Summary
Genes homeobox são genes regulatórios, frequentemente associados com tumores nos organismos adultos. Nós investigamos sua expressão comparativa por imuno-histoquímica e análise PCR em tempo real, na mucosa nasal normal e inflamatória e em neoplasias Nasossinusal para utilizá-los como possíveis alvos de diagnósticos e terapêuticos.
Abstract
Genes homeobox (HB) de OTX são expressos durante a morfogênese embrionária e durante o desenvolvimento do epitélio olfatório em organismos adultos. Mutações ocorrem nestes genes estão muitas vezes relacionadas a tumorigênese em humanos. Não existem dados hoje sobre a possível correlação entre genes OTX e tumores da cavidade nasal. O objetivo deste trabalho é entender se OTX1 e OTX2 podem ser considerado como marcadores moleculares no desenvolvimento de tumores nasais. Nós selecionamos adenocarcinomas nasais e Nasossinusal para investigar a expressão dos genes OTX1 e OTX2 através de imuno-histoquímica e análises PCR em tempo real. Tanto OTX1 como OTX2 estavam ausentes em todas as amostras de Nasossinusal Adenocarcinomas Intestinal-tipo (ITACs). OTX1 mRNA foi identificado apenas em Non-Intestinal tipo Adenocarcinomas (NITACs), enquanto OTX2 mRNA foi expressa somente em Neuroblastomas olfativo (ONs). Nós demonstramos que a expressão diferencial do gene para ambos OTX1 e OTX2 genes pode ser um útil marcador molecular para distinguir os diferentes tipos de tumores Nasossinusal.
Introduction
OTX HB genes são o vertebrados homólogo dos genes orthodenticle da drosófila (otd) e eles codificam para fatores de transcrição que normalmente são expressos durante a morfogénese embrionária, mas eles também podem ser expressos no organismo adulto com diferentes funções . Durante o desenvolvimento embrionário, eles controlam a especificação de identidade celular, diferenciação celular e o posicionamento do axis¹ corpo. A família OTX inclui genes OTX1 e OTX2 , que exibem diferentes funções. OTX1 está envolvida no cérebro e desenvolvimento de órgãos sensoriais. No organismo adulto, que é expresso em órgãos sensoriais e é transcrito em níveis baixos no lobo anterior da hipófise2; também desempenha um papel na hematopoiese, sendo expressa em hematopoiéticas pluripotentes e de células progenitoras3. OTX2 está envolvida no desenvolvimento da cabeça rostral e seus atos de proteína traduzida como um morphogen porque ele gera um gradiente através do quais outros genes são ativados ou reprimidos de forma espaço-temporal, contribuindo assim para a célula proliferação e diferenciação. No organismo adulto, OTX2 é encontrado exclusivamente na glândula pineal e do plexo coroide4.
Mutações nos genes OTX estão muitas vezes relacionadas com o aparecimento de defeitos metabólicos, congênitos ou somáticos humanos. Ganho ou perda de mutações em genes OTX poderiam promover a tumorigênese, se eles não são capazes de controlar corretamente de crescimento e/ou diferenciação celular5. Em leucemias e linfomas, bem como em muitos tumores sólidos (por exemplo, Meduloblastomas6, agressivo linfomas não-Hodgkin2, carcinomas de mama7, cancros colo-rectais8e retinoblastoma9), o desregulamentado expressão de genes de HB OTX é bem documentado10. Além disso, as mutações de OTX2 foram demonstradas em casos de anophthalmia e microphtalmia11 , devido ao papel crucial para este gene no controle do desenvolvimento do olho.
