Funksjonell Imaging av Viral transkripsjon fabrikker bruker 3D fluorescens mikroskopi
Summary
Viral transcriptional fabrikker er diskret strukturer som er beriket med cellular RNA polymerase II å øke viral genet transkripsjon under aktivering. Her, er en metode for å finne steder av aktivt transkribere viral chromatin i 3D-nuclear rom av en kombinasjon av immunofluorescence flekker og i situ RNA hybridisering beskrevet.
Abstract
Det er velkjent at romlige og tidsmessige regulering av gener er en integrert del av styrende riktig genuttrykk. Derfor er det uvurderlig å forstå hvor og når transkripsjon finner sted innen kjernefysiske og visualisere forholdet mellom episomes infisert i den samme celle kjerne. Her, både immunofluorescence (IFA) og RNA-fisk har vært combinedto identifisere aktivt transkribere Kaposis sarkom-assosiert herpesvirus (KSHV) episomes. Av flekker KSHV ventetid-assosiert kjernefysiske antigen (LANA), er det mulig å finne der viral episomes finnes i kjernen. Dessuten, ved å utforme RNA-fisk sonder mot regionen intron med et virus som uttrykkes bare under produktiv infeksjon, kan begynnende RNA utskrifter ligge. Bruker denne kombinasjonen av molekylære sonder, er det mulig å visualisere samlingen av store viral transkripsjon fabrikker og analysere romlige regulering av viral genuttrykk under KSHV reaktivering. Ved anti-RNA polymerase II antistoff flekker, kan man også visualisere tilknytningen mellom RNA polymerase II (RNAPII) aggregering og KSHV transkripsjon under aktivering.
Introduction
Det har blitt stadig klarere at spatiotemporal organiseringen av kjernen spiller en viktig rolle i modulerende finstemt byggkorn under eukaryoter. De fleste vev bestemte gener er fordelt på mange kromosomer, og må reguleres synkront for å svare på spesifikke stimuli i en koordinert måte1. Celler konstruere aktive chromatin huber (ACH) som en måte å bringe sammen gener og deres cis-regulatoriske komponentene til en bestemt kjernefysiske område1.
Det har også vist av ulike studier at selv om kjernen synes svært tette og tyktflytende, biologisk aktive molekyler kan traversere kjernen ganske raskt via diffusjon2. Av flyktige egenskapen hoppe de fleste DNA bindende proteiner’ ‘ fra bindende område til bindende område, føler seg rundt den kjernefysiske plassen, noe som gir en svært tilpasningsdyktige og allsidig kjernen2.
Til tross for denne dynamiske virkemåten av biomolecules i kjernen kjernefysiske organer uten membraner som (men ikke begrenset til) kjerne, Cajal organer, og promyelocytic leukemi kjernefysiske organer (PML-NB) fremdeles eksisterer. Det er gjennom en rekke mekanismer som tandem DNA gjentar (kjerne), rRNA (kjerne) og strukturelle proteiner som Marianne (Cajal organer) eller PML proteiner (PML-NB) som holder disse konstruksjoner sammen3,4,5 . Disse strukturene og andre menigheter som transkripsjon fabrikker tjene som stillaser som ikke bare øke lokale konsentrasjonen av nødvendige komponenter, men også regulere sammensetningen av proteiner og nukleinsyrer i dem til slutt lage en sentrale området for effektiv cellulære funksjoner6.
Visualisere når og hvor kjernefysiske strukturer-skjemaet gir en mengde informasjon til forskere studere epigenetics. Fra et virologi perspektiv, reaktivering av latently infisert virus, som KSHV, vesentlig endrer landskapet i kjernen og distribusjon av kjernefysiske enzymer skifte transkripsjon hovedsakelig fra cellulære gener til viral gener, slutt å produsere fullt funksjonell viral avkom7,8. Hvordan KSHV manipulere mobilnettet gene expression maskiner å lette viral genuttrykk? Slik informasjon kan også kaste lys over timelige mobilnettet genet regulatoriske mekanismer.
