Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Ftaalzuur Ester-Binding DNA Aptamer selectie, karakterisering en toepassing aan een elektrochemische Aptasensor

Published: March 21, 2018 doi: 10.3791/56814
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 2, 1
1Department of Chemistry, Capital Normal University, 2College of Life Sciences, Capital Normal University
* These authors contributed equally

Summary

Een protocol voor de in vitro selectie en karakterisering van groepsspecifieke ftaalzuur ester-binding DNA aptamers wordt gepresenteerd. De toepassing van de geselecteerde aptamer in een elektrochemische aptasensor is ook inbegrepen.

Abstract

Ftaalzuur esters (PAEs) areone van de grote groepen van persistente organische verontreinigende stoffen. De groepsspecifieke detectie van PAEs is zeer gewenst als gevolg van de snel groeiende van congeneren. DNA aptamers zijn steeds meer toegepast als erkenning elementen op biosensor platformen, maar selecteren aptamers richting zeer hydrofobe klein molecuul doelen, zoals PAEs, is zelden gerapporteerd. Dit werk beschrijft een kraal gebaseerde methode ontworpen om te selecteren groepsspecifieke DNA aptamers aan PAEs. De aminogroep matiemaatschappij dibutylftalaat (DBP-NH2) zoals het anker doel werd gesynthetiseerd en geïmmobiliseerd op de epoxy-geactiveerde agarose parels, waardoor de weergave van de ftaal ester-groep aan het oppervlak van de immobilisatie-matrix, en Daarom is de selectie van de groepsspecifieke bindmiddelen. Wij vastbesloten de dissociatieconstanten van de aptamer kandidaten door kwantitatieve polymerisatie kettingreactie van magnetische scheiding wordt gekoppeld. De relatieve affiniteiten en de selectiviteit van de aptamers aan andere PAEs werden bepaald door de concurrerende testen, waar de aptamer kandidaten waren vooraf begrensd aan de DBP-NH2 aangesloten magnetische kralen en vrijgegeven aan het supernatans dat na incubatie met de geteste PAEs of andere potentieel storende stoffen. De concurrerende assay werd toegepast omdat het verstrekt een vergelijking van de facile affiniteit tussen PAEs die had geen functionele groepen voor oppervlakte immobilisatie. Tot slot, wij aangetoond van de fabricage van een elektrochemische aptasensor en gebruikt voor ultrasensitive en selectieve detectie van bis(2-ethylhexyl) ftalaat. Dit protocol biedt inzichten voor de ontdekking van de aptamer van andere hydrofobe kleine moleculen.

Introduction

Samen met de snelle economische ontwikkeling is versnelling van de industrialisatie en de bouw van het stedelijk, milieuvervuiling ernstiger dan ooit. Typische milieuverontreinigende stoffen zijn zware metaal ionen, toxinen, antibiotica, bestrijdingsmiddelen, hormoonontregelaars en persistente organische verontreinigende stoffen (POP's). Naast metaalionen en toxines, andere verontreinigende stoffen zijn kleine moleculen dat heel vaak bestaan uit een verscheidenheid van congeneren. De meest giftige POP's bijvoorbeeld polychloorbifenylen (PCB's), polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK's), bifenyl polybroomdifenylethers (PBDE's), polychloordibenzo-p-dioxines (PCDD's), polychloorbifenylen polychloordibenzofuraancongeneren (PCDF's), en ftaal esters van (PAEs)1,2, die alle bestaan uit vele congeneren. Klein molecuul detectie is voornamelijk uitgevoerd door chromatografie/massa spectrometrie gebaseerde technieken als gevolg van hun verscheidenheid van toepassingen3,,4,,5,6. Voor on-site detecties, hebben antilichamen gebaseerde methoden onlangs ontwikkelde7,8,9. Echter, aangezien deze methoden zeer specifiek voor een bepaalde congeneer zijn, meerdere proeven moeten worden uitgevoerd. Wat ernstiger is, is dat de roman congeneren zo snel groeien dat hun antilichamen kunnen niet worden gegenereerd in de tijd. Dus, de ontwikkeling van groepsspecifieke biosensoren te controleren van het totale gehalte aan alle congeneren in één test kan voorzien in een onschatbare waarde metric milieuvervuiling status beoordelen.

Onlangs, nucleic zuur aptamers wijd zijn toegepast als erkenning elementen in verschillende biosensing platformen als gevolg van hun vermogen van de erkenning van een grote verscheidenheid van doelen, van ionen en kleine moleculen aan eiwitten en cellen10,11 ,12. Aptamers worden geïdentificeerd door middel van een in vitro -methode aangeroepen systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking (SELEX)13,14. SELEX begint met de willekeurige synthetische enkele streng oligonucleotide bibliotheek, die ongeveer 1014-1015 fragmenten bevat. De grootte van de willekeurige bibliotheek zorgt ervoor dat de diversiteit van de RNA of DNA kandidaat-structuren. Het typische SELEX proces bestaat uit meerdere rondes van verrijking totdat de bibliotheek is verrijkt met sequenties met hoge affiniteit en specificiteit naar het doel. Het laatste verrijkt zwembad is dan sequenced en de dissociatieconstanten (Kd) en selectiviteit tegen potentieel storende stoffen worden bepaald door verschillende technieken zoals filteren bindend, chromatografie van de affiniteit, oppervlakte Plasmon resonantie (SPR), enz. 15

Vanwege de extreem slechte water oplosbaarheid en gebrek aan functionele groepen voor oppervlakte immobilisatie is de selectie van de aptamer van POP's theoretisch moeilijk. Significante vooruitgang voor SELEX hebben versneld van de ontdekking van aptamers. Echter, de selectie van groepsspecifieke aptamers voor POP's heeft nog niet is gerapporteerd. Tot nu toe geweest alleen PCB-bindende DNA aptamers met hoge specificiteit voor een bepaalde congeneer geïdentificeerde16. PAEs worden hoofdzakelijk gebruikt in polyvinylchloride materialen, polyvinylchloride van een hard plastic omzetten in een elastische kunststof, dus die fungeert als een weekmaker. Sommige PAEs zijn geïdentificeerd als endocriene verstoorders, kan ernstige schade veroorzaken aan de lever en nierfunctie, beperken de beweeglijkheid van de mannelijke zaadcellen, en kan resulteren in abnormale sperma morfologie en testiculaire kanker17. De compound- noch groepsspecifieke PAE-bindende aptamers zijn gemeld.

Het doel van dit werk is bedoeld als een representatieve protocol voor het selecteren van groepsspecifieke DNA aptamers met zeer hydrofobe kleine molecules zoals PAEs, een representatieve groep van POP's. We tonen ook de toepassing van de geselecteerde aptamer voor milieuvervuiling opsporen. Dit protocol biedt begeleiding en inzichten voor de ontdekking van de aptamer van andere hydrofobe kleine moleculen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bibliotheek en Primer Design en synthese

  1. De eerste bibliotheek en inleidingen ontwerpen.
    Bibliotheek (groep0): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-N40-CCTTTCTGTCCTTCCGTCAC-3'
    Toekomen primer (FP): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-3'
    Phosphorylated omgekeerde primer (PO4- RP): 5'-PO4- GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3'
  2. Synthetiseren zwembad0, FP en PO4- RP met behulp van standaard phosphoramidite chemie18,19,20, en te zuiveren van alle de ANI's door standaard krachtige vloeibare chromatografie (HPLC)21.
  3. Reconstrueren zwembad0, FP en PO4- RP in rang nuclease-gratis water op 100 µM, aliquoot, en bewaar ze op -20-80 ° c voor maximaal één jaar.
    Opmerking: Het wordt sterk aangeraden om te slaan zwembad0, FP en PO4- RP in 10-20 µL porties om te voorkomen dat mogelijke kruisbesmetting.