No contexto de neoplasias sólidas, a descoberta de marcadores moleculares e fenotípicos é um desafio importante para o diagnóstico, classificação e tratamento de vários tipos de tumor11, incluindo aqueles que se originam na cavidade nasal e seios paranasais seios paranasais. Na verdade, apesar de que estas áreas ocupam apenas um modesto espaço anatômico, epitélio da mucosa, glândulas, tecidos moles, osso, cartilagem ou neural/neuroectodérmico, e hematolymphoid as células podem ser frequentemente o local para a origem do complexo e histologicamente diferentes grupos de tumores. Diferentes tipos de neoplasias envolvendo o trato Nasossinusal apresentam uma variedade de características que superar o que geralmente é visto no tracto aerodigestive superior ou mesmo durante a maioria das partes do corpo12. Neoplasias malignas Nasossinusal são raras e apresentam uma incidência anual de 1: 100.000 habitantes em todo o mundo, e então isso impede que estudos sobre as vias envolvidas na tumorigênese e à análise das estratégias de tratamento alternativo. Apesar disso, os avanços em imagens técnicas, as abordagens cirúrgicas e radioterapia têm melhorado o manejo clínico de câncer Nasossinusal. Além disso, o desenvolvimento de linhas de células, bem como modelos animais e perfis genéticos do câncer atualmente constituem a base para a futura terapias anticâncer alvo13. Até à data, não existem relatos sobre OTX1 e/ou OTX2 expressão em neoplasias da cavidade nasal, nasofaringe e seios paranasais. Já observamos anteriormente que OTX1 e OTX2 estão envolvidos no câncer de mama7, gostaríamos de saber se estes genes poderiam estar presentes não só na mucosa nasal normal, mas também em tumores da cavidade nasal. Para atingir este objetivo, que temos obtidos a partir do "Ospedale di Circolo" em amostras de Varese de mucosa normal e adenocarcinomas nasais e Nasossinusal coletados de 1985 para 2012 e classificados de acordo com a Organização Mundial de saúde (OMS), o departamento de patologia classificação dos tumores de pescoço e cabeça. Optamos por analisá-los através de análises em tempo real do PCR e imuno-histoquímica e avaliamos a expressão OTX1 e OTX2 para determinar se eles podem ser considerados marcadores moleculares para estes tipos de tumores.
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Protocol
Todos os estudos foram realizados de acordo com a declaração de Helsínquia (1975) com o consentimento informado por escrito e aprovado pelo Comitê de ética da Universidade de Insubria Varese.
1. coleta das amostras
- Coletar e dividir todas as amostras de Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) humano em diferentes subgrupos de acordo com a classificação do WHO de cabeça e pescoço tumores14.
Nota: Aqui usamos as seguintes amostras: mucosa Nasossinusal Normal como controle (10 amostras); Papiloma invertido (PI, código ICD-O 8121/1); Sinonasal ITAC (ICD-O código 8144 habitantes/3, 32 amostras); NITAC (ICD-O código 8140/3, 12 amostras); Carcinoma adenoide cístico (ACC, código ICD-O 8200/3); Adenoma pleomórfico (PA, código ICD-O 8941/3); (ICD-O código 9522/3, 13 amostras); Mal diferenciadas Carcinoma neuroendócrino (PDNEC, código ICD-O 8041/3, 19 amostras); Tumor neuroendócrino (NET, ICD-O código 8041/3).
2. imunoquímica
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Deparaffinization e reidratação das seções
- Aqueça os slides de amostra em estufa a 60 ° C por 30 min e reidratar 3 µm espessura FFPE seções usando uma série de álcool à água.
- Brevemente, lavar as lâminas em xilol por 10 min e repita este passo; Lave os slides por 5 min em 100% de álcool e repita este passo usando álcool 95%, 85% e 75% em série. Enxágue as lâminas por 5 min em água destilada.
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Bloqueando a atividade endógena
- Bloquear a atividade endógena, colocando os slides em 3% peróxido de hidrogênio aquoso por 12 min.
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Recuperação do antígeno
- Execute a recuperação do antígeno, tratando com 10 mM de tampão citrato (pH 6) por 10 min em um tratamento de microondas.
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Incubação com o anticorpo primário
- Lave as seções em tampão TBS (pH 7,4) e, em seguida, adicionar a solução de bloqueio por 10 min.
