Summary
Denne protokol beskriver fabrikation af optiske kvalitet glasoverflader adsorberet med forbindelser, der indeholder langkædede carbonhydrider, som kan bruges til at overvåge makrofag fusion af levende enheder og muliggør super-resolution mikroskopi af faste enheder .
Abstract
Visualisere dannelsen af multinucleated kæmpe celler (MGCs) fra levende enheder har udfordrende skyldes, at mest levende billedbehandling teknikker kræver formering af lys gennem glas, men på glas makrofag fusion er en sjælden begivenhed. Denne protokol præsenterer fabrikation af flere optiske kvalitet glasoverflader hvor adsorption af forbindelser, der indeholder langkædede carbonhydrider forvandler glas til en fusogenic overflade. Først, forberedelse af rene glasoverflader som udgangspunkt materiale til overflade ændring er beskrevet. For det andet, en metode er fastsat for adsorption af forbindelser, der indeholder langkædede carbonhydrider for at konvertere ikke-fusogenic glas til fusogenic substrat. For det tredje, denne protokol beskriver fabrikation af overflade micropatterns, der fremmer en høj grad af spatiotemporelle kontrol over MGC dannelse. Endelig, opdigte glas bund retter er beskrevet. Eksempler på brug af in vitro- celle systemet som model til at studere makrofag fusion og MGC dannelse er vist.
Introduction
Dannelsen af MGCs følger en række patologiske stater i det menneskelige legeme adskilles på kronisk betændelse1. Trods aftale det mononukleære makrofager smelter sammen og form MGCs2, overraskende få studier har vist fusion i forbindelse med levende enheder3,4. Dette skyldes, at rengøre glasoverflader, der er nødvendige for de fleste Billeddannende teknikker ikke fremmer makrofag fusion når induceret af inflammatoriske cytokiner5. Faktisk, hvis rene glas bruges som substrat for makrofag fusion, så lavt at mellemliggende forstørrelse mål (dvs., 10-20 X) og mere end 15 h af kontinuerlig imaging ofte er forpligtet til at overholde en enkelt fusion begivenhed.
På den anden hånd, fusogenic plastoverflader (fx, permanox) eller bakteriologiske kvalitet plast fremme fusion2. Imaging gennem plast er imidlertid problematisk, fordi underlaget er tyk og scatters lys. Dette komplicerer imaging da længe arbejde afstand (LWD) mål er nødvendige. LWD målsætninger har dog som regel lavt lys indsamling kapacitet i forhold til deres coverslip-korrigeret modstykke. Yderligere, teknikker, der udnytter ændringer i polariteten af lys, der passerer gennem modellen som differential interferens kontrast er umuligt, da plast er birefringent. Barrierer forbundet med brugen af plast er yderligere understreget ved, at det er umuligt at forudsige, hvor makrofag fusion/MGC dannelsen sker på overfladen. Sammen, disse begrænsninger begrænser visualisering af makrofag fusion til fase kontrast optik, udvidet samlede imaging varigheder (> 15 kontinuerlig timer), og lav opløsning.
Vi har for nylig identificeret en meget fusogenic barometer overflade mens enkelt-molekyle super opløsning mikroskopi med faste makrofager/MGCs4. Denne observation blev overraskende fordi rent glas overflader fremme fusion med en meget lav sats på ~ 5% efter 24 h i overværelse af interleukin-4 (IL-4), som bestemmes af fusionen indeks4. Vi fandt, at kapaciteten til at fremme fusion var på grund af oleamide forurening. Adsorptionen af oleamide eller andre forbindelser, der ligeledes indeholdt langkædede carbonhydrider fremstillet glas fusogenic. De fleste fusogenic sammensatte (paraffin voks) var micropatterned, og det bibringes en høj grad af spatiotemporelle kontrol over makrofag fusion og en 2-fold stigning i antallet af fusion begivenheder observeret inden for det samme beløb af tid i forhold til permanox. Disse optiske kvalitet overflader gav den første glimt til morfologiske karaktertræk og kinetik, der styrer dannelsen af MGCs i levende enheder.
I denne protokol beskriver vi fabrikation af en række glasoverflader, der kan bruges til at overvåge dannelsen af MGCs fra levende enheder. Derudover viser vi, at disse overflader er indstillet til langt-ager super-resolution teknikker. Overflade fabrikation er afhængig af målet med forsøget, og hver overflade er beskrevet med tilhørende eksempler i proceduren tekst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedurer, der udnytter dyr blev godkendt af Animal Care og brug udvalg på Mayo Clinic, Janelia forskning Campus, og Arizona State University.
