Summary
We beschrijven een in vivo lymfkliertest model van perineural invasie door het injecteren van syngeneic pancreatic kankercellen in de nervus ischiadicus. Het model zorgt voor de kwantificering van de omvang van de zenuw invasie, en ondersteunt onderzoek naar de cellulaire en moleculaire mechanismen van perineural invasie.
Abstract
Kankercellen binnenvallen zenuwen door middel van een proces genoemd perineural invasie (PNI), in welke kanker cellen vermenigvuldigen en migreren in de communicatie van de zenuw. Dit soort invasie door allerlei soorten kanker wordt tentoongesteld, en zeer vaak in pancreatic kanker wordt gevonden. De microscopische grootte van zenuwvezels binnen muis alvleesklier maakt de studie van de PNI moeilijk in orthotopic lymfkliertest modellen. Hier beschrijven we een heterotopic in vivo -model van de PNI, waar wij syngeneic alvleesklierkanker cellijn Panc02-H7 in de nervus ischiadicus lymfkliertest injecteren. In dit model zijn de ischiadicus zenuwen van narcose muizen blootgesteld en ingespoten met kankercellen. De kankercellen binnenvallen in de zenuwen proximally richting het ruggenmerg vanuit het punt van de injectie. De binnengedrongen ischiadicus zenuwen zijn vervolgens uitgepakt en verwerkt met LGO voor bevroren segmenteren. H & E en immunofluorescentie kleuring van deze secties de kwantificering van zowel de mate van invasie en wijzigingen in eiwit expressie toestaan. Dit model kan worden toegepast op een verscheidenheid van studies over de PNI gegeven zijn veelzijdigheid. Met behulp van muizen met verschillende genetische modificaties en/of verschillende soorten kankercellen kan voor onderzoek van de cellulaire en moleculaire mechanismen van de PNI en voor kanker van de verschillende typen. Bovendien kunnen de effecten van therapeutische agenten op de zenuw invasie door behandeling toe te passen om deze muizen te worden bestudeerd.
Introduction
Zenuwen vormen een specifieke tumor communicatie dat kanker groei en migratie1,2,3 stimuleert. Perineural invasie (PNI) is het proces via welke kanker cellen in en rond de zenuwen binnenvallen. Het kan worden beschouwd als een unieke route van metastase aangezien kanker invasie strekt zich uit van de bezienswaardigheden van oorsprong langs zenuwen. PNI komt voor in verschillende soorten kanker en alvleesklier-, prostaat, hoofd & nek, speeksel, cervicale, colorectal kanker met een incidentie variërend van 22% tot 100%1,2. PNI wordt geassocieerd met pijn en correleert met slechte prognose en erger survival tarieven1,2.
Het ontwikkelen van modellen van perineural invasie is essentieel verhelderen van de cellulaire en moleculaire mechanismen van dit proces, en het testen van kandidaat-therapeutische agenten PNI afnemen. In vitro methoden van de studie van interacties tussen kanker en zenuwen omvatten de co cultuur van kankercellen met zenuw explantaten4, achterwortelganglia ganglion5,6,7, of met bepaalde cellen van de zenuw cellen communicatie zoals Schwann7. In vivo benaderingen, echter meer fysiologisch relevant zijn, omvatten het gebruik van kanker Muismodellen waarin kanker heeft veroorzaakt of getransplanteerde en hebben het voordeel van de boekhouding voor de hele zenuw-communicatie. Modellen van de alvleesklier of prostaat kanker, PNI geweest gerapporteerde8,9,10 in orthotopic en de incidentie van PNI kan worden vastgelegd, maar vanwege de kleine omvang van de zenuwen in deze organen, is het moeilijk om te zien de hele zenuw en daarom te kwantificeren van de omvang van de PNI. Het model die we hier beschrijven is een in vivo model van PNI in welke kanker cellen worden ingespoten in de nervus ischiadicus van muizen door middel van een eenvoudige chirurgische ingreep11. De heterotopic transplantatie valt binnen in de zenuw naar het ruggenmerg. De lengte van de invasie van de zenuw van de site van injectie aan het ruggenmerg kan worden gemeten, evenals de omvang van de kanker binnen de zenuw. Nog belangrijker is, kan de binnengedrongen zenuw ook worden verzameld voor een verscheidenheid van tests met inbegrip van microscopische en moleculaire analyses. Een verscheidenheid van kankercellen kan worden getest, en de gastheer muizen die genetisch hebt gewijzigd of behandeld met specifieke verbindingen kunnen ook worden gebruikt. Deze krachtige test zorgt voor de kankercellen en de communicatie van de host worden gewijzigd voor onderzoek naar de mechanismen van de PNI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures met dierlijke onderwerpen werden goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité bij Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.
