Summary
Homeobox Gene sind regulatorische Gene, die oft im Zusammenhang mit Tumoren in den Erwachsenen Organismen. Wir untersuchen ihre vergleichende Ausdruck durch immunhistochemische und Echtzeit-PCR-Analyse, in normalen und entzündlichen nasale Schleimhäute und sinunasalen Neoplasmen um sie als mögliche diagnostische und therapeutische Ziele zu verwenden.
Abstract
OTX (HB) Homeobox Gene werden während der embryonalen Morphogenese und bei der Entwicklung des olfaktorischen Epithel im erwachsenen Organismus exprimiert. Mutationen in diesen Genen auftreten beziehen sich oft auf Tumorgenese beim Menschen. Über die mögliche Korrelation zwischen OTX Gene und Tumoren der Nasenhöhle sind keine Daten verfügbar heute. Das Ziel dieser Arbeit ist es zu verstehen, wenn OTX1 und OTX2 als molekulare Marker in der Entwicklung der nasalen Tumoren angesehen werden kann. Wir haben Nasal und sinunasalen Adenokarzinome, die Expression von OTX1 und OTX2 Genen durch immunhistochemische und Echtzeit-PCR-Analysen zu untersuchen. OTX1 und OTX2 fehlten in den Proben der sinunasalen Darm-Typ Adenokarzinome (ITACs). OTX1 -mRNA wurde nur in Non-intestinalen Typ Adenokarzinome (NITACs) identifiziert, während OTX2 mRNA nur in olfaktorische Neuroblastome (ONs) zum Ausdruck kam. Wir haben bewiesen, dass die differenzielle Genexpression für OTX1 und OTX2 Gene möglicherweise nützliche molekulare Marker, die verschiedenen Arten von sinunasalen Tumoren zu unterscheiden.
Introduction
OTX HB-Gene sind die Landwirbeltiere homolog der Drosophila Orthodenticle Gene (Otd) und sie codieren für Transkriptionsfaktoren, die normalerweise während der embryonalen Morphogenese ausgedrückt werden, aber sie können auch im erwachsenen Organismus mit unterschiedlichen Funktionen ausgedrückt werden . Während der Embryonalentwicklung steuern sie die Spezifikation der Zelle Identität, Zelldifferenzierung und die Positionierung des Körpers axis¹. Die OTX -Familie umfasst OTX1 und OTX2 Gene, die verschiedene Funktionen angezeigt. OTX1 ist im Gehirn und Sinnesorgan Entwicklung beteiligt. Im erwachsenen Organismus es drückt sich in Sinnesorganen und ist auf einem niedrigen Niveau in der vorderen Lappen von der Hypophyse (Hirnanhangdrüse)2transkribiert; Es spielt auch eine Rolle in der Hämatopoese, ausgedrückt in hämatopoetischen pluripotenten und Progenitor-Zellen-3. OTX2 engagiert sich in der Entwicklung von der Höhlung Kopf und seine übersetzten Protein fungiert als ein Morphogen denn sie einen Farbverlauf durch welche andere Gene erzeugt aktiviert oder in einer räumlich-zeitliche Weise, damit einen Beitrag zur Zelle unterdrückt Proliferation und Differenzierung. Im adulten Organismus ist OTX2 ausschließlich im choroid Plexus und Zirbeldrüse4gefunden.
Mutationen in den Genen OTX beziehen sich oft auf die Darstellung des menschlichen angeborenen, somatische oder metabolische Mängel. Gewinn oder Verlust Mutationen in Genen OTX könnte Tumorgenese fördern, wenn sie nicht in der Lage, richtig zu steuern, zelluläre Wachstum und/oder Differenzierung5sind. In Leukämien und Lymphomen sowie in vielen soliden Tumoren (z. B. Medulloblastome6, aggressiven non-Hodgkin-Lymphome2, Brust Karzinome7, Kolorektale Karzinome8und Retinoblastom9) die deregulierten Ausdruck der OTX HB Gene ist gut dokumentierte10. Darüber hinaus wurden OTX2 Mutationen in Fällen von Anophthalmien und Microphtalmia11 aufgrund der entscheidenden Rolle für dieses Gen bei der Kontrolle der Augenentwicklung nachgewiesen.
