Summary
ホメオ ボックス遺伝子は遺伝子発現しばしば大人の有機体の腫瘍に関連付けられています。免疫組織化学的および正常および炎症性鼻粘膜や副鼻腔腫瘍診断と治療対象としてそれらを使用するためにリアルタイム PCR 解析による発現の比較を行った。
Abstract
OTX (HB) ホメオ ボックス遺伝子は胚形態形成期および大人の有機体の嗅上皮の開発中に表されます。これらの遺伝子で発生する突然変異は人間の腫瘍頻繁に関連しています。OTX遺伝子と鼻腔内の腫瘍の可能な相関について現在利用可能なデータはありません。この作業の目的は、 OTX1 、 OTX2を鼻腔内腫瘍の開発の分子マーカーとして考えることがかどうかを理解することです。我々 は、鼻腔と副鼻腔の腺癌の免疫組織化学的およびリアルタイム PCR 解析を通じてOTX1 、 OTX2遺伝子の発現を調査するを選択します。OTX1 、 OTX2欠席した副鼻腔腸型腺癌 (ITACs) のすべてのサンプルで。OTX1 mRNA は、嗅神経芽細胞腫 (アドオン) でのみ発現していたOTX2 mRNA 中非腸型腺癌 (NITACs) でのみ確認されました。副鼻腔腫瘍の種類を区別するために有用な分子マーカーをことがありますOTX1 、 OTX2遺伝子の遺伝子発現を確認しました。
Introduction
OTXHB 遺伝子ショウジョウバエ orthodenticle 遺伝子 (otd) の脊椎動物ホモログと彼らは転写因子が胚の形態形成時に通常のエンコードしますが、異なる機能を持った大人の有機体で表すこともできます。.萌芽期の開発の間に細胞の識別、細胞分化および体 axis¹ の位置決めの仕様を制御します。OTXファミリには、さまざまな機能を表示するOTX1 、 OTX2遺伝子が含まれています。OTX1は脳および感覚的な器官の開発に関与しています。大人の有機体のそれは感覚器官で表され、下垂2; の前葉の低レベルで転写されます。また、多能性造血前駆細胞3で表現される造血に役割を果たしています。OTX2は吻側のヘッドの開発に関与し、モルフォゲンとして翻訳されたタンパク質行為を他の遺伝子をグラデーションを生成するのでがアクティブ化またはセルに貢献時空間的な抑圧増殖・分化します。大人の有機体では、 OTX2は脈絡叢および pineal 腺4排他的に見られます。
OTX遺伝子の突然変異は先天性、体や代謝の不具合に人間の姿によく関連しています。OTX遺伝子の利得または損失の突然変異は、細胞の成長や分化5を正しく制御することがされていない場合、腫瘍を促進でした。白血病や悪性リンパ腫も多くの固形腫瘍 (あり髄芽腫6など、積極的な非ホジキン リンパ腫2乳房癌7、大腸癌8、および網膜芽細胞腫9) のように、OTX HB 遺伝子の発現はよくとり上げられる10です。また、 OTX2突然変異は、無眼球、microphtalmia11目の開発の制御のこの遺伝子の重要な役割のための例で実証されています。
固形腫瘍の中では、分子および表現型マーカーの発見、診断、分類、および腫瘍の11鼻腔と副鼻腔で発生するものを含むいくつかの種類の治療のための重要な課題副鼻腔。実際には、それにもかかわらずこれらの区域を占めるのみささやかな解剖学的スペース、粘膜上皮、腺、軟部組織、骨、軟骨または神経/神経と hematolymphoid 細胞はしばしば複雑で、組織学的に別の起源のサイトをすることができます。腫瘍のグループ。副鼻腔管を含む腫瘍の種類は、通常上部延びる気道消化管または12体のほとんどの部分も全体に見られるものを克服するための機能の様々 なを紹介します。副鼻腔の悪性腫瘍はまれであり、1: 100,000 人の住民の年間発生率を世界中に存在、ので、腫瘍と代替治療戦略のテストに関与する経路に関する研究できません。これ、画像診断の進歩にもかかわらず、外科的アプローチと放射線治療副鼻腔癌の臨床管理を改善しています。さらに、細胞株、動物モデル、がん遺伝プロファイリングの開発現在将来癌標的治療13の基礎となります。日には、鼻腔、副鼻腔、上咽頭の腫瘍におけるOTX1および/またはOTX2式に関する報告はありません。以来、我々 は以前OTX1 、 OTX2が乳房癌7で関与していることを観察している、我々 はこれらの遺伝子が通常鼻の粘膜だけでなく、鼻腔内の腫瘍だけではなく存在できれば疑問。我々 は、「オスペダーレ ・ ディ ・ Circolo」ヴァレーゼ サンプルで正常粘膜および 2012 年までの 1985 年から収集し、分類される世界保健機構 (WHO) によると鼻腔と副鼻腔の腺癌の病理科から得られるこの目標を達成するには頭と首の腫瘍の分類。リアルタイム PCR および免疫組織化学的解析を通じてそれらを分析することを選択し、彼らがこれらのタイプの腫瘍の分子マーカーを考えることができるかどうかを決定するOTX1 、 OTX2式を評価しました。
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Protocol
インフォームド コンセントを書かれており、ヴァレーゼの Insubria 大学の倫理委員会の承認とヘルシンキ (1975 年) の宣言によるとすべての研究を行った。
1. サンプルの収集
- 収集し、すべての人間の Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) サンプルを14頭と首の腫瘍の WHO の分類によると別のサブグループに分けます。
注:ここで次のサンプルを使用: コントロール (10 サンプル); として通常副鼻腔粘膜倒立乳頭腫 (ICD-O コード 8121/1 IP)副鼻腔 ITAC (ICD-O コード 8144/3 32 サンプル);NITAC (ICD-O コード 8140/3 12 サンプル);腺様嚢胞癌 (ACC、ICD-O コード 8200/3);多形性腺腫 (ICD-O コード 8941/3 PA)(ICD-O コード 9522/3 13 サンプル);不十分な低分化神経内分泌癌 (PDNEC、ICD-O コード 8041/3 19 サンプル);神経内分泌腫瘍 (NET、ICD-O コード 8041/3)。
2. 免疫
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Deparaffinization セクションの退避とステータス復元