1. bereiding van de kankercellen
- Oogst sub confluente Panc02-H7 cellen met 0,25% trypsine gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Het verzamelen van de cellen in een centrifugebuis 15 mL.
Opmerking: De cellen worden gekweekt in T-225 kolf, waarin ongeveer 12 x 106 cellen per erlenmeyer op 80% confluentie en 4 mL trypsine / kolf wordt gebruikt. - Centrifugeer de cellen bij x 900 g bij 4° C gedurende 5 minuten wassen de cellen door de cel resuspending pellet in 1 mL PBS (door twee keer op en neer pipetteren), en spoel de suspensie aan een 1,5 mL microcentrifuge buis op ijs.
- Centrifugeer de cellen weer op x 900 g bij 4° C gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant zonder de pellet te verstoren. Houd de Ingehuld cellen op ijs tot injectie.
2. voorbereiding van de muizen en chirurgie
Opmerking: 8-week-oude mannelijke en vrouwelijke C57BL/6J muizen worden gebruikt in deze studie. De chirurgie voorwaarden volgt de regels van de IACUC van onze instelling. De instrumenten zijn gesteriliseerd, de chirurgische werkoppervlak wordt ontsmet, het dier wordt ontsmet en de chirurg steriele handschoenen draagt.
- Op de dag vóór de operatie, de muis met behulp van 2% Isofluraan anesthetize en verwijder de vacht langs de lengte van het bovenbeen aan dorsale zijde met een dun scheermes of een chemische haar verwijdering agent.
- Anesthetize op de dag van de operatie, de muizen met behulp van 2% isofluorane in de zaal van een inductie. Bevestig de afstomping door een teen snuifje stimulus en een gebrek aan respons.
- Dierenarts zalf toepassen op ogen om te voorkomen dat droogte onder verdoving.
- Plaats de narcose muis aan de ventrale zijde, en zachtjes veilig elke ledemaat met hypoallergene tape maken van milde spanning in de ledematen te worden geïnjecteerd. Anesthesie is onderhouden met behulp van Isofluraan geleverd via een precisie vaporizer en de neus.
- Reinig de injectieplaats met Betadine, dan weer met 70% alcohol. Herhaal dit proces tweemaal meer. Zorg ervoor dat geen losse haren op het chirurgische gebied blijft.
- Maak een incisie van 1 cm met kleine schaar ongeveer 2 mm onder en parallel met het dijbeen. Met een tang lateraal te ontmaskeren de spieren onder de huid worden ingetrokken.
- De nervus ischiadicus loopt diep naar de gluteus maximus en musculus biceps femoris spieren. Scheiden deze twee spieren langs een fasciaal vlak met kleine schaar en de nervus ischiadicus onder blootstellen. Gratis de zenuw van de omliggende spieren met behulp van botte dissectie.
- 3 μL van kankercellen (ongeveer 50.000 cellen) trekken door de pellet in een spuit van 10 μL.
Opmerking: Tekenen als alternatief 3 μL van PBS als een besturingselement. - Plaats een kleine metalen spatel onder de zenuw op de plaats van injectie voor steun. Onder visualization met een ontleden Microscoop, plaatst u de naald in de zenuw tegen de metalen basis, houden de naald als parallel aan de zenuw mogelijk op de invoegpositie. Wees voorzichtig niet te doorprikken via de achterkant van de zenuw. Het minimaliseren van de behandeling van zenuwen zo veel mogelijk in dit hele proces.
- Langzaam injecteren in de zenuw meer dan 5 s. Een formatie van een lamp op het gebied van injectie geeft een goede injectie. Laat dan de naald op zijn plaats voor 3 s voordat de naald voorzichtig te verwijderen. Rekening houdend met de naald plaats voor 3 s minimaliseert terugvoer van de cellen uit de zenuw.