Im Rahmen von soliden Tumoren ist die Entdeckung der molekulare und phänotypische Markierungen eine wichtige Herausforderung für die Diagnose, Klassifikation und Behandlung von mehreren Arten von Tumor11, einschließlich derer, die ihren in der Nasenhöhle und der Nasennebenhöhlen Ursprung Nebenhöhlen. In der Tat, trotz, dass diese Gebiete zu besetzen, nur einen bescheidenen anatomischen Raum, Schleimhaut-Epithel, Drüsen, Weichteile, Knochen, Knorpel oder neuronale/Neuroectodermal und Hematolymphoid Zellen sind oft die Website für den Ursprung des komplexen und histologisch unterschiedlichen Gruppen von Tumoren. Verschiedene Arten von Tumoren mit sinunasalen Trakt präsentieren eine Vielzahl von Funktionen, die zu überwinden, was in der Regel in den oberen Aerodigestive Trakt oder sogar in den meisten Teilen des Körpers12gesehen wird. Sinunasalen Malignomen sind selten und eine jährlichen Inzidenz von 1: 100.000 Einwohner weltweit zu präsentieren, und so verhindert diese Studien über die Wege der Tumorgenese und die Prüfung von alternativen Behandlungsstrategien beteiligt. Trotz dieser, die Fortschritte in der bildgebenden Verfahren, haben chirurgische Ansätze und Strahlentherapie die klinische Behandlung von sinunasalen Krebs verbessert. Darüber hinaus die Entwicklung von Zell-Linien und Tiermodellen sowie Krebs genetische Profilierung derzeit bilden die Grundlage für die zukünftige gezielte Anti-Krebs-Therapien-13. Bisher gibt es keine Berichte über OTX1 und/oder OTX2 Ausdruck in Tumoren der Nasenhöhle, Nasennebenhöhlen und Nasenrachenraum. Da wir bisher beobachtet haben, dass Brust-Krebs-7 OTX1 und OTX2 beteiligt sind, fragten wir uns, wenn diese Gene nicht nur in der normalen Nasenschleimhaut sondern auch in Tumoren der Nasenhöhle vorhanden sein könnte. Um dieses Ziel zu erreichen, die wir von der Abteilung für Pathologie des "Ospedale di Circolo" in Varese Proben der normalen Schleimhaut und Nasen- und sinunasalen Adenokarzinome von 1985 bis 2012 gesammelt und klassifiziert nach der Weltgesundheitsorganisation (WHO) erhalten Klassifizierung von Kopf und Hals-Tumoren. Wir wählen sie durch Real-Time PCR und immunhistochemische Analysen zu analysieren und bewerten wir OTX1 und OTX2 Ausdruck, um festzustellen, ob sie molekulare Marker für diese Arten von Tumoren angesehen werden können.
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Protocol
Die Untersuchungen wurden durchgeführt gemäß der Deklaration von Helsinki (1975) schriftliche Einwilligung nach Aufklärung und genehmigt von der Ethikkommission der Universität Insubria in Varese.
1. Erfassung der Proben
- Sammeln Sie und teilen Sie alle menschlichen Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) Proben in verschiedenen Untergruppen entsprechend der WHO-Klassifikation von Kopf und Hals-Tumoren14.
Hinweis: Hier haben wir die folgenden Beispielen verwendet: normale sinunasalen Schleimhaut als Kontrolle (10 Proben); Invertiertes Papillom (IP, ICD-O Codes 8121/1); Sinonasal ITAC (ICD-O Code 8144/3, 32 Proben); NITAC (ICD-O Code 8140/3, 12 Proben); Adenoide zystische Karzinom (ACC, ICD-O Codes 8200/3); Pleomorphes Adenom (PA, ICD-O Codes 8941/3); (ICD-O-Code 9522/3, 13 Proben); Schlecht differenzierte neuroendokrine Karzinom (PDNEC, ICD-O Codes 8041/3, 19 Proben); Neuroendokrine Tumoren (NET, ICD-O-Code 8041/3).
