Summary
Гомеобокс, регуляторных генов часто ассоциируется с опухолями в взрослых организмов. Мы исследовали их сравнительного выражения иммуногистохимических и анализ в реальном времени PCR, в нормальных и воспалительных носовой mucosae и придаточных пазух носа новообразования для того, чтобы использовать их в качестве возможных диагностических и терапевтических целей.
Abstract
OTX (HB) гомеобокс выражаются во время эмбрионального морфогенеза и в ходе разработки обонятельного эпителия в взрослых организмов. Мутации, происходящие в этих генах часто связаны с tumorigenesis в человека. Данные не доступны сегодня относительно возможной корреляции между OTX генами и опухоли полости носа. Цель этой работы – понять, если OTX1 и OTX2 можно рассматривать как молекулярных маркеров в развитии Носовые опухоли. Мы выбрали носа и придаточных пазух носа аденокарциномы расследовать выражение генов OTX1 и OTX2 через иммуногистохимических и реальном времени ПЦР анализа. OTX1 и OTX2 были отсутствующими во всех пробах придаточных пазух носа аденокарциномы кишечной-типа (ITACs). Только в номера-кишечного типа аденокарциномы (NITACs) было выявлено OTX1 мРНК, пока только в обонятельные нейробластомы (УНС) была выражена OTX2 мРНК. Мы продемонстрировали, что дифференциального ген выражение для OTX1 и OTX2 генов может быть полезным молекулярных маркеров различать различные виды опухолей придаточных пазух носа.
Introduction
OTX HB гены позвоночных гомолог Drosophila orthodenticle генов (ОДТ) и они кодировать транскрипционных факторов, которые обычно выражаются в ходе эмбрионального морфогенеза, но они также могут быть выражены в взрослого организма с различными функциями . Во время эмбрионального развития они контролируют спецификации клеток идентичности, дифференцировки клеток и позиционирования тела axis¹. Семейство OTX включает в себя OTX1 и OTX2 генов, которые отображают различные функции. OTX1 участвует в мозг и сензорный орган развития. Во взрослом организме он выражается в органы чувств и транскрибируется на низком уровне в передней доле гипофиза2; Она также играет роль в кроветворения, выраженные в кроветворных плюрипотентных и прогениторных клеток3. OTX2 участвует в развитии ростральной головы и его перевод белок действует как morphogen потому что он создает градиент через какие гены активирован или репрессированных в пространственно временных манере, тем самым способствуя ячейки пролиферации и дифференцировки. Во взрослом организме OTX2 находится исключительно в сосудистое сплетение и шишковидной железы4.
Мутации в генах OTX часто связаны с появление человека врожденной, соматического или метаболических дефектов. Прибыль или убыток мутаций в генах OTX могло бы способствовать tumorigenesis, если они не в состоянии должным образом контролировать клеточного роста и/или дифференциация5. В лейкозов и лимфом также, как и многих солидных опухолей (например, Медуллобластомы6, агрессивных non лимфомы Hodgkin2, карциномы груди7, колоректального рака8и ретинобластома9) дерегулирование экспрессии генов OTX HB-хорошо документированы10. Кроме того OTX2 перегласовок были продемонстрированы в случаях11 анофтальмия и microphtalmia из-за ключевую роль для этого гена в элементе управления развития глаз.
В контексте твердых опухолей Открытие молекулярной и фенотипические маркеры является важной задачей для диагностики, классификации и обращения нескольких видов опухоль11, включая те, которые происходят в полости носа и околоносовых придаточных пазух носа. В самом деле несмотря на что эти районы занимают только скромный анатомические пространства, эпителия слизистых оболочек, желез, мягких тканей, костей, хряща или нейронных/нейроэктодермальная, и hematolymphoid клетки могут быть часто сайт для происхождения сложных и гистологически различных группы опухолей. Различные типы опухолей с участием урочище придаточных пазух носа представляют различные функции, которые позволяют преодолеть то, что обычно рассматривается в верхнем aerodigestive тракта или даже на протяжении большей части тела12. Придаточных пазух носа злокачественных новообразований являются редкими и представить годовой заболеваемости картирование жителей во всем мире, и поэтому это предотвращает исследования относительно пути, участвующие в tumorigenesis и тестирование стратегий альтернативного лечения. Несмотря на это, прогресс в imaging технологии, хирургическими методами и радиотерапии улучшили клинического управления придаточных пазух носа рака. Кроме того развитие клеточных линий, а также Животные модели и генетического профилирования рака в настоящее время составляют основу для будущей целевой противоопухолевой терапии13. На сегодняшний день, есть никаких сообщений о OTX1 или OTX2 выражение в новообразований полости носа, околоносовых пазух и носоглотки. Поскольку ранее мы заметили, что OTX1 и OTX2 участвуют в груди Рак7, мы думали, если эти гены могут присутствовать не только в нормальной слизистой оболочки носа, но и в опухоли полости носа. Для достижения этой цели, которую мы получили от Департамента патологии «Ospedale di Circolo» в Варезе образцов и нормальной слизистой оболочки носа и придаточных пазух носа аденокарциномы собраны от 1985 до 2012 и классифицированы согласно Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) Классификация опухолей шеи и головы. Мы решили их анализировать с помощью реального времени анализ ПЦР и иммуногистохимии и мы оценивали OTX1 и OTX2 выражением, чтобы определить, если они могут считаться молекулярных маркеров для этих типов опухолей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования были проведены, согласно Декларации о Хельсинки (1975) с письменного информированного согласия и утверждены Этический Комитет университета Инсубрия в Варезе.
