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Chemistry

Phthalic एसिड एस्टर-बंधन डीएनए Aptamer चयन, लक्षण वर्णन, और एक विद्युत Aptasensor के लिए आवेदन

Published: March 21, 2018 doi: 10.3791/56814
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 2, 1
1Department of Chemistry, Capital Normal University, 2College of Life Sciences, Capital Normal University
* These authors contributed equally

Summary

इन विट्रो चयन और समूह-विशिष्ट phthalic एसिड एस्टर बाइंडिंग डीएनए aptamers के लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है । एक विद्युत aptasensor में चयनित aptamer के आवेदन को भी शामिल किया गया है ।

Abstract

Phthalic एसिड एस्टर्स (पेस) लगातार कार्बनिक प्रदूषकों के प्रमुख समूहों की areone । congeners के तेजी से बढ़ने के कारण पेस का समूह-विशिष्ट पता लगाना अत्यधिक वांछित है. डीएनए aptamers तेजी से किया गया है पर मांयता तत्वों के रूप में लागू करने के लिए, सेंसर प्लेटफार्मों, लेकिन aptamers का चयन अत्यधिक hydrophobic छोटे अणु लक्ष्य, जैसे कि पेस, शायद ही कभी सूचना दी है । यह काम एक मनका-आधारित पद्धति का वर्णन करता है जो पेस को समूह-विशिष्ट डीएनए aptamers का चयन करने के लिए बनाया गया है । एमिनो समूह कार्यात्मक dibutyl phthalate (DBP-एनएच2) के रूप में लंगर लक्ष्य संश्लेषित और epoxy पर स्थिर agarose मोतियों का था, की अनुमति स्थिरीकरण मैट्रिक्स की सतह पर phthalic एस्टर समूह के प्रदर्शन को, और इसलिए समूह विशेष के बांधकों का चयन । हम मात्रात्मक बहुलकीकरण श्रृंखला चुंबकीय जुदाई के साथ मिलकर प्रतिक्रिया द्वारा aptamer उंमीदवारों की पृथक्करण स्थिरांक निर्धारित किया है । अंय पेस को aptamers के रिश्तेदार समानताएं और selectivity प्रतिस्पर्धी परख द्वारा निर्धारित किया गया, जहां aptamer उंमीदवारों पूर्व थे DBP-NH2 संलग्न चुंबकीय मोती और के साथ मशीन पर supernatant को रिहा करने के लिए बाध्य परीक्षित पेस या अन्य संभावित हस्तक्षेप करने वाले पदार्थ हैं. प्रतिस्पर्धी परख क्योंकि यह पेस के बीच एक सतही संबंध तुलना कि सतह स्थिरीकरण के लिए कोई कार्यात्मक समूह था प्रदान लागू किया गया था । अंत में, हम एक विद्युत aptasensor के निर्माण का प्रदर्शन किया और ultrasensitive और बीआईएस (2-ethylhexyl) phthalate के चयनात्मक पता लगाने के लिए यह प्रयोग । यह प्रोटोकॉल अंय hydrophobic छोटे अणुओं की aptamer खोज के लिए अंतर्दृष्टि प्रदान करता है ।

Introduction

तेजी से आर्थिक विकास के साथ-साथ औद्योगीकरण का त्वरण और शहरी निर्माण, पर्यावरण प्रदूषण पहले से कहीं अधिक गंभीर है । ठेठ पर्यावरणीय प्रदूषक भारी धातु आयनों, विषाक्त पदार्थों, एंटीबायोटिक दवाओं, कीटनाशकों, अंत-स्रावी अवरोधों, और लगातार कार्बनिक प्रदूषक (चबूतरे) शामिल हैं । धातु आयनों और विषाक्त पदार्थों के अलावा, अंय प्रदूषकों छोटे अणु है कि अक्सर congeners की एक किस्म से मिलकर बना रहे हैं । उदाहरण के लिए, सबसे विषैले चबूतरे में शामिल हैं polychlorinated biphenyls (पीसीबी), एरोमेटिक खुशबूदार हाइड्रोकार्बन (PAHs), polybrominated biphenyl ईथर (PBDEs), polychlorinated dibenzo-पी-डाइअॉकॉ्सिन (PCDDs), polychlorinated dibenzofuran (PCDFs), और phthalic एसिड एस्टर (पेस)1,2, जो सभी कई congeners से मिलकर बनता है । छोटे अणु का पता लगाने के मुख्य रूप से क्रोमैटोग्राफी/जन स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित तकनीक द्वारा किया गया है अनुप्रयोगों की अपनी विविधता के कारण3,4,5,6। ऑन-साइट डिटेक्शन के लिए, एंटीबॉडी-आधारित विधियों को हाल ही में7,8,9विकसित किया गया है । हालांकि, के बाद से इन पद्धतियों एक निश्चित congener के लिए अत्यधिक विशिष्ट हैं, एकाधिक परीक्षण किया जाना चाहिए । इससे ज्यादा गंभीर क्या है कि उपन्यास congeners इतनी तेजी से बढे कि उनके एंटीबॉडी को समय पर उत्पन्न न किया जा सके । इसलिए, एक परीक्षण में सभी congeners के कुल स्तरों की निगरानी करने के लिए समूह विशेष के विकास के लिए एक अमूल्य मीट्रिक पर्यावरण प्रदूषण की स्थिति का आकलन करने के लिए प्रदान कर सकते हैं ।

हाल ही में, न्यूक्लिक एसिड aptamers व्यापक रूप से कई लक्ष्यों की एक विस्तृत विविधता पहचानने की उनकी क्षमता के कारण विभिंन संवेदन प्लेटफार्मों में मांयता तत्वों के रूप में लागू किया गया है, आयनों और छोटे अणुओं से प्रोटीन और कोशिकाओं के लिए10,11 ,12. Aptamers एक इन विट्रो विधि के माध्यम से की पहचान कर रहे है घातीय संवर्धन (SELEX)13,14द्वारा लाइगैंडों के व्यवस्थित विकास बुलाया । SELEX यादृच्छिक सिंथेटिक एकल किनारा oligonucleotide पुस्तकालय है, जो लगभग 1014-1015 दृश्यों में शामिल है के साथ शुरू होता है । यादृच्छिक पुस्तकालय का आकार आरएनए या डीएनए उंमीदवार संरचनाओं की विविधता सुनिश्चित करता है । ठेठ SELEX प्रक्रिया संवर्धन के कई दौर के होते है जब तक पुस्तकालय उच्च समानता और लक्ष्य को विशिष्टता के साथ दृश्यों में समृद्ध है । अंतिम समृद्ध पूल तो अनुक्रम है, और पृथक्करण स्थिरांक (Kd) और संभावित हस्तक्षेप करने वाले पदार्थों के विरुद्ध selectivity विभिंन तकनीकों द्वारा निर्धारित किए जाते है जैसे कि फ़िल्टर बाइंडिंग, संबध क्रोमैटोग्राफी, सरफ़ेस plasmon अनुनाद (SPR), आदि। 15

अत्यंत खराब पानी घुलनशीलता और सतह स्थिरीकरण के लिए कार्यात्मक समूहों की कमी के कारण, चबूतरे का aptamer चयन सैद्धांतिक रूप से कठिन है । SELEX के लिए महत्वपूर्ण प्रगति ने aptamers की खोज को गति दे ली है । हालांकि, चबूतरे के लिए समूह विशेष aptamers के चयन की रिपोर्ट अभी नहीं आई है । अब तक, केवल पीसीबी बाध्यकारी डीएनए aptamers एक निश्चित congener के लिए उच्च विशिष्टता के साथ16पहचान की गई है । पेस मुख्य रूप से polyvinyl क्लोराइड सामग्री में प्रयोग किया जाता है, polyvinyl क्लोराइड एक कठिन प्लास्टिक से एक लोचदार प्लास्टिक से बदल रहा है, इस प्रकार एक plasticizer के रूप में कार्य । कुछ पेस अंत: स्रावी अवरोधकों के रूप में पहचान की गई है, जिगर और गुर्दे समारोह के लिए गंभीर क्षति हो सकती है, पुरुष शुक्राणु के गतिशीलता को कम, और असामान्य शुक्राणु आकृति विज्ञान और वृषण कैंसर में परिणाम हो सकता है17. न तो यौगिक-और न ही समूह-विशिष्ट PAE-बाइंडिंग aptamers रिपोर्ट किया गया है ।

इस कार्य का लक्ष्य उच्च hydrophobic छोटे अणुओं जैसे पेस, चबूतरे का एक प्रतिनिधि समूह के लिए समूह-विशिष्ट डीएनए aptamers के चयन के लिए एक प्रतिनिधि प्रोटोकॉल प्रदान करना है. हम पर्यावरण प्रदूषण का पता लगाने के लिए चयनित aptamer के आवेदन भी प्रदर्शित करते हैं । यह प्रोटोकॉल अंय hydrophobic छोटे अणुओं की aptamer खोज के लिए मार्गदर्शन और अंतर्दृष्टि प्रदान करता है ।