2. het synthetiseren van de anker-Target en haar immobilisatie op Epoxy-geactiveerde Agarose kraal

  1. Synthetiseren de aminogroep matiemaatschappij dibutylftalaat (DBP-NH2) als het doel van het anker.
    Opmerking: De experimentele details op de synthese en de karakterisering van DBP-NH2 zijn beschreven in de literatuur22.
  2. Bereid het anker stamoplossingen van het doel in een medium geschikt is voor de oplosbaarheid van de doelgroep. Voor deze studie, bereiden 100 mM DBP-NH2 stockoplossing in dimethylsulfoxide (DMSO) en bewaren van de oplossing bij 4 of -20 ° C gedurende maximaal één jaar.
  3. Immobiliseren DBP-NH2 op epoxy-geactiveerde agarose kralen volgens een gewijzigde protocol van de fabrikant.
    1. Weeg op 0,1 g gevriesdroogde poeder van epoxy-geactiveerde agarose kralen en schorten in gedestilleerd water. Het wassen van het medium voor 1 h met behulp van 20 mL gedestilleerd water toegevoegd in verschillende porties. Het medium met 0,2 M Na2CO3 (pH 12) wassen.
      Opmerking: Het medium zwelt onmiddellijk na het toevoegen van het water erin.
    2. DBP-NH2 (46.7 mg, 0,15 mmol) los in de 500 µL koppeling buffer (0,2 M Na2CO3 buffer).
    3. Meng de oplossing van de koppeling met de ligand met het medium. Gebruik een shaker bij 5 omwentelingen per minuut gedurende 48 uur bij kamertemperatuur.
    4. Herhaal wassen het product drie keer achter elkaar met 0,1 M acetaat buffer (0.5 M NaCl, pH 4,5) en 0,2 M carbonaat buffer (0.5 M NaCl, pH 12) in elk wasprogramma. Wassen en het product in water om het uiteindelijke volume van 500 µL op te schorten.
    5. Het produkt bij 4 ° C vóór gebruik opslaat.
    6. Bevestig het succes van de doel-immobilisatie door de elementaire analyse.