(2) Immundiagnostik
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4.wenn und Rehydrierung der Abschnitte
- Erhitzen Sie die Probe-Folien in einem Ofen bei 60 ° C für 30 min und rehydrieren Sie 3 µm Dicke FFPE Abschnitte mit einem Alkohol-Serie zu Wasser.
- Kurz waschen Sie die Objektträger in Xylol für 10 min und wiederholen Sie diesen Schritt; Waschen Sie die Folien für 5 min in 100 % Alkohol und wiederholen Sie diesen Schritt mit 95 %, 85 % und 75 % Alkohol seriell. Spülen Sie die Folien für 5 min in destilliertem Wasser.
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Blockierung der endogenen Aktivität
- Blockieren Sie die endogene Aktivität, indem man die Dias in wässrigen Wasserstoffperoxid 3 % für 12 min.
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Antigen-retrieval
- Durchführen Sie Antigen-Retrieval durch die Behandlung mit 10 mM Citrat-Puffer (pH 6) für 10 min in eine Mikrowellen-Behandlung.
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Inkubation mit primären Antikörper
- Waschen Sie die Abschnitte in TBS-Puffer (pH 7,4), dann fügen Sie blockierende Lösung für 10 Minuten.
- Waschen Sie die Abschnitte in TBS-Puffer (pH 7,4), dann fügen Sie 0,2 % Triton X.
- Inkubation über Nacht bei 4 ° C mit Ziege Anti-Human OTX2 Antikörper verdünnt 1: 100.
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Inkubation mit Sekundärantikörper
- Die Abschnitte für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren, mit biotinylierte Kaninchen Anti-Ziege Sekundärantikörper verdünnt 1: 200 gefolgt von ABC-Peroxidase-Komplex (siehe Tabellen der Materialien).
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Entwicklung der Immunantwort
- Die Immunantwort mit 3, 3'-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride zu entwickeln und die Kerne mit Harris Hematoxylin counterstain.
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Montage und Bildgebung
- Die Abschnitte mit einer Sichel Alkohol-Skala zu entwässern und klären sie über eine Lichtung Substanz Terpene (siehe Tabelle der Materialien). Betten Sie Abschnitte in Eindeckmedium ein, legen Sie in den Abschnitten auf einen Objektträger und beobachten Sie die Abschnitten durch ein optisches Mikroskop zu.
(3) RNA-Extraktion und Reverse Transkription
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RNA-Extraktion
- Extrahieren Sie RNA aus den Abschnitten zu, indem Sie den ersten Schritt der Immunopräzipitation Protokoll (siehe Abschnitt 2.1) durchführen und halten Sie die Folien in destilliertem Wasser. Überschneiden sich die ungefärbte Abschnitte mit den entsprechenden Hämatoxylin-Eosin gefärbt Abschnitte um Fragmente von Interesse zu identifizieren.
- Durchzuführen Sie die RNA-Extraktion mit einem kommerziellen RNA Extraktion Kit für FFPE-Proben (siehe Tabelle der Materialien) und folgende Angaben des Herstellers.
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RNA-Reverse Transkription
- Verwenden Sie eine kommerzielle Kit Retro-transkribieren RNA in cDNA (siehe Tabelle der Materialien) nach dem Protokoll. Retro-Transkribieren von mindestens 1.000 ng von Gesamt-RNS, mehrere Analysen durchzuführen.
(4) Real-Time PCR und Datenanalyse
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Real-Time PCR
- Quantitative Echtzeit-PCR-Analysen (qRT-PCR) mit Sonde basierende Technologie durchführen (siehe Tabelle der Materialien) und einem Thermocycler.
