Summary

Zika virüs belirli tanılama Epitope bulma

Published: December 12, 2017
doi:

Summary

Bu protokol için bir yüksek yoğunluklu peptid Mikroarray kullanarak Zika virüs belirli tanılama peptidler keşfetmek için bir teknik açıklar. Bu iletişim kuralı readly ortaya çıkan diğer bulaşıcı hastalıklar için adapte edilebilir.

Abstract

Yüksek yoğunluklu peptid microarrays tek standart mikroskobu slaytta altı binden fazla peptidler tarama sağlar. Bu yöntem ilaç bulma, terapötik hedef tanımlama ve geliştirme için uygulanabilir teşhis. Burada, belirli Zika virüs (ZIKV) tanı peptidler yüksek yoğunluklu peptid Mikroarray kullanarak keşfetmek için bir protokol mevcut. ZIKV enfeksiyon 3,423 benzersiz 15 doğrusal amino asit (aa) kalıntıları bir 14-aa kalıntısı örtüşme ile tercüme tüm ZIKV protein içeren bir yüksek yoğunluklu peptid Mikroarray ile inkübe için doğrulanmış bir insan serum örneği içinde yinelenen baskılı. Aynı dizi içinde farklı ikincil antikorlar ile boyama, immünglobulin M (IgM) ve immünoglobulin G (IgG) antikor serum içinde mevcut bağlayabilirsiniz peptidler tespit ettik. Bu peptidler daha fazla doğrulama denemeleri için seçildi. Bu protokol için tasarım, işlemek ve yüksek yoğunluklu peptid Mikroarray çözümlemek için takip strateji tanımlarlar.

Introduction

Vektörel çizimler, dağılım ve belirtiler Dang Chikungunya virüsü enfeksiyonu ve1ile paylaşır çünkü Zika virüs (ZIKV) tanı klinik belirtiler dayalı meydan okuyor. Olumsuz gebelik çıktıları gebelik sırasında ZIKV ile enfekte kadınlarda için risk göz önüne alındığında, 3 virüs arasında ayırt etmek önemlidir. Geçerli moleküler tanı testleri belirli olmasına rağmen onlar sadece akut enfeksiyon2,3nispeten kısa dönemde kan ya da tükürük yararlıdır. Serolojik deneyleri enfeksiyon4bu başlangıç dönemi dışında tanı için gereklidir.

ZIKV belirli serolojik tahlil gelişimi iki nedenden dolayı zordur: ilk olarak, insan bağışıklık sistemi yanıt Zika antijenleri şu anda bilinmemektedir; ve ikincisi, korunmuş flaviviruses amino asit dizileri antikor olan teşvik. Hedefimiz işlem Tanı’daki kullanılmak üzere benzersiz ZIKV belirli peptidler keşfetmek oldu. FAJ, bakteriyel, dahil olmak üzere tüm proteinler kapsayan ekran peptid kitaplıkları için farklı yaklaşımlar geliştirilmiştir ve Maya yüzey görüntülemek5,6,7,8,9, 10. Hızlı ve ucuz yüksek üretilen iş serolojik gösterimleri11,12 izin veren bir yüksek yoğunluklu peptid Mikroarray kullanmak bizim strateji olmuştur ve daha sonra belirlenen peptidler geçerli serolojik geliştirmek için kullanılabilir deneyleri ZIKV enfeksiyon algılanması için.

Bu iletişim kuralı bir yüksek yoğunluklu peptid Mikroarray (şekil 1) kullanarak Zika virüs belirli tanılama peptidler keşfi sağlar. Yüksek yoğunluklu peptid Mikroarray peptid lazer baskı teknolojisi kullanılarak üretilmiştir. 3,423 amino asit kalıntıları eklenmesi ile oluşan tüm ZIKV protein sıra tabanlı Fransız Polinezya strain (GenBank: KJ776791.2), 14 amino asit kalıntılarında için yinelenen bir çakışma ile 15 doğrusal kalıntılarının bloklar halinde standart cam slayt üzerinde yazılı bir Toplam 6,846 peptid noktalar. Tüm Zika protein sıra peptidler yanı sıra Mikroarray grip hemagglutinin kullanır (HA) peptidler iç kontrol için.

Bir Zika olumlu Wadsworth Merkezi’nden (Albany, NY), elde edilen serum örneği belirli immünglobulin M (IgM) ve immünoglobulin G (IgG) Reaktif peptidler tanımlamak için kullanılan geçerliliği. Örnek ile gecede kuluçka sonra Mikroarray bir ikincil fluorochrome konjuge antikoru (Anti-insan IgM veya anti-insan IgG) ile lekeli ve Mikroarray tarayıcı üzerinde analiz. Miktar spot yoğunluklarda ve peptid ek açıklama Mikroarray üretilen aynı şirket tarafından sağlanan özel bir yazılım ile gerçekleştirildi.