1. forberedelse syre-rengjort Cover glas
Bemærk: Cover glas købt fra mange producenter kan ikke være så rene som forventet. Overveje rutinemæssigt rengøring partier af dækslet glas før enhver procedure, hvor mikroskopi er involveret.
- Køb høje strenghed dækslet glas. Vær særlig forsigtig at vælge den rigtige tykkelse (0,15 eller 0,17 mm).
Bemærk: Valget af dækslet glas tykkelse afhænger af mikroskop mål og er anført direkte på den objektive tønde. - Inkuber i dækslet glas i 12 M saltsyre i et velventileret kemiske stinkskab for 1 h med ultralydbehandling (42 kHz, 70 W). Gentag dette trin for to ekstra gange med frisk 12 M HCl.
- Fyld en separat bægerglas med ultrarent vand og Tilføj cover glas. Der sonikeres cover glas for 5-10 min i et velventileret kemiske hætte. Gentag dette trin 10 gange.
- Inkuber cover glas i ren acetone i et velventileret kemiske hætte i 30 min med sonikering. Gentag dette trin for to ekstra gange.
- Fyld en separat bægerglas med sterilt ultrarent vand og Tilføj cover glas. Der sonikeres cover glas for 5-10 min i et velventileret kemiske hætte. Gentag dette trin 10 gange.
- Inkuber cover glas i 100% ethanol i en kemisk hætte i 30 min med sonikering. Gentag dette trin to yderligere gange.
BEMÆRKNING: Renheden af landbrugsethanol er vigtigt. Forurenende stoffer i form af opløste faste stoffer vil tørre på glasset og kan fremme makrofag fusion. - Til langtidsopbevaring, placere den syre-rengjort cover glas i en container fyldt med ren ethanol. Alternativt, tørre cover glas med nitrogen gas og opbevares i et vakuum ekssikkator.
2. fremstilling af optiske Fusogenic kvalitet overflader
- Opløse DMSO-gratis high-smeltende punkt paraffinvoks i ultrarent toluen.
Bemærk: Stock koncentrationer er lavet på 10 mg/mL, og er fortyndet 1:9 i ultrarent toluen at gøre en 1 mg/mL brugsopløsning.
Forsigtig: Toluen skal håndteres med omhu som en teratogent. Bortskaffe toluen planmæssigt institutionelle kemiske hygiejne. - Anvende paraffin arbejder løsning til en tør syre-rengjort cover glas på en diskenhed, der jævnt dækker glasoverfladen. Dekanteres overskydende løsningen og tørt cover glas med nitrogen gas eller luft. Bulk forberedelse, brug en Coplin krukke designet til at rumme dækslet glas.
- Polsk cover glas 3 streger i x-aksen og næste 3 streger i y-aksen med en fnugfri serviet (Se Tabel af materialer).
- Umiddelbart før forsøget er gennemført, vaske cover glas med sterilt ultrarent vand, og efterfølgende sterilisere for 15-30 min med ultraviolet lys i en biologisk sikkerhed hætte. Alternativt, sterilisere cover glas af ethylen oxid eller gamma bestråling.
3. Micropatterning kulbrinte-holdige forbindelser at begrænse Fusion til forud fastsatte områder
- Tør syre-rengjort cover glas og immobilisere glas på en flad overflade.
- Brug af pincet, omhyggeligt fordybe en guld elektronmikroskopi finder transmissionsnettet i en brugsopløsning af kulbrinte-forbindelser. Vælg en kulbrinte sammensatte, der opfylder det endelige mål for eksperimentet (Se tabel 1). Vægen væk overskydende løsning ved forsigtigt at trykke gitter på filtrerpapir, og straks sted gitteret i midten af dækslet glas. Tillad toluen tørre i 2 min., før du fortsætter til næste trin.
- Kontroller, at nettet er bundet til glasset af forsigtigt invertere glasset. Hvis gitteret løsner Gentag trin 3.2 ved hjælp af et nyt cover glas.
Bemærk: Hvis der ikke findes en plasma renere, Udelad trin 3.4. - Plasma rent cover glas ved behandling med vakuum gasplasma.
Bemærk: Finder nettet fungerer som en maske til at beskytte den underliggende overflade adsorberet med langkædede carbonhydrider fra plasma. De regioner, der er ubeskyttede af gitteret gengives ikke-fusogenic ved udsættelse for plasma. Mængden tid cover glas er expose til plasma bør fastlægges empirisk. - Bruger fine-spids pincet, forsigtigt fjerne gitteret fra glasoverfladen at afsløre micropattern.