Opmerking: Injectie kan worden uitgevoerd naar de distale zenuw of het ruggenmerg. Het is belangrijk om te blijven consistent binnen een reeks van experimenten. Als de cellen buiten morsen, moet het dier niet worden opgenomen in de analyse van het experiment. Met ervaring zijn deze gebeurtenissen zeer zeldzaam. - De zenuw terugkeren naar de oorspronkelijke positie. Dekking van de zenuw met de bovenliggende spieren. Behandelen van de muizen met goede Analgesie, en sluit vervolgens de huid met 5-0 Nylon hechtingen.
- Plaats de muis alleen in een schone kooi voor observatie tijdens het herstel, totdat het volledig wakker uit de narcose.
Opmerking: Het duurt 5 tot 15 min voor het dier te herwinnen van volledig bewustzijn. Het dier is niet onbeheerd totdat het voldoende bewustzijn te handhaven sternale lighouding heeft herwonnen. Het dier wordt niet teruggezonden naar het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld. Daarna evalueren herstel ten minste eenmaal elke 24 h gedurende 72 uur.
3. de Ischiaszenuw extractie
- Euthanaseren op postop dag #7, de muizen met CO2. Plaats de muis aan de ventrale zijde en stabiliseren van de distale ledematen met behulp van pennen.
- Verwijder de huid aan de dorsale zijde van de geïnjecteerde ledematen en romp.
- Met behulp van botte dissectie, bloot de nervus ischiadicus diep aan de spieren.
- De cursussen van de zenuw tussen de ilium en de sacrum. Als u wilt toegang tot de zenuw in de regio van het ruggenmerg, scheiden de twee beenderen. Eerst gesloten schaar invoegen in het smal gebied waar de nervus ischiadicus zich bevindt en open vervolgens de schaar terwijl de muis. Delicaat en handhaven van de integriteit van de nervus ischiadicus tijdens de dissectie.
- Zorgvuldig ontleden de nervus ischiadicus distally aan het einde van het dijbeen, en proximally naar het ruggenmerg.
- Opmerking: Binnengevallen zenuwen zijn uiterst kwetsbaar en gevoelig voor breken onder spanning of krachtig behandeling.
- Oogst de zenuw door het eerste snijden het distale uiteinde. Trek voorzichtig de zenuw terwijl het bevrijden van de aangrenzende weefsel. Snijd de zenuw eind proximale, zo dicht mogelijk naar de uitgang van de wervelkolom.
- Record dan bruto lengte van invasie met behulp van een schuifmaat gemeten. Deze macroscopische schatting is uitsluitend indicatief.
4. zenuwen verwerking en kwantificering
- Insluiten de ontleed zenuw in LGO samengestelde. Zorg u ervoor zorgen dat zenuwen lengterichting en zo plat op de bodem van de mal mogelijk.
- De proximale en distale zijde van de zenuw met behulp van merktekens van de letter P en overleden op de cassette aangeven
- Schakel ingesloten zenuwen op de top van droogijs, als ze niet onmiddellijk worden gesegmenteerd. Monster kan wekenlang bij-80 ° C worden bewaard.
- Sectie monsters gebruikend microtome cryostaat op 5 μm-dikte en plaats delen op glas dia's. Indien mogelijk, passen 2 zenuw secties per dia. Geven aan proximale zijde van de zenuw.
- Dia's met behulp van H & E kleuring12vlek.
- Digitaal scannen gebeitst zenuw secties met een dia-scanner waarmee de hoge resolutie digitale gegevens.
- De lengte van de invasie door de maatregel afstand klikken met behulp van beeldbewerkingssoftware, kwantificeren, gebied van invasie, of andere gewenste parameters. Voor een goede schatting van de lengte van invasie, door meerdere secties (2 tot en met 4) van de dezelfde zenuw te gebruiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze methode beschrijft de chirurgische inplanting van pancreatic kankercellen in de lymfkliertest nervus ischiadicus om een model in vivo van kwantificeerbare zenuw invasie te maken. Figuur 1 illustreert de anatomische locatie van de nervus ischiadicus en de plaats van injectie. Figuur 2 toont de twee ischiadicus zenuwen van een naakt muis. Een PBS geïnjecteerd zenuw (links) kan worden vergeleken met een zenuw geïnjecteerd met MiaPaCa-2 kankercellen (rechts). De zenuw geïnjecteerd met kankercellen is geïnfiltreerd door tumor en verschijnt zowel dikker en donkerder dan de zenuw geïnjecteerd met PBS.