- Lave as seções em tampão TBS (pH 7,4) e, em seguida, adicione 0,2% Triton X.
- Incube durante uma noite a 4 ° C com cabra anti-humano OTX2 anticorpo diluído 1: 100.
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Incubação com anticorpo secundário
- Incubar as seções por 1h à temperatura ambiente com biotinilado coelho anticorpo secundário de antidiluído cabra 1: 200 seguido pelo complexo ABC-peroxidase (ver Tabelas de materiais).
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Desenvolvendo o immunoreaction
- Desenvolver o immunoreaction usando 3, 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride e counterstain os núcleos com Harris Hematoxylin.
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Montagem e imagem
- Desidratar as seções usando uma escala crescente de álcool e explicitá-los usando uma clareira a substância de origem de terpenos (ver Tabela de materiais). Incorporar as seções em meio de montagem, colocar as seções em um microscópio e observar as seções através de um microscópio óptico.
3. extração do RNA e transcrição reversa
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Extração de RNA
- Extraia o RNA das seções, realizando a primeira etapa da imunoprecipitação (ver secção 2.1) e manter as lâminas em água destilada. Se sobrepõem as seções imaculadas com o correspondente hematoxilina-eosina manchado seções para identificar fragmentos de interesse.
- Realize a extração do RNA usando um kit de extração de RNA comercial para amostras FFPE (ver Tabela de materiais) e seguir indicações do fabricante.
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Reversa de RNA-transcrição
- Usar um kit comercial retrô-transcrever RNA em cDNA (ver Tabela de materiais) seguindo o protocolo. Retrô-transcrever pelo menos 1.000 ng do RNA total para realizar diversas análises.
4. em tempo real do PCR e análise de dados
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PCR em tempo real
- Realizar análises quantitativas de PCR em tempo real (qRT-PCR) com tecnologia baseada em investigação (ver Tabela de materiais) e um termociclador.
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Preparação da mistura de reação de PCR
- Prepare a mistura de reação de PCR usando 12,5 µ l do mix de mestre baseada em investigação, µ l 1,25 cada de OTX1, OTX2 e ACTB sondas (ver Tabela de materiais), 50 ng de cDNA e livre de nuclease até 25 µ l de volume total de água.
- Execute todas as reações em triplicata, utilizando o gene ACTB como o controle endógeno para normalizar os níveis de expressão do gene.
- Centrifugar a placa a 1.109 x g por 3 min e armazenar a placa protegida da luz a 4 ° C até o experimento.
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Definindo o termociclador
- Conjunto o perfil do termociclador com um começo quente inicial do ciclo a 50 ° C por 2 min e 95 ° C por 10 min, seguido por 40 ciclos a 95 ° C por 15 s e um ciclo final de 60 ° C por 1 min.
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Análises nível de expressão do gene
- Normalize os níveis de expressão do gene através do método de ciclo comparativo limiar (ΔCt) usando o gene ACTB como o controle endógeno.
- Avaliar os níveis de expressão de gene usando o método 2-ΔCt e plotar os resultados.
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Análises estatísticas
- Realizar análises estatísticas usando o Student t-teste, considerando resultados estatisticamente significativos com p < 0,05.
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Representative Results
Na mucosa normal observamos reatividade nuclear forte e homogênea para genes OTX no epitélio de tipo respiratório pseudoestratificado ciliado e nas células glandulares submucosas (figura 1A). Encontramos uma expressão nuclear para OTX1 em todas NITACs as amostras (figura 1B), enquanto pouco ou ausente imunorreatividade destacou-se em ITACs (Figura 1). Imunorreatividade intensa esteve presente em todos os ONs (Figura 1); entre PDNECs, expressão OTX variou em intensidade e porcentagem de células positivas (Figura 1E). Imuno-histoquímica análise estatística realizada com Chi-quadrado ou teste exato de Fisher demonstrou que a ausência de genes OTX em amostras ITAC foi estatisticamente significativa (n = 23, p < 0,01).
Análises PCR em tempo real confirmaram a expressão de genes de ambos os OTX1 e OTX2 em amostras de controle (Figura 2A–B); OTX1 mas não OTX2 foi expressa em amostras NITAC e ambos os genes foram completamente ativador em ITACs (Figura 2A–B). Em amostras encontramos apenas a expressão do gene OTX2 enquanto OTX1 era o ativador, e entre as amostras PDNEC a expressão de ambos os genes variados (Figura 2A–B).
Teste t de Student, realizado na PCR em tempo real confirmou dados estatisticamente significativos para OTX1 em controles vs ITACs (n = 9, p < 0,05), controles vs ONs (n = 6, p < 0,05), controles vs PDNECs (n = 8, p < 0,05), e para OTX2 no controle vs NITACs (n = 5, p < 0,05), controles vs ITACs (n = 9, p < 0,05), controles vs ONs (n = 6, p < 0.05) e controles vs PDNECs (n = 8, p < 0,05).
Figura 1 : Imagens representativas de expressão de imuno-histoquímica OTX no controle e nos tecidos tumorais.. A reação desenvolvida pelo anticorpo secundário conjugado peroxidase revelou que o sinal (marrom escuro) era visível em 5 seções FFPE controle da mucosa Nasossinusal normal (A), 7 casos de adenocarcinomas Non-intestinal-tipo (NITACs) (B), 7 casos neuroblastomas olfativos (ONs) (D), 11 casos pouco diferenciado carcinomas neuroendócrinos (PDNECs) (E), enquanto a imunorreatividade não é detectada em 23 casos de adenocarcinoma do tipo Intestinal (ITACs) analisados (C). DAB-hematoxilina; ampliação original: 200 x, barra de escala = 100 µm.
Figura 2 : Análise de PCR em tempo real de OTX1 (A) e a expressão de mRNA (B) OTX2 em tecidos nasais normais e neoplásicos. Para análises PCR em tempo real, foram utilizadas as seguintes amostras: 5 seções FFPE de controle de mucosa normal, 5 casos de adenocarcinomas Non-intestinal-tipo (NITACs), 9 casos de adenocarcinoma do tipo Intestinal (ITACs), 6 casos de neuroblastomas olfativos (ONs), 8 casos de mal diferenciado carcinomas neuroendócrinos (PDNEC). No eixo X o tipo de amostra é relatado, enquanto o eixo Y representa os valores- ΔCt 2. Dados estatisticamente significantes (p < 0,05) entre controle e tumores foram obtidos pelo t do estudante-teste e são destacados com asteriscos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este estudo mostra pela primeira vez que, com base nos níveis de RNAm, os genes HB OTX1 e OTX2 são expressas em mucosa Nasossinusal normal e glândulas submucosas, pólipos inflamatórios, Nasossinusal Schneiderian papilomas e em diferentes epiteliais e Neuroectodérmicos Neoplasias, incluindo carcinomas escamosos, tipo não-intestinal Nasossinusal adenocarcinomas, tumores de glândulas salivares-tipo, neoplasias neuroendócrinas e ONs.
Modificações e solução de problemas:
Para evitar a degradação do RNA, realizamos o protocolo deparaffinization em laboratório de patologia. Depois arranhamos os slides, todas as amostras foram rapidamente arrefecidas e armazenadas em gelo seco até nova utilização. Foram realizadas todas as análises subsequentes em uma capa de fluxo laminar segurança usando um conjunto dedicado de pipetas com pontas estéril para manter condições experimentais assépticas e evitar contaminações de RNA.
Limitações da técnica:
A principal limitação da técnica baseia-se na disponibilidade de amostras desde que tumores de cavidade Nasossinusal frequentemente são raros. A quantidade de RNA extraído é outra questão importante porque a extração do RNA das amostras FFPE resulta em RNA fragmentado que é difícil de analisar.
Importância no que diz respeito a métodos existentes:
O diagnóstico de tumores da cavidade nasal geralmente consiste de análises de raios-x, o exame endoscópico da cavidade nasal, tomografia computadorizada, ressonância magnética (RMN) e biópsia. Durante os últimos anos, os avanços da instrumentação cirúrgica e o progresso das técnicas de imagem levou cirurgia endoscópica como a estratégia preferencial para tumores Nasossinusal. Notavelmente, esta técnica tem sido relatada como viável para diferentes tipos de benignos ou malignos de Nasossinusal tumores15. Nossa técnica baseada na qRT-PCR permite a identificação de biomarcadores moleculares, que diferencialmente pode discriminar amostras de tumores diferentes: na verdade, nós fornecemos a evidência que a ausência de ambos os genes de HB em ITACs pode ser usada como marcadores moleculares para este tipo de tumor, bem como a ausência de OTX2 em NITACs. Além disso, esta técnica pode ser aplicada imediatamente após a biópsia e pode dar resultados definitivos em menos de 6 horas em relação a dias ou semanas necessárias para o relatório do hospital.
Aplicações futuras:
Nossos futuros estudos envolvem análise gene e níveis de expressão da proteína de genes OTX1 e OTX2 HB usando análises PCR em tempo real, Western blot e imunofluorescência com anticorpos específicos para detectar não apenas OTX1 e OTX2, mas também os níveis de expressão família p53. Desde que temos demonstrado anteriormente que a expressão OTX1 é regulada pela p53 em câncer de mama7, seria interessante entender se esse regulamento existe também em tumores da cavidade nasal. Um ensaio de imunofluorescência e um ensaio da imunoprecipitação da cromatina (ChiP) podem revelar, respectivamente, uma proteína-proteína e uma interação DNA-proteína p53 e OTXs. Se tal uma conexão for encontrado, o alvo silenciar de p53 (e os membros da família, p63 e p73), irá revelar se a sobre-expressão ou para baixo-regulamento de genes OTX é dependente de p53.
p53 perda de função, através de mutação no p53 em si ou perturbações nas vias de sinalização para p53, é uma característica comum na maioria dos cânceres humanos16. A maioria das mutações p53 cluster dentro do domínio de ligação a DNA; Portanto, a atividade da DNA-ligando é a função crítica que é alterada, sugerindo que alterações em genes transcriptional poderiam ser a chave para o mutante p53 atividade16. p53 mutações têm sido relatadas como uma característica comum de câncer Nasossinusal, com uma frequência total de 77%, e eles mostram Associação de adenocarcinoma e exposição de pó de madeira17. Assim, em nossas amostras, seria interessante para avaliar os níveis de mRNA e proteína (por qR-PCR e análise Western Blot) e realizar o sequenciamento deste gene, a fim de identificar ou excluir a presença de mutações de ativar/desativar. Finalmente, se uma mutação recorrentes específicas do tipo de tumor é encontrado, seria notável para produzir células engenharia e ratos (com um alelo mutante) que abrigam essa mutação e examinar se a mutação pode recapitular a doença.
