fluorescence lifetime enregistré trop près de la surface de la lamelle de microscope. Cela se traduit par un pic de grande réflexion (représenté par la zone ombrée jaune). (G) même dans le groupe C, mais maintenant raccord avec une courbe de décroissance exponentielle bi avec les durées de vie fixe les conditions de contrôle (Voir l’étape 4.4 de protocole). Les amplitudes des composantes de (A2) lentes et rapide (A1) étaient respectivement 14.42 et 0,01, résultant en une fraction estimée de collets en complexe F de 0,99 (équation 3). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Fichier complémentaire 1. Fichier de fonction FLIM_convoluted_IRF s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Fichier complémentaire 2. Fichier de fonction FLIM_convoluted_IRF_biexp s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
Ce protocole illustre l’utilisation de la frette-FLIM pour la visualisation des interactions de SNARE entre syntaxine 4 et VAMP3 dans des cellules HeLa vivantes. 4 syntaxine est une protéine de Qa-SNARE localisation principalement à la membrane plasmique où il intervient dans l’exocytose1,2,20,21. VAMP3 est un R-SNARE qui est principalement décrite pour localiser à compartiments endosomes de recyclage et intervient dans le trafic d’autres endosomes, aussi bien quant à la membrane plasmique1,2,20. Toutefois, le dosage de la frette-FLIM peut être facilement adapté pour l’étude des autres protéines SNARE. La seule condition est que ces futs contiennent une hélice transmembranaire C-terminal, qui est le cas pour la plupart des protéines SNARE par extrême1,2. En outre, le protocole décrit ici peut être adapté pour la visualisation des complexes SNARE dans n’importe quel type de cellule eucaryote, y compris les plantes et la levure. Dans ce protocole, nous avons utilisé le raccourcissement de la durée de vie de fluorescence du fluorophore donneur en guise de frette. Comme une approche complémentaire, la durée de vie du fluorophore accepteur a pu être examinée, car l’émission sensibilisée provoque une phase d’augmentation qui apporte la preuve sans ambiguïté ce transfert d’énergie de résonance se produit.
Actuellement, la technique de la frette-FLIM peut être pas en mesure de visualiser les complexes SNARE en compartiments lysosomes. Pour la construction de 3-mCitrine-mCherry tandem syntaxine, la fluorescence mCherry peut souvent être trouvée plus accumulée dans une zone de substance, qui correspond probablement à compartiments lysosomes, tandis que le signal de mCitrine est plus abondant dans le cellulaire 5de périphérie. Une accumulation de juxtanucléaire semblable de mCherry par rapport à mCitrine a été observée, lorsque les mêmes protéines SNARE fusionnées à ces protéines fluorescentes ont conjointement exprimé5. Lysosomes sont caractérisés par un faible pH (< 4) et une forte activité des enzymes protéolytiques. L’accumulation de la substance de mCherry est probablement dû à une plus grande résistance du fluorophore mCherry à la dégradation lysosomiale contre le fluorophore de mCitrine. Il n’est pas à cause de pH-trempe de mCitrine, comme l’accumulation de la substance de mCherry se produit également lors de la fixation des cellules5. Ainsi, la technique de la frette-FLIM sous-estime la quantité de FRET dans les régions (lysosomes) juxtanucléaire et cela nécessiterait d’autres protéines fluorescentes journaliste qui survivent aux conditions rigoureuses dans les lumières des lysosomes.