3. SELEX

  1. Bereiden van 500 mL voor PAE bindende buffer in ultra puur water of water van de nuclease-gratis rang met 20 mM Tris· HCl, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1% polyoxyethy-lene (20) sorbaitan Propyleenglycolmonolauraat en 0,03% niet-ionogene oppervlakte-actieve agent (pH 7,9). Filtreer de buffer door een steriele 0,22 µm nitrocellulose filter en sla deze op een temperatuur hoger dan 20 ° C voor maanden.
    Opmerking: Het is essentieel om de status van een goede spreiding van PAEs in PAE bindende buffer te handhaven. Meerdere soorten oppervlakteactieve stoffen zijn nodig om de oplosbaarheid van PAEs in waterige oplossing. Het aantal oppervlakteactieve stoffen moet echter worden gehouden tot een minimum beperkt om te voorkomen dat de vorming van micellen van de oppervlakteactieve stof die moleculen PAE wilt insluiten. Niet-ionogene, oppervlakte actieve agens is gemakkelijk te precipiteren bij temperaturen lager dan 20 ° C, en daarom de buffer moet worden opgeslagen bij een temperatuur hoger dan 20 ° C.
  2. Verdun 10 µL van 100 µM zwembad0(~1.0 nmol voor 1014-10-15 -sequenties) in 490 µL van PAE bindende buffer. Verwarm de Pool0 aliquots (5 × 100 µL) in de dun-muur centrifuge buizen in het water Badset bij 95 ° C gedurende 10 min. plaats de buizen op het ijs gedurende 5 minuten en vervolgens Incubeer de buizen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (~ 25 ° C in dit werk).
  3. De eerste ronde van de selectie: incubatie van zwembad0 en DBP−NH2−coated medium.
    1. Spoel 200 µL van DBP−NH2−coated medium driemaal met 500 µL van PAE bindende buffer. Mix DBP−NH2−coated medium met0 bundelen en het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 1 uur onder zacht schudden uit te broeden.
    2. Aparte het DBP−NH2−coated medium gebonden met aptamers van de niet-afhankelijke Ani ultrafiltratie usingan ultrafiltratie buis met een moleculaire licht-donkerscheiding van 100 kDa. Spoel het medium driemaal met 500 µL van PAE bindende buffer en centrifuge bij 9,168 × g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
  4. De eerste ronde van de selectie: aptamer elutie van DBP−NH2−coated medium.
    1. 50 µL van PAE bindende buffer aan de gewassen medium en warmte het mengsel bij 90 ° C gedurende 9 min onder schudden toevoegen.
    2. Het verzamelen van het supernatans dat de eluted Ani bevattende ultrafiltratie. Herhaal dit proces elutie driemaal om te herstellen meer afhankelijke Ani.
  5. De eerste ronde van de selectie: PCR
    1. Kleinschalige PCR
      1. Uitvoeren van een kleine schaal PCR23 (4 × 20 µL aliquots) met behulp van ~ 15-30 cycli. Een PCR reactie24 als volgt instellen: 6.5 µL van RNase-gratis water, 1 µL van 10 µM elke primer (FP, PO4- RP, elke 0,01 nmol), 1.5 µL geëlueerd zwembad uit sectie 3.4 (of RNase-gratis water als negatieve controle) en 10 µL van vooraf gemengd reactie mengsels bevattende dNTPs, warme start polymerase, en 2 × PCR reactie buffer (20 mM tris· HCl, 100 mM KCl, 3 mM MgCl2, pH 8.3).
      2. Uitvoeren van PCR een thermische cycler met de volgende instellingen opgegeven: 1 cyclus van 95 ° C, 1 min; 30 cycli van [95 ° C, 30 s; 56 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s]; 1 cyclus van 72 ° C, 2 min en houd bij 4 ° C. Wanneer het instrument wordt uitgevoerd de 20th s van de stappen van de uitbreiding aan de 15, 20, 25 en 30 cycli, druk op de pauze-toets, open de klep van het instrument en het nemen van een buis uit, dan druk op de toets pause om verder te gaan van PCR.
      3. 12% gedenatureerd polyacrylamide-gel elektroforese (pagina)25,26te bereiden. Meng 4,8 g ureum, 6 mL ultra pure water, 1 mL 10 × tris/boorzuur zuur/Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (FSME), 3 mL 40% acrylamide, 10 µL van tetramethylethylenediamine (TEMED) en 100 µL 10% ammoniumnitraat persulfate (APS), in die volgorde. Goed roeren en wachten op 1,5-2 h om ervoor te zorgen dat de gel volledig stolt.
      4. Analyseren van de resultaten van de optimalisatie cyclus: 1 µL van elke PCR product combineren met 5 µL van RNA laden buffer (62,5% formamide 0.4 M formaldehyde, 1.25×3-(N-morpholino) propansulfonic zuur buffer, 0,02% xyleen cyanol FF, 0,02% bromophenol blauw) en 4 µL van RNase-gratis water; Verwarm het mengsel bij 95 ° C gedurende 10 min, en snel afkoelen tot 0 ° C op ijs; Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur; belasting in 5 aparte putjes van de 12% gedenatureerd pagina; elektroforese gerund door een verticale elektroforese systeem in 1 × TBE buffer op 170 V voor 45 min.
      5. Na elektroforese, vlek de gel met 3 µL van 1 × nucleïnezuur gel vlek in 30 mL 1 × TBE buffer gedurende 10 minuten, en neem een foto van de gel.
    2. Large scale PCR: Selecteer het juiste aantal cycli te produceren van de hoogste intensiteit band op de juiste grootte markering zonder ongewenste bijproducten. Het uitvoeren van een grootschalige PCR (20 × 100 µL aliquots) met behulp van de voorwaarden en het juiste aantal cycli bepaald in punt 3.5.1.
      Opmerking: Het definitieve bedrag van single-stranded-bibliotheek die kan worden verkregen is evenredig aan het totale volume van de PCR, niet de concentratie van de sjabloon. Voor het verkrijgen van 1 nmol van bibliotheek, moet het single-stranded zwembad doorgaans 2 mL PCR. PCR is zeer gevoelig en gemakkelijk besmet door de ANI van buiten. Stappen moeten worden genomen om de kans op besmetting, zoals het dragen van handschoenen, met behulp van gesteriliseerde tips niet spugen in de buizen en niet het openen van het GLB van de PCR-buis vóór centrifugeren.
  6. De eerste ronde van de selectie: zuivering van het PCR-product door ethanol neerslag.
    1. Combineer twee buizen van PCR mengsel in een buis (elk 200 µL). Herhaal dit voor alle buizen.
    2. 15 µL van natrium acetaat (3 M, pH 5.2) oplossing, 4 µL van DNA/RNA neerslag vervoerder oplossing en 2,5 maal het volume van vooraf gekoelde ethanol toevoegen bij-20 ° C in elke buis. Meng ze gelijkmatig.
      Opmerking: DNA/RNA neerslag vervoerder wordt veel gebruikt in ethanol neerslag experimenten tot een aanzienlijke verbetering van het percentage van de terugwinning van DNA/RNA bij lage concentraties. Het interfereert niet met downstream toepassingen zoals PCR en sequencing.
    3. Centrifugeer het mengsel bij 20,627 × g gedurende 20 min bij 4 ° C en zorgvuldig Verwijder het supernatant en verlaten witte neerslag.
    4. Voeg 400 µL van 70% ethanol oplossing bij-20 ° C vooraf te koelen in elke buis te wassen van de neerslag. Centrifugeer het mengsel bij 20,627 × g gedurende 5 min bij 4 ° C, en zorgvuldig Verwijder het supernatant en verlaten witte neerslag. Herhaal de stap wassen twee meer tijden.
    5. Open de klep van de buis; Prik de verzegeling membraan; laat ethanol vormen bij 40 ° C op het blok van de verwarming, totdat de witte neerslag transparant wordt. Winkel de neerslag bij-20 ° C.
      Opmerking: Het gezuiverde PCR product kan worden opgeslagen bij-20 ° C.
  7. De eerste ronde van de selectie: single-stranded DNA generatie (generatie van verrijkte zwembad1) door het uitvoeren van de λ exonuclease reactie om te verteren de gefosforyleerd omgekeerde strand.
    1. Kleinschalige λ exonuclease reactie
      1. 100 µL van RNase-gratis water toevoegen aan één buis met het gezuiverde PCR-product van punt 3.6. Vortex de buis te volledig los het precipitaat op in de buis.
      2. Bereiden van vijf centrifuge buizen en voeg 5 µL van de bovenstaande oplossing, 11 µL van RNase - gratis water, en 2 µL van 10 × reactie buffer (670 mM glycine-KOH, 25 mM MgCl2 , 0,1% (v/v) Triton X-100 pH 9.4) in elke buis.
      3. Voeg 2 µL van water of verdunde λ exonuclease oplossing met 2 U, 5 U, U 8 en 10 U λ exonuclease in deze buizen, respectievelijk. Meng de oplossing goed door voorzichtig pipetteren. De 10 × reactie buffer wordt geleverd samen met λ exonucleasefrom de provider.
      4. Incubeer de buizen gedurende 35 minuten bij 37 ° C, 15 min bij 80 ° C, en houd bij 4 ° C.
      5. Voorbereiden van de 12% inheemse pagina. Meng 6 mL ultra pure water, 1 mL 10 × TBE, 3 mL 100 µL van 10%, 40% acrylamide en 10 µL van TEMED APS, in die volgorde. Roer goed en wacht 60-90 min om ervoor te zorgen dat de gel volledig stolt.
      6. Het analyseren van de resultaten van de reacties door het combineren van 5 µL van elke reactie met 1 µL van laden kleurstof en 4 µL van RNase-gratis water en het laden van deze mengsels in 5 aparte putten voor 12% native pagina (150 V voor 45 min).
        Opmerking: Een 20 bp double-stranded DNA-ladder kan ook geladen worden op de gel, maar het niet noodzakelijk kan zijn aangezien de verschillende bands van PCR product en de gegenereerde één gestrande bibliotheek Toon op de gel.
        Opmerking: De λ exonuclease reactie heeft een uitstekende structurele selectiviteit. Het PCR-product van double-stranded (de bundel van de anti-gevoel is gemarkeerd met een fosfaatgroep eind 5') kan volledig worden verteerd in de bibliotheek van een single-stranded in aanwezigheid van λ exonuclease in een vrij breed concentratiebereik (Figuur 4). De minimale hoeveelheid λ exonuclease die volledig single-stranded DNA in de kleinschalige λ exonuclease reactie kan genereren wordt ook gebruikt voor de grootschalige λ exonuclease reactie. Een hogere concentratie van λ exonuclease kan ook worden gebruikt, aangezien λ exonuclease goed in een breed concentratiebereik werkt zonder verlies van het structuur-selectiviteit en product-rendement. De λ exonuclease reactie wordt geremd door een hoge concentratie van zout. De onvolledige spijsvertering van het PCR product impliceert meestal dat teveel zout in het PCR-product bestaat. De zuivering van PCR producten door ethanol neerslag (punt 3.6) is meestal compatibel is met deze stap, terwijl het PCR product gezuiverd door isopropanol neerslag vaak te veel zout bevat.
    2. Grote schaal λ exonuclease reactie: Kies de minimale hoeveelheid λ exonuclease die single-stranded Ani voor de grootschalige λ exonuclease reactie volledig kan genereren. De reactie is proportioneel opgeschaald volgens deze voorwaarde. Bijvoorbeeld: indien 2 U de minimale hoeveelheid λ exonuclease vereist is, meng 38 µL van Rnase-gratis water, 10 µL van 10 x buffer, 50 µL van DNA zwembad1 en 2 µL van 10 U/µL λ exonuclease.
  8. De eerste ronde van de selectie: zuivering van de single-stranded zwembad1 door ethanol neerslag.
    1. Volg de instructies stap 3.6.
    2. Bepaal de concentratie van Pool1 gezuiverd door UV-absorptie op 260 nm.
    3. Het reconstrueren van de 90% gezuiverd zwembad1 in een passende hoeveelheid PAE bindende buffer. Als er niet genoeg DNA verkregen voor de volgende ronde van de selectie, herhaal secties 3.5-3.8.2.
      Opmerking: Het volume van PAE bindende buffer meestal varieert van 200 tot 500 µL volgens het bedrag van de bibliotheek en de gewenste eindconcentratie van bibliotheek in de volgende ronde van SELEX.
  9. De tweede, derde, vierde en vijfde rondes van SELEX.
    1. Voeren van de tweede, derde, vierde en vijfde rondes van SELEX nadien volgens dezelfde procedure beschreven hierboven (sectie 3.2-3.8), behalve dat de bibliotheek ~ 300 pmol was input om de striktheid van de selectie.
    2. Om te minimaliseren van de niet-specifieke absorptie van Ani op het medium, Incubeer het zwembad met ongewijzigde medium op een rondschudapparaat gedurende 30 min. in de derde en vierde ronde van selectie voorafgaand aan incubatie met het DBP−NH2−coated medium.
      Opmerking: Het SELEX proces eindigde op de vijfde ronde als gevolg van de ernstige dwarslijn tussen Ani geopenbaard door de grote hoeveelheid ultrahoog moleculair gewicht product dat in de gel niet migreren.