1. сбор образцов
- Собирать и разделить различные подгруппы согласно классификации ВОЗ14головы и шеи опухоли всех человеческих образцов Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE).
Примечание: Здесь мы использовали следующие образцы: нормальный придаточных пазух носа слизистая оболочка как управления (10 образцов); Перевернутый папилломы (IP, код МКБ-O 8121/1); КППО придаточных пазух носа (ICD-O код 8144/3, 32 образцы); NITAC (12 образцов кода 8140/3, МКБ-O); Лимфоидной кистозный рак (АКК, код МКБ-O 8200/3); Плеоморфные аденомы (ПА, код МКБ-O 8941/3); НА (13 образцов кода 9522/3, МКБ-O); Слабо дифференцированной нейроэндокринной карцинома (PDNEC, МКБ-O кода 8041/3, 19 образцов); Нейроэндокринные опухоли (нетто, МКБ-O кода 8041/3).
2. Иммунохимия
-
Депарафинизации и регидратации секций
- Тепла образца слайдов в духовке при 60 ° C в течение 30 мин и увлажняет 3 µm толщиной FFPE секции с помощью алкоголя серии к воде.
- Кратко мыть слайды в ксилоле на 10 минут и повторите этот шаг; Вымойте слайды для 5 мин в 100% алкоголя и повторите этот шаг, серийно с использованием 95%, 85% и 75% алкоголя. Промойте слайды для 5 мин в дистиллированной воде.
-
Блокируя действие эндогенных
- Блокировать действие эндогенного, поместив слайды в 3% водного раствора пероксида водорода для 12 мин.
-
Антиген поиска
- Выполните поиск антигена с 10 мм цитрат буфере (рН 6) для 10 мин в СВЧ обработка.
-
Инкубация с основного антитела
- Мыть в подразделах TBS буфере (рН 7,4), а затем добавить блокировки решение для 10 мин.
- Мыть в подразделах TBS буфере (рН 7,4), а затем добавить 0,2% Тритон X.
- Инкубируйте на ночь при 4 ° C с OTX2 антитела разбавленный коза античеловеческие масштаба 1: 100.
-
Инкубация с вторичного антитела
- Инкубировать в разделах 1 ч при комнатной температуре с 1: биотинилированным кролик вторичного антитела анти коза разводят 200 следуют комплекс ABC-пероксидаза (см. Таблицы материалы).
-
Разработка immunoreaction
- Разработка с использованием 3, 3'-диаминобензидин tetrahydrochloride immunoreaction и counterstain ядер с Харрис гематоксилином.
-
Монтаж и обработка изображений
- Обезвоживает разделы, используя Полумесяца алкоголя шкалы и уточнить их с помощью очистки вещество терпеновые происхождения (см. Таблицу материалы). Внедрить секций в среде монтажа, Место разделы на микроскопа и наблюдать разделы через оптический микроскоп.
3. РНК добыча и реверс транскрипция
-
Извлечение RNA
- Извлечь РНК из разделов, выполняя первый шаг иммунопреципитации протокола (см. раздел 2.1) и хранить слайды в дистиллированной воде. Перекрытие неокрашенных разделы с соответствующими гематоксилином эозином, окрашенных разделы для того, чтобы определить фрагменты интерес.
- Выполните извлечение RNA, с использованием коммерческих РНК добыча комплект для FFPE образцов (см. Таблицу материалы) и следующими инструкциями.
-
Реверс транскрипции РНК
- Использование коммерческого набора для ретро транскрибировать РНК в cDNA (см. Таблицу материалы) после протокол. Ретро записать по крайней мере 1000 нг всего РНК для выполнения несколько анализов.