Figuur 3 toont de meetbare verschillen van de nervus ischiadicus invasie van pancreatic kankercel Panc02H7 in wild type en NCAM KO muizen. NCAM KO muizen zijn muizen waarin de adhesie molecuul neurale-cel adhesie molecuul 1 gebrekkig13 is. Lengte en de oppervlakte van de invasie is gekwantificeerd met behulp van beeldbewerkingssoftware. Invasie werd gevonden in NCAM KO muizen7aanzienlijk verminderd.
Figuur 1 : De Ischiaszenuw muis en de plaats van injectie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : De twee ontleed ischiadicus zenuwen van een muis. Een PBS geïnjecteerd zenuw (links) en een zenuw geïnjecteerd met MiaPaCa-2 kanker cellen (rechts) worden weergegeven. Zwarte pijlen wijzen naar de plaats van injectie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : H & E longitudinale secties van ischiadicus zenuwen ingespoten met Panc02H7 kankercellen in wild type en NCAM KO muizen. Witte pijlen geven aan dat de plaats van injectie en proximale zijde van het ruggenmerg. De zwarte pijlen geven de lengte van de invasie met de bijbehorende waarden (mm). Schaal bar: 5 mm (populair) en 0,2 mm (onderste foto's). Kwantificering van zenuw invasie, zoals gemeten door de lengte en de oppervlakte van de invasie. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SD. n = 8 (NCAM1 WT), n = 7 (NCAM1 KO), ** P < 0.005, *** P < 0.0005 met behulp van t-test. (Resultaten van Deborde et al.., 20167). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol beschrijven we een in vivo lymfkliertest model van perineural invasie die het mogelijk voor de kwantificering van de nervus ischiadicus invasie van pancreatic kankercellen maakt. Dit model maakt de studie van moleculaire mechanismen van zenuw invasie. Succesvolle experimenten met behulp van deze techniek vereist een zorgvuldige benadering van drie essentiële stappen in het proces: 1) de injectie van kankercellen (stappen 2.7, 2.8), 2) de winning van binnengevallen zenuwen (stap 3.4), en 3) verwerking van geoogste zenuwen (stap 4.1).
De injectie moet worden gedaan met grote voorzichtigheid om te voorkomen dat prikken door de achterste muur van de zenuw, die tot een verlies van kankercellen leidt. Zodra de naald in de plaats is, de injectie moet gebeuren in een langzame en gestage tempo meer dan 5 s om te voorkomen dat de hydraulische kracht voortbewegen van de kanker cellen te ver vooruit vanaf het punt van de injectie. Laat de naald in de zenuw na injectie voor een extra 3 s terug stroom en kanker cel lekkage zal minimaliseren. Tijdens de extractie van de nervus ischiadicus moet dissectie zeer zacht de binnengedrongen ischiadicus zenuw is erg kwetsbaar. Kanker invasie verstoort de normale cellulaire organisatie van de nervus ischiadicus. Hoewel binnengevallen zenuwen worden weergegeven dikker diameter in vergelijking met niet-ingespoten of niet-binnengevallen zenuwen, ze zijn meer gevoelig voor breken met geringe rekken en manipulatie. Tijdens het insluiten van de verwijderde zenuw in LGO voor verwerking, is het zeer belangrijk om te verzekeren dat de zenuw volledig plat wordt verlegd naar de schimmel. Deze stap zorgt voor het segmenteren van het monster te vangen de hele lengte van de zenuw voor juiste analyse. Vaak moet solide tumor op de zenuw worden bijgesneden om te voorkomen dat de zenuw segment proximale aan de tumor van het verhogen van de zenuw van de onderkant van de schimmel. De gehele lengte van de zenuw moet worden plat volledig tegen de schimmel.