4. high-Throughput Sequencing

  1. Zwembad,4 van punt 3.9.2 voorbereiden door sequentiebepaling door PCR versterking met compatibele inleidingen.
    1. Ontwerpen en synthetiseren van een geïndexeerde voorwaartse primer met 6 nt 5 ' eind ter vergemakkelijking van de sequentieanalyse.
      Geïndexeerd voorwaartse primer (FP-sequencing): 5'-agtacgaTCCCACGCATTCTCCACATC-3'
    2. Een 1000 µLPCR reactie als volgt instellen: 380 µL van RNase-gratis water, 50 µL van elk 10 µM primer (FP-sequencing, PO4- RP, 0.5 nmol elk), 20 µL van geëlueerd zwembad uit punt 3.9.2, en 500 µL van vooraf gemengd reactiemengsel met dNTPs, hete begin polymerase , en 2 × PCR reactie buffer. Aliquot het mengsel in 10 PCR buizen. Gebruik dezelfde PCR voorwaarden zoals beschreven in sectie 3.5.1.2.
  2. Zuiveren om te voldoen aan de eisen van de faciliteit van de sequencing van het PCR-product. Bijvoorbeeld de pagina-gel DNA herstel kit volgens de instructies van de fabrikant te gebruiken.
  3. Het gezuiverde PCR product (~ 2 µg) verzenden een faciliteit rangschikken onder de scheepvaart voorwaarden vereist door de sequencing-faciliteit. Bijvoorbeeld, het PCR-product in een centrifugebuis met doppen grondig afgedicht met koelelementen de sequencing-faciliteit te verschepen.
    Opmerking: Kreeg de resultaten die de sequenties volgens het exemplaaraantal van elke sequentie om te beoordelen van de verrijking van het gesequenceerd zwembad gerangschikt. De hoogste reeks heette DBP-1 (5'-CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT-3'). Zijn affiniteit en selectiviteit werden gemeten door het volgende protocol (sectie 5 en 6). De toepassing ervan in een elektrochemische bio-sensing bleek vervolgens in hoofdstuk 7.

5. Kd bepaling van geselecteerd Aptamer kandidaten met behulp van kwantitatieve PCR Magnetic Bead-Based (qPCR)

  1. Synthetiseren van DBP-1-qPCR- en grondlagen met behulp van standaard phosphoramidite chemie en het zuiveren door standaard HPLC.
    Aptamer kandidaat (DBP-1-qPCR): 5'-ATACCAGCTTATTCAATTCTTTCTGTCCTTCCGTCACATC-CCACGCATTCTCCACATAGATAGTAAGTGCAATCT-3'
    Toekomen primer voor qPCR (FP-qPCR): 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3'
    Omgekeerde primer voor qPCR (RP-qPCR): 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3'
    Opmerking: De primer regio's van de geteste reeks verschillen van die van zwembad0 gebruikt in sectie 3. Het doel van het veranderen van de primer regio's is voor het testen van de affiniteit van de kern volgorde alleen, met uitzondering van de primer regio's.
  2. Immobiliseren DBP-NH2 op carbonzuur beklede magnetische kralen na instructies van de fabrikant.
    1. Wassen van de carbonzuur beklede magnetische kralen tweemaal met 25 mM 2-(N-morfolino) ethanesulfonic zuur (MES) (pH 5.0), met behulp van een gelijk volume van magnetische kralen (100 µL) afgepipetteerde uit de flacon, voor 10 min met goed mengen (eind over of gelijkaardig).
    2. Onmiddellijk vóór gebruik, 50 mg/mL 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) oplossing met koude 25 mM MES (pH 5.0) te bereiden.
    3. Onmiddellijk vóór gebruik, 50 mg/mL N-hydroxysuccinimide (NHS) oplossing met koude 25 mM MES (pH 5.0) te bereiden.
    4. Meng 100 µL van de EDG-oplossing en 100 µL van NHS oplossing met de gewassen kralen en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met langzame tilt rotatie.
    5. Zet de tube op een magneet voor 4 min na incubatie, verwijder het supernatant en wassen kralen tweemaal met 100 µL van koude 25 mM MES (pH 5.0).
    6. Incubeer 6 µL van de stockoplossing 100 mM DBP-NH2 en 25 mM MES (pH 5.0, 290 µL) met de geactiveerde kralen onder rotatie gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur of 2 uur bij 4 ° C, met langzame tilt rotatie bij 5 omwentelingen per minuut.
    7. Zet de buis aan de magneet voor 4 min na incubatie en verwijder het supernatant. De gecoate kralen 4 keer wassen en resuspendeer kralen met 200 µL van PAE bindende buffer en bewaren bij 4 ° C tot gebruik.
  3. Verzamelen titratiecurve om na te gaan van Kd.
    1. Bereid een reeks van DBP-1 oplossingen (500 µL) bij een gevarieerde concentratie PAE bindende buffer van 13.00 tot 300 nM.
    2. Voeg 10 µL van DBP-NH2-magnetische kralen bekleed, zoals beschreven in sectie 5.2.7 aan elke DBP-1-oplossing. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder rotatie.
    3. Plaats de buizen op een magneet voor 4 min en verwijder de bovendrijvende substantie. Wassen van de kralen 4 keer met 200 µL van PAE bindende buffer.
    4. Voeg 60 µL van PAE bindende buffer toe aan elke buis. Incubeer de buizen bij 95 ° C gedurende 15 min. verzamelen het supernatant bevattende de eluted DBP-1 magnetische scheiding. Herhaal dit proces elutie om te herstellen meer afhankelijke DBP-1.
    5. Verdun de oplossing van de elute 100-fold en 3 µL voor real-time qPCR te nemen. De reactie van een qPCR als volgt instellen: 3 µL RNase-gratis water, 2 µL van 10 µM elke primer (FP, PO4- RP, elke 0,01 nmol), 3 µL van geëlueerd en verdund DBP-1 en 10 µL van vooraf gemengd reactiemengsel met dNTPs, polymerase en 2 x PCR reactie buffer.
    6. Bepalen van het aantal DBP-1 in elk monster door het uitvoeren van qPCR met behulp van een thermische cycler met de volgende instellingen: 1 cyclus van 95 ° C, 30 s; 30 cycli van [95 ° C, 30 s; 45 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s]; 1 cyclus van 72 ° C, 30 s en houd bij 4 ° C.
    7. Uitzetten van de titratiecurve en Kd bepalen door niet-lineaire montage van de curve uitgaande van een verhouding van 1:1 bindende27.

6. relatieve affiniteit en specificiteit Test door concurrerende Assays

  1. Voeg 10 µL van DBP-NH2-gecoat magnetische kralen DBP-1-oplossing (500 µL, 1 µM). Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder rotatie. Plaats de buizen op een magneet voor 4 min en verwijder de bovendrijvende substantie. Wassen van de kralen 4 keer met 200 µL van PAE bindende buffer en resuspendeer het in 10 µL van PAE bindende buffer.
  2. Voeg 10 µL van DBP-NH2-gecoate middellange gebonden met DBP-1 naar 110 µL van elk 10 µM getest monster (DBP-NH2, DBP, DEHP, butyl benzyl phthalate(BBP), zware metaal ionen, enz.) Incubeer bij kamertemperatuur voor 1 h. verzamelen het supernatant door magnetische scheiding.
  3. Verdun het supernatant 100-fold en nemen 3 µL voor qPCR kwantificering. De reactie van een qPCR als volgt instellen: 3 µL RNase-gratis water, 2 µL van 10 µM elke primer (FP, PO4- RP, elke 0,01 nmol), 3 µL van geëlueerd en verdund DBP-1 en 10 µL van vooraf gemengd reactiemengsel met dNTPs, polymerase en 2 x PCR reactie buffer.
  4. Bepalen van het aantal DBP-1 in elk monster door het uitvoeren van qPCR met behulp van een thermische cycler met de volgende instellingen: 1 cyclus van 95 ° C, 30 s; 30 cycli van [95 ° C, 30 s; 45 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s]; 1 cyclus van 72 ° C, 30 s en houd bij 4 ° C.
  5. De relatieve affiniteit berekenen door het aantal DBP-1 vrijgegeven van de kralen in de aanwezigheid van het monster door het nummer van de DBP-1 vrijgegeven van de kralen in de PAE-bindende buffer: relatieve affiniteit = Nmonster/Nbuffer.

