Summary
生体外の選択グループ特定フタル酸エステル結合 DNA アプタマーのキャラクタリゼーションのためのプロトコルが表示されます。電気化学 aptasensor で選択したアプタマーのアプリケーションが含まれています。
Abstract
フタル酸エステル (パエス) は残留性有機汚染物質の主要なグループの一人。・ パエスのグループ固有の検出が同族体の急速な成長のために望ましい。DNA アプタマーは、ますますバイオ センサー プラットフォーム上の認識要素として適用されているが、パエスなどの高い疎水性小分子目標に向かって選択するアプタマーはほとんど報告します。この作業では、・ パエスに DNA アプタマーの探索グループ特定を選択するように設計ビーズ法について説明します。アミノ基修飾フタル酸ジブチル (DBP NH2) アンカー ターゲットを合成し、エポキシ活性化アガロース ビーズに固定化した、固定マトリックスの表面でフタル酸エステルのグループの表示を許可してしたがって、グループ固有のバインダーの選択。我々 は、磁気分離と結合の定量的重合連鎖反応によるアプタマー候補の解離定数を決定しました。相対的な親和性と選択性他のパエスにアプタマーの競争の試金によって定められた磁気ビーズを添付アプタマー候補あった DBP NH2限定事前どこと培養上清にリリーステスト ・ パエスまたは他の潜在的な妨害物質。競争の試金は、表面固定化のための機能グループがなかった・ パエスの安易な親和性の比較を提供されるために適用しました。最後に、我々 は電気化学 aptasensor の作製を実証し、bis(2-ethylhexyl) フタル酸の超高感度かつ選択的な検出のためにそれを使用します。このプロトコルは、他の疎水性小分子のアプタマー探索の洞察力を提供します。
Introduction
急速な経済発展に伴って、工業化と都市建設公害の加速は今までよりもより厳しいです。代表的な環境汚染物質は、重金属、毒素、抗生物質、農薬、内分泌攪乱物質、残留性有機汚染物質 (POPs) に含まれます。金属イオンおよび毒素のほか他の汚染物質が低分子化合物がかなり多くの場合は、同族の様々 な。たとえば、最も有毒なポップス、ポリ塩化ビフェニル (Pcb)、多環芳香族炭化水素 (PAHs)、ポリ臭化ビフェニル エーテル (PBDEs)、ポリ塩化ジベンゾ-p-ジオキシン (ダイオキシン類)、ポリ塩化ジベンゾ フラン (濃度)、フタル酸と酸エステル (パエス)1、2、すべて多くの同族体から成っています。小分子の検出は、アプリケーション3,4,5,6の多様性のためのクロマトグラフィー/質量分析法を用いたテクニックで主に行われています。オンサイト検出の抗体を用いた方法は最近開発された7,8,9をされています。ただし、これらのメソッドは特定の同族体に非常に特有なので、複数のテストを実行する必要があります。深刻なは新規の同族が非常に高速にその抗体を生成できないことを成長します。したがって、1 つのテストですべての同族体のレベルの合計を監視するグループ固有のバイオ センサーの開発は環境汚染状況を評価するため非常に貴重な指標を提供可能性があります。
最近、核酸アプタマーは広く様々 なイオンと蛋白質と細胞10,11 小分子化合物からのターゲットを認識の彼らの能力のための様々 なバイオセンシング プラットフォームの認識要素として適用されています。 ,12。アプタマーは、指数関数的濃縮 (SELEX)13,14によって配位子の系統進化と呼ばれる体外法によって識別されます。SELEX から始まるランダム合成一本鎖オリゴヌクレオチド ライブラリは、約 10 の14-1015シーケンスが含まれています。ランダムなライブラリのサイズは、RNA または DNA 候補構造の多様性を保証します。SELEX の典型的なプロセスは、ライブラリが高い親和性と特異性をターゲットのシーケンスで濃縮されてまで濃縮の複数のラウンドで構成されます。最終的な豊かなプールがシーケンスをサポートしと解離定数 (Kd) と妨害物質などさまざまな手法によって決定されます潜在的な選択性フィルター、アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー、表面のバインディングプラズモン共鳴 (SPR)、等。15
非常に貧しい人々 の水の溶解度と表面固定化機能群の不足、Pop のアプタマー選択は理論的に難しい。SELEX にとって重要な進歩がアプタマーの探索を高速化します。しかし、Pop のグループ固有のアプタマーの選択はまだ報告されていません。これまでのところ、特定の同族体の高度だけ基板結合 DNA アプタマーの探索は、識別された16をされています。パエスはポリ塩化ビニール材料、硬質プラスチックから、弾塑性解析、可塑剤として作用するポリ塩化ビニルを変更することで主に使用されます。いくつかのパエス内分泌かく乱物質として識別されている、深刻な損傷を引き起こすことができる肝臓と腎臓機能、男性の精子の運動性の軽減、精子形態の異常および精巣癌17があります。化合物 - もグループ固有 PAE バインディング アプタマーが報告されています。
この作業の目的は、ポップスの代表的なグループ ・ パエスといった高疎水性の小さな分子に DNA アプタマーの探索グループ特定を選択するための代表的なプロトコルを提供するためにです。また環境汚染検出のため選択したアプタマーのアプリケーションを示します。このプロトコルは、他の疎水性小分子のアプタマー探索の指導と洞察力を提供します。
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Protocol
1 図書館およびプライマーの設計と合成
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最初のライブラリおよびプライマーを設計します。
ライブラリ (プール0): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-N40-CCTTTCTGTCCTTCCGTCAC-3'
プライマー (FP) を転送: 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-3'
逆プライマーをリン酸化 (PO4RP): 5'-PO4- GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3' - プール0FP、PO を合成4- RP 標準ホスホロアミダイト化学18,19、20を使用して標準的な高速液体クロマトグラフィー (HPLC)21すべての Dna を浄化。
- プール0FP、PO を再構成4- ヌクレアーゼ フリー グレードで RP 100 μ M、分注で水し、-20 に格納または 1 年間-80 ° C。
注: プール0FP と PO を格納すること強くお勧め4可能なクロス汚染を避けるために 10-20 μ 因数で RP。
2. アンカー ターゲットとその固定化エポキシ活性化アガロース ビーズを合成します。
- アンカー ターゲットとして、アミノ基修飾フタル酸ジブチル (DBP NH2) を合成します。