Veel wijzigingen kunnen worden beschouwd, terwijl het gebruik van dit protocol. Wanneer een kleine metalen spatel niet beschikbaar is voor onder de nervus ischiadicus worden geplaatst, kan het oppervlak van een paar brede pincet in plaats daarvan worden gebruikt. Een verlostang kan worden gebruikt voor de naald op zijn plaats houden na inbrengen, hoewel de nadelen van deze aanpak een verkleinde weergave van de injectie en de mogelijkheden zijn om de zenuw te verpletteren als buitensporig geweld wordt gebruikt. Een andere manier is het gebruik van een fijne pincet te heffen van de zenuw, vervolgens de verlostang om te strekken de zenuwen te openen. Deze methode is gemakkelijker uit te voeren en biedt zowel de spanning en de stabilisatie tijdens de injectie, maar kan schade veroorzaken aan de zenuw met het overmatig uitrekken van de zenuw. De injectie kan worden gedaan in een proximaal of DISTAAL richting, maar we hebben gevonden dat in beide gevallen, de richting van de invasie van de kanker meestal naar het ruggenmerg is. Wij verkiezen daarom distally injecteren om verdere minimaliseren hydraulische kracht die kan duwen van de kankercellen naar het ruggenmerg en latere maatregelen van lengte van invasie beschamen. Wij adviseren dat het gaat om consequent zijn in de keuze van de richting van injectie uit een aantal experimenten.
Hoewel wij een model syngeneic enten presenteren, kan een soortgelijke techniek kan worden gebruikt voor xenografts menselijke kankercellen in immunodeficiëntie muizen, met slechts lichte variaties. Xenografts in naakt muizen kunnen vereist langere periodes van kanker invasie aan het rendement van soortgelijke lengtes van zenuw invasie in syngeneic modellen. Verschillende kanker cellijnen kunnen ook worden gebruikt. PNI is niet alleen overwegend in de kanker van de alvleesklier, maar ook van het hoofd- en nek-, prostaat- en huidkanker. Onze lab heeft met succes geïnjecteerd naakt muizen in de nervus ischiadicus met menselijke alvleesklierkanker cellijnen MiaPaCa-2 en Panc17,14,15.
Mogelijke ongewenste voorvallen zijn wond dehiscentie, de muizen af en toe kauwen hun steken wat resulteert in de opening van de wond. In dat geval zou de wond moeten opnieuw gestikt. Wij controleren dagelijks de wond voor de eerste 3 dagen van post-operatieve. De muizen kunnen ook lopen met een lichte slap postoperatief, waarschijnlijk als gevolg van pijn van zowel de chirurgische procedure evenals invasie van hun nervus ischiadicus met kanker. Dit is meestal niet ernstig genoeg pijn medicatie vereist.
Dit model heeft beperkingen. Enkele bedrag van strechings en het knijpen van de zenuw tijdens de procedure kan doen schade ontstaan in de zenuw. Bovendien is het moeilijk om te bepalen van het exacte aantal cellen in te gaan op de zenuw. Dit model is bovendien beperkt tot de studie van cellen die zenuwen al zijn binnengedrongen. Het is niet een model om te studeren van de interactie van zenuwen bij kankercellen gelegen in de primaire tumor. Het grootste nadeel van het gebruik van de zenuwen van de ischiadicus versus zenuwen van de gastro-intestinale tractus is dat de nervus ischiadicus niet een metastatische site van pancreatic kanker is. Het verschil in de samenstelling en de aard van de zenuwvezels invloed kan zijn op de invasie. De toegankelijkheid en de zeer geringe omvang van de alvleesklier zenuwen zou echter niet zulk een studie.
Onze belangrijkste suggesties voor de beginners zou het haar in een groot gebied rond de geplande incisie sites verwijderen zodat de bezienswaardigheden kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd en moet ervoor zorgen dat een stabiele positie vóór begin te injecteren. Na veel injecties, moet de uitvoerder kunnen krijgen 100% van de dieren met de invasie van de zenuw.