7. fabricage en Electrochemische metingen van DEHP elektrochemische biosensoren

  1. Synthetiseren van de thiolated kern volgorde (HS-DBP-1) en de signalering sonde (DBP-1-C-Fc) met behulp van standaard phosphoramidite chemie en het zuiveren door standaard HPLC.
    HS-DBP-1: 5' - HS-(CH2)6- CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT -3 '
    DBP-1-C-Fc: 5 '- GATGTGACGGAAGGTTTTTTTT-(CH2)6Fc -3'
    Opmerking: Het rationele ontwerp van de sensor-sondes werd beschreven in onze eerdere pbulications18,22.
  2. HS-DBP-1 en DBP-1-C-Fc in rang nuclease-gratis water bij 100 µM, aliquoot, reconstrueren en bewaar ze op -20-80 ° c voor maximaal één jaar.
  3. De gouden elektrode zorgvuldig om een spiegel-achtig oppervlak met 1, 0,3 en 0,05 µm Al2O3 poeder op een microcloth voor 5 min Pools en bewerk het ultrasone trillingen ten in ultrazuiver water gedurende 5 minuten om te verwijderen van de resterende Al2O3. Vervolgens schoon de elektrode elektrochemische schuren met 35 opeenvolgende cyclische voltammetrie (CV) scans van 0.4 +1.2 V (vs. Hg-Hg2SO4) in 0.5 M H2SO4 op 100 mV/s.
  4. Bereiden een mengsel van 0,5 µM HS-DBP-1 en 0,5 µM DBP-1-C-Fc 100 µL 10 mM fosfaatbuffer met 1 M NaCl, pH 7.4 (PBS). Verwarm het mengsel in de centrifugebuis van dun-muur in het water Badset bij 95 ° C gedurende 10 min, en langzaam het mengsel tot kamertemperatuur afkoelen.
  5. Voeg 1 µL van tris-(2-carboxyethyl)-Fosfine hydrochloride (TCEP, 10 mM, stockoplossing) in het mengsel. Bewaren bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  6. Dompel de schone goud elektrode in de bovenstaande oplossing voor 12 h of overnachting bij kamertemperatuur.
  7. Spoel de elektrode met PBS en dompel de elektrode in 1 mM [S (CH2)2(OCH2CH2)6OCH3]2 (HS-EG6- OMe) in PBS voor 1 h. Spoel de elektrode grondig met behulp van PAE bindende buffer en dompel de elektrode in PAE bindende buffer.
  8. Neem een achtergrond blokgolf voltammetrie (SWV) scan in doel-vrije PAE bindende buffer.
    1. Schoon alle experimentele apparatuur: elektrolytische cellen, gouden werken elektrode, platina teller elektrode en verzadigde kalomel referentie-elektrode (SCE).
    2. Activeren van de geïnstalleerde software; de experimentele parameters instellen voor SWV metingen.
      Opmerking: De volgende experimentele parameters werden gebruikt voor de SWV experimenten: potentiële bereik: van -0,2 naar 0,7 V; amplitude modulatie: 25 mV; Pulse breedte: 5 ms; scan rate: 50 mV/s; stap potentieel: 1 mV.
    3. Sluit het goud elektrode, platina teller elektrode en SCE werken aan een potentiostaat, en deze drie elektroden gestoken door een elektrolytische cel met PAE bindende buffer.
    4. Haal de SWV meetwaarde.
      Opmerking: Zodra de SWV meting gestart, een curve SWV worden weergegeven op het scherm van de computer. De scan wordt herhaald totdat de scans constant zijn en geen verdere veranderingen in piekhoogte of vorm worden waargenomen.
  9. Dompel de elektrode van de werken in de PAE-bindende buffer met een bepaalde concentratie van DEHP (bijvoorbeeld 10 pM) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Spoel de elektrode grondig met behulp van PAE bindende buffer en dompel de elektrode in PAE bindende buffer met de teller elektrode en SCE. Verzamel de SWV curve onder dezelfde voorwaarde als beschreven in punt 7.8.
  10. Herhaal stap 7,9, behalve dat de concentratie van DEHP (bv 100 pM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 µM) werd sequentieel verhoogd. Zet de titratiecurve.
  11. Specificiteit proeven: Herhaal stap 7.3-7,9, behalve dat de PAE bind buffer met DEHP is vervangen door de PAE bindende buffer met de mogelijke storende stof bij de gewenste concentratie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

We ontworpen en gesynthetiseerd de aminogroep matiemaatschappij dibutylftalaat (DBP-NH2) als het anker doel (figuur 1F). We uitgevoerd dan de DNA aptamer selectie van PAEs DBP-NH2 gebruikt als anker doel en na de klassieke doel immobilisatie gebaseerde methode (Figuur 2). In elke ronde, werd een pilot PCR uitgevoerd met behulp van de gedenatureerde pagina voor het optimaliseren van het nummer van de cyclus van PCR (Figuur 3). Het gedenatureerde pagina, in plaats van de oorspronkelijke pagina, wordt sterk aangeraden omdat wij en andere collega's gemerkt heb dat de bijproducten van de vermoedelijke ultrahoog moleculair gewicht komt te staan op de inheemse gels op de hogere cyclus nummers daadwerkelijk crosslinking complexen gevormd door sequenties van de juiste maat. Zo kan de intensiteit van de band van de gedenatureerde pagina echt weerspiegelen het bedrag van het juiste product. De één gestrande DNA-generatie is een andere kritische stap, en vele methoden voor deze stap geweest gerapporteerde28. De λ exonuclease spijsvertering is de goedkoopste methode. Het succes van de single-stranded DNA generatie gemakkelijk kan worden gecontroleerd door inheemse pagina, waar het PCR product wordt weergegeven als (eerste verschillende rondes van SELEX) één of meerdere bands, terwijl slechts één band wordt weergegeven na de vertering (Figuur 4).

De SELEX werd gestopt na de vijfde ronde van de selectie vanwege de aanzienlijke hoeveelheid DNA opgebouwd aan de bovenkant van de pagina, zelfs na de behandeling van de denaturatie (waarin Ani zijn verhit tot 95 ° C gedurende 10 minuten in 2 × TBE-bevattende 8.3 M ureum) , die voorgesteld ernstige cross-linking tussen de ANI's en ook aangegeven dat de sequenties werden verrijkt. Daarom was de zwembad4 verstuurd voor de high-throughput sequencing. Het resultaat van de high-throughput bleek dat de top 100 meestvoorkomende sequenties werden zeer bewaard en afkomstig uit één familie waren. De hoogste reeks DBP-1 nanomolar affiniteit (Figuur 5) en goede groep-specificiteit voor PAE congeneren (DBP, BBP, DEHP) weergegeven (Figuur 6) via de handige qPCR testen, zoals beschreven in de sectie protocol.

DBP-1 is gebruikt voor de bouw van een strand displacement gebaseerde elektrochemische aptasenor dienovereenkomstig aan onze eerder gemelde werken29. De sensor DEHP kan gevoelig en selectief inspelen DEHP (Figuur 7). Het gemeenschappelijk milieu verontreinigende stoffen zoals zware metalen ionen, antibiotica en kleine moleculen met soortgelijke functionele groepen bleek zeer zwakke reactie op DBP-1.