Som alle andre herpesviruses har KSHV to sykluser kalt lytisk replikering og ventetid. KSHV ligger hovedsakelig i ventetid scenen, der mesteparten av sin viral genet uttrykk er taushet, bortsett fra ventetid forbundet gener9,10. Under ventetid KSHV produserer tilknyttet ventetid kjernefysiske antigen (LANA), som constitutively binder viral genomer og tethers viral chromatin menneskelige kromosomet11. På grunn av LANAS intimt forhold til viral genomet er det mulig å bruke IFA og DAPI flekker og finne hvor de viral episomes var i forhold til verten chromatin.
For å studere KSHV reaktivering på én episome nivå og tilknytning til andre viral episomes i en infiserte cellen, er en strategi for å finne aktivt transkribere viral chromatin i situ etablert. Følgelig ble LANA og RNAPII IFA med intron RNA-fisk kombinert, ved å generere RNA-fisk sonder som binder til regionen intron (nøyaktig sonde sekvenser kan finnes i Izumiya lab siste publikasjon8) KSHV K-Rta-the nøkkel viral protein som er viktig og tilstrekkelig for KSHV aktivering-det var mulig å identifisere hvor transkripsjon faktisk tok sted8,11,12,13,14,15 . Denne intron RNA-fisk teknikk kan forskere å visualisere hvor mRNA er blir transkriberte umiddelbart før det er skjøtes og eksportert til cytoplasma16,17.
KSHV kan aktiveres av ulike kjemiske stimuli inkludert phorbol estere som 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (TPA) og histone deacetylase hemmere som natrium butyrate, i tillegg KSHV kan bli overtalt til å reaktivere ved overuttrykte viral transkripsjon faktor, K-Rta19. Forskere har økte effektiviteten av KSHV aktivering ved å synkronisere cellens sykluser før inducing reaktivering18. Således, for disse bestemte studier, celler ble synkronisert ved hjelp av en dobbel thymidine blokk (protokoll beskrevet nedenfor), og inkubert med TPA og doxycycline (Dox) for en kort tid. Doxycyline ble brukt fordi cellen linjen benyttet i disse eksperimentene har en doxycycline-induserbart K-Rta kassetten, som ble klonet fra cDNA og omfatter ikke intron regionen K-Rta. Selv om det er mulig å aktivere KSHV bruker bare indusert K-Rta uttrykk, det er bevist av andre forskere at på grunn av ulike biokjemiske faktorer K-Rta uttrykk alene viser seg for å være en svak reaktivering stimuli20. Ved å kombinere alle disse, og ved å begrense narkotika incubations til en kort tidsperiode, ble en robust, men ikke altfor kunstig KSHV reaktivering oppnådd for bildebehandling.
Etter merking LANA, RNAPII, K-Rta introns og DNA som beskrevet i denne hvitboken, 3D fluorescens imaging ble utført widefield deconvolution mikroskop. Etter behandling med redigeringsprogramvare, kan den romlige fordelingen av aktive viral episomes bli skikkelig evaluert. Bruker denne teknikken, kan de sentrale spørsmålene om grunnleggende natur av dannelse av aktive chromatin huber og andre kjernefysiske strukturer studeres. Har identiske viral episomes i en enkelt celle som behandler de samme regulatoriske elementene kan representere en unik forskning verktøyet å utdype forståelsen av spatiotemporal genet regulatoriske mekanismer.
En begrensning av imaging flere celle prøver fast på ulike tidspunkt betegner en iboende dynamisk molekylær prosess er det subtile eller mindre endringer i fluorescens distribusjon er uoppdaget eller anses ubetydelig. Dette gjelder med mindre i sjeldne tilfeller, hver celle observert viser samme subtile endringen. Dermed kan fullt spatiotemporal forholdet mellom aktive viral transkripsjon og andre kjernefysiske strukturer ikke kritisk evalueres med fast imaging. For å løse disse tekniske utfordringer, er den beste tilnærmingen å bilde lever celler som merket viral episomes og følge plasseringen av viktige mobilnettet enzymer over tid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er noen aspekter av protokollen som kan endres for å imøtekomme uvanlige omstendigheter. Valg av fiksering og permeabilization buffere kan også endres. For fiksering buffere, paraformaldehyde er også effektiv og etanol kan brukes til permeabilization.
