Vi beskriver en i vivo murine modell perineural invasjon ved å injisere syngeneic kreft i bukspyttkjertelen celler i sciatic nerve. Modellen gir kvantifisering av omfanget av nerve invasjon, og støtter undersøkelse av mobilnettet og molekylære mekanismer perineural invasjon.
Kreftceller invadere nervene gjennom en prosess kalt perineural invasjonen (PNI), som kreft celler sprer og overføre i nerve microenvironment. Denne typen invasjonen er utstilt ved en rekke typer kreft, og veldig ofte finnes i bukspyttkjertelkreft. Mikroskopiske størrelsen på nerve fiber innen musen bukspyttkjertelen gjengir studiet av PNI vanskelig orthotopic murint modeller. Her beskriver vi en heterotopic i vivo modell av PNI, hvor vi injisere syngeneic bukspyttkjertelkreft celle linje Panc02-H7 i murine sciatic nerve. I denne modellen er sciatic nerver bedøvet mus utsatt og injisert kreftceller. Kreftceller invadere i nervene proximally mot ryggmargen fra poenget med injeksjon. Invaderte sciatic nerver er deretter trekkes ut og behandles med OCT frosne snitting. H & E og immunofluorescence flekker av disse delene at kvantifisering av både graden av invasjonen og endringer i protein uttrykk. Denne modellen kan brukes til en rekke studier på PNI gitt dens allsidighet. Hvis du bruker mus med forskjellige genetiske modifikasjoner og/eller ulike typer av kreftceller kan for undersøkelse av mobilnettet og molekylære mekanismer for PNI og forskjellige kreftformene. Videre kan effekten av terapeutisk agenter på nerve invasjonen studeres ved å bruke behandling mus.
Nervene danner en bestemt svulst microenvironment som stimulerer kreft vekst og migrasjon1,2,3. Perineural invasjonen (PNI) er prosessen gjennom som kreft celler invadere i og rundt nerver. Det kan betraktes som en unik måte av metastasering siden kreft invasjonen strekker seg fra webområdene opprinnelsesland langs nervene. PNI finnes i flere typer kreft inkludert bukspyttkjertelen, prostata, hode og nakke, salivary, livmorhalsen, og kolorektal kreft med en forekomst, fra 22% til 100%1,2. PNI er forbundet med smerte og korrelerer med dårlig prognose og verre overlevelse priser1,2.
Utvikle perineural invasjonen er viktig å belyse cellulære og molekylære mekanismer for denne prosessen, og å teste kandidat terapeutiske agenter for å redusere PNI. In vitro -metoder for å studere interaksjonen mellom kreft og nerver inkluderer co kulturen av kreftceller med nerve explants4, med dorsal root ganglions5,6,7, eller bestemte celler fra nerve celler microenvironment som Schwann7. I vivo tilnærminger, er imidlertid mer fysiologisk relevante, omfatter bruk av kreft musen modeller som har kreft indusert eller transplantert og har fordelen av hele nerve microenvironment. I orthotopic modeller av bukspyttkjertelen eller prostata kreft, PNI har vært rapportert8,9,10 og forekomsten av PNI kan registreres, men på grunn av den lille størrelsen på nervene i disse organene, er det vanskelig å se hele nerve og derfor å kvantifisere omfanget av PNI. Modellen vi beskriver her er en i vivo modell av PNI i som kreft celler blir injisert i sciatic nerve mus gjennom et enkelt kirurgisk inngrep11. Heterotopic transplantasjon invaderer innen nerve mot ryggmargen. Lengden på nerve invasjon fra området av injeksjon i ryggmargen kan måles, og volumet av kreft i nerve. Viktigere, kan invaderte nerve også samles for en rekke analyser inkludert mikroskopiske, og molekylær analyser. En rekke kreftceller kan testes, og vert musene som er genetisk endret eller behandlet med bestemte forbindelser kan brukes også. Denne kraftige analysen gir kreftceller og vert microenvironment endres for etterforskning mekanismer av PNI.
I denne protokollen beskriver vi en i vivo murine modell av perineural invasjonen som gir mulighet for kvantifisering av ischias nerven invasjon av kreft i bukspyttkjertelen celler. Denne modellen muliggjør studiet av molekylære mekanismer nerve invasjon. Vellykket eksperimenter ved hjelp av denne teknikken krever en forsiktig tilnærming til tre viktige trinn i prosessen: 1) injeksjon av kreftceller (trinn 2.7, 2.8), 2) utvinning av invaderte nerver (trinn 3.4), og 3) behandling av høstet nerver (trinn 4.1)….
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne bekrefter tekniske tjenestene som tilbys av molekylære cytologi anlegget og dyr anlegget av Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd CA157686 (til RJ Wong) og P30 CA008748 (Memorial Sloan Kettering Cancer Center støtte grant).
Mouse | Number and age variable depending on experimental needs | ||
Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS) | Any | Steps 1.1, 1.2, 1.3. | |
Conical centrifuge tube, 50 mL | Falcon | 352098 | Step 1.1 |
Microcentrifuge tube 1.5 mL | Axygen | MCT-150-C-S | Step 1.2 |
Electric razor | WAHL | 9962 | Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent |
Isoflurane, 250 mL | Baxter | 1001936060 | Step 2.2 |
Hypoallergenic surgical tape | 3M Blenderm | 70200419342 | Step 2.3 |
Betadine Swapsticks | PDI | SKU 41350 | Step 2.4 |
Webcol Alcohol Preps | Covidien | 5110 | Step 2.4 |
Sterile surgical tools (scissors and forceps) | Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5 | ||
10 μL Hamilton syringe | Hamilton | 80308 | Steps 2.7, 2.8 |
Steel Micro spatula | Fisher Scientific | S50823 | Step 2.7 |
Dissecting microscope | Step 2.7 | ||
Bupivacine, 1 g | Enzo Life Sciences | BML-NA139-0001 | Step 2.9. Reconstitute to 0.5% |
5-0 Nylon suture | Ethicon | 698H | Step 2.9 |
Tissue-Tek O.C.T. Compound | VWR | 25608-930 | Step 4.1 |
Tissue-Tek Cryomold Molds | VWR | 25608-916 | Step 4.1 |