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Vorbereitung der PCR-Reaktion-Mix
- Vorbereiten des PCR-Reaktion-Mixes mit 12,5 µL Testbasierte master-Mix, 1,25 µL des OTX1, OTX2 und ACTB Sonden (siehe Tabelle der Materialien), 50 ng cDNA, und Nuklease-freies Wasser bis zu 25 µL Gesamtvolumen.
- Führen Sie alle Reaktionen in dreifacher Ausfertigung mit der ACTB-gen als die endogene Steuerung gen Ausdruck Niveaus zu normalisieren.
- Die Platte 1.109 x g für 3 min Zentrifugieren und lichtgeschützt bei 4 ° C bis das Experiment Platte zu speichern.
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Einstellung der Thermocycler
- Satz der Thermocycler-Profil mit einer anfänglichen hot-Start-Zyklus bei 50 ° C für 2 min und 95 ° C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen bei 95 ° C für 15 s und einer letzten Zyklus bei 60 ° C für 1 min.
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Genexpressionsanalysen Ebene
- Die gen-Ausdruck-Ebenen durch die vergleichende Zyklus Schwelle (ΔCt) Methode mit der ACTB-gen als die endogene Steuerung zu normalisieren.
- Gen-Ausdruck-Ebenen mit der 2-ΔCt -Methode zu bewerten und die Ergebnisse Plotten.
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Statistische Analysen
- Statistische Analysen mit der Student t-Test, wenn man statistisch signifikante Ergebnisse mit p < 0,05.
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Representative Results
In der normalen Schleimhaut beobachteten wir starke und homogene nuklearen Reaktivität für OTX Gene sowohl in pseudostratified Flimmerepithel der Atemwege-Typ submucosal Drüsenzellen (Abbildung 1A). Wir fanden, dass nukleare Ausdruck für OTX1 in allen NITACs Proben (Abbildung 1 b), während wenig oder fehlende Immunoreactivity in ITACs (Abbildung 1) hervorgehoben wurde. Intensive Immunoreactivity war in allen ONs (Abbildung 1); unter PDNECs OTX Ausdruck in Intensität und Prozentsatz der positiven Zellen (Abbildung 1E) variiert. Immunhistochemische statistische Analyse mit Chi-Quadrat und/oder Fishers exakter Test durchgeführt hat gezeigt, dass die Abwesenheit von OTX Gene in ITAC Proben statistisch signifikant war (n = 23, p < 0,01).
Echtzeit-PCR-Analysen bestätigt die Expression von OTX1 und OTX2 Genen in Kontrollproben (Abbildung 2A–B); OTX1 aber nicht OTX2 drückte sich in NITAC Proben und beide Gene waren völlig herunterreguliert in ITACs (Abbildung 2A–B). In Proben fanden wir nur die Expression des OTX2-Gens, während OTX1 herunterreguliert, und der Ausdruck der beiden Gene zwischen den PDNEC Proben (Abbildung 2A–B variiert).
Schülers t Test mit Real-Time PCR bestätigt statistisch signifikante Daten für OTX1 in Steuerelementen vs. ITACs (n = 9, p < 0,05), Kontrollen vs. ONs (n = 6, p < 0,05), Kontrollen vs. PDNECs (n = 8, p < 0,05), und für OTX2 unter Kontrolle vs. NITACs (n = 5, p < 0,05), Kontrollen vs. ITACs (n = 9, p < 0,05), Kontrollen vs. ONs (n = 6, p < 0,05), und Kontrollen vs. PDNECs (n = 8, p < 0,05).
Abbildung 1 : Repräsentative Bilder von OTX immunhistochemische Expression in Kontrolle und neoplastische Gewebe. Die Reaktion von Peroxidase konjugierten Sekundärantikörper entwickelt ergab, dass das Signal (dunkelbraun) in 5 Kontrolle FFPE Abschnitten des normalen sinunasalen Schleimhaut (A), 7 Fälle von Non intestinalen Typ Adenokarzinome (NITACs) (B), 7 sichtbar war Fällen olfaktorische Neuroblastome (ONs) (D), 11 Fälle schlecht differenzierte neuroendokrine Karzinome (PDNECs) (E), während kein Immunoreactivity erkannt wird in 23 Fällen der Darm-Typ Adenokarzinome (ITACs) analysiert (C). DAB-Hämatoxylin; ursprüngliche Vergrößerung: 200 x, Maßstabsleiste = 100 µm.