注: 合成と DBP NH2の評価実験の詳細は文献22に記載されています。 - アンカー ターゲット溶解度の適切な媒体でターゲット在庫ソリューションを準備します。この研究のため 100 mM DBP NH2ジメチルスルホキシド (DMSO) で原液を準備し、4 でソリューションを格納または-20 ° C、最大 1 年間。
- DBP NH2メーカーから修正されたプロトコルに従ってエポキシ活性化アガロース ビーズを固定します。
- エポキシ活性化アガロース ビーズの凍結乾燥粉末を 0.1 g を量り、蒸留水にそれを中断します。いくつかの因数で水 20 mL の蒸留水を使用して 1 h の中を洗ってください。0.2 M Na2CO3 (pH 12) 中を洗ってください。
注: 媒体はそれに水を追加した直後に膨らみます。 - DBP NH2 (46.7 mg、0.15 ミリ モル) を 500 μ L 結合バッファー (0.2 M Na2CO3バッファー) に溶かしてください。
- 媒体は配位子を含む結合ソリューションをミックスします。5 rpm でシェーカーを使用すると、室温で 48 時間。
- 0.1 M 酢酸緩衝液 (pH 4.5 0.5 M NaCl) を使用して順に 3 回、製品の洗浄を繰り返し、各洗浄サイクルの炭酸塩バッファー (0.5 M NaCl、pH 12) の 0.2 M。洗って、500 μ L の最終巻を作るためにプロダクトを中断します。
- 使用する前に 4 ° C で保管します。
- 元素分析によるターゲット固定化の成功を確認します。
- エポキシ活性化アガロース ビーズの凍結乾燥粉末を 0.1 g を量り、蒸留水にそれを中断します。いくつかの因数で水 20 mL の蒸留水を使用して 1 h の中を洗ってください。0.2 M Na2CO3 (pH 12) 中を洗ってください。
3. SELEX
- 500 mL の超純水や 20 mm Tris· グレードのヌクレアーゼ フリー水で PAE 結合バッファーを準備します。HCl、100 mM の NaCl、2 mM MgCl2, 5 mM KCl、1 mM CaCl21 %polyoxyethy レネ (20) sorbaitan monolaurate、および 0.03% 非イオン性界面活性剤 (pH 7.9)。滅菌 0.22 μ m 硝酸セルロース フィルターを介してバッファーをフィルター、ヶ月の 20 ° C より高い温度で保存できます。
注: PAE 結合バッファーでパエスの良好な分散状態を維持するために重要です。複数の界面活性剤の種類は、パエス水溶液への溶解度を高めるために必要です。ただし、界面活性剤の数は、PAE 分子カプセル化界面活性剤ミセルの形成を避けるために最小限に抑える必要があります。非イオン界面活性剤は簡単に 20 の ° C より低い温度で沈殿し、したがってバッファーを 20 ° C 以上の高温で保存する必要があります。 - PAE 結合バッファーの 490 μ L で 100 μ M プール0(~1.0 nmol 1014-1015シーケンス) の 10 μ L を希釈します。5 分間氷の上管 95 ° C 10 分の場所で水のお風呂セットで薄肉管遠沈管にプール0因数 (5 × 100 μ L) を加熱し、その後室温 (この作品で ~ 25 ° C) で 5 分間チューブを孵化させなさい。
- 選択範囲の最初のラウンド: プール0と DBP−NH2−coated 培地による培養。
- DBP−NH2−coated 媒体を 200 μ l 添加を PAE 結合バッファーの 500 μ L で 3 回洗います。ミックス DBP−NH2−coated 媒体は0をプール、小さな揺れの下 1 時間室温で混合物を孵化させなさい。
- 別 DBP−NH2−coated 中縛られてアプタマーと非連結の Dna から 100 kDa の分子切断を限外ろ過不適切限外ろ過チューブ。4 ° C で 10 分間 9,168 × g で媒体を PAE 結合バッファーの遠心分離機 500 μ L で 3 回洗浄します。
- 選択範囲の最初のラウンド: DBP−NH2−coated メディアからアプタマー溶出します。
- 洗浄中、熱振動の下で 9 分間の 90 ° C で混合物に PAE 結合バッファーの 50 μ L を追加します。
- 限外濾過法による溶出の Dna を含む上清を収集します。この溶出過程を 3 回繰り返すよりバインドされた Dna を回復します。
- 選択範囲の最初のラウンド: PCR
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小規模な PCR
- 小規模な PCR23 (4 × 20 μ 因数) 15 〜 30 を使用してを実行サイクル。24 PCR 反応を次のように設定: RNase フリー水 6.5 μ、10 μ M の各プライマーの 1 μ L (FP、PO4RP 0.01 nmol)、1.5 μ L 溶出セクション 3.4 (または陰性対照として RNase フリーの水) からプール、予混合の 10 μ L の反応混合物を含むdNTPs、ホット スタートのポリメラーゼおよび 2 × PCR 反応バッファー (20 mM tris·HCl、100 mM KCl、3 mM MgCl2、pH 8.3)。
- PCR サーマルサイクラーを使用して次の設定を実行: 95 ° C、1 分; の 1 サイクル30 サイクルの [95 ° C、30 s; 56 ° C、30 s; 72 ° C、30 秒];4 ° C で 72 ° C、2 分の 1 サイクル楽器は、拡張ステップ、15、20、25、20th秒と 30 サイクル、pause キーを押して実行する中に、計測器カバーを開く、1 つのチューブに乗りし、PCR を再開するもう一度一時停止キーを押します。
- 12% 変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ)25,26を準備します。尿素、超純水、10 × トリス/ホウ酸の 1 mL の 6 mL の 4.8 g をミックス/エチレンジアミン四酢酸 (TBE)、40% アクリルアミドの 3 mL、10 μ L のテトラメチルエチレンジアミン (TEMED) と 100 μ L 10% 過硫酸アンモニウム (AP)、その順序で。よくかき混ぜて、完全に凝固するゲルを確実に 1.5-2 時間待ちます。
- サイクルの最適化の結果の分析: 5 μ L の RNA 読み込みバッファー (62.5% ホルムアミド、0.4 M ホルムアルデヒド、1.25×3-(N-morpholino) propansulfonic 酸緩衝液、0.02% キシレンシアノール FF、0.02% ブロモフェノール ブルー) との 4 μ L 各 PCR の製品の 1 μ L を組み合わせるRNase フリー水;95 ° C 10 分の混合物を熱するし、すぐに氷の上の 0 の ° C に冷やしてください部屋の温度で 5 分間インキュベートします。12% の 5 つの井戸に負荷変性ページ;45 分の 170 V で 1 × TBE バッファー内垂直電気泳動システムで電気泳動を実行します。