Protocol

Bu veri, New York University College, diş hekimliği bir devam eden araştırma parçasıdır ve New York Üniversitesi Tıp Fakültesi, IRB kurumsal inceleme kurulca onaylanmış # H10-01894. Bu çalışmada kullanılan klinik örnekler daha önce kullanılan tanı ve izinle üzerinden Wadsworth Center, New York Dışişleri Bakanlığı Sağlık, Albany, NY de-tespit edildi. 1. ZIKV yüksek yoğunluklu peptid Mikroarray slayt yükleme içinde belirli bir kuluçka tepsi Cam slayt p…

Representative Results

Açıklanan protokolü kullanılarak elde edilen sonuçları Şekil 2 ‘ de gösterilen ve şekil 3. Hiçbir arka plan etkileşimleri Mikroarray ikincil Anti-insan IgM (veri gösterilmez) ile önceden boyama zaman kaydedilmiştir. Anti-bir insanla IgM boyama eşlenik yukarıda arka plan yeşil Floresans yoğunluklarını, IgM ile Bu peptidler (Şekil 2) ana bilgisayar serum örneğind…

Discussion

Biz tüm Zika virüs protein (Fransız Polinezya zorlanma) sıra içeren bir yüksek yoğunluklu peptid Mikroarray kullanan bir iletişim kuralı tasarlanmıştır. Mikrodizi yazdırma 3,423 farklı örtüşen doğrusal peptidler tarafından üretildi. Her peptid 15 amino asitler yapıldı ve onun en yakın komşu sırada (Yani, 14 kalıntı örtüşme) üzerinden tek bir kalıntı tarafından çeşitli. Daha kısa örtüştüğü yazdırılabilmesi için epitope eşleme ile uzun örtüştüğü daha kesin olsa …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Geçerli destek NIDCRR44 DE024456 bir SBIR (küçük iş yenilik araştırma) yönetim ek grant tarafından sağlanır. NIDCR dışında gelişti NIDCR HIV verme doğrulayıcı bir bakım noktası kontrol kalkınma HIV U01 DE017855 verin. Biz minnetle kabul Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) onun teknik yardım ve tür destek için. Ayrıca NYU Langone Tıp Merkezi LI-COR Odyssey görüntüleme sistemi için teşekkür ediyoruz.

Materials

PEPperCHIP Custom Peptide Microarray PEPperPRINT PPC.001.001 Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence
PEPperCHIP incubation tray 3/1 PEPperPRINT PPC.004.001
PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling) PEPperPRINT PPC.037.002
PepSLide Analyzer PEPperPRINT PSA.004.001 14-days free License for Windows
Rockland Blocking buffer Rockland MB-070
anti-human IgM (mu chain) DyLight 800 Rockland 609-145-007
anti-human IgG Fc DyLight 680 Thermo Scientific SA5-10138
LI-COR Odyssey Imaging System LI-COR
Orbital shaker device IKA MTS 2/4 digital microtiter shaker
Adobe Illustrator Adobe
Deltagraph Redrocks

References

  1. Kelser, E. A. Meet dengue’s cousin. Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).
  2. Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).
  3. Siqueira, W. L., et al. Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus. Oral Health. , (2016).
  4. Duarte, G. Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women. Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).
  5. Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
  6. Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery. Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).
  7. Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera. Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).
  8. t Hoen, P. A., et al. Phage display screening without repetitious selection rounds. Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).
  9. Townend, J. E., Tavassoli, A. Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli. ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).
  10. Turchetto, J., et al. High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery. Microbial Cell Factories. 16 (1), 6 (2017).
  11. Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features. Plos One. 7 (12), e50748 (2012).
  12. Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome. PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330 (2017).
  13. Basile, A. J. Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus. J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).
  14. Madden, T. The BLAST Sequence Analysis Tool. The NCBI Handbook. , (2013).
  15. Services, U. S. D. o. H. a. H. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , (2009).
  16. Pellois, J. P., et al. Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips. Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).
  17. Stafford, P., et al. Physical Characterization of the “Immunosignaturing Effect”. Mol Cell Proteomics. 11 (4), (2012).
  18. Gardner, T. J., et al. Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein. Nat Commun. 7, (2016).
  19. Nixon, C. E., et al. Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1. Clin Vaccine Immunol. , (2017).

Play Video

Cite This Article
Sabalza, M., Barber, C. A., Abrams, W. R., Montagna, R., Malamud, D. Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery. J. Vis. Exp. (130), e56784, doi:10.3791/56784 (2017).

View Video