4. opdigte glas bund retter
- Bore et 6-10 mm cirkelformet hul i bunden af en 35-mm plast petriskål ved hjælp af et trin borehoved.
Bemærk: Det er afgørende for at bruge en trin boret til at oprette glatte kanter. Hvis kanterne er for groft, vil dække glas ikke obligation flad til bunden af skålen. Ufuldkomment flade overflader vanskeliggøre mikroskopi. - Omhyggeligt mix og degas silikoneelastomer ifølge producentens anvisninger (dvs., Polydimethylsiloxan; PDMS).
- Anvende en tynd belægning af elastomer lige umiddelbare til kanten af (dvs., omskriver) hullet.
Bemærk: Elastomer bør fremstå som en kontinuerlig, omend tynd bandet omkring hullet. - Forsigtigt anvende fusogenic cover glas (beskrevet i afsnit 2), eller de tørre syre-rengjort cover glas (beskrevet i afsnit 1) til fadet for at dække det hul omgivet af elastomer. Sikre at dække glas synes flugter med bunden af fadet og strækker sig ud over diameter af hullet, således at en betydelig del af glasset er i kontakt med plastik. Helbrede elastomer ved bagning ved 50 ° C i 2-3 h.
- Hvis fusogenic glas er at foretrække, UV sterilisere parabol og kultur cellerne ifølge standardprotokoller. Men, hvis en micropattern er at foretrække, Fortsæt til trin 3.2 for micropattern forberedelse (gasplasma anvendt under micropatterning steriliserer fadet og stærkt par PDMS til glas).
5. indsamling Thioglycollate-fremkaldte makrofager
- Injicere 8-uge-forhenværende C57BL/6 mus med 0,5 mL af en steril opløsning af 4% Brewer's thioglycollate som tidligere beskrevet3,4,6.
- Halvfjerds-to timer senere, aflive dyr efter godkendte dyrs pleje og bruge retningslinjer, og indsamle makrofager ved peritoneal lavage med iskold fosfatbufferet saltopløsning suppleret med 5 mM ethylendiamintetraacetat.
- Centrifugeres makrofager ved 300 x g i 3 min og resuspend i 1 mL af DMEM:F12 suppleret med 15 mM HEPES, 10% FBS, og 1% antibiotika (næringssubstratet).
Bemærk: Cellerne tælles efterfølgende med en Neubauer hemocytometer. Makrofager er fortyndet til den passende koncentration og påføres overfladerne. Antallet af celler til anvendelse på en given overflade bør overvejes nøje af investigator med henblik på den eksperimentelle spørgsmål. Høre kendte standarder i den primære litteratur. - Efter 30 min vask overfladen med HBSS suppleret med 0,1% BSA at fjerne ikke-tilhænger celler og erstatte med frisk næringssubstratet. Returnere kulturerne til inkubator (5% CO2 i luften ved 37 ° C).
- 2 timer senere, Aspirér medium og erstatte med næringssubstratet suppleret med 10 ng/mL af IL-4. Image celler som beskrevet andetsteds4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fysisk-kemiske parametre af materialer har dramatiske konsekvenser for omfanget af makrofag fusion7,8,9,10. Derudover er overflade forurenende stoffer kendt for at fremme makrofag fusion11. Derfor er det vigtigt at starte med ren cover glas som en negativ kontrol for makrofag fusion. Når renset som beskrevet i protokol 1, cover glas skal er usædvanlig flad med ingen indlysende overflade funktioner, mens adsorption af langkædede carbonhydrider efterfulgt af overflade polering skaber en grad af nanotopography (figur 1).
På ren cover glasoverflader fuse makrofager til en meget lav (figur 2). Derimod efter 24 h i overværelse af IL-4 gennemgå makrofager anvendes på overflader adsorberet med forbindelser, der indeholder langkædede carbonhydrider robust fusion (figur 2). Yderligere, adsorption af opløsningsmiddel alene (fx, toluen, isopropanol) gør ikke glas en fusogenic overflade (figur 2).