- 電気泳動、染色 1 × 核酸ゲルの 3 μ L をゲルを 10 分の 1 × TBE バッファーの 30 mL で汚し、ゲルのイメージを取る後。
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大規模 PCR:不要な副産物がなければ正しいサイズのマーカーで最高強度のバンドを生成するサイクルの適切な数を選択します。大規模な PCR (20 × 100 μ 因数) 利用条件と適切なセクション 3.5.1 で決定サイクル数を実行します。
注: ことができる単一座礁させたライブラリの最終的な金額は PCR テンプレートのない濃度の総量に比例。通常、ライブラリの 1 nmol を得るためには、一本鎖のプールは 2 mL PCR を必要です。PCR は非常に敏感、容易に外 dna 汚染されました。手順は、手袋、滅菌のヒントを使用して、ないチューブに唾を吐き、遠心分離前に PCR チューブのキャップが開かないなどの汚染のチャンスを減らすために取られるべき。
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小規模な PCR
- 選択範囲の最初のラウンド: エタノールの沈殿物によって PCR の製品の浄化。
- PCR の混合物の 2 つの管を 1 つの管 (各 200 μ L) にまとめた。すべてのチューブのため、この手順を繰り返します。
- 各チューブに-20 ° C で (3 M, pH 5.2) 酢酸ナトリウム溶液 15 μ、DNA ・ RNA の沈殿物キャリア ソリューションの 4 μ L と 2.5 倍量の予冷エタノールを追加します。均等にそれらをミックスします。
注: DNA ・ RNA の沈殿物のキャリアは広くエタノール沈殿実験し低濃度の DNA ・ RNA の回収率を大幅に向上します。PCR やシーケンスなどの下流のアプリケーションと干渉しません。 - 4 ° C で 20 分間 20,627 × g で混合物を遠心分離機し慎重に上澄みを廃棄し、白色沈殿物を残します。
- 70% の沈殿物を洗うように各管に-20 ° C でエタノールを予冷の 400 μ L を追加します。4 ° C で 5 分間 20,627 × g で混合物を遠心分離機し慎重に上澄みを廃棄し、白色沈殿物を残します。洗浄ステップをさらに 2 回繰り返します。
- チューブ カバーを開く封止膜を刺す白い沈殿物が透明になるまで暖房のブロックに 40 ° C で揮発エタノールができます。-20 ° C で沈殿物を保存します。
注意: 精製 PCR の製品が-20 ° C で保存することができます。
- 選択範囲の最初のラウンド: 一本鎖 DNA ジェネレーション (ジェネレーション濃縮プール1) リン酸化逆鎖を消化する λ exonuclease 反応を実行することによって。
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小規模な λ exonuclease 反応
- セクション 3.6 精製 PCR 産物を含む 1 つのチューブに RNase フリー水の 100 μ L を追加します。渦管の沈殿が完全に溶解する管。
- 5 遠心チューブを用意し、各チューブに無料の水と 2 μ L 10 × 反応バッファー (670 mM グリシン-KOH、25 mM MgCl2 0.1% (v/v) トリトン X-100 pH 9.4) の上記の解決策は、rnase - 11 μ L の 5 μ L を追加します。
- 2 μ L の水またはこれらの管に 2 U、5 U、8 U、10 U λ exonuclease をそれぞれ含む希薄 λ exonuclease ソリューションを追加します。軽くピペッティングでよくソリューションを混ぜます。10 × 反応バッファーは、プロバイダーを λ exonucleasefrom と一緒に提供されます。
- 37 ° C、80 ° c、15 分で 35 分間チューブを孵化させなさい、4 ° C で保持
- 12% ネイティブ ページを準備します。超純水、10 × TBE、40% アクリルアミド、TEMED の 10 μ L、100 μ L の 10% の 3 mL の 1 mL の 6 mL を混ぜて AP の場合、その順序で。よくかき混ぜて、完全に凝固するゲルを 60-90 分待ちます。
- 各反応染料と RNase フリーの水の 4 μ L 読み込み、およびこれらの混合物を読み込んで 12% ネイティブ ページ (45 分 150 V) の 5 つの井戸の 1 μ L で 5 μ L を組み合わせることによって、反応の結果を分析します。
注: ゲルの 20 bp 二本鎖 DNA の梯子を読み込むもできますが、ない必要があります、ゲルの PCR の製品と生成された単一の孤立したライブラリの明瞭なバンドを示すので。
注: λ exonuclease 反応の構造に高い選択性があります。(アンチセンス鎖は 5' 末端にリン酸基を持つラベル) 二本鎖 PCR の製品は、非常に広い濃度範囲 (図 4) で λ exonuclease の存在下での単一座礁させたライブラリに完全に消化できます。小規模 λ exonuclease 反応の単一座礁させた DNA を生成できます完全に λ exonuclease の最小量は、大規模な λ exonuclease 反応も使用されます。Λ exonuclease はその構造の選択性と製品の収率を失うことがなく広い濃度範囲でよく動作するので、λ exonuclease の高濃度も使用可能性があります。Λ exonuclease 反応は、塩の高い濃度で抑制されます。PCR の製品の不完全な消化力は通常 PCR の製品にあまりにも多くの塩が存在することを意味します。エタノールの沈殿物 (セクション 3.6) によって PCR の製品の浄化は、イソプロパノールの沈殿物かなり頻繁により精製 PCR の製品にあまりにも多くの塩が含まれている通常このステップとの互換性。
- 大規模な λ exonuclease 反応:大規模な λ exonuclease 反応の単一座礁させた Dna を生成ことができます完全に λ exonuclease の最小量を選ぶ。反応がこの条件によると比例してスケール アップ。たとえば: 2 U が必要な λ exonuclease の最小量の場合のミックスには、Rnase フリー水の 38 μ L、バッファー x 10 の 10 μ、50 μ L の DNA プール1 10 U/μ L λ exonuclease の 2 μ L。
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小規模な λ exonuclease 反応
- 選択の最初のラウンド:エタノールの沈殿物によって単一座礁させたプール1の浄化。
- 3.6 ステップの指示に従います。
- 濃度精製プール1 260 UV 吸収を決定する nm。
- PAE 結合バッファーの適切なボリュームで 90% 精製プール1を再構築します。選択の次のラウンドのために得られた十分な DNA が存在しない場合は、セクション 3.5 3.8.2 を繰り返します。