Dit model zorgt voor de studie van de interacties tussen kanker en zenuwen in een dierlijk model. Het kan worden toegepast op een breed scala van oncologische studies met behulp van genetisch gemodificeerde muizen, kankercellen, of beide. Farmacologische behandelingen tegen invasie van de tumor langs zenuwen kunnen ook worden getest door het vergelijken van lengte en de oppervlakte van invasie tussen behandeling en controlegroepen. Deze verschillende mogelijke toepassingen maken dit model een uiterst veelzijdige en krachtige hulpmiddel voor het bestuderen van de PNI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de technische diensten van de moleculaire cytologie faciliteit en het dier faciliteit van het Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. Dit werk werd gesteund door de NIH subsidies CA157686 (voor R.J. Wong) en P30 CA008748 (toekenning van de steun van de Memorial Sloan-Kettering Cancer Center).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse | Number and age variable depending on experimental needs | ||
| Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS) | Any | Steps 1.1, 1.2, 1.3. | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | Falcon | 352098 | Step 1.1 |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Axygen | MCT-150-C-S | Step 1.2 |
| Electric razor | WAHL | 9962 | Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent |
| Isoflurane, 250 mL | Baxter | 1001936060 | Step 2.2 |
| Hypoallergenic surgical tape | 3M Blenderm | 70200419342 | Step 2.3 |
| Betadine Swapsticks | PDI | SKU 41350 | Step 2.4 |
| Webcol Alcohol Preps | Covidien | 5110 | Step 2.4 |
| Sterile surgical tools (scissors and forceps) | Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5 | ||
| 10 μL Hamilton syringe | Hamilton | 80308 | Steps 2.7, 2.8 |
| Steel Micro spatula | Fisher Scientific | S50823 | Step 2.7 |
| Dissecting microscope | Step 2.7 | ||
| Bupivacine, 1 g | Enzo Life Sciences | BML-NA139-0001 | Step 2.9. Reconstitute to 0.5% |
| 5-0 Nylon suture | Ethicon | 698H | Step 2.9 |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | VWR | 25608-930 | Step 4.1 |
| Tissue-Tek Cryomold Molds | VWR | 25608-916 | Step 4.1 |
References
- Liebig, C., Ayala, G., Wilks, J. A., Berger, D. H., Albo, D. Perineural invasion in cancer. Cancer. 115 (15), 3379-3391 (2009).
- Bapat, A. A., Hostetter, G., Von Hoff, D. D., Han, H. Perineural invasion and associated pain in pancreatic cancer. Nat Rev Cancer. 11 (10), 695-707 (2011).
- Deborde, S., Wong, R. J. How Schwann cells facilitate cancer progression in nerves. Cell Mol Life Sci. 341 (177-186), 1236361-1236416 (2017).
- Abiatari, I., et al. Consensus transcriptome signature of perineural invasion in pancreatic carcinoma. Mol Cancer Ther. 8 (6), 1494-1504 (2009).
- Ayala, G. E., et al. In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction: redefining perineural invasion in prostate cancer. Prostate. 49 (3), 213-223 (2001).
- Gil, Z., Cavel, O., et al. Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves. J Natl Cancer Inst. 102 (2), 107-118 (2010).
- Deborde, S. T., et al. Schwann cells induce cancer cell dispersion and invasion. J Clin Invest. 126 (4), 1538-1554 (2016).
- Pour, P. M., Egami, H., Takiyama, Y. Patterns of growth and metastases of induced pancreatic cancer in relation to the prognosis and its clinical implications. Gastroenterology. 100 (2), 529-536 (1991).
- Eibl, G., Reber, H. A. A xenograft nude mouse model for perineural invasion and recurrence in pancreatic cancer. Pancreas. 31 (3), 258-262 (2005).
- Stopczynski, R. E., et al. Neuroplastic changes occur early in the development of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Res. 74 (6), 1718-1727 (2014).
- Gil, Z., et al. Nerve-sparing therapy with oncolytic herpes virus for cancers with neural invasion. Clin Cancer Res. 13 (21), 6479-6485 (2007).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Cremer, H., et al. Inactivation of the N-CAM gene in mice results in size reduction of the olfactory bulb and deficits in spatial learning. Nature. 367 (6462), 455-459 (1994).
- He, S., et al. The chemokine (CCL2-CCR2) signaling axis mediates perineural invasion. Mol Cancer Res. 13 (2), 380-390 (2015).
- He, S., et al. GFRα1 released by nerves enhances cancer cell perineural invasion through GDNF-RET signaling. P Natl Acad Sci USA. , 02944 (2014).