FRETTE-FLIM en principe permet d’obtenir une estimation quantitative (semi-) de la fraction des pièges dans le complexe5. Comme nous l’avons expliqué dans le présent protocole, cela nécessite le montage des histogrammes de durée de vie de fluorescence avec fonctions de décroissance exponentielle double (équation 2), où l’amplitude de la composante rapide est proportionnel à la fraction de collets dans (complexe Équation 3). Cependant, ce montage avec un modèle à deux composants est techniquement difficile. Montage avec plusieurs paramètres de forme libres (deux durées de vie de fluorescence et deux amplitudes) nécessite un très grand nombre de photons, surtout depuis les paramètres influenceront mutuellement et de petites erreurs dans la vie aura une incidence sur les amplitudes et vice versa. Pour résoudre ces problèmes de montage, les durées de vie de fluorescence de la composante lente peuvent être fixées sur la durée de vie de la seule condition de donateurs (c.-à-d.aucune frette ; seulement mCitrine présent) et celle de la composante rapide de la durée de vie du tandem construire) FRETTE prévisible maximale). Toutefois, cela devrait aussi être interprété avec précaution, car les durées de vie de fluorescence peuvent être pas les mêmes que dans ces États de contrôle et pourraient s’écarter pour des raisons multiples (extinction automatique, orientation de dipôle, variations dans le microenvironnement). Plusieurs complexes SNARE à proximité (< 10 nm) peuvent entraîner frette dépendant de la distance, le même principe qui permet à frette être utilisé comme un « dirigeant moléculaire », mais dans ce cas, obscurcit la quantification des complexes SNARE. En outre, une estimation quantitative n’est pas toujours explicite, parce que les embûches étiquetées concurrencent endogènes SNAREs (sans étiquette). En conséquence, le niveau d’expression de SNARE marqué mCherry est des principaux déterminants pour le pourcentage de frette5. En raison de toutes ces mises en garde, il est recommandé de monter les histogrammes fluorescent à vie avec une fonction de décroissance exponentielle-mono (équation 1). Cela a l’avantage qu’il ne nécessite aucune connaissance a priori des durées d’et la vie de fluorescente moyenne apparente résultante fournit une mesure solide pour SNARE complexants5.
Néanmoins, il est prévu que l’imagerie quantitative frette-FLIM de deux-composant de montage modèles auront des applications futures puissantes. SNARE-codage gènes dans les chromosomes peuvent être fusionnés avec des protéines fluorescentes reporter, par exemple par CRISPR/CAS9. Cela se traduit par le marquage fluorescent de protéines SNARE endogènes, avec des niveaux de protéine endogène et aucun fond de collets sans étiquette et permet ainsi une estimation quantitative significative de la fraction des complexes SNARE par frette-FLIM. Tandis que les niveaux d’expression de collets endogènes peuvent être assez faible et donner relativement faibles signaux fluorescents, il est prévu qu’un nombre suffisant de photons peut être obtenu, en particulier pour la cellule entière FLIM (qui nécessite seulement quelques 1,000 s de photons). En outre, ces mesures de la frette-FLIM peuvent être réalisées avec des détecteurs photodiode avalanche plus sensibles qui seront traduira également par des signaux de fluorescence plus élevés et de meilleures statistiques de photon.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une bourse de Hypatia de la Radboud University Medical Center, une bourse de développement de carrière de la Human Frontier Science Program, la Gravitation Programme 2013 de l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO ; ICI-024.002.009), un VIDI subvention du NWO (ALW VIDI 864.14.001) et une subvention de démarrage depuis le Conseil européen de recherche (CER) au titre du septième Programme-cadre de l’Union européenne (Grant entente numéro 336479).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid DNA 'syntaxin 4-mCitrine' | Addgene | ID 92422 | Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP). |
| Plasmid DNA 'VAMP3-mCherry' | Addgene | ID 92423 | Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP). |
| Plasmid DNA 'syntaxin 3-mCitrine-mCherry' | Addgene | ID 92426 | Positive control for maximum achievable FRET. |
| Hela cells | |||
| 35 mm glass bottom dishes | Willco Wells | HBST-3522 | Other live cell imaging chambers will work as a substitute |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco, Life Technologies | 31966-021 | |
| Fetal calf serum | Greiner Bio-one | 758093 | |
| Antibiotic-antimycotic solution | Gibco, Life Technologies | 15240-062 | Pen/Strep will work as a substitute |
| Live cell imaging medium | Thermo Fisher Scientific | A14291DJ | Any other live cell imaging solution will work, as long as fluorescence from the medium is prevented |
| Leica SP8 confocal microscope with a 63x 1.20 NA water immersion objective | Leica | SP8 | Other confocal microscopes capable of time-domain FLIM can also be used |
| Pulsed white light laser | Leica | SP8 | Other pulsed laser sources can also be used |
| Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system | PicoQuant | PicoHarp 300 | |
| PT32ICS conversion software | Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com | ||
| data analysis software programme capable of deconvolution | Originlabs | OriginPro 2016 | |
| Fiji ImageJ | |||
| Custom-made Fiji ImageJ macro for convolution of FLIM image with Intensity | Fiji ImageJ | Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com | |
| Bürker Haemocytometer | VWR | 630-1541 | |
| HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| PBS | B Braun Melsungen AG | 362 3140 | |
| EDTA 2 mM | Merck | 108417 | CAS: 60-00-4 |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-one | 188271 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | 93595 | CAS: 72-57-1 |
| NEON cell electroporation device | Thermo Fisher Scientific | MPK5000S |
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