Figure 1
Figuur 1: Chemische structuren van (A) PAEs, BBP (B), (C) DBP, (D) DEHP, (E) 4-OH-DEHP, (F) DBP−NH,2. Dit cijfer is herdrukt met toestemming van Han Y. et al. 22 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Groepsspecifieke DNA aptamer selectieprocedure voor PAEs DBP-NH2 gebruikt als een anker doel. Dit cijfer is herdrukt met toestemming van Han Y. et al. 22 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: vertegenwoordiger resultaten van PCR cyclus optimalisatie via gedenatureerde pagina. Van links naar rechts, vertegenwoordigen de rijstroken: 20 bp DNA ladder standaard, 15 cycli (geen DNA-sjabloon) 20 cycli (geen DNA-sjabloon), 25 cycli (geen DNA-sjabloon), 30 cycli (geen DNA-sjabloon), 15 cycli, 20 cycli, 25 cycli en 30 cycli. Optimale omstandigheden werden waargenomen bij 25 cycli, waar de band één product was bij een hoge intensiteit zonder ongewenste bijproducten, bovendien geen band werd waargenomen in de overeenkomstige blanco-controle. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: het optimaliseren van λ exonuclease reactie te verteren de gefosforyleerd strand met behulp van inheemse pagina. Van links naar rechts, vertegenwoordigen de rijstroken: 20 bp DNA ladder standaard, negatieve (geen λ exonuclease) 2U, 5U, 8U en 10U. De minimale hoeveelheid enzym werd waargenomen op 2U, waar de dubbele PCR product wordt de ANI van de single-stranded. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: metingen van de affiniteit voor DBP-1 door qPCR gebaseerde testen. De fout (standaarddeviatie, SD) van de Kd's werd berekend op basis van drie metingen van hetzelfde monster. Dit cijfer is herdrukt met toestemming van Han Y. et al. 22

Figure 6
Figuur 6: metingen van de relatieve affiniteit voor DBP-1 voor gratis DBP-NH2 (10 µM), DBP (10 µM), DEHP (10 µM), BBP (10 µM), ethylacetaat (10 µM), benzoëzuur (10 µM), ftaalzuur (10 µM) en andere via competitie testen. Andere: een mengsel van eventuele storingen (glucose, kanamycine, ampicilline en ethanol) allemaal op 10 µM. De verhouding (de relatieve affiniteit) werd berekend door het aantal aptamers verlost van de kralen in de aanwezigheid van het monster door het aantal aptamers verlost van de kralen in de PAE-bindende-buffer. De gemiddelde ± SD. de staven De SDs werden berekend op basis van drie afzonderlijke metingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: de elektrochemische biosensor DEHP voor ultrasensitive en ultraselective detectie van DEHP: mechanisme (A), SWV curven (B), ijkcurve (C), en selectiviteit tests (D). De fouten (SDs) werden berekend op basis van drie afzonderlijke metingen. Dit cijfer is herdrukt met toestemming van Han Y. et al. 22 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een uitstekende voordeel van aptamers is dat ze worden geïdentificeerd door middel van de methode in vitro SELEX, hoewel antilichamen worden gegenereerd via in vivo immunoreactions. Daarom, aptamers kunnen worden geselecteerd met de gewenste doelgroep specificiteit uit hoofde van goed ontworpen proefomstandigheden, overwegende dat antilichamen beperkt tot de fysiologische omstandigheden zijn.

Ter vergemakkelijking van de scheiding van afhankelijke sequenties van gratis sequenties, verschillende gemodificeerde SELEX hebben onlangs gemeld, in welke capillaire elektroforese30, microfluidics31, magnetische / acryl kralen / agarose kralen14, etc., nitrocellulose filters of affiniteit kolommen om efficiënter scheiding hebben vervangen. Onder deze technieken, de kraal gebaseerde methoden zijn wijdst gebruikt voor de selectie van de aptamer van klein molecuul doelstellingen als gevolg van hun eenvoudige set-up, eenvoudige bediening en zijn vatbaar voor klein molecuul analyses.

Er zijn twee groepen van methoden die vaak worden gebruikt voor aptamer selectie van kleine molecuul doelstellingen: het doel13 en bibliotheek14 immobilisatie gebaseerde methoden. In de voormalige groep van methoden, zijn de doelstellingen klein molecuul geïmmobiliseerd op de vaste fase zoals matiemaatschappij magnetische kralen of agarose kralen via covalente koppeling reacties. Bibliotheken worden geïncubeerd met kleine-molecuul gecoate kralen en deze sequenties die niet binden of zwak binden aan het doel op de solide fase gewoon door het uitvoeren van wassen en centrifugeren of magnetische scheiding stappen worden verwijderd. Later worden de afhankelijke sequenties geëlueerd en versterkt door PCR. De kleine molecuul doelstellingen moet ten minste één functiegroep beschikbaar voor de reactie van de koppeling. Voor mensen zonder geschikte functionele groepen moet de functionele groep worden opgenomen in de oorspronkelijke doelstelling via organische synthese. De synthese van de zorgvuldig ontworpen doelstelling kan betrekking hebben op meerdere stappen, en soms ook heel uitdagend. De structurele wijziging van de doelstellingen kan ook sterk van invloed op de bandplaatsen en affiniteit met hun aptamers. Om te voorkomen dat deze problemen, bibliotheek immobilisatie gebaseerde methoden zijn ontwikkeld, waar de bibliotheek is gekruist met complementaire DNA vangen sondes op magnetische kralen, en de bindende sequenties vallen de kralen op de binding met de doelstellingen. In deze groep van methoden, de doelstellingen worden toegevoegd in de buffer bindend en geen functionele groepen zijn vereist. PAEs zijn de afgeleiden van de ester van ftalaat zuur, en een typische PAE bestaat uit een ftalaat acid ester groep en één of twee alkyl ketens (figuur 1A-D). PAEs hebben geen functionele groepen beschikbaar voor immobilisatie van de vaste fase. Dus, de bibliotheek immobilisatie gebaseerde methoden lijken meer aantrekkelijk voor de selectie van de aptamer van PAEs.

Een goed gecontroleerde spreiding status is van cruciaal belang om de gewenste verrijking van de bibliotheek via SELEX. Zijn zeer hydrofobe echter PAEs en gemakkelijk vormen aggregaten in waterige oplossingen bij een concentratie hoger dan de verschillende µM, zelfs in aanwezigheid van meerdere oppervlakteactieve stoffen te vergemakkelijken van dispersie. Dus, de status van de dispersie van PAEs is moeilijk onder controle te, en het zou moeilijk zijn om te selecteren van de aptamers die zich specifiek aan afzonderlijke PAE-moleculen binden. Om de oplosbaarheid probleem oplossen, werden doel-immobilisatie methoden gekozen, in welke PAEs waren geïmmobiliseerd op de hydrofiele parels via covalente bindingen. Met behulp van deze strategie immobilisatie, moeten de streefcijfers dominant aanwezig op het oppervlak van de parel in een moleculaire eenheidsstaat, in plaats van aggregaten.

Het structurele ontwerp van de anker-doelstelling is ook heel cruciaal voor de succesvolle selectie van groepsspecifieke aptamers. Drie factoren moeten worden overwogen voor het structurele ontwerp. De eerste factor is het doel van de selectie van de aptamer. Gezien het doel van het selecteren van de groep-specifieke aptamers, is het essentieel om bloot de gemeenschappelijke groep van PAEs voor aptamer bindende en te voorkomen dat de rest van de onderdelen van deelname aan de aptamer binding. Dus, de functionele groep moeten worden ingevoerd op de terminal van de zijketen. Aan het begin, we ontworpen OH-matiemaatschappij DEHP (4-OH−DEHP) (figuur 1E) als het doel van het anker en het geïmmobiliseerd op de carbonzuur magnetische kralen16. Dus, de alkyl kettingen waren blootgesteld aan de oppervlakte van de matrix. We hebben geprobeerd om te kiezen van magnetische kralen met carboxylgroepen als de vaste matrix. Geen voor de hand liggende affiniteit verbetering werd waargenomen na vijf rondes van de selectie en de niet-specifieke absorptie op de kale matrix bleef sterk.

Daarom, DBP-NH2 later werd ontworpen op basis van de volgende gedachten: (1) de groep ftalaat is meer kans om te communiceren met de aptamer via de π-π-stack en de waterstofbrug dan de alkylketen; (2) NHS-gemedieerde carbodiimide reactie is mild en heeft een zeer efficiënte koppeling efficiëntie, zodat -NH2 wordt ingevoerd aan het einde van een alkylketen voor DBP; (3) het is eenvoudig te bedienen met de magnetische kralen als een partitie van de vaste fase, maar de niet-specifieke adsorptie van de bibliotheek is sterk. Hoewel het verlies van de parels van de agarose tijdens de scheiding hoger dan de magnetische kralen is, is de niet-specifieke adsorptie van de bibliotheek veel lager. Dus, DBP-NH2 werd geïmmobiliseerd op de epoxy-geactiveerde agarose parels, en de ftaal acidester groep werd blootgesteld aan de oppervlakte van de matrix.

