Summary

En i Vivo Murine Sciatic Nerve modell Perineural invasjon

Published: April 23, 2018
doi:

Summary

Vi beskriver en i vivo murine modell perineural invasjon ved å injisere syngeneic kreft i bukspyttkjertelen celler i sciatic nerve. Modellen gir kvantifisering av omfanget av nerve invasjon, og støtter undersøkelse av mobilnettet og molekylære mekanismer perineural invasjon.

Abstract

Kreftceller invadere nervene gjennom en prosess kalt perineural invasjonen (PNI), som kreft celler sprer og overføre i nerve microenvironment. Denne typen invasjonen er utstilt ved en rekke typer kreft, og veldig ofte finnes i bukspyttkjertelkreft. Mikroskopiske størrelsen på nerve fiber innen musen bukspyttkjertelen gjengir studiet av PNI vanskelig orthotopic murint modeller. Her beskriver vi en heterotopic i vivo modell av PNI, hvor vi injisere syngeneic bukspyttkjertelkreft celle linje Panc02-H7 i murine sciatic nerve. I denne modellen er sciatic nerver bedøvet mus utsatt og injisert kreftceller. Kreftceller invadere i nervene proximally mot ryggmargen fra poenget med injeksjon. Invaderte sciatic nerver er deretter trekkes ut og behandles med OCT frosne snitting. H & E og immunofluorescence flekker av disse delene at kvantifisering av både graden av invasjonen og endringer i protein uttrykk. Denne modellen kan brukes til en rekke studier på PNI gitt dens allsidighet. Hvis du bruker mus med forskjellige genetiske modifikasjoner og/eller ulike typer av kreftceller kan for undersøkelse av mobilnettet og molekylære mekanismer for PNI og forskjellige kreftformene. Videre kan effekten av terapeutisk agenter på nerve invasjonen studeres ved å bruke behandling mus.

Introduction

Nervene danner en bestemt svulst microenvironment som stimulerer kreft vekst og migrasjon1,2,3. Perineural invasjonen (PNI) er prosessen gjennom som kreft celler invadere i og rundt nerver. Det kan betraktes som en unik måte av metastasering siden kreft invasjonen strekker seg fra webområdene opprinnelsesland langs nervene. PNI finnes i flere typer kreft inkludert bukspyttkjertelen, prostata, hode og nakke, salivary, livmorhalsen, og kolorektal kreft med en forekomst, fra 22% til 100%1,2. PNI er forbundet med smerte og korrelerer med dårlig prognose og verre overlevelse priser1,2.

Utvikle perineural invasjonen er viktig å belyse cellulære og molekylære mekanismer for denne prosessen, og å teste kandidat terapeutiske agenter for å redusere PNI. In vitro -metoder for å studere interaksjonen mellom kreft og nerver inkluderer co kulturen av kreftceller med nerve explants4, med dorsal root ganglions5,6,7, eller bestemte celler fra nerve celler microenvironment som Schwann7. I vivo tilnærminger, er imidlertid mer fysiologisk relevante, omfatter bruk av kreft musen modeller som har kreft indusert eller transplantert og har fordelen av hele nerve microenvironment. I orthotopic modeller av bukspyttkjertelen eller prostata kreft, PNI har vært rapportert8,9,10 og forekomsten av PNI kan registreres, men på grunn av den lille størrelsen på nervene i disse organene, er det vanskelig å se hele nerve og derfor å kvantifisere omfanget av PNI. Modellen vi beskriver her er en i vivo modell av PNI i som kreft celler blir injisert i sciatic nerve mus gjennom et enkelt kirurgisk inngrep11. Heterotopic transplantasjon invaderer innen nerve mot ryggmargen. Lengden på nerve invasjon fra området av injeksjon i ryggmargen kan måles, og volumet av kreft i nerve. Viktigere, kan invaderte nerve også samles for en rekke analyser inkludert mikroskopiske, og molekylær analyser. En rekke kreftceller kan testes, og vert musene som er genetisk endret eller behandlet med bestemte forbindelser kan brukes også. Denne kraftige analysen gir kreftceller og vert microenvironment endres for etterforskning mekanismer av PNI.

Protocol

Alle prosedyrer med dyr fag ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen ved Memorial Sloan Kettering Cancer Center. 1. forberedelse av kreftceller Høste sub confluent Panc02-H7 celler med 0,25% trypsin i 5 min på 37 ° C. Samle inn cellene i et 15 mL sentrifuge rør.Merk: Cellene er dyrket i T-225 kolbe, som inneholder ca 12 x 106 celler per kolbe på 80% confluency og 4 mL trypsin / kolbe brukes. Sentrifuge cellene på x 900 g på 4° C i …

Representative Results

Denne metoden beskriver kirurgisk implantering av kreft i bukspyttkjertelen celler i murine sciatic nerve til å opprette en i vivo modell kvantifiserbare nerve invasjon. Figur 1 illustrerer anatomiske plasseringen av ischias nerven og injeksjonsstedet. Figur 2 viser to sciatic nerver av en naken mus. En PBS injisert nerve (venstre) kan sammenlignes med en nerve injisert med MiaPaCa-2 kreftceller (høyre). Nerve injiser…

Discussion

I denne protokollen beskriver vi en i vivo murine modell av perineural invasjonen som gir mulighet for kvantifisering av ischias nerven invasjon av kreft i bukspyttkjertelen celler. Denne modellen muliggjør studiet av molekylære mekanismer nerve invasjon. Vellykket eksperimenter ved hjelp av denne teknikken krever en forsiktig tilnærming til tre viktige trinn i prosessen: 1) injeksjon av kreftceller (trinn 2.7, 2.8), 2) utvinning av invaderte nerver (trinn 3.4), og 3) behandling av høstet nerver (trinn 4.1)….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne bekrefter tekniske tjenestene som tilbys av molekylære cytologi anlegget og dyr anlegget av Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd CA157686 (til RJ Wong) og P30 CA008748 (Memorial Sloan Kettering Cancer Center støtte grant).

Materials

Mouse Number and age variable depending on experimental needs
Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS) Any Steps 1.1, 1.2, 1.3.
Conical centrifuge tube, 50 mL Falcon 352098 Step 1.1
Microcentrifuge tube 1.5 mL Axygen MCT-150-C-S Step 1.2
Electric razor WAHL 9962 Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent
Isoflurane, 250 mL Baxter 1001936060 Step 2.2
Hypoallergenic surgical tape 3M Blenderm 70200419342 Step 2.3
Betadine Swapsticks PDI SKU 41350 Step 2.4
Webcol Alcohol Preps Covidien 5110 Step 2.4
Sterile surgical tools (scissors and forceps) Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5
10 μL Hamilton syringe Hamilton 80308 Steps 2.7, 2.8
Steel Micro spatula Fisher Scientific S50823 Step 2.7
Dissecting microscope Step 2.7
Bupivacine, 1 g Enzo Life Sciences BML-NA139-0001 Step 2.9. Reconstitute to 0.5%
5-0 Nylon suture Ethicon 698H Step 2.9
Tissue-Tek O.C.T. Compound VWR 25608-930 Step 4.1
Tissue-Tek Cryomold Molds VWR 25608-916 Step 4.1

References

  1. Liebig, C., Ayala, G., Wilks, J. A., Berger, D. H., Albo, D. Perineural invasion in cancer. Cancer. 115 (15), 3379-3391 (2009).
  2. Bapat, A. A., Hostetter, G., Von Hoff, D. D., Han, H. Perineural invasion and associated pain in pancreatic cancer. Nat Rev Cancer. 11 (10), 695-707 (2011).
  3. Deborde, S., Wong, R. J. How Schwann cells facilitate cancer progression in nerves. Cell Mol Life Sci. 341 (177-186), 1236361-1236416 (2017).
  4. Abiatari, I., et al. Consensus transcriptome signature of perineural invasion in pancreatic carcinoma. Mol Cancer Ther. 8 (6), 1494-1504 (2009).
  5. Ayala, G. E., et al. In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction: redefining perineural invasion in prostate cancer. Prostate. 49 (3), 213-223 (2001).
  6. Gil, Z., Cavel, O., et al. Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves. J Natl Cancer Inst. 102 (2), 107-118 (2010).
  7. Deborde, S. T., et al. Schwann cells induce cancer cell dispersion and invasion. J Clin Invest. 126 (4), 1538-1554 (2016).
  8. Pour, P. M., Egami, H., Takiyama, Y. Patterns of growth and metastases of induced pancreatic cancer in relation to the prognosis and its clinical implications. Gastroenterology. 100 (2), 529-536 (1991).
  9. Eibl, G., Reber, H. A. A xenograft nude mouse model for perineural invasion and recurrence in pancreatic cancer. Pancreas. 31 (3), 258-262 (2005).
  10. Stopczynski, R. E., et al. Neuroplastic changes occur early in the development of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Res. 74 (6), 1718-1727 (2014).
  11. Gil, Z., et al. Nerve-sparing therapy with oncolytic herpes virus for cancers with neural invasion. Clin Cancer Res. 13 (21), 6479-6485 (2007).
  12. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (6), 655-658 (2014).
  13. Cremer, H., et al. Inactivation of the N-CAM gene in mice results in size reduction of the olfactory bulb and deficits in spatial learning. Nature. 367 (6462), 455-459 (1994).
  14. He, S., et al. The chemokine (CCL2-CCR2) signaling axis mediates perineural invasion. Mol Cancer Res. 13 (2), 380-390 (2015).
  15. He, S., et al. GFRα1 released by nerves enhances cancer cell perineural invasion through GDNF-RET signaling. P Natl Acad Sci USA. , 02944 (2014).

Play Video

Cite This Article
Deborde, S., Yu, Y., Marcadis, A., Chen, C., Fan, N., Bakst, R. L., Wong, R. J. An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion. J. Vis. Exp. (134), e56857, doi:10.3791/56857 (2018).

View Video