注: PAE 結合バッファーのボリュームは図書館と SELEX の次のラウンドでライブラリの目的の最終的な集中量に応じて 500 μ L に 200 から通常によって異なります。
- 2 番目、3 番目、4 番目、および 5 SELEX のラウンド。
- 第四に、第三に、第二を行うし、SELEX その後同様の手順の 5 番目のラウンドは上記 (セクション 3.2 3.8) ~ 300 pmol ライブラリが選択の金詰りを高めるため入力されたことを除いて。
- 媒体に DNAs の無指定の吸収を最小限に抑えるためシェーカー 3 番目で 30 分間に変更されていない中でプールを孵化させなさいし、DBP−NH2−coated 培地で培養する前に選択範囲の第 4 ラウンドします。
注: SELEX のプロセスが大量のゲルに移行しなかった高分子量製品によって明らかに Dna の深刻な橋渡しのため第 5 ラウンドで終了しました。
4. 高スループット シーケンス
- 互換性のあるプライマーによる PCR 増幅シーケンスのセクション 3.9.2 からプール4を準備します。
- 設計・合成 6 インデックス付き前方プライマー シーケンス解析を容易にする 5 ' 端に nt。
前方プライマー (FP シーケンス) をインデックス: 5'-agtacgaTCCCACGCATTCTCCACATC-3' - 1,000 µLPCR 反応を次のように設定: RNase フリー水 380 μ、10 μ M プライマーを各 50 μ L (PO4FP 配列-RP、0.5 nmol)、セクション、3.9.2 から溶出したプールの 20 μ L と 500 μ L の予 dNTPs を含む反応混合物、ホット スタートのポリメラーゼ、および 2 × PCR 反応バッファー。約数 10 PCR チューブに混合物。3.5.1.2 のセクションで説明されているように同じの PCR 条件を使用します。
- 設計・合成 6 インデックス付き前方プライマー シーケンス解析を容易にする 5 ' 端に nt。
- シーケンス処理施設の要件を満たすために PCR の製品を浄化します。たとえば、製造元の指示に従ってページ-ゲルの DNA の回復キットを使用します。
- シーケンス機能によって必要な送料の条件下でシーケンス処理施設に浄化された PCR の製品 (〜 2 μ g) を送信します。たとえば、徹底的にシーケンス処理施設に氷のパックで密封のキャップが遠心分離機管の PCR の製品を出荷します。
注: は、シーケンス処理されたプールの充実を評価するために各シーケンスのコピー数に応じてシーケンスをランク付け結果を受け取った。トップのシーケンスは、DBP 1 が命名された (5'-CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT-3')。その親和性と選択性は、次のプロトコル (セクション 5 と 6) により測定しました。セクション 7 で電気化学的にバイオセンシングへの応用をその後示した。
5 しますKd Magnetic Bead-Based 定量的 PCR (qPCR) を使用して選択したアプタマー候補決定。
- DBP 1 qPCR および標準ホスホロアミダイト化学を使用してプライマーを合成し、標準的な高速液体クロマトグラフィーによる浄化します。
アプタマー候補 (DBP-1-qPCR): 5'-ATACCAGCTTATTCAATTCTTTCTGTCCTTCCGTCACATC CCACGCATTCTCCACATAGATAGTAAGTGCAATCT-3'
QPCR (FP qPCR) のためのプライマーを転送: 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3'
逆に qPCR (RP qPCR) のためのプライマー: 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3'
注: テスト シーケンスのプライマー領域は、プール0 3 のセクションで使用のものとは異なる。プライマーの領域を変更の目的は、単独で、プライマー地域を除くコア シーケンスのアフィニティをテストすることです。 - 製造元の指示に従ってカルボン酸をコートした磁気ビーズに DBP NH2を固定します。
- 25 mM 2-(N morpholino) で 2 回カルボン酸をコートした磁気ビーズを洗う ethanesulfonic 酸 (MES) (pH 5.0) を使用して磁気ビーズ (100 μ L) の等量戻バイアル (エンド オーバー エンドまたは類似の) 良い混合と 10 分のため。
- 使用前にすぐに冷たい 25 mm MES (pH 5.0) 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) カルボジイミド塩酸塩 (EDC) 溶液 50 mg/mL を準備します。
- 使用前にすぐに 50 mg/mL の冷たい 25 mm MES (pH 5.0) N ヒドロキシスクシンイミド (NHS) 溶液を準備します。
- EDC ソリューションを 100 μ l 添加し、NHS 溶液 100 μ L を混ぜて洗浄ビーズと遅い傾斜回転室温で 30 分間インキュベートします。
- 孵化後 4 分のための磁石にチューブを入れて、上澄みを廃棄し、ビード冷たい 25 mM MES (pH 5.0) の 100 μ L で 2 回洗浄しなさい。
- 6 μ 100 mM DBP NH2原液と 25 mM MES (pH 5.0 290 μ L) 5 rpm の低速傾斜と少なくとも 30 分室温でまたは 4 ° C で 2 h 回転下活性化ビーズをインキュベートします。
- 孵化後 4 分のための磁石にチューブを入れ、上澄みを廃棄します。4 回コーティングを施したビーズを洗浄し、使用するまで PAE 結合バッファーと 4 ° C でストアの 200 μ L でビーズを再懸濁します。
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Kdは、滴定曲線を収集します。
- 300 13 から PAE 結合バッファーに様々 な濃度で DBP 1 ソリューション (500 μ L) のシリーズを準備 nM。
- DBP NH2の 10 μ L を追加-各 DBP 1 ソリューションに 5.2.7 セクションで説明した磁気ビーズをコーティングします。回転の下で室温で 1 時間インキュベートします。
- 4 分のための磁石にチューブを置き、上澄みを除去します。4 回使用して 200 μ L PAE 結合バッファーのビードを洗います。
- 各チューブに PAE 結合バッファーの 60 μ L を追加します。95 ° c で 15 分間収集管磁気分離による溶出の DBP 1 を含む上清を孵化させなさい。連結 DBP 1 を回復するには、この溶出過程を繰り返します。
- 想定し, 浸出液ソリューションを 100 倍希釈し、リアルタイムの qPCR の 3 μ L を取る。QPCR 反応を次のように設定: RNase 自由水の 3 μ、10 μ M の各プライマーの 2 μ L (FP、PO4RP 0.01 nmol)、3 μ L の溶出し、DBP-1、希釈、10 μ L の予 dNTPs、ポリメラーゼおよび 2 x PCR 反応バッファーを含む反応混合物。