De keuze van selectie buffer is belangrijk, vooral voor kleine molecuul doelen met uiteenlopende oplosbaarheid. De bindende buffer moet zorgvuldig voorbereide aggregatie voorkomen en ervoor zorgen dat de staat van een goede spreiding van POP's tijdens het hele aptamer selectie en karakterisering. In onze studie vonden we dat DEHP niet kan in regelmatige buffers zonder oppervlakteactieve stoffen ontbinden, tonen twee verschillende lagen. De laag verdwijnt na toevoeging van meerdere oppervlakteactieve stoffen in de geoptimaliseerde hoeveelheid. De duidelijke oplossingen moeten worden opgeslagen bij temperaturen hoger dan 20 ° C om de status te handhaven. Details vindt u in protocol stap 3.1.

Single-stranded DNA generatie van double-stranded PCR producten is een essentiële stap in het proces van SELEX. Momenteel zijn verschillende methoden beschreven in de literatuur32,33, met inbegrip van asymmetrische PCR, λ exonuclease spijsvertering, magnetische scheiding met streptavidine beklede kralen en grootte scheiding door denaturering ureum-polyacrylamidegel.

Verschillende methoden hebben hun eigen sterke en zwakke punten. Momenteel is de meest gebruikte methode voor het genereren van ssDNA magnetische scheiding met streptavidine beklede kralen. De uitstekende voordeel van deze methode is de tijd te besparen en eenvoudige werking. Het nadeel is de hoge kosten in vergelijking met andere methoden. In tegenstelling, is de grootte scheiding gebaseerde methode, met behulp van omgekeerde inleidingen met GC-rijke stam – lusstructuur, een van de goedkoopste manieren, terwijl de opbrengst van de single-stranded DNA de laagste onder deze methoden32 is. In dit protocol beschreven we het gebruik van λ exonuclease spijsvertering voor het genereren van single-stranded DNA, dat een van de goedkoopste manieren is. We vonden dat de opbrengst van de single-stranded DNA vergelijkbaar met de twee methoden voor magnetische scheiding en daar beklede kralen is. Bovendien, we vonden dat de exonuclease reactie was geremd door de hoge concentratie van zout. De onvolledige vertering van het PCR-product gemeld in de literatuur33 was waarschijnlijk te wijten aan teveel zout bestaande in het PCR-product. Bovendien, de λ-exonuclease is zeer actief en goedkoop (Figuur 4).

De karakterisatie en validatie van aptamers is moeizaam en tijdrovend, en belichaamt een grote knelpunt in de aptamer ontdekking pijpleiding33. De meeste technieken zijn massa-gevoelige methoden die goed voor de grotere aptamer bindende partners werken (> 10.000 amu), maar zijn niet voldoende gevoelig zijn voor het meten van de interacties met laag molecuulgewicht targets (< 1.000 amu)15. De karakterisatie en validatie van aptamers van hydrofobe kleine molecules zoals PAEs is zelfs nog moeilijker. Hun oplosbaarheid in water van de slechte resultaten in de unsaturation van de titratiecurve, die voorkomt dat de Kdbepaling in oplossing of ummobiliseerd van de aptamers op het oppervlak. Dus vastbesloten wij de Kds van de geïdentificeerde aptamers door sequentiebepaling van hoge-doorvoer door het immobilizing van de DBP-NH,2 op de hydrofiele magnetische kralen om te voorkomen dat het probleem van de oplosbaarheid. De relatieve affiniteiten en de selectiviteit van de aptamers aan andere PAEs waren dan bepaald door de concurrerende testen, waar de aptamer kandidaten waren vooraf begrensd aan de DBP-NH2 aangesloten magnetische kralen en vrijgegeven aan het supernatans dat na incubatie met de geteste PAEs of andere potentieel storende stoffen. De concurrerende assay werd toegepast omdat het verstrekt een vergelijking van de facile affiniteit tussen PAEs die had geen functionele groepen voor oppervlakte immobilisatie. Magnetische fluorescerende kraal gebaseerde testen zijn bovendien geschikt voor de studie van de affiniteit van kleine molecuul-aptamer interacties34. We vonden echter dat de magnetische kralen soms veroorzaken fluorescentie blussen om onbekende redenen. Dus, het testen van de qPCR werden gebruikt voor de metingen affiniteit.

Een kritieke techniek tip voor de elektrochemische biosensor beschreven in deze studie is de oppervlakte passivering van de elektrode35. Als gevolg van de hoge hydrophobicity van DEHP heeft het een sterke neiging om nonspecifically opgenomen op de gouden elektrode, wat leidt tot het mislukken van de detectie. De meest algemeen gebruikte oppervlakte passivering agent, 6-mercapto-1-hexanol (MCH)36,37, is niet voldoende om te voorkomen dat de niet-specifieke absorptie van DEHP, terwijl we dat HS-(CH2)2-[OCH2CH2 vonden ]6- OCH3 was voldoende effectief om de gevoelige detectie van DEHP38.

Deze procedure wordt een protocol voor het selecteren van groepsspecifieke DNA aptamers van zeer hydrofobe kleine moleculen en een toepassing van de geselecteerde aptamer in een elektrochemische biosensor beschreven. Het protocol helpt bij de keuze van andere hydrofobe kleine moleculen en biedt inzichten van zeer hydrofobe kleine moleculen alsmede ontwikkelingssamenwerking sensor. Het selectieproces aptamer behoort tot de categorie van doelstelling immobilisatie gebaseerde methoden. De beperkingen van dit soort methode bestaan ook voor dit protocol, bijvoorbeeld de noodzaak voor gecompliceerde synthese van anker doelen en de gevolgen van de vaste fase op aptamer binding. De aantrekkelijke voordelen van de elektrochemische biosensoren beschreven in dit protocol zijn hun simpele ontwerp en hoge gevoeligheid. Het grote nadeel is de beperkte precisie als gevolg van hun zeer breed dynamisch bereik. Dus zijn de hier beschreven biosensoren meer geschikt voor screeningtests, in plaats van kwantitatieve metingen van de doelstellingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende financieel belang.