4. в реальном масштабе времени PCR и анализ данных
-
ПЦР в реальном времени
- Анализ количественных реального времени PCR (qRT ПЦР) с технологией на основе выборки (см. Таблицу материалы) и тепловая велосипедист.
-
Подготовка смеси реакции PCR
- Подготовьте смесь реакции PCR, используя 12,5 мкл мастер смесь на основе зонд, 1,25 мкл OTX1, OTX2 и ACTB зонды (см. Таблицу материалы), 50 нг cDNA и свободной от нуклеиназы воды до 25 мкл общего объема.
- Выполните все реакции в трех экземплярах, с использованием ACTB ген как внутреннего управления для нормализации уровни выражения гена.
- Центрифуга пластину на 1 109 g x 3 мин и хранить пластину, защищенном от света на 4 ° C до эксперимента.
-
Установка тепловой циклователь
- Набор, тепловая велосипедист профиль с первоначального горячий старт цикла при 50 ° C на 2 мин и 95 ° C в течение 10 мин, следуют 40 циклов при 95 ° C 15 s и окончательный цикл при 60 ° C за 1 мин.
-
Анализ уровня выражение гена
- Нормализуют уровни выражения гена через метод сравнительного цикла порог (ΔCt), с использованием ACTB ген как внутреннего управления.
- Оценивать уровни выражения гена, с помощью метода 2-ΔCt и печати результатов.
-
Статистический анализ
- Проводить статистический анализ с использованием студента t-теста, учитывая статистически значимые результаты с p < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В нормальной слизистой наблюдается сильный и однородной ядерной реактивности генов OTX мерцательного эпителия псевдомногослойный дыхания типа и в подслизистую железистые клетки (рис. 1A). Мы нашли, что ядерные выражение для OTX1 во всех пробах NITACs, (Рисунок 1B), пока мало или отсутствие иммунореактивности было подчеркнуто в ITACs (рис. 1 c). Интенсивным иммунореактивности присутствовал в всех ОНов (рис. 1 d); среди PDNECs OTX выражение различные по интенсивности и процент положительных клеток (Рисунок 1E). Иммуногистохимическая статистический анализ выполняется с квадратный чи или точный тест Фишера показали, что отсутствие OTX генов в образцах КППО статистически значимой (n = 23, p < 0.01).
Реальном масштабе времени PCR анализами экспрессии генов OTX1 и OTX2 в контрольных образцах (рисунок 2A–B); OTX1 но не OTX2 была выражена в NITAC образцах и оба гены были полностью downregulated в ITACs (рисунок 2A–B). В ОБРАЗЦАХ мы нашли только выражение гена OTX2 OTX1 было downregulated, а среди образцов PDNEC экспрессии генов, как разнообразны (Bрисунок 2A–).
Студента t -тест на реальном масштабе времени PCR OTX1 подтвердил статистически значимые данные в элементах управления против ITACs (n = 9, p < 0,05), контроля против УНС (n = 6, p < 0,05), контроля против PDNECs (n = 8, p < 0,05), и для OTX2 управления против NITACs (n = 5, p < 0,05), контроля против ITACs (n = 9, p < 0,05), контроля против УНС (n = 6, p < 0,05) и элементы управления против PDNECs (n = 8, p < 0,05).
Рисунок 1 : Представитель изображений экспрессии иммуногистохимических OTX управления и опухолевой ткани. Реакции, разработанный вторичное антитело проспряганное пероксидазы показало, что сигнал (темно-коричневый) был виден в 5 разделах FFPE управления нормальной придаточных пазух носа слизистая оболочка (A), 7 случаев Non кишечного типа аденокарциномы (NITACs) (B), 7 случаях обонятельные нейробластомы (УНС) (D), 11 случаев слабо дифференцированной нейроэндокринной карциномы (PDNECs) (E), в то время как не иммунореактивности обнаруживается в 23 случаях аденокарциномы кишечной типа (ITACs) анализируются (C). DAB-гематоксилином; исходный масштаб: 200 x, шкалы бар = 100 мкм.