- QPCR サーマルサイクラーを使用して次の設定を実行して、各サンプルの DBP 1 の数字を決定: 95 ° C、30 の 1 サイクル s;30 サイクルの [95 ° C、30 s; 45 ° C、30 s; 72 ° C、30 秒];72 ° C、30 s および 4 ° C で開催の 1 サイクル
- 滴定曲線をプロットし、1:1 の結合比27と仮定すると曲線の非線形当てはめによってKdを決定します。
6. 相対的親和性と競争の試金による特異性試験
- DBP NH2の 10 μ L を追加-DBP 1 ソリューション (500 μ、1 μ M) に磁気ビーズをコーティングします。回転の下で室温で 1 時間インキュベートします。4 分のための磁石にチューブを置き、上澄みを除去します。4 回は PAE 結合バッファーの 200 μ L を使用してビーズを洗浄し、PAE 結合バッファーの 10 μ L でそれを再懸濁します。
- DBP NH2の 10 μ L を追加-各 10 μ M の 110 μ L に DBP 1 コーティング媒体バインド テスト サンプル (DBP NH2DBP、DEHP、ブチル ベンジル phthalate(BBP)、重金属イオンなど)。磁気分離による 1 h. 収集上清の室温で孵化させなさい。
- 上清を 100 倍希釈し、qPCR 定量化のため 3 μ L を取る。QPCR 反応を次のように設定: RNase 自由水の 3 μ、10 μ M の各プライマーの 2 μ L (FP、PO4RP 0.01 nmol)、3 μ L の溶出し、DBP-1、希釈、10 μ L の予 dNTPs、ポリメラーゼおよび 2 x PCR 反応バッファーを含む反応混合物。
- QPCR サーマルサイクラーを使用して次の設定を実行して、各サンプルの DBP 1 の数字を決定: 95 ° C、30 の 1 サイクル s;30 サイクルの [95 ° C、30 s; 45 ° C、30 s; 72 ° C、30 秒];72 ° C、30 s および 4 ° C で開催の 1 サイクル
- DBP 1 DBP 1 PAE 結合バッファーのビードからリリースの数によってサンプルの存在下でビーズからリリースの数を割ることによって相対的な親和性を計算: 相対的親和性 = Nサンプル/Nバッファー。
7. 作製と DEHP 電気化学バイオ センサーの電気化学測定
- チオール コア シーケンス (HS-DBP-1) と標準ホスホロアミダイト化学を用いた信号プローブ (DBP 1 C Fc) を合成し、標準的な高速液体クロマトグラフィーによる浄化します。
HS-DBP-1:5 ' - HS を-(2CH)6- CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT-3'
DBP-1-C-Fc: 5' - GATGTGACGGAAGGTTTTTTTT-(2CH)6Fc-3'
注: センサー プローブの合理的な設計は、私たち以前の pbulications18,22で説明しました。 - HS DBP 1 と 100 μ M、分注、グレードのヌクレアーゼ フリー水の DBP-1-C-Fc を再構成し、-20 に保管または 1 年間-80 ° C。
- 5 分間 microcloth に 1、0.3 0.05 μ m Al2O3粉末と鏡のような表面を慎重に金電極を磨くし、残留 Al2O3を削除する 5 分間超純水で超音波。+1.2 V、0.4 から 35 連続サイクリックボルタンメトリー (CV) のスキャンによる電気化学的研磨加工で電極をきれい (Hg Hg2対など4) 0.5 M H2SO4 100 mV/秒で。
- 0.5 μ M HS DBP 1 と 0.5 μ M の混合物を準備, pH 7.4 (PBS) 1 M の NaCl を含む 100 μ L 10 mM リン酸緩衝で DBP-1-C-Fc。10 分、95 ° C で水のお風呂セットで薄肉・遠心管中混合物を熱し、ゆっくりと部屋の温度に混合物を冷却します。
- トリス-(2-carboxyethyl) ホスフィン塩酸塩 (TCEP、10 mM、貯蔵液) 1 μ L を混合物に追加します。1 時間室温で維持します。
- 12 時間は、上記の解決策できれいな金の電極を浸したり、室温で一晩します。
- PBS で電極を洗浄し、1 mM [S (2CH)2(OCH2CH2)6OCH3]2の電極を浸す (例えば HS6- 青梅) 1 のため PBS で PAE を使用して徹底的に電極を洗うバッファーをバインドおよび PAE 結合バッファーで電極を浸します。
- ターゲット無料 PAE 結合バッファーで背景の矩形波ボルタンメトリー (SWV) スキャンを取る。
- きれいにすべての実験装置: 電解槽、ゴールドの作用電極、白金対極、カロメル参照電極 (SCE)。
- インストールされているソフトウェアをアクティブにします。SWV 測定の実験的パラメーターを設定します。
注: 次の実験的パラメーターあった SWV 実験用: 潜在的な範囲: から-0.2 0.7 V;変調振幅: 25 mV。パルス幅: 5 ms。スキャン レート: 50 mV/秒;潜在的なステップ: 1 mV。 - 電極、白金対極、SCE、ポテンシオスタットにして金を接続し、PAE 結合バッファーを含む電解セルにこれらの 3 つの電極を置きます。
- SWV の測定を実行します。
注: 一度 SWV 測定開始 SWV 曲線になります、コンピューターの画面に表示されます。スキャンは、スキャンは定数であり、ピークの高さや形状のさらなる変更は観察されるまで繰り返されます。
- DEHP 濃度を含む PAE 結合バッファーで作用電極を浸す (例えば22) 室温で 30 分間。PAE 結合バッファーを使用して徹底的に電極を洗浄し、対向電極と SCE の PAE 結合バッファーで電極を浸します。セクション 7.8 で説明した同じ条件下で SWV 曲線を収集します。
- 繰り返しステップ 7.9, ことを除いて DEHP 濃度 (例えば100 pM、1 nM、10 nM、100 nM、1 μ M) 順番に増加しました。滴定曲線をプロットします。
- 特異性テスト:DEHP を含む PAE バインド バッファーは必要な濃度で潜在的な妨害物質を含む PAE 結合バッファーに置き換えられますことを除いて 7.3 7.9 の手順を繰り返します。
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Representative Results