Selvom det er usandsynligt, at en 10-nm lag af adsorberet kulbrinter dramatisk påvirker opløsning, var det ikke desto mindre vigtigt at vurdere kvantitativt spændingsforskel i resolution blandt de forskellige overflader. Opløsning er typisk defineret af Rayleigh kriterium. En alternativ metrikværdi, som ofte bruges til at tilnærme opløsning er fuld bredde på halv maksimum (FWHM) af strukturer, der er mindre end diffraktion grænsen for lys. Vigtigere, er der ingen synlig forskel i FWHM af 100 nm fluorescerende perler blandt de forskellige overflader (figur 3A), tyder på, at egenskaber af glas kræves for fluorescerende imaging tilstrækkeligt blev bevaret. Desuden, vi var i stand til at generere en flygtige felt og udføre 3D direkte stokastiske optisk genopbygning mikroskopi af makrofager anvendes på overflader som indeholder langkædede carbonhydrider (figur 3B). En række live imaging teknikker er muligt når makrofager anvendes til overflader (figur 4, supplerende Video 1, supplerende Video 2).
Fordelen ved hver overflade er beskrevet i tabel 1. Bemærk, at størstedelen af avanceret billedbehandling teknikker, der kræver høj NA olie fordybelse mål er uforenelig med de fleste fusogenic plastoverflader, da de er tykke, og har en grad af autofluorescence. Det skal bemærkes, at overflader adsorberet med langkædede carbonhydrider aktiverer et stort antal af Billeddannende teknikker herunder12 PALM/dSTORM/GSDIM13,14,15,16, 17, DIC, og andre18,19,20,21 (tabel 1). Desuden ikke kun er et stort antal af Billeddannende teknikker muligt (tabel 1), men anvendelsen af en micropattern giver en høj grad af spatiotemporelle kontrol over MGC dannelse (figur 4B; Supplerende Video 1).
Figur 1 : Paraffin adsorberet overflader har en grad af nanoskala overflade topografi. AFM scanninger (5 x 5 µm) af glasoverflader viser ingen åbenlyse topografiske egenskaber paraffin-adsorberet overflader indeholder arrays af materiale udsmykning overfladen. Intensitet skala på højre side af hver Mikrograf viser højden langs z-aksen. Skala barer er 500 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Adsorberet med langkædede carbonhydrider overflader fremme makrofag fusion på dækslet glas. (A) i mangel af IL-4, der synes at være meget få multinucleated celler på rene glasoverflader som fastsat af Wrights pletten. (B) efter 24 h i overværelse af IL-4, overflader adsorberet med opløsningsmiddel anvendes til solubilize langkædede carbonhydrider (fx, toluen eller isopropanol) har få multinucleated celler. (C-E) Derimod fremme overflader adsorberet med langkædede carbonhydrider fusion og MGC dannelse. Paraffin adsorption resultater i den højeste grad af IL-4 induceret fusion. MGCs er skitseret i sort. (F) graden af MGC dannelse på permanox plast er vist for sammenligning. I hvert billede, lyseblå viser kerner, og cytoplasmaet vises lilla. Skala barer er 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Adsorberet med langkædede carbonhydrider overflader påvirker ikke dramatisk opløsning. (A) sammenligning af 100 nm fluorescerende perler belyst med Total interne Reflection fluorescens (JOHANNAS) mikroskopi. Indsatser i det øverste venstre panel er en forstørret visning en enkelt fluorescerende perle. Den røde linje blev overlejret for at vise et eksempel line profil bruges til at beregne FWHM. Ingen synlig forskel i FWHM af 100 nm perler blev observeret. Skala barer er 5 µm. (B) sammenligning af fordelingen af Mac-1 integrin som vurderet af JOHANNAS og 3D direkte stokastiske optisk genopbygning mikroskopi. Makrofager blev anvendt til en oleamide-holdige overflade og inkuberes med IL-4 i 24 timer. Den hvide indsatser i B fremhæver regionen afbildet i efterfølgende micrographs. Skala barer er 5 µm for JOHANNAS billeder og 2 µm til 3D STORM. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Adsorberet med langkædede carbonhydrider overflader aktiverer tidsopløst udsigt over makrofag fusion og sprede. (A) i diagram viser proceduren bruges til at generere en micropattern. (B) Micropatterned overflader give spatiotemporelle kontrol af makrofag fusion. Flere timer efter anvendelsen af IL-4, blev makrofager afbildet med fasekontrast. Bemærk migration af celler fra indre af gitter på micropattern. Fusion blev observeret kun på micropattern. De hvide streger skitsere en udvidelse af en MGC. Tid er vist i det øverste venstre hjørne af hver Mikrograf som klokkeslæt. Skala barer er 50 µm. (C) gitter lys ark mikroskopi20 afslører høj spatiotemporelle dynamikken i en makrofag spredes på en paraffin-adsorberet overflade. Farve koder intensitet distribution (gul er mest intens) af eGFP-LifeAct. Tid er vist i det øverste højre hjørne af hver Mikrograf som mm:ss. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Overflade: | ||||||
| Teknik | Paraffin | Oleamide | Petrolatum | MP paraffin | Permanox | Rene glas |
| fasekontrast | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| brightfield | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| DIC | √ | √ | N/T | √ | x | √ |
| epifluorescensmikroskop | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| Konfokal | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| JOHANNAS | √ | √ | N/T | x | x | √ |
| PALM/dSTORM/GSDIM | √ | √ | N/T | x | x | √ |
| SIM | N/T | N/T | N/T | N/T | N/T | N/T |
| STED | N/T | √ | N/T | N/T | N/T | √ |
| LLSM | √ | N/T | N/T | √ | N/T | √ |
| Fusion indeks | mellemliggende | mellemliggende | mellemliggende | høj | mellemliggende | lav |
| Fusion placering | tilfældige | tilfældige | tilfældige | defineret | tilfældige | tilfældige |
| MP-micropattern | ||||||
| DIC - differential interferens kontrast | ||||||
| JOHANNAS - total interne reflection fluorescens | ||||||
| PALM - photoactivated lokalisering mikroskopi | ||||||
| dSTORM - direkte stokastiske optisk genopbygning mikroskopi | ||||||
| GSDIM - grundtilstand udtynding efterfulgt af enkelte molekyle tilbage | ||||||
| SIM - struktureret belysning | ||||||
| STED - stimuleret emission udtynding | ||||||
| LLSM - gitter lys ark mikroskopi | ||||||
| √ - kompatibel | ||||||
| x - uforenelige | ||||||
| √ * - muligt kun med LWD, lav forstørrelse eller nedsænkning mål | ||||||
| N/T - ikke testet | ||||||
Tabel 1: potentielle anvendelser af hver overflade. Bemærk at de plastoverflader udelukker anvendelse af de fleste Billeddannende teknikker.
Supplerende Video 1: tidsopløst fase kontrast opfattelse af MGC dannelsen. Bemærk den tilsyneladende synkronicitet af MGC dannelse. Tid er vist i klokkeslæt i øverste venstre hjørne. Skalalinjen er 50 µm. venligst klik her for at downloade denne video.
Supplerende Video 2: gitter lys ark mikroskopi 20 af en thioglycollate-fremkaldte eGFP-LifeAct makrofag spredes på en paraffin adsorberet overflade. Venligst klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Behovet for at identificere og efterfølgende udvikle optisk kvalitet glasoverflader, der fremmer makrofag fusion skyldtes, at indtil for nylig ikke offentliggjort undersøgelse direkte visualiseret makrofag fusion inden for rammerne af levende enheder3, 4. Dette er skyldes, at fusogenic plast overflader, der er almindeligt anvendt kræver LWD mål og er stort set begrænset til fase kontrast optik. Disse hindringer er blevet overvundet gennem engineering en optisk kvalitet glasoverflade, der ikke kun fremmes ekstraordinære satser af makrofag fusion, men bibringes en overraskende grad af fysisk kontrol over dannelsen af MGCs.
Selv om denne teknologi muliggør brug af avanceret billedbehandling teknikker til at overvåge makrofag fusion, kommer det ikke uden begrænsning. Selv om de polerede overflader adsorberet med langkædede carbonhydrider (fx, oleamide, paraffinvoks, etc.) producere ekstraordinære satser af makrofag fusion i forhold til fusogenic plastoverflader, forbliver fusion et rumligt stokastiske proces (figur 2). Denne begrænsning er til hinder for anvendelsen af høj forstørrelse mål at visualisere fusion med levende enheder, da det er umuligt at forudsige, hvor fusion vil forekomme. At overvinde denne begrænsning, vi micropatterned paraffin begrænse fusion proces til forud fastsatte områder (figur 4; Supplerende Video 1). Rumligt begrænser makrofag fusion til micropattern gjort det muligt at forudsige hvor fusion ville forekomme og derfor udnytte højere forstørrelse mål for at studere denne meget animere begivenhed.
Hvad er betydningen af at anvende en optisk kvalitet overflade, der formidler fysisk kontrol af makrofag fusion? Først, da disse overflader fremme høje priser af fusion, er det muligt at overvåge fusion fra levende enheder inden for en rimelig tidsramme. Dette er afgørende for fluorescens mikroskopi, da øget eksponering af celler til lys fører til photobleaching og fototoksicitet. For det andet aktiverer disse overflader avancerede billedbehandling teknikker baseret på fluorescens eller polarisering skal ansættes (figur 4; Tabel 1; Supplerende Video 1; Supplerende Video 2). Endelig, den spatiotemporelle kontrol af micropatterned overflader er beskrevet i denne protokol bør fremskynde undersøgelser designet til at identificere de cellulære og subcellulært mekanismer, der styrer makrofag fusion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke medlemmerne af Ugarova laboratorium og efterforskere i centrum for Metabolic og vaskulære biologi for nyttig diskussion af dette arbejde. James Faust ønsker at udtrykke sin taknemmelighed over for instruktører på det europæiske molekylærbiologiske laboratorium Super opløsning mikroskopi kursus i 2015. Vi vil gerne takke Satya Khuon på Janelia for at få hjælp med prøveforberedelse til LLSM. Under gennemgang og filme dele af dette arbejde var James Faust understøttes af en T32 Fellowship (5T32DK007569-28). Komponenten gitter lys ark af dette arbejde blev støttet af HHMI og Betty og Gordon Moore Foundation. T.U. er finansieret af NIH give HL63199.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Finder grid | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | any gold TEM grid will work |
| Cover glass (22x22 mm) | Thor Labs | CG15CH | use only high stringency cover glass |
| Paraffin wax | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | must be α-tocopherol-free if substituted |
| Oleamide | Sigma Aldrich | O2136 | prepare fresh |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Acetone | VWR International | BDH1101 | |
| Ethanol | Electron microscopy sciences | 15050 | use low dissolved solids ethanol |
| Hydrochloric acid | Fischer Scientific | A144C-212 | use to acid wash cover glass |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h |
| 35 mm petri dish | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont no. 5 forceps | Electron microscopy sciences | 72705 | ideal for removing TEM grid in section 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-092 | contains 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA solution | Sigma Aldrich | A9576 | use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents |
| eGFP-LifeAct mice | n/a | n/a | use for live fluorescence imaging |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces |
References
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Interleukin-4 induces foreign body giant cells from human monocytes/macrophages. Differential lymphokine regulation of macrophage fusion leads to morphological variants of multinucleated giant cells. Am J Pathol. 147 (5), 1487 (1995).
- Helming, L., Gordon, S.
- Podolnikova, N. P., Kushchayeva, Y. S., Wu, Y., Faust, J., Ugarova, T. P. The Role of Integrins α M β 2 (Mac-1, CD11b/CD18) and α D β 2 (CD11d/CD18) in Macrophage Fusion. Am J Pathol. 186 (8), 2105-2116 (2016).
- Faust, J. J., Christenson, W., Doudrick, K., Ros, R., Ugarova, T. P. Development of fusogenic glass surfaces that impart spatiotemporal control over macrophage fusion: Direct visualization of multinucleated giant cell formation. Biomaterials. 128, 160-171 (2017).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Alkylsilane-modified surfaces: Inhibition of human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation. J Biomed Mater Res. 46 (1), 11-21 (1999).
- Vignery, A. Methods to fuse macrophages in vitro. Cell Fusion: Overviews Methods. , 383-395 (2008).
- Zhao, Q., et al. Foreign-body giant cells and polyurethane biostability: In vivo correlation of cell adhesion and surface cracking. J Biomed Mater Res. 25 (2), 177-183 (1991).
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Effects of surface-coupled polyethylene oxide on human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation in vitro. J Biomed Mater Res. 44 (2), 206-216 (1999).
- DeFife, K. M., Colton, E., Nakayama, Y., Matsuda, T., Anderson, J. M. Spatial regulation and surface chemistry control of monocyte/macrophage adhesion and foreign body giant cell formation by photochemically micropatterned surfaces. J Biomed Mater Res. 45 (2), 148-154 (1999).
- Jenney, C. R., DeFife, K. M., Colton, E., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage adhesion, macrophage motility, and IL-4-induced foreign body giant cell formation on silane-modified surfaces in vitro. J Biomed Mater Res. 41 (2), 171-184 (1998).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Fölling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Ange Chem Int Edit. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Betzig, E. Proposed method for molecular optical imaging. Optics Letters. 20 (3), 237-239 (1995).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
- Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2013).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Planchon, T. A., et al. Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination. Nat Methods. 8 (5), 417-423 (2011).