Рисунок 2 : Анализ ПЦР в реальном времени OTX1 (A) и (B) мРНК выражение OTX2 в нормальных и опухолевых тканей носа. Для реального времени PCR анализа, были использованы следующие образцы: 5 FFPE Секции управления нормальной слизистой оболочки, 5 случаев Non кишечного типа аденокарциномы (NITACs), 9 случаев кишечной тип аденокарциномы (ITACs), 6 случаев обонятельные нейробластомы (УНС), 8 случаев слабо дифференцированной нейроэндокринной карциномы (PDNEC). На оси X тип примера сообщается, а ось Y представляет значения 2- ΔCt . Были получены статистически значимые данные (p < 0,05) между элементом управления и опухоли студента t-тест и выделяются с звездочками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это исследование показывает в первый раз, что, основываясь на уровни mRNA, HB генов OTX1 и OTX2 выражаются в нормальной придаточных пазух носа слизистая и подслизистую желез, воспалительные полипы, придаточных пазух носа Schneiderian папиллом и в различных эпителиальных и нейроэктодермальная новообразования, включая плоскоклеточной карциномы, -кишечного типа придаточных пазух носа аденокарциномы, опухоли слюнных желез типа, нейроэндокринных опухолей и дополнений.
Модификации и устранения неполадок:
Чтобы избежать деградации РНК, мы выполнили протокол депарафинизации в лаборатории патологии. После того, как мы почесал слайды, все образцы были быстро охлаждается и хранятся в сухого льда до дальнейшего использования. Мы выполнили все последующие анализы в капюшоне ламинарного потока безопасности с использованием выделенного набора пипетки с стерильных советы поддержание асептических условий экспериментальных и избегать загрязнений РНК.
Ограничения метода:
Основные ограничения метода зависит от наличия образцов поскольку опухоли полости придаточных пазух носа часто встречаются редко. Количество извлеченных РНК является еще одним важным вопросом, потому что извлечение RNA от образцов FFPE приводит в разрозненных РНК, которая трудно анализировать.
Значение в отношении существующих методов:
Диагностика опухолей полости носа обычно состоит из рентген анализов, эндоскопическая экзамен носовой полости, КТ, магнитного резонанса (RMN) и биопсии. В последние годы успехи хирургического инструментария и хода методы визуализации привели эндоскопической хирургии как предпочтительной стратегией для опухолей, придаточных пазух носа. В частности эта техника было сообщено как возможно для различных типов доброкачественные или злокачественные опухоли придаточных пазух носа15. Наша техника, основан на ПЦР qRT позволяет идентификации молекулярных биомаркеров, дискриминационного характера можно дифференциально образцы различных опухолей: в самом деле, мы предоставляем доказательства того, что отсутствие HB генов в ITACs может использоваться как молекулярные маркеры для этого тип опухоли, а также отсутствие OTX2 в NITACs. Кроме того этот метод может применяться сразу же после биопсии и может дать окончательные результаты в менее 6 часов, дней или недель, необходимых для отчета из больницы.
Будущих приложений:
Наши будущие исследования включают анализ генов и уровнях выражения протеина генов OTX1 и OTX2 HB, используя анализы ПЦР в режиме реального времени, Западная помарка и иммунофлюоресценции с специфические антитела для выявления не только OTX1 и OTX2, но и уровнях семьи выражение p53. Поскольку ранее мы показали, что OTX1 выражение регулируется p53 в груди Рак7, было бы интересно понять, если такое положение также существует в опухоли полости носа. Assay иммунофлюоресценции и assay иммунопреципитации Chromatin (обломока) можно выявить, соответственно, белок белковых и взаимодействия Дна протеина p53 и OTXs. Если такое соединение найдено, целенаправленного подавления p53 (и членов семьи, p63 и p73), раскроет если гиперэкспрессия или вниз регулирование OTX генов зависит p53.
p53 потери функции, через мутации p53 сам или возмущения в пути, сигнализации p53, является общей чертой большинства человеческих раков16. Большая часть кластера перегласовок p53 в дна связывая домене; Таким образом ДНК связывающих деятельность является критической функции, которая изменяется, предполагая, что изменения в транскрипционный анализ генов может быть ключом к мутант p53 деятельность16. перегласовки p53 были зарегистрированы как общей чертой придаточных пазух носа рака, с общей частотой 77%, и они показывают ассоциации аденокарциномы и воздействия древесины пыли17. Таким образом в наших образцов, было бы интересно для выполнения последовательности этого гена, с тем чтобы идентифицировать или исключить наличие мутаций, активация/деактивация и оценить мРНК и белка уровнях (qR-PCR и западной помарке анализа). Наконец если опухоль тип конкретных периодических мутация найден, он будет быть Примечательно производить инженерии клетки и мышей (с одним Мутантный аллель), которые гавани этой мутации и изучить если мутация может охарактеризовать болезнь.