私たちは設計・ アンカー ターゲット (図 1 階) として、アミノ基修飾フタル酸ジブチル (DBP NH2) を合成します。・ パエス DBP NH2を使用してアンカー ターゲットとして、次の古典的なターゲット固定ベース メソッド (図 2) の DNA アプタマーの選択を行った。各ラウンドでパイロットの PCR は PCR (図 3) のサイクル数を最適化する変性のページを用いて行った。高いサイクル数でネイティブのゲルに疑われる高分子量副産物が実際に架橋複合体である我々 と他の同僚を発見したので変性] ページで、ネイティブのページの代わりにお勧め適切なサイズのシーケンス。したがって、変性のページのバンドの強度は本当に適切な製品の量を反映できます。単一の孤立した DNA 生成は別の重要なステップと、このステップのための多くの方法が報告されている28をされています。Λ exonuclease 消化法は、最も安い方法です。単一座礁させた DNA の生成の成功はネイティブ] ページで、PCR の製品のようで便利にチェックできます (SELEX の最初のいくつかのラウンド) を単一または複数のバンド、のみ 1 つのバンドは (図 4) 消化後は表示します。
5 番目は (前記 Dna を 2 TBE-含む × 8.3 M 尿素 10 分 95 ° C で加熱します) 変性治療後も、ページの上部に蓄積された DNA のかなりの量のための選択のラウンド後、SELEX が停止しました。、Dna の間深刻な架橋を示唆し、指摘したシーケンスを濃縮しました。したがって、プール4は、高スループット シーケンスのために送られました。高スループットの結果を示した最も頻出シーケンスをするトップ 100 が高度に保存された、一つの家族からあった。トップ シーケンス DBP 1 ナノモル親和性 (図 5) と良いグループ特異性を PAE 同族 (DBP、BBP、DEHP) に表示されます (図 6) を介してプロトコル セクションの便利な qPCR の試金。
DBP 1 はそれに応じてストランド変位に基づく電気化学 aptasenor を構築に使用されている我々 の既報に働く29。DEHP センサーは、DEHP (図 7) に敏感、選択的に応答できます。似たような官能基を持つ小分子、抗生物質、重金属イオンなど一般的な環境汚染物質は、DBP 1 に非常に弱い反応を示した。
図 1: 化学構造 (A) ・ パエス、BBP (B)、(C) DBP、(D) (E) 4 OH DEHP、(F) DBP−NH2DEHP 。この図は、韓裕らの許可を得て転載されています22この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: グループ固有の DNA アプタマー選択手順・ パエス DBP NH2アンカー ターゲットとして使用します。この図は、韓裕らの許可を得て転載されています22この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 代表に起因する変性のページを使用して PCR サイクル最適化します。左から右に、車線を表す: 20 bp DNA ラダー標準、15 サイクル (DNA テンプレートなし)、20 サイクル (DNA テンプレートなし)、25 サイクル (DNA テンプレートなし)、30 サイクル (DNA テンプレートなし)、15 サイクル、20 サイクル、25 サイクル、および 30 のサイクル。最適な条件は、単一の製品バンドところ不要な副産物がなければ高強度でさらに、空白の対応するコントロールにバンドが認められず 25 サイクルで観測しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: ネイティブ] ページを使用してリン酸化繊維を消化する λ exonuclease 反応の最適化。左から右に、車線を表す: 20 bp DNA ラダー標準、負 (λ exonuclease ない)、2 u、5 u、8 u、および 10U。最低限酵素の 2 u、ダブルの PCR の製品が一本鎖 Dna になる観測されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: qPCR ベースアッセイ DBP 1 のアフィニ ティー測定。Kdのエラー (標準偏差、SD) は、同じサンプルの 3 つの測定から計算しました。この図は、韓裕らの許可を得て転載されています22
図 6: 無料 DBP NH2 (10 μ M)、DBP の DBP 1 の相対的親和性測定 (10 μ M)、DEHP (10 μ M)、BBP (10 μ M)、酢酸エチル (10 μ M)、安息香酸 (10 μ M)、フタル酸 (10 μ M)、および他の競争の試金を経由します。その他: 10 μ M のすべての潜在的な干渉 (グルコース、カナマイシン、アンピシリン、エタノール) の混合。率 (相対的親和性) は、PAE 結合バッファーのビードからリリース アプタマーの数によってサンプルの存在下でビーズからリリース アプタマーの数で除して算出しました。バーを表す平均 ± SD.SDs は、3 つの個々 の測定値から算出しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: DEHP の超高感度と ultraselective の検出用 DEHP 電気化学バイオ センサー: メカニズム (A)、SWV 曲線 (B)、(C)、校正曲線と選択性をテスト (D).エラー (SDs) は、3 つの個々 の測定値から算出しました。この図は、韓裕らの許可を得て転載されています22この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
アプタマーの顕著な利点の 1 つは抗体が生体内で免疫反応を介して生成された SELEX、体外法によって識別されます。したがって、アプタマーは抗体が生理的条件に限定しているに対し、適切に設計された実験条件下で目的のターゲット特異性と選択できます。
無料シーケンスからバインドされたシーケンスの分離を容易にするいくつかの変更された SELEX 最近報告されている、キャピラリー電気泳動30、31マイクロ流体、磁気/アクリル ビーズ/アガロース ビーズ14、 など、硝酸セルロース フィルターまたはより効率的な分離を達成するために親和性列に置き換えています。ビーズ法これらの技術の間で簡単なため小分子ターゲットのアプタマー選択のため最も広く使用されているセットアップ、簡単操作、および小分子の解析に適しています。
小さな分子のアプタマー選択の一般的に使用されるメソッドの 2 つのグループがある: ターゲット13と図書館14固定ベース メソッド。メソッドの元のグループの機能性磁気ビーズや共有結合の結合反応を介してアガロース ビーズなどの固相に小分子ターゲット固定されています。ライブラリに孵化する小分子コーティングを施したビーズを固相のターゲットに弱くバインドまたはバインドしないでくださいこれらのシーケンスは、洗濯と遠心分離または磁気分離のステップを実行することによって単に削除されます。連結シーケンスはその後溶出、PCR によって増幅されます。小分子ターゲット カップリング反応に使用できる、少なくとも 1 つの機能グループが必要です。適当な官能基を持たない、機能グループは、有機合成によって元のターゲットに組み込まれます。注意深く設計されたターゲットの合成は、複数のステップを含むことができるし、同様非常に困難があります。ターゲットの構造の変更を結合部位と、アプタマーとの親和性も強く影響します。これらの問題を避けるためにライブラリの固定ベースの方法を開発されている、ライブラリに相補的な交配磁気ビーズで DNA キャプチャ プローブしターゲットの間でバインド時にビード落ちるバインド シーケンス。メソッドのグループ、結合バッファーでターゲットを追加し、官能する必要はありません。パエスはフタル酸酸のエステル誘導体であり、典型的な PAE は、フタル酸エステルのグループと 1 つまたは 2 つのアルキル鎖 (図 1 a~ D) で構成されています。パエスは固相固定で利用できる機能グループをあります。したがって、ライブラリの固定ベースのメソッドはパエスのアプタマー選択のより魅力的に見えます。