Abbildung 2 : Real-Time PCR-Analyse der OTX1 (A) und OTX2 (B) mRNA Expression in normalen und neoplastischen Nasengewebe. Für Real-Time PCR-Analysen, die folgenden Beispiele wurden verwendet: 5 FFPE-Abschnitte der Kontrolle normalen Schleimhaut, 6 Fälle von olfaktorischen Neuroblastome (ONs), 8, 9 Fälle von Darm-Typ Adenokarzinome (ITACs), 5 Fälle von Non intestinalen Typ Adenokarzinome (NITACs) Fälle von schlecht differenzierte neuroendokrine Karzinome (PDNEC). Auf der x-Achse wird die Art der Probe berichtet, während die y-Achse steht für die 2- ΔCt -Werte. Statistisch signifikante Daten (p < 0,05) zwischen Kontrolle und Tumoren stammen von Student t-test und sind mit Sternchen markiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Diese Studie zeigt zum ersten Mal, die, basierend auf mRNA-Niveaus, die HB-Gene OTX1 und OTX2 werden ausgedrückt in normalen sinunasalen Schleimhaut und submucosal Drüsen, entzündliche Polypen, sinunasalen Schneiderian Papillome und in den verschiedenen epithelialen und Neuroectodermal Tumoren, einschließlich plattenepithelialen Karzinome, nicht intestinalen Typ sinunasalen Adenokarzinome, Speicheldrüse-Typ Tumoren, neuroendokrinen Tumoren und ONs.
Modifikationen und Fehlerbehebung:
Zur Vermeidung von RNA-Abbau führten wir das Deparaffinisierung-Protokoll in das Labor für Pathologie. Nachdem wir die Dias zerkratzt, wurden die Proben schnell abgekühlt und in Trockeneis bis zur weiteren Verwendung gespeichert. Wir spielten alle nachfolgenden Analysen in eine laminar-Flow-Schutzhaube mit einer engagierten Gruppe von Pipetten mit sterilen Tipps, aseptische experimentelle Bedingungen beizubehalten und RNA Kontaminationen zu vermeiden.
Grenzen der Technik:
Der begrenzende Faktor der Technik stützt sich auf die Verfügbarkeit von Proben, da Tumoren der sinunasalen Hohlraum oft selten sind. Die Höhe der extrahierten RNA ist ein weiteres wichtiges Thema, da RNA-Extraktion aus FFPE-Proben in fragmentierten RNA, die schwer führt zu analysieren ist.
Bedeutung im Hinblick auf bestehende Methoden:
Die Diagnose von Tumoren der Nasenhöhle besteht in der Regel Röntgenaufnahmen Analysen, endoskopische Untersuchung der Nasenhöhle, Computertomographie, Magnetresonanztomographie (RMN) und Biopsie. In den letzten Jahren führte die Fortschritte von chirurgischen Instrumenten und die Fortschritte der bildgebenden Verfahren endoskopischen Chirurgie als die bevorzugte Strategie für sinunasalen Tumoren. Diese Technik wurde vor allem, wie möglich für verschiedene gutartige oder bösartige sinunasalen Tumoren15berichtet. Unsere Technik basierend auf qRT-PCR erlaubt die Identifizierung von molekularen Biomarker, die differentiell Proben von verschiedenen Tumoren unterscheiden kann: in der Tat, wir nachweisen, dass das Fehlen der beiden HB Gene in ITACs als molekulare Marker dafür verwendet werden kann Typ des Tumors sowie das Fehlen von OTX2 in NITACs. Darüber hinaus ist diese Technik kann sofort nach der Biopsie angewendet werden und kann endgültige Ergebnisse in weniger als 6 Stunden in Bezug auf die Tage oder Wochen notwendig für den Bericht aus dem Krankenhaus geben.