Slukke formaldehyd med glysin PBS er anbefalt som det hindrer at formaldehyd deaktivere antistoffer i fravær av bovin serum albumin (BSA), men hvis coverslips er vasket grundig nok, glysin PBS steg kan hoppet. I protokollen, unngå å br…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av National Institutes of Health grant (R01-DE025985) og en American Cancer Society forskning Scholar Award (RSG-13-383-MPC). Dette arbeidet ble også støttet av tilskudd fra US Department of Agriculture (2015-67015-23268 og 2014-67015-21787) og nye forskningsstipend initiativ fra University of California, Davis.
Materials
| RPMI medium 1650 GlutaMAX | Gibco by Life Technologies | 61870-036 | Needs to be warmed to 37 °C |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco by Life Technologies | 10378-016 | |
| Thymidine | Sigma Aldrich | T9250 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| TPA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 252549 | Corrosive, toxic, health hazard |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D-5758 | Acute toxicity |
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | Flammable, toxic |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | Flammable, toxic, health hazard |
| Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73 | Advanced Biotechnologies | 13-210-100 | |
| Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8 | EMD Milipore | 05-623 | |
| Ribonucleic acid, transfer from baker’s yeast (S. cerevisiae) | Sigma Aldrich | 9014-25-9 | |
| Saline sodium citrate buffer 20x (SSC) | Thermo Fisher Scientific | 15557044 | |
| Formamide | Sigma Aldrich | 295876 | |
| Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution | EMD Milipore | 1916C093 | |
| DAPI (4’,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| slowFade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Micro cover glass 22×22 | Matsunami | C022221 | |
| VoloCITY | 3D imaging software | ||
| DeltaVision microscope | |||
| Superfrost/Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
References
- de Laat, W., Grosveld, F. Grosveld Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub. Chromosome Res. 11 (5), 447-459 (2003).
- Misteli, T. Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression. Science. 291 (5505), 843-847 (2001).
- Bernardi, R., Pandolfi, P. P. Structure, dynamics and functions of promyelocytic leukaemia nuclear bodies. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 1006-1016 (2007).
- Cioce, M., Lamond, A. I. Cajal bodies: a long history of discovery. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 105-131 (2005).
- Boisvert, F. M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., Lamond, A. I. The multifunctional nucleolus. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 574-585 (2007).
- Sutherland, H., Bickmore, W. A. Transcription factories: gene expression in unions. Nat Rev Genet. 10 (7), 457-466 (2009).
- Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. J Virol. 88 (3), 1404-1420 (2014).
- Chen, C. P., et al. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. J Virol. 91 (11), (2017).
- Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J Clin Invest. 120 (4), 939-949 (2010).
- Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. Kaposi’s sarcoma and its associated herpesvirus. Nat Rev Cancer. 10 (10), 707-719 (2010).
- Campbell, M., et al. Protein arginine methyltransferase 1-directed methylation of Kaposi sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen. J Biol Chem. 287 (8), 5806-5818 (2012).
- Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).
- Darst, R. P., Haecker, I., Pardo, C. E., Renne, R., Kladde, M. P. Epigenetic diversity of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Nucleic Acids Res. 41 (5), 2993-3009 (2013).
- Osborne, C. S., et al. Myc dynamically and preferentially relocates to a transcription factory occupied by Igh. PLoS Biol. 5 (8), 192 (2007).
- Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
- Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. PLoS Pathog. 7 (10), 1002300 (2011).
- Chang, P. C., et al. Histone demethylase JMJD2A regulates Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus replication and is targeted by a viral transcriptional factor. J Virol. 85 (7), 3283-3293 (2011).
- McAllister, S. C., Hansen, S. G., Messaoudi, I., Nikolich-Zugich, J., Moses, A. V. Increased efficiency of phorbol ester-induced lytic reactivation of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus during S phase. J Virol. 79 (4), 2626-2630 (2005).
- Miller, G., El-Guindy, A., Countryman, J., Ye, J., Gradoville, L. Lytic cycle switches of oncogenic human gammaherpesviruses. Adv Cancer Res. 97, 81-109 (2007).
- Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).