よく管理された分散状態は、SELEX を経由してライブラリの目的の濃縮を確保するため重要です。ただし、パエスは非常に疎水性であり、分散を容易にするために複数の界面活性剤の存在下でも、数 μ M よりも高い濃度の水溶液中で容易に形成します。したがって、パエスの分散状態がコントロールするは難しい、それは個々 の PAE 分子に特異結合するアプタマーを選択することは困難でしょう。容解性の問題を解決するためにどのパエスの共有結合を介して親水性のビーズに固定化したターゲット固定方法は選ばれました。この固定化戦略を使用して、ターゲットは優性の集計ではなく、単一の分子状態でビーズ表面に存在する必要があります。
アンカー ターゲットの構造の設計もグループ固有のアプタマーの選択に失敗しないために非常に重要です。3 つの要因は、構造設計を考慮する必要があります。最初の要因は、アプタマー選択の目的です。グループ固有のアプタマーを選択する目的を考慮したアプタマー バインディングのパエスの共通のグループを公開し、アプタマーのバインディングに参加しているから残りの部品を防ぐため不可欠です。機能グループはこのように、側鎖のターミナルで導入してください。初めに、アンカー ターゲットとして DEHP ああ官能基化 (4-OH−DEHP) (図 1E) を設計し、カルボン酸磁気ビーズ16で固定.したがって、アルキル鎖マトリックスの表面に露出しています。我々 は、固体のマトリックスとしてカルボキシル磁気ビーズを選択ましょう。選択の 5 つのラウンド後明白な親和性改善みられなかったされ裸の行列に無指定の吸収は強かった。
したがって、DBP NH2はその後次の考えに基づいて設計された: (1) フタル酸のグループ、特に π-π スタックとアルキル鎖; よりも水素結合を介してアプタマーとやり取りする可能性が高く(2) NHS を介したカルボジイミド反応は軽度と -NH2は DBP; のアルキル鎖の終わりに導入された、非常に効率的な結合効率(3) 固相パーティションとして磁気ビーズで動作するように簡単ですが、ライブラリの無指定の吸着が強い。分離中にアガロース ビーズの損失は磁気ビーズよりも高いが、ライブラリの無指定の吸着ははるかに低い。したがって、DBP NH2だったエポキシ活性化アガロース ビーズに固定化した、フタル酸エステルのグループは、マトリックスの表面にさらされました。
選択バッファーの選択は重要、特に多様な容解性の小分子ターゲットです。結合バッファーは集計を回避し、全体のアプタマーの選抜とその特性のプロセス中に Pop の良好な分散状態に慎重に準備する必要があります。本研究では、DEHP が 2 つの明瞭な層を示す溶解できない界面活性剤なし標準バッファーを発見しました。レイヤーは最適化された量で複数の界面活性剤添加時に表示されなくなります。明確な解決策は、その状態を維持するために 20 ° C 以上の高温で保存する必要があります。詳細は、プロトコル手順 3.1 で提供されます。
二本鎖の PCR の製品からの単一座礁させた DNA 生成は、SELEX プロセスの 1 つの重要なステップです。いくつかの異なる方法は、文献32,33の変化によって非対称的な PCR、λ exonuclease 消化、ストレプトアビジン コーティング ビーズ、磁気分離およびサイズ分離を含む現在記載されています。尿素ポリアクリルアミドのゲル。
さまざまな方法、独自の長所と短所があります。現在、ssDNA の生成のための最も一般的に使用されるメソッドは、ストレプトアビジンをコートしたビーズと磁気分離です。この方法の顕著な利点は、その時間の節約と簡単な操作です。欠点は、他の方法と比較してコストが高いです。対照的に、GC リッチ幹-ループ構造を持つ逆プライマーを使用して、サイズ分離ベースのメソッドは、単一座礁させた DNA の収量がこれらのメソッドの32の間で最も低い最も安い方法の 1 つです。このプロトコルでは、最も安価な方法の 1 つである単一座礁させた DNA を生成する λ exonuclease 消化の使い方を説明しました。単一座礁させた DNA の収量が磁気分離とストレプトアビジン コーティング ビーズの 2 つの方法に匹敵することがわかった。さらに、exonuclease 反応が塩の高い濃度で阻害されたことがわかった。文学33で報告された PCR の製品の不完全な消化力は PCR の製品にあまりにも多くの塩存在可能性があります。さらに、λ exonuclease は非常にアクティブな安価な (図 4)。
特性とアプタマーの検証は骨の折れる、時間がかかり、アプタマー探索パイプライン33の主要なボトルネックを体現しています。ほとんどの技術はより大きいアプタマー結合パートナーに適している質量に依存するメソッド (> 10,000 amu)、低分子量のターゲットとの相互作用を測定に十分に敏感ではないが、(< 1,000 amu)15。特性評価および検証・ パエスのような疎水性分子のアプタマーはさらに困難です。貧しい水溶解性のソリューションでKdの定量を防ぐことができますまたは表面のアプタマーを固定化滴定曲線の不飽和の結果します。したがって、我々 は DBP NH2容解性の問題を避けるために親水性の磁気ビーズに固定化した高スループット シーケンスによって識別されたアプタマーのKds を決定しました。相対的な親和性と選択性他のパエスにアプタマーのいた競争の試金によって決まります、アプタマー候補あった DBP NH2限定事前どこ磁気ビーズを添付し、培養上清にリリーステスト ・ パエスまたは他の物質に干渉する可能性があります。競争の試金は、表面固定化のための機能グループがなかった・ パエスの安易な親和性の比較を提供されるために適用しました。さらに、磁気ビーズを用いた蛍光アッセイは、小さな分子アプタマー相互作用34の親和性研究に適しています。しかし、我々 は磁気ビーズは、未知の理由のため蛍光消光時々 原因と発見します。したがって、qPCR の試金は親和性測定に使用されました。
本研究で記述されている電気化学バイオ センサーの 1 つの重大な技術ヒントは電極35の表面不活性化です。DEHP の疎水性が高いためそれ特異的検出の障害につながる、金電極に吸収する強い傾向があります。ほとんどの一般的表面不活性化剤、6-メルカプト-1-ヘキサノール (MCH)36,37を使用、我々 が見つかりましたその HS-(2CH)2-[OCH2CH2 間、DEHP の無指定の吸収を防ぐために十分ではないです。]6- OCH3いた DEHP38の高感度の検出を有効にするのに十分効果的です。