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Protocol

1. पुस्तकालय और प्राइमर डिजाइन और संश्लेषण

  1. डिजाइन प्रारंभिक पुस्तकालय और प्राइमरों ।
    पुस्तकालय (पूल0): 5 '-TCCCACGCATTCTCCACATC-N40-CCTTTCTGTCCTTCCGTCAC-3 '
    फॉरवर्ड प्राइमर (एफ पी): 5 '-TCCCACGCATTCTCCACATC-3 '
    Phosphorylated रिवर्स प्राइमर (पीओ4-आरपी): 5 '-po4-GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3 '
  2. संश्लेषित पूल0, FP, और पीओ4-आरपी मानक phosphoramidite रसायन विज्ञान18,19,20का उपयोग कर, और मानक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC)21द्वारा सभी DNAs शुद्ध ।
  3. 0, FP, और PO4nuclease-नि: शुल्क ग्रेड पानी में 100 µ मीटर, aliquot में आरपी पूल का पुनर्गठन, और उंहें एक वर्ष के लिए-20 या-80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    नोट: यह दृढ़ता से संभव पार संदूषण से बचने के लिए 10-20 µ l aliquots में पूल0, FP, और पीओ4-आरपी स्टोर करने के लिए सुझाव दिया है ।

2. लंगर लक्ष्य और Epoxy-सक्रिय Agarose मनका पर अपनी स्थिरीकरण संश्लेषित

  1. अमीनो समूह को संश्लेषित dibutyl phthalate (DBP-NH2) लंगर लक्ष्य के रूप में ।
    नोट: DBP-एनएच2 के संश्लेषण और लक्षण वर्णन पर प्रायोगिक विवरण साहित्य22में वर्णित किया गया है ।
  2. एक माध्यम में लंगर लक्ष्य स्टॉक समाधान तैयार लक्ष्य घुलनशीलता के लिए उपयुक्त । इस अध्ययन के लिए, dimethyl sulfoxide (DMSO) में 100 mM DBP-NH2 स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें और समाधान को एक वर्ष तक के लिए 4 या-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।
  3. स्थिर DBP-एनएच2 पर epoxy-सक्रिय agarose मोती निर्माता से एक संशोधित प्रोटोकॉल के अनुसार ।
    1. 0.1 g फ्रीज बाहर वजन epoxy के पाउडर-सक्रिय agarose मोती सूख और आसुत जल में निलंबित । 1 ज के लिए मीडियम को धो कर 20 मिलीलीटर आसुत पानी का उपयोग करके कई aliquots में जोड़ा । मध्यम को 0.2 M ना2CO3 (pH 12) के साथ धो लें ।
      नोट: इस में पानी को जोड़ने के बाद मध्यम फूल जाता है ।
    2. भंग DBP-एनएच2 (४६.७ मिलीग्राम, 0.15 mmol) में 500 µ l युग्मन बफर (0.2 M ना2CO3 बफर).
    3. युग्मन मध्यम के साथ ligand युक्त समाधान मिश्रण । कमरे के तापमान पर 48 घंटे के लिए 5 rpm पर एक शेखर का प्रयोग करें ।
    4. दोहराने उत्पाद तीन बार धोने, क्रमिक रूप से 0.1 m एसीटेट बफर का उपयोग (0.5 एम NaCl, पीएच 4.5) और 0.2 एम कार्बोनेट बफर (0.5 m NaCl, पीएच 12) प्रत्येक धो चक्र में । पानी में उत्पाद को धोने और निलंबित 500 µ एल की अंतिम मात्रा बनाने के लिए ।
    5. उपयोग करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर उत्पाद की दुकान ।
    6. मौलिक विश्लेषण द्वारा लक्ष्य स्थिरीकरण की सफलता की पुष्टि करें ।

3. SELEX

  1. तैयार अल्ट्रा शुद्ध पानी या nuclease में PAE बाध्यकारी बफर के 500 मिलीलीटर-20 मिमी Tris के साथ नि: शुल्क ग्रेड पानी · एचसीएल, 100 एमएम NaCl, 2 एमएम MgCl2, 5 एमएम KCl, 1 एमएम CaCl2, 1% polyoxyethy-लेणे (20) sorbaitan monolaurate, और 0.03% गैर ईओण सतह सक्रिय एजेंट (pH 7.9) । एक बाँझ 0.22 µm nitrocellulose फिल्टर के माध्यम से बफर फ़िल्टर और महीनों के लिए 20 डिग्री सेल्सियस से अधिक तापमान पर यह दुकान.
    नोट: यह PAE बाइंडिंग बफ़र में पेस का एक अच्छा फैलाव स्थिति बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है । सर्फेक्टेंट के कई प्रकार के जलीय समाधान में पेस की घुलनशीलता को बढ़ाने की जरूरत है. हालांकि, सर्फेक्टेंट की संख्या surfactant micelles कि PAE अणुओं encapsulate के गठन से बचने के लिए एक ंयूनतम करने के लिए रखा जाना चाहिए । गैर ईओण, सतह सक्रिय एजेंट 20 डिग्री सेल्सियस से कम तापमान पर हाला करने के लिए आसान है, और इसलिए बफर 20 डिग्री सेल्सियस से अधिक तापमान पर संग्रहित किया जाना चाहिए ।
  2. पतला 10 µ l के 100 µ m पूल0(~ 1.0 nmol के लिए 1014-1015 अनुक्रम) में 490 बाइंडिंग बफ़र की µ एल. हीट पूल0 aliquots (5 × 100 µ एल) में पतली दीवार केंद्रापसारक ट्यूबों में पानी स्नान पर सेट 95 ° c 10 मिनट के लिए । 5 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूबों प्लेस और बाद में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ट्यूबों गर्मी (~ 25 ° c इस काम में) ।
  3. चयन का पहला दौर: पूल0 और DBP − NH2− लेपित माध्यम की मशीन ।
    1. DBP − NH2− लेपित मध्यमा के 200 µ l को धो लें, PAE बाइंडिंग बफ़र के 500 µ l के साथ तीन बार । पूल0 के साथ DBP − NH2− लेपित माध्यम मिलाएं और हल्के झटकों के तहत 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण को तैयार करें ।
    2. 100 केडीए के एक आणविक कट-ऑफ के साथ ultrafiltration usingan ultrafiltration ट्यूब द्वारा असीम DNAs से aptamers के साथ बंधे DBP − NH2− लेपित मध्यम को अलग कर लें । मध्यम धो PAE बाध्यकारी बफर के 500 µ एल के साथ तीन बार और ९,१६८ × g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक ।
  4. चयन का पहला दौर: DBP − NH2− लेपित माध्यमों से aptamer रेफरेंस ।
    1. धोया मध्यम करने के लिए PAE बाध्यकारी बफर के 50 µ एल जोड़ें और झटकों के तहत 9 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण गर्मी ।
    2. ultrafiltration द्वारा eluted DNAs युक्त supernatant लीजिए. अधिक बाउंड DNAs पुनर्प्राप्त करने के लिए इस रेफरेंस प्रोसेस को तीन बार दोहराएं ।
  5. चयन का पहला दौर: पीसीआर
    1. स्मॉल स्केल पीसीआर
      1. प्रदर्शन एक छोटे पैमाने पर पीसीआर23 (4 × 20 µ l aliquots) का उपयोग कर ~ 15-30 चक्र । एक पीसीआर रिएक्शन24 को निम्नानुसार सेट करें: 6.5 µ l of RNase-नि: शुल्क जल, 1 µ l के 10 µ मीटर प्रत्येक प्राइमरी (एफ पी, पीओ4-आरपी, 0.01 nmol प्रत्येक), 1.5 µ एल eluted पूल धारा 3.4 से (या RNase-नकारात्मक नियंत्रण के रूप में मुक्त पानी), और 10 µ एल मिश्रित प्रतिक्रिया के मिश्रण युक्त dNTPs, गर्म शुरू पोलीमरेज़, और 2 × पीसीआर प्रतिक्रिया बफर (20 mM tris · एचसीएल, 100 एमएम KCl, 3 एमएम MgCl2, पीएच 8.3) ।
      2. निंनलिखित सेटिंग्स के साथ एक थर्मल साइकिल चालक का उपयोग कर पीसीआर भागो: 95 ° c, 1 मिनट के 1 चक्र; के 30 चक्र [95 ° c, 30 s; 56 ° c, 30 s; 72 ° c, 30 s]; 72 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ के 1 चक्र । जब साधन 15, 20, 25, और 30 चक्र पर एक्सटेंशन कदम के 20th चल रहा है, ठहराव कुंजी दबाएँ, साधन कवर खुला और एक ट्यूब बाहर ले, तो फिर से थामने कुंजी दबाएँ फिर पीसीआर फिर से शुरू करने के लिए ।
      3. तैयार 12% विकृत polyacrylamide जेल ट्रो (पृष्ठ)25,26। यूरिया के 4.8 ग्राम मिश्रण, अल्ट्रा शुद्ध पानी की 6 मिलीलीटर, 10 × tris के 1 मिलीलीटर/बोरिक एसिड/ईथीलीन डायमाइन tetraacetic एसिड (TBE), 40% acrylamide की 3 मिलीलीटर, µ के 10 tetramethylethylenediamine एल (TEMED), और 100 µ एल 10% अमोनियम persulfate (एपीएस), उस क्रम में । अच्छी तरह से हलचल और 1.5 के लिए प्रतीक्षा-2 एच जेल को पूरी तरह से जम सुनिश्चित करने के लिए ।
      4. चक्र ऑप्टिमाइज़ेशन के परिणामों का विश्लेषण करें: आरएनए लोडिंग बफर के 5 µ l के साथ प्रत्येक पीसीआर उत्पाद के 1 µ l का मिश्रण (मीलियन% formamide, 0.4 मीटर formaldehyde, 1.25 × 3-(N-morpholino) propansulfonic एसिड बफर, 0.02% xylene cyanol एफएफ, 0.02% bromophenol ब्लू), और 4 µ l की RNase-मुक्त जल; 10 मिनट के लिए 95 ° c पर मिश्रण गर्मी, और जल्दी से बर्फ पर 0 ° c के लिए शांत; कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन; 12% विकृत पृष्ठ के 5 अलग कुओं में लोड; भागो ट्रो 1 × TBE बफर में एक ऊर्ध्वाधर ट्रो प्रणाली द्वारा 170 V 45 मिनट के लिए ।
      5. ट्रो के बाद, 1 × न्यूक्लिक एसिड जेल के 3 µ एल के साथ जेल दाग 10 मिनट के लिए 1 × TBE बफर के 30 मिलीलीटर में दाग, और जेल की एक छवि ले लो ।
    2. बड़े पैमाने पर पीसीआर: -उत्पादों अवांछित बिना सही आकार मार्कर पर उच्चतम तीव्रता बैंड का उत्पादन करने के लिए चक्र की उचित संख्या का चयन करें । एक बड़े पैमाने पर पीसीआर प्रदर्शन (20 × 100 µ एल aliquots) शर्तों और खंड 3.5.1 में निर्धारित चक्रों की उचित संख्या का उपयोग ।
      नोट: एकल-कतरा पुस्तकालय है कि प्राप्त किया जा सकता है की अंतिम राशि पीसीआर की कुल मात्रा, नहीं टेंपलेट की एकाग्रता के लिए आनुपातिक है । आम तौर पर, 1 nmol पुस्तकालय की प्राप्त करने के लिए, एकल-असहाय पूल 2 एमएल पीसीआर की जरूरत है । पीसीआर बहुत संवेदनशील है और आसानी से बाहर DNAs द्वारा दूषित है । कदम संदूषण की संभावना को कम करने के लिए लिया जाना चाहिए, इस तरह के दस्ताने पहने के रूप में, निष्फल सुझावों का उपयोग, ट्यूबों में थूकना नहीं है, और पीसीआर ट्यूब की टोपी नहीं शुरू करने से पहले केंद्रापसारक ।
  6. चयन का पहला दौर: इथेनॉल वर्षण द्वारा पीसीआर उत्पाद की शुद्धि ।
    1. एक ट्यूब (200 µ एल प्रत्येक) में पीसीआर मिश्रण की दो ट्यूबों जुडा है । सभी ट्यूबों के लिए यह दोहराएं ।
    2. सोडियम एसीटेट के 15 µ एल जोड़ें (3 एम, पीएच 5.2) समाधान, 4 डीएनए के µ l/आरएनए वर्षा वाहक समाधान, और 2.5 गुना पूर्व ठंडा इथेनॉल की मात्रा में-20 ° c प्रत्येक ट्यूब में । उन्हें समान रूप से मिलाएं ।
      नोट: डीएनए/आरएनए वर्षा वाहक कम सांद्रता पर डीएनए/आरएनए की वसूली प्रतिशत में काफी सुधार करने के लिए व्यापक रूप से इथेनॉल वर्षा प्रयोगों में प्रयोग किया जाता है । यह ऐसे पीसीआर और अनुक्रमण के रूप में बहाव अनुप्रयोगों के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है ।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए २०,६२७ × जी में मिश्रण केंद्रापसारक और ध्यान से supernatant त्यागें और सफेद हाला छोड़ दें ।
    4. प्रत्येक ट्यूब में-20 ° c पर 70% पूर्व ठंडा इथेनॉल समाधान के 400 µ एल जोड़ें वर्षा को धोने के लिए । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए २०,६२७ × जी में मिश्रण केंद्रापसारक, और ध्यान से supernatant त्यागें और सफेद हाला छोड़ दें । धो चरण दो बार दोहराएं ।
    5. ट्यूब कवर खोलें; सील झिल्ली चुभन; सफेद हाला पारदर्शी हो जाता है जब तक हीटिंग ब्लॉक पर 40 डिग्री सेल्सियस पर इथेनॉल volatilize चलो । -20 डिग्री सेल्सियस पर हाला की दुकान ।
      नोट: शुद्ध पीसीआर उत्पाद-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  7. चयन के पहले दौर: एकल असहाय डीएनए पीढ़ी (समृद्ध पूल की पीढ़ी1) phosphorylated रिवर्स कतरा को पचाने के लिए λ exonuclease प्रतिक्रिया प्रदर्शन से ।
    1. स्मॉल स्केल λ exonuclease प्रतिक्रिया
      1. धारा 3.6 से शुद्ध पीसीआर उत्पाद युक्त एक ट्यूब के लिए RNase-नि: शुल्क पानी के 100 µ एल जोड़ें । ट्यूब में पूरी तरह से हाला को भंग करने के लिए ट्यूब भंवर ।
      2. पांच केंद्रापसारक ट्यूबों तैयार है और ऊपर समाधान के 5 µ एल जोड़ने के लिए, 11 RNase के µ एल-मुफ्त पानी, और 10 × प्रतिक्रिया बफर के 2 µ एल (670 mm glycine-KOH, 25 mM MgCl2 , 0.1% (v/v) ट्राइटन X-100 पीएच 9.4) प्रत्येक ट्यूब में ।
      3. इन ट्यूबों में क्रमशः 2 u, 5 u, 8 u, और 10 u λ exonuclease युक्त पानी या पतला λ exonuclease समाधान का µ l जोड़ें । घोल को अच्छी तरह से धीरे से pipetting । 10 × प्रतिक्रिया बफर प्रदाता exonucleasefrom λ के साथ प्रदान की जाती है ।
      4. 35 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 80 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट, और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ के लिए ट्यूबों की मशीन ।
      5. 12% मूल पृष्ठ तैयार करें । मिश्रण के 6 मिलीलीटर अल्ट्रा शुद्ध पानी, 10 × TBE के 1 मिलीलीटर, 40% acrylamide के 3 मिलीलीटर, TEMED के 10 µ एल, और 100 µ एल के 10% ए पी एस, उस क्रम में । अच्छी तरह से हलचल और 60-90 मिनट के लिए प्रतीक्षा के लिए जेल पूरी तरह से जम सुनिश्चित करते हैं ।
      6. 1 µ के साथ प्रत्येक प्रतिक्रिया के 5 µ एल के संयोजन से प्रतिक्रियाओं के परिणामों का विश्लेषण करें l लोड हो रहा है डाई और 4 µ एल के RNase-नि: शुल्क पानी, और इन मिश्रण को लोड करने के 5 अलग कुओं में 12% मूल पृष्ठ (150 V 45 मिनट के लिए).
        नोट: एक 20 बीपी डबल असहाय डीएनए सीढ़ी भी जेल पर लोड किया जा सकता है, लेकिन यह पीसीआर उत्पाद के विशिष्ट बैंड और जेल पर उत्पंन एकल असहाय पुस्तकालय शो के बाद से आवश्यक नहीं हो सकता है ।
        नोट: λ exonuclease प्रतिक्रिया एक उत्कृष्ट संरचनात्मक selectivity है । डबल-कतरा पीसीआर उत्पाद (विरोधी भावना किनारा 5 ' अंत में एक फॉस्फेट समूह के साथ लेबल है) पूरी तरह से एक काफी व्यापक एकाग्रता रेंज में λ exonuclease की उपस्थिति में एक एकल असहाय पुस्तकालय में पचा जा सकता है (चित्रा 4) । λ exonuclease की न्यूनतम मात्रा जो छोटे पैमाने में एकल-कतरा डीएनए को पूरी तरह उत्पन्न कर सकती है λ exonuclease प्रतिक्रिया भी बड़े पैमाने पर λ exonuclease प्रतिक्रिया के लिए प्रयोग की जाती है. λ exonuclease की एक उच्च एकाग्रता भी इस्तेमाल किया जा सकता है, क्योंकि λ exonuclease अपनी संरचना selectivity और उत्पाद उपज खोने के बिना एक व्यापक एकाग्रता रेंज में अच्छी तरह से काम करता है । λ exonuclease प्रतिक्रिया नमक की एक उच्च एकाग्रता से हिचकती है । पीसीआर प्रोडक्ट के अधूरे पाचन से आमतौर पर यह तात्पर्य होता है कि पीसीआर प्रोडक्ट में बहुत ज्यादा नमक मौजूद है । जब पीसीआर उत्पाद isopropanol वर्षण से शुद्ध अक्सर बहुत अधिक नमक होता है, जबकि इथेनॉल वर्षण (धारा 3.6) द्वारा पीसीआर उत्पादों की शुद्धि आमतौर पर इस कदम के साथ संगत है ।
    2. बडे पैमाने पर λ exonuclease प्रतिक्रिया: λ exonuclease की ंयूनतम राशि चुनें जो बड़े पैमाने पर λ exonuclease प्रतिक्रिया के लिए एकल-असहाय DNAs को पूरी तरह से उत्पंन कर सकता है । प्रतिक्रिया आनुपातिक रूप से इस शर्त के अनुसार स्केल है । उदाहरण के लिए: यदि 2 यू λ exonuclease की न्यूनतम राशि आवश्यक है, तो मिश्रण 38 µ l के Rnase-मुक्त पानी, 10 µ l के 10 x बफर, 50 µ l के DNA पूल1 और 2 µ l के 10 U/µ l λ exonuclease.
  8. चयन के पहले दौर: इथेनॉल वर्षण द्वारा एकल असहाय पूल1 की शुद्धि ।
    1. चरण 3.6 के निर्देशों का पालन करें ।
    2. 260 एनएम में यूवी अवशोषण द्वारा शुद्ध पूल1 की एकाग्रता का निर्धारण ।
    3. PAE बाइंडिंग बफ़र का एक उपयुक्त मात्रा में 90% शुद्ध पूल1 का पुनर्गठन । यदि चयन के अगले दौर के लिए पर्याप्त डीएनए प्राप्त नहीं है, दोहराने वर्गों 3.5-3.8.2 ।
      नोट: PAE बाइंडिंग बफ़र की मात्रा आमतौर पर बदलता है 200 करने के लिए 500 µ l के अनुसार लायब्रेरी की मात्रा और SELEX के अगले दौर में पुस्तकालय के वांछित अंतिम एकाग्रता.
  9. SELEX के दूसरे, तीसरे, चौथे, और पांचवें दौर ।
    1. आचरण SELEX के दूसरे, तीसरे, चौथे, और पांचवें दौर बाद में एक ही प्रक्रिया के बाद ऊपर वर्णित (धारा 3.2-3.8), सिवाय इसके कि ~ 300 pmol पुस्तकालय के लिए चयन stringency वृद्धि इनपुट था ।
    2. मध्यम पर DNAs के विशिष्ट अवशोषण को कम करने के लिए, DBP − NH2− लेपित माध्यम के साथ मशीनीकरण से पहले चयन के तीसरे और चौथे दौर में 30 मिनट के लिए एक रोटरी के बरतन पर अनसंशोधित माध्यम के साथ पूल की मशीन ।
      नोट: SELEX प्रक्रिया उच्च आणविक भार उत्पाद है कि जेल में विस्थापित नहीं किया की बड़ी राशि से पता चला DNAs के बीच गंभीर crosslink के कारण पांचवें दौर में समाप्त हो गया ।

4. उच्च-प्रवाह अनुक्रमण

  1. संगत प्राइमरों के साथ पीसीआर प्रवर्धन द्वारा अनुक्रमण के लिए धारा 3.9.2 से पूल4 तैयार करते हैं ।
    1. डिजाइन और संश्लेषित 5 ' अंत में 6 nt के साथ एक अनुक्रमित आगे प्राइमर अनुक्रम विश्लेषण की सुविधा के लिए ।
      अनुक्रमित फॉरवर्ड प्राइमर (FP-अनुक्रमण): 5 '-agtacgaTCCCACGCATTCTCCACATC-3 '
    2. एक 1,000 µ lpcr प्रतिक्रिया निम्नानुसार सेट करें: 380 µ l के RNase-मुक्त जल, 50 µ एल प्रत्येक 10 µ एम प्राइमर (FP-अनुक्रमण, पीओ4-आरपी, 0.5 nmol प्रत्येक), धारा eluted से 3.9.2 पूल के 20 µ एल, और µ युक्त मिश्रित प्रतिक्रिया मिश्रण के 500 dNTPs एल, गर्म शुरू पोलीमरेज़ , और 2 × पीसीआर प्रतिक्रिया बफर । इस मिश्रण को 10 पीसीआर ट्यूबों में Aliquot । सेक्शन 3.5.1.2 में बताए गए अनुसार ही पीसीआर की स्थिति का उपयोग करें ।
  2. sequencing सुविधा की आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करें । उदाहरण के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार पृष्ठ-जेल डीएनए रिकवरी किट का उपयोग करें ।
  3. अनुक्रमण सुविधा द्वारा आवश्यक शिपिंग शर्तों के तहत एक sequencing सुविधा के लिए शुद्ध पीसीआर उत्पाद (~ 2 µ g) भेजें । उदाहरण के लिए, पीसीआर उत्पाद को अच्छी तरह से sequencing सुविधा के लिए आइस पैक के साथ बंद टोपियां के साथ एक केंद्रापसारक ट्यूब में जहाज ।
    नोट: अनुक्रम पूल के संवर्धन का आकलन करने के लिए प्रत्येक अनुक्रम की प्रतिलिपि संख्या के अनुसार अनुक्रम क्रमित है कि परिणाम प्राप्त किया. शीर्ष अनुक्रम DBP-1 (5 '-CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT-3 ') नाम दिया गया था । इसके अपनत्व और selectivity को निम्न प्रोटोकॉल (धारा ५ और ६) द्वारा मापा गया. एक विद्युत जैव संवेदन में इसके आवेदन बाद में धारा 7 में प्रदर्शन किया गया ।

5. चुंबकीय मनका आधारित मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) का उपयोग कर चयनित Aptamer उंमीदवारों के Kd निर्धारण

  1. संश्लेषित DBP-1-qPCR और प्राइमर मानक phosphoramidite रसायन विज्ञान का उपयोग कर और यह मानक HPLC द्वारा शुद्ध ।
    Aptamer उमेदवार (DBP-1-qPCR): 5 '-ATACCAGCTTATTCAATTCTTTCTGTCCTTCCGTCACATC CCACGCATTCTCCACATAGATAGTAAGTGCAATCT-3 '
    फॉरवर्ड प्राइमर qPCR के लिए (FP-qPCR): 5 '-ATACCAGCTTATTCAATT-3 '
    रिवर्स qPCR के लिए प्राइमर (RP-qPCR): 5 '-AGATTGCACTTACTATCT-3 '
    नोट: परीक्षण अनुक्रम के प्राइमर क्षेत्रों अनुभाग 3 में इस्तेमाल किया0 पूल के उन लोगों से अलग हैं. प्राइमरी क्षेत्रों को बदलने का उद्देश्य प्राइमरी क्षेत्रों को छोड़कर अकेले कोर सीक्वेंस के संबधों का परीक्षण करना है ।
  2. स्थिर DBP-एनएच2 पर carboxylic एसिड लेपित चुंबकीय मोती निर्माता के निर्देशों का पालन ।
    1. carboxylic एसिड लेपित चुंबकीय मोती दो बार 25 मिमी 2-(एन morpholino) ethanesulfonic एसिड (एमईएस) (पीएच 5.0) के साथ धो, चुंबकीय मोतियों की एक समान मात्रा का प्रयोग (100 µ एल) शीशी से बाहर pipetted, के लिए 10 मिनट के साथ अच्छा मिश्रण (अंत से अधिक अंत या इसी तरह) ।
    2. तुरंत उपयोग करने से पहले, ठंड 25 मिमी एमईएस (पीएच 5.0) के साथ 1-एथिल-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide हाइडरोक्लॉराइड (EDC) समाधान की 50 मिलीग्राम/
    3. तुरंत उपयोग करने से पहले, ठंड 25 मिमी एमईएस (पीएच 5.0) के साथ N-hydroxysuccinimide (एन एच एस) समाधान की 50 मिलीग्राम/
    4. EDC समाधान के 100 µ l को मिलाएं और 100 µ l को धोकर मोतियों के साथ एन एच एस समाधान की और धीमी गति से झुकाव रोटेशन के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
    5. 4 मिनट के लिए एक चुंबक पर ट्यूब डाल गर्मी के बाद, supernatant त्यागें, और धोने के साथ दो बार मोतियों की 100 µ l के साथ ठंड 25 मिमी एमईएस (पीएच 5.0).
    6. 100 मिमी DBP के 6 µ एल-एनएच2 स्टॉक समाधान और 25 मिमी एमईएस (पीएच 5.0, 290 µ एल) के लिए रोटेशन के तहत सक्रिय मोतियों के साथ कमरे के तापमान या 2 पर 4 में एच डिग्री सेल्सियस पर, धीमी गति से झुकाव रोटेशन के साथ 5 rpm ।
    7. मशीन के बाद 4 मिनट के लिए चुंबक पर ट्यूब रखो और supernatant त्यागें । लेपित मोती 4 बार धोने और PAE बाध्यकारी बफर के 200 µ l के साथ मोतियों को फिर से सस्पेंड और 4 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग तक की दुकान ।
  3. Kdका निर्धारण करने के लिए अनुमापन वक्र लीजिए ।
    1. DBP-1 समाधान की एक श्रृंखला तैयार करें (500 µ l) PAE बाइंडिंग बफ़र में विविध सांद्रता पर 1 से 300 एनएम के लिए ।
    2. प्रत्येक DBP-1 समाधान के लिए खंड 5.2.7 में वर्णित के रूप में DBP-NH2-लेपित चुंबकीय मोतियों की 10 µ l जोड़ें । रोटेशन के तहत कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मशीन ।
    3. 4 मिनट के लिए एक चुंबक पर ट्यूबों प्लेस और supernatant हटा दें । धो मोती 4 बार PAE बाइंडिंग बफर के 200 µ एल का उपयोग कर ।
    4. प्रत्येक ट्यूब के लिए PAE बाइंडिंग बफर के 60 µ एल जोड़ें । 15 मिनट के लिए 95 ° c पर ट्यूबों मशीन-चुंबकीय जुदाई से eluted DBP-1 युक्त supernatant लीजिए । अधिक बाउंड DBP-1 को पुनर्प्राप्त करने के लिए इस रेफरेंस प्रोसेस को दोहराएँ ।
    5. elute समाधान 100 गुना पतला और वास्तविक समय qPCR के लिए 3 µ एल ले लो । एक qPCR प्रतिक्रिया निम्नानुसार सेट करें: RNase के 3 µ l-मुक्त जल, 2 µ एल के 10 µ मीटर प्रत्येक प्राइमर (एफ पी, पीओ4-आरपी, 0.01 nmol प्रत्येक), 3 µ एल के eluted और पतला DBP-1, और µ, dNTPs युक्त मिश्रित प्रतिक्रिया मिश्रण के 10 पोलीमरेज़ एल, और 2x पीसीआर प्रतिक्रिया बफर ।
    6. निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ एक थर्मल साइकिल चालक का उपयोग qPCR चलाकर प्रत्येक नमूने में DBP-1 की संख्या निर्धारित करें: 95 डिग्री सेल्सियस, 30 एस के 1 चक्र; के 30 चक्र [95 ° c, 30 s; 45 ° c, 30 s; 72 ° c, 30 s]; 72 ° c के 1 चक्र, 30 एस और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो ।
    7. अनुमापन वक्र साजिश और एक 1:1 बाध्यकारी अनुपात27संभालने वक्र के रैखिक फिटिंग द्वारा कश्मीरडी का निर्धारण ।

6. प्रतिस्पर्धी परख द्वारा सापेक्ष संबध और विशिष्टता परीक्षण

  1. DBP-1 समाधान (500 µ l, 1 µ m) के लिए DBP-NH2-लेपित चुंबकीय मोतियों की 10 µ l जोड़ें । रोटेशन के तहत कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मशीन । 4 मिनट के लिए एक चुंबक पर ट्यूबों प्लेस और supernatant हटा दें । मोती धो 4 बार pae बाध्यकारी बफर के 200 µ एल का उपयोग कर और यह 10 µ में reसस्पेंड pae बाध्यकारी बफर के l ।
  2. DBP के 10 µ l जोड़ें-nh2-लेपित मध्यम DBP-1 से 110 µ l के साथ बाउंड प्रत्येक 10 µ m का परीक्षण नमूना (DBP-nh2, DBP, DEHP, butyl benzyl phthalate (BBP), भारी धातु आयनों, आदि.) 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर मशीन चुंबकीय जुदाई से supernatant इकट्ठा ।
  3. पतला supernatant 100 गुना और ले 3 µ एल qPCR ठहराव के लिए । एक qPCR प्रतिक्रिया निम्नानुसार सेट करें: RNase के 3 µ l-मुक्त जल, 2 µ l के 10 µ m प्रत्येक प्राइमरी (एफ पी, पीओ4-RP, 0.01 nmol प्रत्येक), 3 µ एल के eluted और पतला DBP-1, और µ, dNTPs युक्त मिश्रित प्रतिक्रिया मिश्रण के 10 पोलीमरेज़ l, और 2 एक्स पीसीआर प्रतिक्रिया बफर ।
  4. निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ एक थर्मल साइकिल चालक का उपयोग qPCR चलाकर प्रत्येक नमूने में DBP-1 की संख्या निर्धारित करें: 95 डिग्री सेल्सियस, 30 एस के 1 चक्र; के 30 चक्र [95 ° c, 30 s; 45 ° c, 30 s; 72 ° c, 30 s]; 72 ° c के 1 चक्र, 30 एस और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो ।
  5. DBP-1 की संख्या द्वारा नमूने की उपस्थिति में मोतियों से जारी DBP-1 की संख्या को विभाजित करके सापेक्ष संबध की गणना PAE बाइंडिंग बफ़र में मोतियों से जारी: सापेक्ष संबध = Nनमूना/Nबफरहै ।

7. DEHP विद्युत के निर्माण और विद्युत मापन

  1. thiolated कोर अनुक्रम (एच एस-DBP-1) और संकेतन जांच (DBP-1-C-Fc) को विश्लेषित मानक phosphoramidite रसायन विज्ञान का उपयोग और यह मानक HPLC द्वारा शुद्ध ।
    hs-DBP-1:5 '-hs-(CH 2) 6-CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT-3 '
    DBP-1-C-Fc: 5 '-GATGTGACGGAAGGTTTTTTTT-(CH2)6एफसी-3 '
    नोट: सेंसर जांच के तर्कसंगत डिजाइन हमारे पिछले pbulications18,22में वर्णित किया गया था ।
  2. एच एस-DBP-1 और DBP-1-सी-एफसी में nuclease-नि: शुल्क ग्रेड पानी में 100 µ एम, aliquot, और उन पर स्टोर-20 या-80 ° c एक वर्ष तक के लिए ।
  3. पोलिश गोल्ड इलेक्ट्रोड ध्यान से एक दर्पण की तरह सतह के लिए 1, 0.3, और 0.05 µm अल2o3 पाउडर के लिए एक microcloth पर 5 मिनट के लिए और ultrapure पानी में sonicate यह 5 मिनट के लिए अवशिष्ट अल2ओ3को दूर करने के लिए । तो विद्युत चमकाने द्वारा इलेक्ट्रोड को साफ 35 क्रमिक चक्रीय voltammetry (CV) के साथ स्कैन 0.4 से + 1.2 V (बनाम पारा-पारा2तो4) में 0.5 M H2तो4 पर 100 एमवी/
  4. 1 मीटर µ, पीएच 7.4 (पंजाब) युक्त 100 NaCl एल 10 मिमी फॉस्फेट बफर में 0.5 µ एम एच एस-DBP-1 और 0.5 µ एम DBP-1-सी-एफसी का एक मिश्रण तैयार करें । पानी स्नान में पतली दीवार केंद्रापसारक ट्यूब में मिश्रण गर्मी 10 मिनट के लिए 95 ° c पर सेट है, और धीरे कमरे के तापमान को शांत मिश्रण ।
  5. tris के 1 µ l को जोड़ें-(2-carboxyethyl)-phosphine हाइडरोक्लॉराइड (TCEP, 10 mM, स्टॉक सॉल्यूशन) मिश्रण में । 1 ज के लिए कमरे के तापमान पर रखें ।
  6. 12 घंटे के लिए ऊपर समाधान में स्वच्छ सोने इलेक्ट्रोड विसर्जित, या कमरे के तापमान पर रात भर ।
  7. पंजाबियों के साथ इलेक्ट्रोड कुल्ला और 1 मिमी में इलेक्ट्रोड विसर्जित [एस (CH2)2(OCH2ch2)6OCH3]2 (एच एस-उदा6-OMe) के लिए पंजाबियों में 1 ज. कुल्ला इलेक्ट्रोड अच्छी तरह से PAE का उपयोग बफ़र बाइंडिंग और PAE बाइंडिंग बफ़र में इलेक्ट्रोड विसर्जित ।
  8. एक पृष्ठभूमि वर्ग लहर voltammetry (SWV) लक्ष्य मुक्त PAE बाइंडिंग बफर में स्कैन ले लो ।
    1. सभी प्रायोगिक उपकरण साफ: इलेक्ट्रोलाइटिक कोशिकाओं, सोना काम इलेक्ट्रोड, प्लेटिनम काउंटर इलेक्ट्रोड, और संतृप्त calomel संदर्भ इलेक्ट्रोड (SCE).
    2. स्थापित सॉफ़्टवेयर को सक्रिय करें; SWV माप के लिए प्रयोगात्मक मापदंडों सेट करें ।
      नोट: निम्नलिखित प्रायोगिक मापदंडों SWV प्रयोगों के लिए उपयोग किया गया: संभावित सीमा: से-0.2 में 0.7 V; मॉडुलन आयाम: 25 एमवी; पल्स चौड़ाई: 5 ms; स्कैन दर: 50 एमवी/ संभावित कदम: 1 एमवी ।
    3. एक potentiostat करने के लिए सोने काम इलेक्ट्रोड, प्लेटिनम काउंटर इलेक्ट्रोड, और SCE कनेक्ट, और PAE बाइंडिंग बफर युक्त एक इलेक्ट्रोलाइटिक सेल में इन तीन इलेक्ट्रोड डाल.
    4. SWV माप चलाएं ।
      नोट: एक बार SWV माप शुरू होता है, एक SWV वक्र कंप्यूटर की स्क्रीन पर प्रदर्शित किया जाएगा । स्कैन निरंतर है और पीक ऊंचाई या आकृति में कोई और परिवर्तन स्वीकार्य है जब तक दोहराया है ।
  9. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए DEHP (उदा., 10 बजे) के एक निश्चित एकाग्रता युक्त PAE बाइंडिंग बफर में काम इलेक्ट्रोड विसर्जित कर दिया । इलेक्ट्रोड अच्छी तरह से pae बाइंडिंग बफ़र का उपयोग कर कुल्ला और इलेक्ट्रोड के साथ pae बाइंडिंग बफ़र में विसर्जित काउंटर इलेक्ट्रोड और SCE. खंड 7.8 में वर्णित के रूप में एक ही शर्त के तहत SWV वक्र लीजिए ।
  10. दोहराएँ कदम 7.9, सिवाय इसके कि एकाग्रता की DEHP (जैसे 100 pM, 1 एनएम, 10 एनएम, 100 एनएम, 1 µ एम) क्रमिक रूप से बढ़ गया था. अनुमापन वक्र प्लाट ।
  11. विशिष्टता परीक्षण: दोहराएँ चरण 7.3-7.9, सिवाय इसके कि DEHP युक्त pae बाइंड बफ़र वांछित एकाग्रता पर संभावित हस्तक्षेप पदार्थ से युक्त pae बाइंडिंग बफ़र द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है ।

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Representative Results

हम डिजाइन और संश्लेषित एमिनो समूह कार्यात्मक dibutyl phthalate (DBP-NH2) लंगर लक्ष्य (चित्रा 1F) के रूप में । हमने तब पेस का डीएनए aptamer चयन किया DBP-NH2 का प्रयोग एंकर टारगेट के रूप में और शास्त्रीय लक्ष्य स्थिरीकरण आधारित विधि (चित्रा 2) के बाद । प्रत्येक राउंड में पीसीआर के चक्र नंबर (चित्रा 3) को ऑप्टिमाइज़ करने के लिए सुविकृत पेज का उपयोग करते हुए एक पायलट पीसीआर का प्रदर्शन किया गया । विकृत पृष्ठ, बजाय मूल पृष्ठ की, दृढ़ता से सुझाव दिया है क्योंकि हम और अंय सहयोगियों ने पाया है कि संदिग्ध उच्च आणविक वजन द्वारा उच्च चक्र संख्या में देशी जैल पर दिखाया उत्पादों वास्तव में crosslinking परिसरों का गठन कर रहे है सही आकार का जुगाड़ । इस प्रकार, विकृत पृष्ठ के बैंड तीव्रता वास्तव में सही उत्पाद की राशि को प्रतिबिंबित कर सकते हैं । एकल असहाय डीएनए पीढ़ी एक और महत्वपूर्ण कदम है, और इस कदम के लिए कई तरीकों को28बताया गया है । λ exonuclease पाचन विधि सबसे सस्ता तरीका है । एकल-कतरा डीएनए पीढ़ी की सफलता सुविधाजनक रूप से देशी पृष्ठ, जहां पीसीआर उत्पाद एकल (पहले कई दौर SELEX के रूप में) या एकाधिक बैंड के रूप में दिखाया गया है द्वारा जांच की जा सकती है, जबकि केवल एक बैंड पाचन के बाद दिखाया गया है (चित्रा 4) ।

SELEX पृष्ठ के शीर्ष पर संचित डीएनए की महत्वपूर्ण मात्रा की वजह से चयन के पांचवें दौर के बाद बंद कर दिया गया था, यहां तक कि विकार उपचार के बाद (जिसमें DNAs 95 ° c पर 2 × TBE में 10 मिनट के लिए गरम कर रहे हैं – 8.3 मीटर यूरिया युक्त) , जो DNAs के बीच गंभीर पार जोड़ने का सुझाव दिया और यह भी संकेत दिए कि अनुक्रम समृद्ध थे । इसलिए, पूल4 उच्च-प्रवाह sequencing के लिए भेजा गया था । उच्च प्रवाह परिणाम से पता चला है कि शीर्ष 100 सबसे अक्सर होने वाली अनुक्रम अत्यधिक संरक्षण और एक परिवार से थे । शीर्ष अनुक्रम DBP-1 प्रदर्शित nanomolar संबध (चित्रा 5) और अच्छा समूह-विशेष करने के लिए PAE congeners (DBP, BBP, DEHP) (चित्रा 6) के माध्यम से सुविधाजनक qPCR परख, के रूप में वर्णित प्रोटोकॉल अनुभाग में ।

DBP-1 एक कतरा विस्थापन के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया गया है आधारित विद्युत aptasenor हमारे पहले रिपोर्ट काम29के अनुसार । DEHP सेंसर संवेदनशील और चुनिंदा DEHP (चित्रा 7) का जवाब कर सकते हैं. ऐसे भारी धातु आयनों, एंटीबायोटिक दवाओं के रूप में आम पर्यावरण प्रदूषक, और इसी तरह के कार्यात्मक समूहों के साथ छोटे अणुओं DBP-1 के लिए बहुत कमजोर प्रतिक्रिया दिखाई ।

Figure 1
चित्रा 1: (क) के रासायनिक संरचनाओं पेस, (ख) BBP, (ग) DBP, (घ) DEHP, (ङ) 4-OH-DEHP, (च) DBP − NH2. हान Y. et al से अनुमति के साथ इस आंकड़े का पुनर्मुद्रण किया गया है । 22 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: समूह विशेष डीएनए aptamer चयन प्रक्रिया के लिए पेस का उपयोग DBP-NH2 एक एंकर लक्ष्य के रूप में । हान Y. et al से अनुमति के साथ इस आंकड़े का पुनर्मुद्रण किया गया है । 22 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: पीसीआर साइकिल से प्रतिनिधि परिणाम विकृत पृष्ठ का उपयोग कर अनुकूलन । बाएं से दाएं, गलियों का प्रतिनिधित्व करते हैं: 20 बीपी डीएनए सीढ़ी मानक, 15 चक्र (कोई डीएनए टेंपलेट), 20 चक्र (कोई डीएनए टेंपलेट), 25 चक्र (कोई डीएनए टेंपलेट), 30 चक्र (कोई डीएनए टेंपलेट), 15 चक्र, 20 चक्र, 25 चक्र, और 30 चक्र । इष्टतम शर्तों 25 चक्र है, जहां एकल उत्पाद बैंड अवांछित द्वारा उत्पादों, इसके अलावा, कोई बैंड इसी रिक्त नियंत्रण में मनाया गया था बिना उच्च तीव्रता पर किया गया था पर मनाया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: λ exonuclease प्रतिक्रिया का अनुकूलन phosphorylated कतरा मूल पृष्ठ का उपयोग कर पचाने के लिए । बाएं से दाएं, गलियों का प्रतिनिधित्व करते हैं: 20 बीपी डीएनए सीढ़ी मानक, नकारात्मक (कोई λ exonuclease), 2U, 5U, 8U, और 10U । एंजाइम की ंयूनतम मात्रा 2U पर देखा गया था, जहां डबल पीसीआर उत्पाद एकल असहाय DNAs हो जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: DBP के संबध मापन-1 द्वारा qPCR-आधारित परख. Kd की त्रुटि (मानक विचलन, SD) की गणना एक ही नमूने के तीन मापन से की गई थी । हान Y. et al से अनुमति के साथ इस आंकड़े का पुनर्मुद्रण किया गया है । 22

Figure 6
चित्रा 6: DBP के सापेक्ष संबध माप-1 मुक्त DBP के लिए-एनएच2 (10 µ एम), DBP (10 µ मीटर), DEHP (10 µ मीटर), BBP (10 µ मीटर), एथिल एसीटेट (10 µ मीटर), बेंजोइक एसिड (10 µ मीटर), phthalic एसिड (10 µ मीटर), और अन्य के माध्यम से प्रतियोगिता परख । अंय: संभावित हस्तक्षेप का एक मिश्रण (ग्लूकोज, कनमीसिन, एम्पीसिलीन, और इथेनॉल) सभी में 10 µ एम । अनुपात (सापेक्ष संबध) के नमूने की उपस्थिति में मोतियों से जारी aptamers की संख्या को विभाजित करके की गणना की गई थी aptamers की संख्या में मोतियों से PAE बाइंडिंग बफ़र में जारी. सलाखों मतलब ± एसडी प्रतिनिधित्व करते हैं । एसडीएस तीन व्यक्तिगत माप से गणना की गई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7: DEHP के ultrasensitive और ultraselective डिटेक्शन के लिए DEHP विद्युत का पता लगाना: तंत्र (क), SWV घटता (B), अंशांकन वक्र (C), और selectivity परीक्षण (D) । त्रुटियों (एसडीएस) तीन व्यक्तिगत माप से गणना की गई । हान Y. et al से अनुमति के साथ इस आंकड़े का पुनर्मुद्रण किया गया है । 22 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

aptamers के एक उत्कृष्ट लाभ यह है कि वे के माध्यम से पहचाना जाता है इन विट्रो विधि SELEX, जबकि एंटीबॉडी के माध्यम से उत्पंन कर रहे है vivo immunoreactions में । इसलिए, aptamers अच्छी तरह से डिजाइन प्रयोगात्मक शर्तों के तहत वांछित लक्ष्य विशिष्टता के साथ चुना जा सकता है, जबकि एंटीबॉडी शारीरिक स्थितियों तक ही सीमित हैं ।

मुक्त दृश्यों से बाध्य दृश्यों के पृथक्करण की सुविधा के लिए, कई संशोधित SELEX हाल ही में सूचित किया गया है, जिसमें केशिका ट्रो30, microfluidics31, चुंबकीय/ऐक्रेलिक मोती/agarose मोती, आदि, अधिक कुशल पृथक्करण प्राप्त करने के लिए nitrocellulose फ़िल्टर या संबध स्तंभों को प्रतिस्थापित किया है । इन तकनीकों के अलावा, मनका आधारित तरीकों सबसे व्यापक रूप से छोटे अणु उनके सरल सेट अप, आसान आपरेशन के कारण लक्ष्य के aptamer चयन के लिए इस्तेमाल किया गया है, और छोटे अणु विश्लेषण के लिए उत्तरदाई जा रहा है ।

वहां विधियों कि सामांयतः छोटे अणु लक्ष्यों के aptamer चयन के लिए उपयोग किया जाता है के दो समूहों: लक्ष्य13 और पुस्तकालय14 स्थिरीकरण आधारित तरीके हैं । विधियों के पूर्व समूह में, छोटे अणु लक्ष्य आबंध युग्मन प्रतिक्रियाओं के माध्यम से कार्यात्मक चुंबकीय मोती या agarose मोतियों के रूप में ठोस चरण पर मैटीरियल हैं । पुस्तकालयों छोटे अणु लेपित मोतियों के साथ मशीन हैं, और उन दृश्यों कि बांध या ठोस चरण पर लक्ष्य को कमजोर बांध नहीं है बस धोने और केंद्रापसारक या चुंबकीय जुदाई कदम प्रदर्शन से हटा रहे हैं । इसके बाद बंधे हुए दृश्यों को पीसीआर द्वारा eluted और प्रवर्धित किया जाता है । छोटे अणु लक्ष्यों युग्मन प्रतिक्रिया के लिए एक कार्यात्मक समूह उपलब्ध होना चाहिए । उपयुक्त कार्यात्मक समूहों के बिना उन लोगों के लिए, कार्यात्मक समूह कार्बनिक संश्लेषण के माध्यम से मूल लक्ष्य में शामिल किया जाना है । ध्यान से डिजाइन लक्ष्य के संश्लेषण कई कदम शामिल हो सकता है, और कभी-कभार काफी चुनौतीपूर्ण भी है । लक्ष्यों के संरचनात्मक संशोधन भी दृढ़ता से बाध्यकारी साइटों और उनके aptamers के साथ संबंध को प्रभावित कर सकता है । इन समस्याओं से बचने के लिए, पुस्तकालय स्थिरीकरण आधारित तरीकों विकसित किया गया है, जहां पुस्तकालय चुंबकीय मोतियों पर पूरक डीएनए पर कब्जा जांच करने के लिए संकर है, और बाध्यकारी दृश्यों लक्ष्यों के साथ बाध्यकारी पर मोतियों से गिर जाते हैं । विधियों के इस समूह में, लक्ष्य बाइंडिंग बफ़र में जोड़े जाते हैं और कोई कार्यशील समूह आवश्यक हैं । पेस phthalate एसिड के एस्टर डेरिवेटिव हैं, और एक ठेठ PAE एक phthalate एसिड एस्टर समूह और एक या दो alkyl चेन (चित्र 1a-डी) के होते हैं । पेस के पास ठोस चरण स्थिरीकरण के लिए कोई कार्यात्मक समूह उपलब्ध नहीं है । इस प्रकार, पुस्तकालय स्थिरीकरण आधारित तरीके पेस के aptamer चयन के लिए अधिक आकर्षक लगते हैं.

एक अच्छी तरह से नियंत्रित फैलाव स्थिति SELEX के माध्यम से पुस्तकालय के वांछित संवर्धन सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है । हालांकि, पेस अत्यंत hydrophobic है और आसानी से कई µ मीटर से अधिक एकाग्रता में जलीय समाधान में समुच्चय फार्म, भी एकाधिक सर्फेक्टेंट की उपस्थिति में फैलाव की सुविधा के लिए । इस प्रकार, पेस के फैलाव की स्थिति को नियंत्रित करना कठिन है, और aptamers का चयन करना कठिन होगा जो विशेष रूप से व्यक्तिगत PAE अणुओं को बाइंड करते हैं । घुलनशीलता समस्या के समाधान के लिए लक्ष्य-स्थिरीकरण के तरीकों को चुना गया, जिसमें पेस को आबंध बॉन्डिंग के जरिए हाइड्रोफिलिक मोतियों पर मैटीरियल दिया गया. इस स्थिरीकरण रणनीति का उपयोग करके, लक्ष्य के बजाय समुच्चय के एक आणविक राज्य में मनका सतह पर मुख्य रूप से मौजूद होना चाहिए ।

लंगर लक्ष्य के संरचनात्मक डिजाइन समूह विशेष aptamers के सफल चयन के लिए भी काफी महत्वपूर्ण है । तीन कारकों संरचनात्मक डिजाइन के लिए विचार किया जाना चाहिए । पहला कारक aptamer चयन का उद्देश्य है । समूह-विशिष्ट aptamers के चयन के उद्देश्य को ध्यान में रखते हुए, aptamer बाइंडिंग के लिए पेस के कॉमन ग्रुप को बेनकाब करना और बाकी हिस्सों को aptamer बाइंडिंग में भाग लेने से रोकना अनिवार्य है । इस प्रकार, कार्यात्मक समूह पक्ष श्रृंखला के टर्मिनल पर पेश किया जाना चाहिए । शुरुआत में हमने ओह फंक्शनल DEHP (4-oh − DEHP) (फिगर 1E) को एंकर टारगेट के तौर पर तैयार किया और इसे carboxylic एसिड चुंबकीय मोतियों पर मैटीरियल16. इस प्रकार, मैट्रिक्स की सतह पर alkyl जंजीरों को उजागर किया गया । हम ठोस मैट्रिक्स के रूप में carboxyl समूहों के साथ चुंबकीय मोतियों का चयन करने की कोशिश की । कोई स्पष्ट संबंध सुधार चयन के पांच दौर के बाद मनाया गया था, और नंगे मैट्रिक्स पर विशिष्ट अवशोषण मजबूत रखा गया था ।

इसलिए, DBP-एनएच2 बाद में निंनलिखित विचारों के आधार पर बनाया गया था: (1) phthalate समूह में π-π स्टैक और alkyl श्रृंखला की तुलना में हाइड्रोजन बांड के माध्यम से aptamer के साथ विशेष रूप से बातचीत करने की संभावना है; (2) एन एच एस-मध्यस्थता carbodiimide प्रतिक्रिया हल्के है और एक बहुत ही कुशल युग्मन दक्षता है, तो-NH2 DBP की एक alkyl श्रृंखला के अंत में पेश किया है; (3) यह एक ठोस चरण विभाजन के रूप में चुंबकीय मोतियों के साथ काम करने के लिए आसान है, लेकिन पुस्तकालय के विशिष्ट सोखना मजबूत है । हालांकि जुदाई के दौरान agarose मोतियों की हानि चुंबकीय मोतियों की तुलना में अधिक है, पुस्तकालय के विशिष्ट सोखना बहुत कम है । इस प्रकार, DBP-एनएच2 epoxy-सक्रिय agarose मोतियों पर मैटीरियल था, और phthalic acidester समूह मैट्रिक्स की सतह पर उजागर किया गया था ।

चयन बफर का चुनाव विशेष रूप से विविध घुलनशीलता के साथ छोटे अणु लक्ष्यों के लिए महत्वपूर्ण है । बाइंडिंग बफ़र एकत्रीकरण से बचने और पूरे aptamer चयन और लक्षण वर्णन प्रक्रिया के दौरान चबूतरे का एक अच्छा फैलाव राज्य को सुनिश्चित करने के लिए सावधानीपूर्वक तैयार होने की आवश्यकता है । हमारे अध्ययन में, हमने पाया कि DEHP नियमित बफ़र्स में सर्फेक्टेंट के बिना भंग नहीं कर सकते, दो अलग परतों दिखा । परत अनुकूलित मात्रा में कई सर्फेक्टेंट के अलावा पर गायब हो जाता है । स्पष्ट समाधान 20 डिग्री सेल्सियस से अधिक तापमान पर संग्रहित करने के लिए अपनी स्थिति बनाए रखने की जरूरत है । विवरण प्रोटोकॉल चरण 3.1 में दिए गए हैं ।

डबल-कतरा पीसीआर उत्पादों से सिंगल-कतरा डीएनए जनरेशन SELEX प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है । कई विभिंन तरीकों वर्तमान में साहित्य में वर्णित किया गया है32,33, असममित पीसीआर सहित, λ exonuclease पाचन, streptavidin के साथ चुंबकीय जुदाई-लेपित मोती, और आकार जुदाई denaturing द्वारा यूरिया-polyacrylamide जेल ।

विभिंन तरीकों अपनी शक्तियों और कमजोरियों है । वर्तमान में, ssDNA की पीढ़ी के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया विधि streptavidin-लेपित मोतियों के साथ चुंबकीय जुदाई है । इस विधि का बकाया लाभ अपने समय की बचत और सरल आपरेशन है । कमियां अंय तरीकों के साथ तुलना में उच्च लागत है । इसके विपरीत, आकार जुदाई-आधारित विधि, GC-रिच स्टेम के साथ रिवर्स प्राइमरों का उपयोग-पाश संरचना, सबसे सस्ता तरीकों में से एक है, जबकि एकल असहाय डीएनए की उपज इन तरीकों के बीच सबसे कम है32. इस प्रोटोकॉल में, हम λ exonuclease पाचन के उपयोग के लिए एकल असहाय डीएनए, जो सबसे सस्ता तरीकों में से एक है उत्पंन वर्णित है । हमने पाया है कि एकल असहाय डीएनए की उपज चुंबकीय जुदाई और streptavidin-लेपित मोतियों की दो विधियों के साथ तुलनीय है । इसके अलावा, हमने पाया कि exonuclease प्रतिक्रिया नमक की उच्च एकाग्रता से हिचक रहा था । साहित्य में सूचना देने वाले पीसीआर प्रोडक्ट के अधूरे पाचन33 के कारण पीसीआर प्रोडक्ट में मौजूदा बहुत ज्यादा नमक की संभावना थी. इसके अलावा, λ exonuclease अत्यधिक सक्रिय और सस्ती है (चित्रा 4) ।

aptamers के लक्षण वर्णन और सत्यापन श्रमसाध्य, समय लेने वाली है, और aptamer डिस्कवरी पाइपलाइन में एक बड़ी अड़चन का प्रतीक है33। अधिकांश तकनीकों बड़े aptamer बाध्यकारी भागीदारों (> 10, 000 एएमयू) के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं, लेकिन कम आणविक भार लक्ष्य (< 1, 000 एएमयू)15के साथ बातचीत को मापने के लिए पर्याप्त संवेदनशील नहीं हैं । पेस जैसे hydrophobic छोटे अणुओं की aptamers का लक्षणात्मक और सत्यापन करना और भी कठिन है. उनका खराब पानी अनुमापन वक्र के अनघुलनशीलता में परिणाम होता है, जो Kdके निर्धारण को समाधान में या सतह पर aptamers को स्थिर करने से रोकता है । इसलिए, हम घुलनशीलता समस्या से बचने के लिए हाइड्रोफिलिक चुंबकीय मोतियों पर DBP-NH2 को मैटीरियल करके उच्च प्रवाह sequencing द्वारा पहचाने गए aptamers के Kds को निर्धारित करते हैं । दूसरे लफ्ज को aptamers के रिश्तेदार समानताएं और selectivity को तब प्रतिस्पर्धी परख कर निर्धारित किया गया, जहां aptamer उम्मीदवारों को पूर्व में DBP-NH2 से जुड़ी चुंबकीय मोतियों की माला और supernatant को जारी की गई मशीन से बाउंड किया गया था परीक्षित पेस या अन्य संभावित हस्तक्षेप करने वाले पदार्थों के साथ. प्रतिस्पर्धी परख क्योंकि यह पेस के बीच एक सतही संबंध तुलना कि सतह स्थिरीकरण के लिए कोई कार्यात्मक समूह था प्रदान लागू किया गया था । इसके अलावा, चुंबकीय मनका आधारित फ्लोरोसेंट परख छोटे अणु के संबध अध्ययन के लिए उपयुक्त है-aptamer बातचीत34। हालांकि, हमने पाया है कि चुंबकीय मोती कभी-कभार अज्ञात कारणों से प्रतिदीप्ति शमन का कारण बन जाते हैं । इस प्रकार, qPCR परख अपनत्व माप के लिए इस्तेमाल किया गया ।

विद्युत के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक टिप इस अध्ययन में वर्णित सेंसर इलेक्ट्रोड की सतह passivation है35. DEHP के उच्च hydrophobicity के कारण, यह एक मजबूत करने के लिए विशेष रूप से सोने इलेक्ट्रोड पर अवशोषित प्रवृत्ति है, का पता लगाने की विफलता के लिए अग्रणी । सबसे अधिक इस्तेमाल किया सतह passivation एजेंट, 6-mercapto-1-hexanol (एमसीएच)36,37, DEHP के गैर-विशिष्ट अवशोषण को रोकने के लिए पर्याप्त नहीं है, जबकि हमने पाया कि एच एस-(ch2)2-[OCH2ch2 ]6-OCH3 DEHP38के संवेदनशील डिटेक्शन को सक्षम करने के लिए पर्याप्त प्रभावी था ।

यह प्रक्रिया अत्यधिक hydrophobic छोटे अणुओं और एक विद्युत में चयनित aptamer के एक आवेदन के समूह विशेष डीएनए aptamers का चयन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है । प्रोटोकॉल अंय hydrophobic छोटे अणुओं के चयन के साथ मदद करता है और उच्च hydrophobic छोटे अणुओं के संवेदक विकास पर अंतर्दृष्टि प्रदान करती है के रूप में अच्छी तरह से । aptamer चयन प्रक्रिया को लक्ष्य स्थिरीकरण आधारित विधियों की श्रेणी के अंतर्गत आता है । विधि के इस प्रकार की सीमाएं भी इस प्रोटोकॉल के लिए मौजूद है, उदाहरण के लिए लंगर लक्ष्य के जटिल संश्लेषण और aptamer बाध्यकारी पर ठोस चरण के प्रभावों के लिए की जरूरत है । इस प्रोटोकॉल में वर्णित विद्युत के आकर्षक फायदों में उनके सरल डिजाइन और उच्च संवेदनशीलता शामिल हैं । प्रमुख खामी उनके बेहद व्यापक गतिशील रेंज के कारण उनके सीमित परिशुद्धता है । इसलिए, यहां वर्णित विसेंसरों स्क्रीनिंग परीक्षणों के लिए अधिक उपयुक्त हैं, बजाय लक्ष्यों की मात्रात्मक माप की ।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा नहीं वित्तीय हित की घोषणा ।

Acknowledgments

हम राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (२१६७५११२) से वित्तीय सहायता के लिए आभारी हैं, बीजिंग शिक्षा आयोग (KZ201710028027) की विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना की प्रमुख परियोजना और राजधानी सामान्य विश्वविद्यालय के Yanjing युवा विद्वान कार्यक्रम.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UV-2550 Shimadzu,Japan protocol, section 3.8.2
DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200 BIO-RAD section 3.5.1.2 and 3.5.2
C1000 Touch BIO-RAD section 5.3.6 and 6.3
VMP3 multichannel potentiostat Bio-Logic Science, Claix, France section 7.4,7.8 and 7.11
Epoxy-activated Sepharose 6B GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) 10220020 argarose beads, section 2.3 and 3.3
Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beads Invitrogen, USA 420420 magnetic beads,section 5.2. and 5.3
Premix Taq Hot Start Version Takara,Dalian,China R028A polymerase, section 3.5.1.1
PARAFILM Sealing Membrane Bemis, USA PM-996 section 3.6.5
Lambda Exonuclease Invitrogen, USA EN0561 section3.7.1.2.The 10 × reaction buffer is provided along with λ exonuclease by the provider.
Dr. GenTLE
Precipitation Carrier		 Takara,Dalian,China 9094 section 3.6.2 and 3.8.1
UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit Sangon Biotech (Shanghai) B511135 section 4.2
SYBR Gold nucleic acid gel stain Invitrogen, USA 1811838 nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5
SYBR Premix Ex Taq II Takara,Dalian,China RR820A polymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) Sigma-Aldrich CAS: 1132-61-2 section 5.2.1
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) Invitrogen, USA CAS: 25952-53-8 section 5.2.2
N-hydroxysuccinimide (NHS) Sigma-Aldrich 6066-82-6 section 5.2.3
mercaptohexanol (MCH) Sigma-Aldrich CAS: 1633-78-9 section 7.7
Gold electrode Shanghai Chenhua CHI101 section 7.4. - 7.11
tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich CAS: 51805-45-9 section 7.5
O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethylene glycol) Sigma-Aldrich CAS: 651042-82-9 section 7.7
diethylhexyl phthalate (DEHP) National Institute of Metrology, China CAS: 117-81-7 section 7.11
Tween 20 Sigma-Aldrich CAS: 9005-64-5 polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate
Triton X-100 Sigma-Aldrich CAS: 9002-93-1 non-ionic surface active agent
PBS Sigma-Aldrich P5368 10 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4

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References

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रसायन विज्ञान 133 अंक Aptamer चयन phthalic एसिड एस्टर समूह विशेष hydrophobic छोटे अणुओं मात्रात्मक बहुलकीकरण श्रृंखला प्रतिक्रिया विद्युत aptasensor लगातार कार्बनिक प्रदूषक
Phthalic एसिड एस्टर-बंधन डीएनए Aptamer चयन, लक्षण वर्णन, और एक विद्युत Aptasensor के लिए आवेदन
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