Passos críticos:
Passos críticos deste estudo incluem a obtenção de amostras bem armazenadas, quer como biópsias armazenadas em buffer protetora de RNA ou FFPE amostras pelo menos 8 µm de espessura e a extração pelo menos 200 ng do RNA para realizar análises de qRT-PCR.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Centro Grandi Strumenti Università dell'Insubria, Fondazione Comunitaria del Varesotto, Fondazione del Monte di Lombardia e e Fondazione Anna Villa Felice Rusconi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation | Applied Biosystem | AM1975 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystem | 4368814 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG | Applied Biosystem | 4326614 | |
| ABI Prism 7000 | Applied Biosystem | 270001857 | |
| ACTB probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| OTX1 probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| OTX2 probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| Acqueous Hydrogen Peroxide | Merk | 1072090250 | |
| Citrate Buffer | Sigma-Aldrich | 20276292 | |
| Triton | Sigma-Aldrich | 101473728 | |
| Tris | Merk | 108382 | |
| NaCl | Merk | 106404 | |
| Goat Anti-OTX2 Antibody | Vector Laboratories | Out of production. Catalog number not available | |
| Rabbit Anti-Goat Antibody | Vector Laboratories | BA5000 | |
| ABC-Peroxidase Complex | Vector Laboratories | PK6100 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB) | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Harris Hematoxylin | Bioptica | 0506004/L | |
| Pertek | Kaltek SRL | 1560 | |
| BioClear | Bioptica | W01030799 |
References
- Boncinelli, E., Simeone, A., Acampora, D., Gulisano, M. Homeobox genes in the developing central nervous system. Ann genet. 36 (1), 30-37 (1993).
- Omodei, D., et al. Expression of the Brain Transcription Factor OTX1 Occurs in a Subset of Normal Germinal-Center B Cells and in Aggressive Non-Hodgkin Lymphoma. American J. Pathol. 175, 2609-2617 (2009).
- Levantini, E., et al. Unsuspected role of the brain morphogenetic gene Otx1 in hematopoiesis. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 100 (18), 10299-10303 (2003).
- Larsen, K. B., Lutterodt, M. C., Mollgard, K., Moller, M. Expression of the homeobox OTX2 and OTX1 in the early developing human brain. J. Histochem. Cytochem. 58, 669-678 (2010).
- Abate-Shen, C. Deregulated homeobox gene expression in cancer: cause or consequence? Nat. Rev. Cancer. 2, 777-785 (2002).
- de Haas, T., et al. OTX1 and OTX2 expression correlates with the clinicopathologic classification of medulloblastomas. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 65, 176-186 (2006).
- Terrinoni, A., et al. OTX1 expression in breast cancer is regulated by p53. Oncogene. 30 (27), 3096-3103 (2001).
- Yu, K., et al. OTX1 promotes colorectal cancer progression through epithelial-mesenchymal transition. Biochem. Biophys Res Commun. 44 (1), 1-5 (2014).
- Glubrecht, D. D., Kim, J. H., Russel, L., Bamforth, J. S., Godbout, R. Differential CRX and OTX2 expression in human retina and retinoblastoma. J. Neurochem. 111 (1), 250-263 (2009).
- Coletta, R. D., Jedlicka, P., Gutierrez-Hartamn, A., Ford, H. L. Transcriptional control of the cell cycle in mammary gland development and tumorigenesis. J. mammary gland Biol. Neoplasia. 9, 39-53 (2004).
- Cordes, B., et al. Molecular and phenotypic analysis of poorly differentiated sinonasal neoplasms: an integrated approach for early diagnosis and classification. Hum Pathol. 40, 283-292 (2009).
- Stelow, E. B., Bishop, J. A. Update from the 4th Edition of the World Health Organization Classification of Head and Neck Tumours: Tumors of the Nasal Cavity, Paranasal Sinuses and Skull Base. Head Neck Pathol. 11 (1), 3-15 (2017).
- Llorente, J. L., et al. Sinonasal carcinoma: clinical, pathological, genetic and therapeutic advances. Nat. Rev. Clin. Oncol. 11 (8), 460-472 (2014).
- Sidransky, D. World health organization classification of tumors. Pathology and genetics of head and neck tumors. 9, WHO Press. (2005).
- Radulesku, T., et al. Endoscopic surgery for sinonasal tumors: The transcribriform approach. J Stomatol Oral Maxillofac Surg. 118 (4), 248-250 (2017).
- Muller, P. A. J., Vousden, K. H. p53 mutations in cancer. Nature cell biology. 15 (1), 2-8 (2013).
- Holmila, R., et al. Profile of TP53 gene mutations in sinonasal cancer. Mutat Res. 686 (1-2), 9-14 (2010).