Zukünftige Anwendungen:
Unsere zukünftigen Studien beinhalten gen und Proteingehalte Ausdruck der Gene OTX1 und OTX2 HB mit Real-Time PCR-Analysen, Western-Blot und Immunfluoreszenz mit spezifischen Antikörpern, um nicht nur OTX1 und OTX2 zu erkennen, sondern auch p53 Familie Ausdruck Ebenen zu analysieren. Da wir zuvor gezeigt, dass OTX1 Expression von p53 in der Brust Krebs7reguliert ist, wäre es interessant zu verstehen, wenn eine solche Regelung auch in Tumoren der Nasenhöhle vorhanden ist. Immunfluoreszenz-Assay und ein Chromatin Immunopräzipitation (ChiP)-Assay können, bzw. eine Protein-Protein und eine DNA-Protein-Interaktion zwischen p53 und OTXs offenbaren. Wenn eine solche Verbindung gefunden wird, wird die gezielte Stummschaltung p53 (Familienmitglieder, p63 und p73), zeigen, wenn die Überexpression oder Down-Regulierung des OTX Gene p53 abhängig ist.
p53-Verlust der Funktion durch Mutationen in p53 selbst oder Störungen im Wege, p53-Signalisierung, ist ein gemeinsames Merkmal in den meisten menschlichen Krebserkrankungen16. Die meisten des Clusters p53-Mutationen in der DNA-bindende Domäne; DNA-bindende Aktivität ist daher die wichtige Funktion, die geändert wird, was darauf hindeutet, dass Änderungen in transcriptional Gene könnte der Schlüssel zur mutierten p53 Tätigkeit16. p53-Mutationen als ein gemeinsames Merkmal der sinunasalen Krebs mit einer Gesamthäufigkeit von 77 % berichtet worden, und sie zeigen Verein Adenokarzinom und Holz-Staubbelastung17. So in unsere Proben wäre es interessant, mRNA und Protein Ebenen (durch qR-PCR und Western-Blot Analyse) zu bewerten und die Sequenzierung dieses Gens, um zu erkennen oder ausschließen, die Anwesenheit von Aktivierung/Inaktivierung Mutationen durchführen. Schließlich ist eine Tumorart spezifische wiederkehrende Mutation würde gefunden, sein bemerkenswert, veränderter Zellen und Mäuse (mit ein mutiertes Allel), die diese Mutation Hafen zu produzieren, und zu prüfen, wenn die Mutation die Krankheit rekapitulieren kann.
Wichtige Schritte:
Wichtige Schritte dieser Studie gehören die Einholung von gut gespeicherten Samples, entweder als Biopsien gespeichert in RNA schützende Puffer oder FFPE-Proben von mindestens 8 µm dick und die Gewinnung von mindestens 200 ng RNA, qRT-PCR-Analysen durchzuführen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt von Centro Grandi Strumenti Università dell'Insubria, Fondazione Comunitaria del Varesotto, Fondazione del Monte di Lombardia und Fondazione Anna Villa e Felice Rusconi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation | Applied Biosystem | AM1975 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystem | 4368814 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG | Applied Biosystem | 4326614 | |
| ABI Prism 7000 | Applied Biosystem | 270001857 | |
| ACTB probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| OTX1 probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| OTX2 probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| Acqueous Hydrogen Peroxide | Merk | 1072090250 | |
| Citrate Buffer | Sigma-Aldrich | 20276292 | |
| Triton | Sigma-Aldrich | 101473728 | |
| Tris | Merk | 108382 | |
| NaCl | Merk | 106404 | |
| Goat Anti-OTX2 Antibody | Vector Laboratories | Out of production. Catalog number not available | |
| Rabbit Anti-Goat Antibody | Vector Laboratories | BA5000 | |
| ABC-Peroxidase Complex | Vector Laboratories | PK6100 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB) | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Harris Hematoxylin | Bioptica | 0506004/L | |
| Pertek | Kaltek SRL | 1560 | |
| BioClear | Bioptica | W01030799 |
References
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