Acknowledgments

We zijn dankbaar voor de financiële steun van de nationale natuurlijke Science Foundation (21675112), Key project van de wetenschap en technologie plan van Peking onderwijs Commissie (KZ201710028027) en Yanjing jonge geleerde programma van kapitaal Normal University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UV-2550 Shimadzu,Japan protocol, section 3.8.2
DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200 BIO-RAD section 3.5.1.2 and 3.5.2
C1000 Touch BIO-RAD section 5.3.6 and 6.3
VMP3 multichannel potentiostat Bio-Logic Science, Claix, France section 7.4,7.8 and 7.11
Epoxy-activated Sepharose 6B GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) 10220020 argarose beads, section 2.3 and 3.3
Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beads Invitrogen, USA 420420 magnetic beads,section 5.2. and 5.3
Premix Taq Hot Start Version Takara,Dalian,China R028A polymerase, section 3.5.1.1
PARAFILM Sealing Membrane Bemis, USA PM-996 section 3.6.5
Lambda Exonuclease Invitrogen, USA EN0561 section3.7.1.2.The 10 × reaction buffer is provided along with λ exonuclease by the provider.
Dr. GenTLE
Precipitation Carrier		 Takara,Dalian,China 9094 section 3.6.2 and 3.8.1
UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit Sangon Biotech (Shanghai) B511135 section 4.2
SYBR Gold nucleic acid gel stain Invitrogen, USA 1811838 nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5
SYBR Premix Ex Taq II Takara,Dalian,China RR820A polymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) Sigma-Aldrich CAS: 1132-61-2 section 5.2.1
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) Invitrogen, USA CAS: 25952-53-8 section 5.2.2
N-hydroxysuccinimide (NHS) Sigma-Aldrich 6066-82-6 section 5.2.3
mercaptohexanol (MCH) Sigma-Aldrich CAS: 1633-78-9 section 7.7
Gold electrode Shanghai Chenhua CHI101 section 7.4. - 7.11
tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich CAS: 51805-45-9 section 7.5
O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethylene glycol) Sigma-Aldrich CAS: 651042-82-9 section 7.7
diethylhexyl phthalate (DEHP) National Institute of Metrology, China CAS: 117-81-7 section 7.11
Tween 20 Sigma-Aldrich CAS: 9005-64-5 polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate
Triton X-100 Sigma-Aldrich CAS: 9002-93-1 non-ionic surface active agent
PBS Sigma-Aldrich P5368 10 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vorkamp, K., Riget, F. F. A review of new and current-use contaminants in the Arctic environment: Evidence of long-range transport and indications of bioaccumulation. Chemosphere. 111, 379-395 (2014).
  2. Net, S., Sempere, R., Delmont, A., Paluselli, A., Ouddane, B. Occurrence, fate, behavior and ecotoxicological state of phthalates in different environmental matrices. Environ Sci Technol. 49 (7), 4019-4035 (2015).
  3. Xie, Q. L., Liu, S. H., Fan, Y. Y., Sun, J. Z., Zhang, X. K. Determination of phthalate esters in edible oils by use of QuEChERS coupled with ionic-liquid-based dispersive liquid-liquid microextraction before high-performance liquid chromatography. Anal BioanalChem. 406 (18), 4563-4569 (2014).
  4. Ierapetritis, I., Lioupis, A., Lampi, E. Determination of phthalates into vegetable oils by isotopic dilution gas chromatography mass spectrometry. Food Anal Methods. 7 (7), 1451-1457 (2014).
  5. Sun, J. Z., He, H., Liu, S. H. Determination of phthalic acid esters in Chinese white spirit using dispersive liquid-liquid microextraction coupled with sweeping beta-cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography. J Sep Sci. 37 (13), 1679-1686 (2014).
  6. Yilmaz, P. K., Ertas, A., Kolak, U. Simultaneous determination of seven phthalic acid esters in beverages using ultrasound and vortex-assisted dispersive liquid-liquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography. J Sep Sci. 37 (16), 2111-2117 (2014).
  7. Sun, R., Zhuang, H. An ultrasensitive gold nanoparticles improved real-time immuno-PCR assay for detecting diethyl phthalate in foodstuff samples. Anal Biochem. 480, 49-57 (2015).
  8. Sun, R. Y., Zhuang, H. S. A sensitive heterogeneous biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of di-(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP) in beverages using a specific polyclonal antibody. Anal Methods. 6 (24), 9807-9815 (2014).
  9. Zhou, L., Lei, Y., Zhang, D., Ahmed, S., Chen, S. An ultra-sensitive monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosobent assay for dibutyl phthalate in human urinary. Sci Total Environ. 541, 570-578 (2016).
  10. Shen, J., Li, Y., Gu, H., Xia, F., Zuo, X. Recent development of sandwich assay based on the nanobiotechnologies for proteins, nucleic Acids, small Molecules, and ions. Chem Rev. 114 (15), 7631-7677 (2014).
  11. Yin, X. -B. Functional nucleic acids for electrochemical and electrochemiluminescent sensing applications. TrAC, Trends Anal Chem. 33, 81-94 (2012).
  12. Nguyen, V. -T., Kwon, Y. S., Gu, M. B. Aptamer-based environmental biosensors for small molecule contaminants. Curr Opin Biotechnol. 45, 15-23 (2017).
  13. Groher, F., Suess, B. In vitro selection of antibiotic-binding aptamers. Methods. 106, 42-50 (2016).
  14. Yang, K. -A., Pei, R., Stojanovic, M. N. In vitro selection and amplification protocols for isolation of aptameric sensors for small molecules. Methods. 106, 58-65 (2016).
  15. Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).
  16. Mehta, J., et al. Selection and characterization of PCB-binding DNA aptamers. Anal Chem. 84 (3), 1669-1676 (2012).
  17. Matsumoto, M., Hirata-Koizumi, M., Ema, M. Potential adverse effects of phthalic acid esters on human health: A review of recent studies on reproduction. Regul Toxicol Pharm. 50 (1), 37-49 (2008).
  18. Goodchild, J. Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: a review of their synthesis and properties. Bioconjug Chem. 1 (3), 165-187 (1990).
  19. Brown, D. M. A brief history of oligonucleotide synthesis. Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties. , 1-17 (1993).
  20. Reese, C. B. Oligo-and poly-nucleotides: 50 years of chemical synthesis. Org Biomol Chem. 3 (21), 3851-3868 (2005).
  21. Sproat, B., Colonna, F., Mullah, B., et al. An efficient method for the isolation and purification of oligoribonucleotides. Nucleos Nucleot Nucl. 14 (1-2), 255-273 (1995).
  22. Han, Y., et al. Selection of group-specific phthalic acid esters binding DNA aptamers via rationally designed target immobilization and applications for ultrasensitive and highly selective detection of phthalic acid esters. Anal Chem. 89 (10), 5270-5277 (2017).
  23. Bartlett, J. M. S., Stirling, D. A short history of the polymerase chain reaction. PCR protocols. , 3-6 (2003).
  24. Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230, 1350-1354 (1985).
  25. Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , A. 3B 1-A. 3B 5 (2001).
  26. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). JoVE. (32), e1485 (2009).
  27. Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal Chim Acta. 686 (1), 9-18 (2011).
  28. Sharma, T. K., Bruno, J. G., Dhiman, A. ABCs of DNA aptamer and related assay development. Biotechnol Adv. 35 (2), 275-301 (2017).
  29. Liu, R., et al. Signaling-probe displacement electrochemical aptamer-based sensor (SD-EAB) for detection of nanomolar kanamycin A. Electrochim Acta. 182, 516-523 (2015).
  30. Mendonsa, S. D., Bowser, M. T. In vitro evolution of functional DNA using capillary electrophoresis. J Am Chem Soc. 126, 20-21 (2004).
  31. Lou, X. H., et al. Micromagnetic selection of aptamers in microfluidic channels. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (9), 2989-2994 (2009).
  32. Cho, M., et al. Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15373-15378 (2010).
  33. Cho, M., et al. Quantitative selection and parallel characterization of aptamers. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (46), 18460-18465 (2013).
  34. Song, K. -M., et al. Gold nanoparticle-based colorimetric detection of kanamycin using a DNA aptamer. Anal Biochem. 415 (2), 175-181 (2011).
  35. Yang, Z., Ding, X., Guo, Q., et al. Second generation of signaling-probe displacement electrochemical aptasensor for detection of picomolar ampicillin and sulfadimethoxine. Sens Actuators B. 253 (2017), 1129-1136 (2017).
  36. Lou, X., Zhao, T., Liu, R., Ma, J., Xiao, Y. Self-assembled DNA monolayer buffered dynamic ranges of mercuric electrochemical sensor. Anal Chem. 85 (15), 7574-7580 (2013).
  37. Zhao, T., et al. Nanoprobe-enhanced, split aptamer-based electrochemical sandwich assay for ultrasensitive detection of small molecules. Anal Chem. 87 (15), 7712-7719 (2015).
  38. Lou, X., He, L. A. Surface passivation using oligo(ethylene glycol) in ATRP-assisted DNA detection. Sens Actuators,B. 129 (1), 225-230 (2008).

Tags

Chemie kwestie 133 Aptamer selectie ftaalzuur esters groepsspecifieke hydrofobe kleine molecules kwantitatieve polymerisatie kettingreactie elektrochemische aptasensor persistente organische verontreinigende stoffen
Ftaalzuur Ester-Binding DNA Aptamer selectie, karakterisering en toepassing aan een elektrochemische Aptasensor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, X., Diao, D., Lu, Z., Han, Y.,… More

Wu, X., Diao, D., Lu, Z., Han, Y., Xu, S., Lou, X. Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor. J. Vis. Exp. (133), e56814, doi:10.3791/56814 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter