기능 이미징 3D 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 바이러스 성 녹음 방송 공장
Summary
바이러스 성 transcriptional 팩터리는 세포질 RNA 중 합 효소 II 다시 활성화 하는 동안 바이러스 성 유전자 전사를 증가 함께 풍성 하 게 이산 구조. 여기, 적극적으로 면역 형광 얼룩이 지 고 제자리에서 RNA 교 잡의 조합에 의해 3D 핵 공간에서 바이러스 성 염색 질을 속기의 사이트를 찾을 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
그것은 잘 알려진 유전자의 공간과 일시적인 규칙 경 세 적절 한 유전자 발현의 중요 한 부분입니다. 따라서, 어디 고 때 전사 일어나 핵 공간 내에서 이해 하 고 episomes 같은 세포의 핵 내에서 감염 사이 관계를 시각화 하기 위해 중요 한 아니다. 여기, 면역 형광 검사 (IFA)와 RNA-물고기 왔다 combinedto 식별 적극적으로 속기 Kaposi의 육 종 관련 herpesvirus (KSHV) episomes. KSHV 대기 시간 관련 핵 항 원 (라 나), 얼룩이 지기에 의해 바이러스 episomes는 핵 내에서 존재 하는 곳을 찾을 수입니다. 또한, 생산적인 감염 동안에 표시 됩니다, 바이러스 성 유전자의 intron 지역 대상으로 RNA-물고기 프로브를 설계 하 여 초기 RNA 사본 있을 수 있습니다. 이 조합의 분자 프로브를 사용 하 여, 큰 바이러스 성 녹음 방송 공장 조립 시각화 하 고 분석 KSHV 다시 활성화 하는 동안 바이러스 성 유전자 발현의 공간 규정 가능 하다. 포함 하 여 안티-RNA 중 합 효소 II 항 체 얼룩이 지기, 하나 또한 RNA 중 합 효소 II (RNAPII) 집계 및 재 활성화 하는 동안 KSHV 전사 사이 협회를 시각화할 수 있습니다.
Introduction
그것은 점점 더 분명 핵의 spatiotemporal 조직 진핵생물에서 정밀 하 게 조정 된 유전자 발현 조절에 중요 한 역할을 담당 하 게 되었다. 대부분 조직의 특정 유전자 많은 염색체를 통해 배포 됩니다 하 고 동기적으로 조정된 방식으로1특정 자극에 반응 하기 위하여 통제 될 필요가 있다. 셀 활성화 chromatin 허브 (ACH)을 함께 데리고의 유전자 및 그들의 cis 규정 구성 요소 특정 핵 공간1방법으로 생성 합니다.
그것은 또한 입증 되었습니다 다양 한 연구에 의해 그 핵 보이지만 매우 조밀 하 고 점성, 생물학적 활성 분자 통과할 수 핵 오히려 신속 하 게 보급2를 통해. 이 임시 속성 때문 대부분 DNA 의무적인 단백질 ‘ 점프 ‘를 그들의 길은 매우 적응 하 고 다양 한 핵2수 있는 핵 공간 느낌 사이트 바인딩 사이트 바인딩에서.
생체 내에서 핵의이 동적 동작에도 불구 하 고 핵 기관 막 없이 같은 (하지만에 국한 되지 않음) 핵소체 Cajal 몸과 promyelocytic 백혈병 핵 시체 (PML-NB) 여전히 존재. 그것은 탠덤 DNA 반복 (핵소체), rRNA (핵소체) 및 coilin (Cajal 몸) 또는 PML 등 구조 단백질 같은 메커니즘의 다양 한 통해 단백질 (PML-NB)는 이러한 구문을 함께3,4,5 . 이러한 구조와 전사 공장 등 다른 교회 역할 뿐만 아니라 필수 구성 요소의 현지 농도 증가 하지만 단백질 및 궁극적으로 만들 그들 내에서 핵 산의 구성 조절 건설 기계는 효율적인 세포 기능6중앙 사이트입니다.
머릿속으로 하는 핵 구조 형태 epigenetics 공부 하는 연구원에 게 풍부한 정보를 제공 언제, 어디. 바이러스학의 관점에서 KSHV, 같은 latently 감염된 바이러스의 재 활성화 크게 변경 핵의 풍경과 전사 세포 유전자에서 주로 바이러스 성 유전자, 궁극적으로 이동 핵 효소의 분포를 완전 한 기능 바이러스 자손7,8생산. KSHV는 바이러스 성 유전자 발현을 촉진 하기 위하여 세포 유전자 식 기계를 어떻게 조작 합니까? 이러한 정보에는 일시적인 세포 유전자 규제 메커니즘에 빛 창 고 수 있습니다.
다른 모든 herpesviruses KSHV는 용균성 복제 및 지연 시간 이라는 두 개의 라이프 사이클. KSHV는 주로 대기 시간 관련 유전자9,10를 제외 하 고는 대부분의 바이러스 성 유전자의 식 입 막 음, 대기 시간 단계에 상주 합니다. KSHV 생산 대기 시간 동안 대기 핵 항 원 (라 나), constitutively 바이러스 성 게놈을 결속 하 고 인간 염색체11에 바이러스 chromatin tethers 관련. 바이러스 성 게놈과 라 나의 친밀 한 관계 때문에 IFA와 DAPI를 사용 하 여 얼룩을 바이러스 성 episomes 호스트 chromatin 관계 했다 찾을 수 있다.
공부 하 고 단일 episome 수준과 감염 된 세포에 바이러스 성 다른 episomes와 협회에 KSHV 재 활성화, 적극적으로 베 끼 기 바이러스 chromatin에 제자리에 찾을 전략 설립 되었습니다. 따라서, 라 나 및 RNAPII IFA intron RNA-물고기와 결합 했다, KSHV K Rta는 주요 바이러스 성 단백질의 intron 지역 (정확한 프로브 시퀀스 이즈미 야 연구소의 최신 간행물8에서 찾을 수 있습니다)에 바인딩되는 RNA-물고기 프로브를 생성 하 여 필수 고 KSHV 다시 활성화-그것은 식별 가능한 충분 한 전사 찍고 실제로 어디 장소8,11,12,,1314,15 . 이 intron RNA-물고기 기술 연구원을 어디 mRNA 접합 이며 세포질16,17수출 직전 변하게 되는 시각화 수 있습니다.
KSHV phorbol 에스테 르 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (TPA) 등을 포함 한 다양 한 화학적 자극에 의해 활성화 될 수 있습니다 및 또한 KSHV 낙 산 염 나트륨 같은 히스톤 deacetylase 억제 물의 overexpression에 의해 활성화 유도 될 수 있다 바이러스 성 녹음 방송 인수, K-Rta19입니다. 연구원은 성공적으로 다시 활성화18유도 전에 셀의 사이클을 동기화 하 여 KSHV 재 활성화의 효율성 증가. 따라서, 이러한 특정 연구에 대 한 셀 더블 티 미 딘 블록 (아래에 설명 된 프로토콜)를 사용 하 여 및 짧은 시간에 대 한 TPA와 아목시실린과 (Dox) 알을 품을 동기화 했다. Doxycyline는 이러한 실험에 활용 셀 라인 doxycycline 유도할 수 있는 K-Rta 카세트 cDNA에서 복제 했다 하 고 K-Rta의 intron 지역에 포함 되지 않습니다 때문에 사용 되었다. 다시 활성화할 수 있지만 K-Rta 식 유도 KSHV 사용 하 여, 그것은 입증 된 다른 연구자는 다양 한 다른 생 화 확 적인 요인으로 인해 K-Rta 식 혼자 판명 미약한 재 자극20. 이들의 모두를 결합 하 여, 시간의 짧은 기간에 마약 외피를 제한 하 여 강력한 하지만 지나치게 인공 KSHV 재 이미징 달성 되었다.
라 나, RNAPII, 라벨링 후 K-Rta introns 그리고 DNA로이 문서에 설명 된, 3D 형광 이미징 widefield deconvolution 현미경을 사용 하 여 수행 되었다. 이미징 소프트웨어와 처리 후 활성 바이러스 episomes의 공간적 분포는 제대로 평가할 수 있습니다. 이 기술을 사용 하 여, 활성 chromatin 허브 및 다른 핵 구조 형성의 근본적인 성격에 관한 중앙 질문 공부 될 수 있다. 동일한 규제 요소를 처리 하는 단일 셀에 있는 동일한 바이러스 episomes spatiotemporal 유전자 규제 메커니즘의 이해를 깊게 하는 독특한 연구 도구를 나타낼 수 있습니다.
이미징 여러 세포 표본을 다른 시간 지점에서 고정 본질적으로 동적 분자 과정의 특성의 한계는 형광 분포에서 미묘한 또는 소규모 변화 감지 되지 않습니다 또는 하 찮은 것으로 간주. 희소 한 경우에 모든 세포 관찰 같은 미묘한 변화를 표시 하지 않는 한 이것은 사실 이다. 따라서, 활성 바이러스 성 전사 및 다른 핵 구조의 전체 spatiotemporal 관계 비판적으로 계산 해야 고정 된 이미지를 사용 하 여 합니다. 이러한 기술적 과제를 해결 하기 위해 가장 좋은 방법은 이미지 라이브 세포 바이러스 episomes을 표시 하 고 시간이 지남에 주요 세포질 효소의 위치에 따라입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
특이 한 상황에 맞게 변경 될 수 있는 프로토콜의 몇 가지 측면을 확인 하 고 있습니다. 고정 및 permeabilization 버퍼의 선택 또한 변경 될 수 있습니다. 고정 버퍼에 대 한 paraformaldehyde도 효과적 이며 에탄올 permeabilization 사용할 수 있습니다.
PBS는 것이 좋습니다 그것 포름알데히드 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 부재에 항 체를 사용 하지 않도록 설정 하지만 글리신 PBS 단계를 건너뛸 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 미국의 암 사회 연구 학술 상 (RSG-13-383-MPC)와 건강의 국가 학회 교부 금 (R01-DE025985)에 의해 지원 되었다. 이 작품 또한 지원 되었다 미국 농 무부 (2015-67015-23268 및 2014-67015-21787) 및 캘리포니아 대학에서에서 새로운 연구 이니셔티브 부여에서 교부 금에 의해 데이비스.
Materials
| RPMI medium 1650 GlutaMAX | Gibco by Life Technologies | 61870-036 | Needs to be warmed to 37 °C |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco by Life Technologies | 10378-016 | |
| Thymidine | Sigma Aldrich | T9250 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| TPA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 252549 | Corrosive, toxic, health hazard |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D-5758 | Acute toxicity |
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | Flammable, toxic |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | Flammable, toxic, health hazard |
| Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73 | Advanced Biotechnologies | 13-210-100 | |
| Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8 | EMD Milipore | 05-623 | |
| Ribonucleic acid, transfer from baker’s yeast (S. cerevisiae) | Sigma Aldrich | 9014-25-9 | |
| Saline sodium citrate buffer 20x (SSC) | Thermo Fisher Scientific | 15557044 | |
| Formamide | Sigma Aldrich | 295876 | |
| Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution | EMD Milipore | 1916C093 | |
| DAPI (4’,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| slowFade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Micro cover glass 22×22 | Matsunami | C022221 | |
| VoloCITY | 3D imaging software | ||
| DeltaVision microscope | |||
| Superfrost/Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
References
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