Важнейшие шаги:
Важнейшие шаги этого исследования включают в себя получение хорошо сохраненные образцы, либо как биопсий, хранящихся в РНК защитного буфера или FFPE образцов толщиной минимум 8 мкм и извлечение по меньшей мере 200 нг РНК для выполнения qRT ПЦР анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Centro Grandi инструментов Università dell'Insubria, Фондационе агролесоводства del Varesotto, Фондационе дель Монте ди Ломбардия и e Fondazione Анна Villa Felice Рускони.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation | Applied Biosystem | AM1975 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystem | 4368814 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG | Applied Biosystem | 4326614 | |
| ABI Prism 7000 | Applied Biosystem | 270001857 | |
| ACTB probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| OTX1 probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| OTX2 probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| Acqueous Hydrogen Peroxide | Merk | 1072090250 | |
| Citrate Buffer | Sigma-Aldrich | 20276292 | |
| Triton | Sigma-Aldrich | 101473728 | |
| Tris | Merk | 108382 | |
| NaCl | Merk | 106404 | |
| Goat Anti-OTX2 Antibody | Vector Laboratories | Out of production. Catalog number not available | |
| Rabbit Anti-Goat Antibody | Vector Laboratories | BA5000 | |
| ABC-Peroxidase Complex | Vector Laboratories | PK6100 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB) | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Harris Hematoxylin | Bioptica | 0506004/L | |
| Pertek | Kaltek SRL | 1560 | |
| BioClear | Bioptica | W01030799 |
References
- Boncinelli, E., Simeone, A., Acampora, D., Gulisano, M. Homeobox genes in the developing central nervous system. Ann genet. 36 (1), 30-37 (1993).
- Omodei, D., et al. Expression of the Brain Transcription Factor OTX1 Occurs in a Subset of Normal Germinal-Center B Cells and in Aggressive Non-Hodgkin Lymphoma. American J. Pathol. 175, 2609-2617 (2009).
- Levantini, E., et al. Unsuspected role of the brain morphogenetic gene Otx1 in hematopoiesis. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 100 (18), 10299-10303 (2003).
- Larsen, K. B., Lutterodt, M. C., Mollgard, K., Moller, M. Expression of the homeobox OTX2 and OTX1 in the early developing human brain. J. Histochem. Cytochem. 58, 669-678 (2010).
- Abate-Shen, C. Deregulated homeobox gene expression in cancer: cause or consequence? Nat. Rev. Cancer. 2, 777-785 (2002).
- de Haas, T., et al. OTX1 and OTX2 expression correlates with the clinicopathologic classification of medulloblastomas. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 65, 176-186 (2006).
- Terrinoni, A., et al. OTX1 expression in breast cancer is regulated by p53. Oncogene. 30 (27), 3096-3103 (2001).
- Yu, K., et al. OTX1 promotes colorectal cancer progression through epithelial-mesenchymal transition. Biochem. Biophys Res Commun. 44 (1), 1-5 (2014).
- Glubrecht, D. D., Kim, J. H., Russel, L., Bamforth, J. S., Godbout, R. Differential CRX and OTX2 expression in human retina and retinoblastoma. J. Neurochem. 111 (1), 250-263 (2009).
- Coletta, R. D., Jedlicka, P., Gutierrez-Hartamn, A., Ford, H. L. Transcriptional control of the cell cycle in mammary gland development and tumorigenesis. J. mammary gland Biol. Neoplasia. 9, 39-53 (2004).
- Cordes, B., et al. Molecular and phenotypic analysis of poorly differentiated sinonasal neoplasms: an integrated approach for early diagnosis and classification. Hum Pathol. 40, 283-292 (2009).
- Stelow, E. B., Bishop, J. A. Update from the 4th Edition of the World Health Organization Classification of Head and Neck Tumours: Tumors of the Nasal Cavity, Paranasal Sinuses and Skull Base. Head Neck Pathol. 11 (1), 3-15 (2017).
- Llorente, J. L., et al. Sinonasal carcinoma: clinical, pathological, genetic and therapeutic advances. Nat. Rev. Clin. Oncol. 11 (8), 460-472 (2014).
- Sidransky, D. World health organization classification of tumors. Pathology and genetics of head and neck tumors. 9, WHO Press. (2005).
- Radulesku, T., et al. Endoscopic surgery for sinonasal tumors: The transcribriform approach. J Stomatol Oral Maxillofac Surg. 118 (4), 248-250 (2017).
- Muller, P. A. J., Vousden, K. H. p53 mutations in cancer. Nature cell biology. 15 (1), 2-8 (2013).
- Holmila, R., et al. Profile of TP53 gene mutations in sinonasal cancer. Mutat Res. 686 (1-2), 9-14 (2010).