この手順では、電気化学バイオ センサーで高い疎水性小分子のグループ特定 DNA アプタマーの探索と選択したアプタマーのアプリケーションを選択するためのプロトコルについて説明します。プロトコルは他の疎水性小分子の選択に役立ち、高い疎水性小分子同様のセンサーの開発に洞察力を提供します。アプタマーの選択プロセスは、ターゲット固定ベース メソッドのカテゴリに属しています。このタイプの方法の制限は、このプロトコルは、たとえばアンカー ターゲットの複雑な合成の必要性とアプタマー バインディングにおける固相の影響も存在します。このプロトコルで記述されている電気化学バイオ センサーの魅力的な利点は、そのシンプルなデザインと高感度に含まれます。主な欠点は、非常に広いダイナミック レンジのための限られた精密です。したがって、ここで説明したバイオ センサーは目標の定量的な測定ではなく、スクリーニングに適しています。
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Disclosures
著者は競争の経済的利害関係を宣言しません。
Acknowledgments
国家自然科学基金 (21675112)、北京教育委員会 (KZ201710028027) と燕若い学者プログラムの首都師範大学の科学技術計画のキー プロジェクトから財政支援に感謝しております。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UV-2550 | Shimadzu,Japan | protocol, section 3.8.2 | |
| DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200 | BIO-RAD | section 3.5.1.2 and 3.5.2 | |
| C1000 Touch | BIO-RAD | section 5.3.6 and 6.3 | |
| VMP3 multichannel potentiostat | Bio-Logic Science, Claix, France | section 7.4,7.8 and 7.11 | |
| Epoxy-activated Sepharose 6B | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 10220020 | argarose beads, section 2.3 and 3.3 |
| Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beads | Invitrogen, USA | 420420 | magnetic beads,section 5.2. and 5.3 |
| Premix Taq Hot Start Version | Takara,Dalian,China | R028A | polymerase, section 3.5.1.1 |
| PARAFILM Sealing Membrane | Bemis, USA | PM-996 | section 3.6.5 |
| Lambda Exonuclease | Invitrogen, USA | EN0561 | section3.7.1.2.The 10 × reaction buffer is provided along with λ exonuclease by the provider. |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier |
Takara,Dalian,China | 9094 | section 3.6.2 and 3.8.1 |
| UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit | Sangon Biotech (Shanghai) | B511135 | section 4.2 |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Invitrogen, USA | 1811838 | nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5 |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara,Dalian,China | RR820A | polymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5 |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | CAS: 1132-61-2 | section 5.2.1 |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Invitrogen, USA | CAS: 25952-53-8 | section 5.2.2 |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 6066-82-6 | section 5.2.3 |
| mercaptohexanol (MCH) | Sigma-Aldrich | CAS: 1633-78-9 | section 7.7 |
| Gold electrode | Shanghai Chenhua | CHI101 | section 7.4. - 7.11 |
| tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | CAS: 51805-45-9 | section 7.5 |
| O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | CAS: 651042-82-9 | section 7.7 |
| diethylhexyl phthalate (DEHP) | National Institute of Metrology, China | CAS: 117-81-7 | section 7.11 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | CAS: 9005-64-5 | polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | CAS: 9002-93-1 | non-ionic surface active agent |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5368 | 10 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4 |
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