- 30 分の 60 ° C のオーブンでスライドのサンプルを加熱し、水にアルコール系を使用して 3 μ m 厚 FFPE セクションを水分補給。
- 簡単に 10 分のキシレンのスライドを洗浄し、この手順を繰り返します100% アルコールに 5 分用のスライドを洗浄し、連続 95%, 85%, 75% のアルコールを使用してこの手順を繰り返します。蒸留水で 5 分用のスライドをすすいでください。
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内因性のアクティビティをブロック
- 12 分間 3% 過酸化水素でスライドを配置することによって、内因性の活動をブロックします。
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抗原検索
- 10 mm クエン酸緩衝液 (6) マイクロ波治療で 10 分間処理することによって抗原検索を実行します。
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一次抗体の孵化
- TBS バッファー (pH 7.4) のセクションを洗浄し、ブロッキング溶液中 10 分間を追加します。
- TBS バッファー (pH 7.4) のセクションを洗浄し、0.2% トリトン X を追加します。
- ヤギ抗ひと OTX2 抗体希釈 1: 100 で 4 ° C で一晩インキュベートします。
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二次抗体の孵化
- ビオチン標識ウサギの反やぎ二次抗体希釈 1: 200 ABC ペルオキシダーゼ複合体が続くと部屋の温度で 1 時間セクションを孵化させなさい (教材の一覧表を参照してください)。
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導管を開発
- 3, 3'-ジアミノベンジジン tetrahydrochloride を用いた抗原抗体反応の開発および counterstain ハリス ヘマトキシリンで核。
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取り付けとイメージング
- 三日月のアルコール スケールを使用してセクションを脱水してテルペン由来の清算物質を使用してそれらを明らかにする (材料の表を参照してください)。メディアをマウントのセクションを埋め込む、顕微鏡スライドの上セクションに配置およびセクションを光学顕微鏡で観察します。
3. RNA の抽出および逆のトランスクリプション
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RNA の抽出
- 免疫沈降プロトコル (セクション 2.1 を参照) の最初のステップを実行することによって、セクションから RNA を抽出し、蒸留水でスライドを保ちます。対応するヘマトキシリン-エオシン染色が関心のフラグメントを識別するためにセクションを染色無染色のセクションをオーバー ラップします。
- FFPE サンプル (材料の表を参照)、次の製造元の指示の商業 RNA 抽出キットを使用して RNA の抽出を実行します。
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RNA 逆転写
- レトロは cDNA に、RNA を転写する市販のキットを使用して (材料表参照) プロトコルに従います。いくつかを分析するための総 RNA の少なくとも 1,000 のレトロ-議事録 ng。
4. リアルタイム PCR およびデータ解析
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リアルタイム PCR
- プローブ ベースの技術と定量的リアルタイム PCR 解析 (qRT PCR) を実行 (材料の表を参照してください)、サーマルサイクラー。
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PCR の反作用の組合せの準備
- プローブ ベースのマスターの組合せの 12.5 μ L を使用して PCR 反応混合物の準備、ACTB、OTX2、OTX1 各 1.25 μ プローブ (材料の表を参照)、50 ng の cDNA とヌクレアーゼ フリー水総量の最大 25 μ L。
- 遺伝子発現のレベルを正規化する内因性制御として ACTB 遺伝子を用いた 3 通すべての反応を実行します。
- 3 分間 1,109 x gでプレートを遠心し、実験まで 4 ° C で光から保護プレートは保管します。
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熱 cycler を設定
- 50 ° c 2 分、95 ° C 10 分サイクルの初期のホット スタートでサーマルサイクラー プロファイル設定は続いて 40 サイクル 95 ° C で 15 秒と 1 分の 60 ° C で最終的なサイクル。
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遺伝子発現レベル解析
- 内因性制御として ACTB 遺伝子を用いた比較サイクルしきい値 (ΔCt) による遺伝子発現レベルを正規化します。
- 2-ΔCt法を用いた遺伝子発現レベルを評価し、結果をプロットします。
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統計解析
- 学生のtを使用して統計解析の実行-テスト、 p < 0.05 と統計的に有意な結果を考慮しました。
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Representative Results
正常粘膜 OTX 遺伝子繊毛の偽重層型呼吸上皮と粘膜下腺細胞 (図 1 a) の両方の強く、同種原子力反応が見られました。すべて NITACs のサンプル (図 1 b)、少し中または不在の免疫で OTX1 の核式 ITACs (図 1) で強調表示されたが分かった。強い免疫反応性があったすべてのアドオン (図 1)。PDNECs、間 OTX 式は強度と陽性細胞 (図 1E) の割合で変化。免疫組織化学的統計解析実行 Chi 正方形やフィッシャーの正確確率検定と実証 ITAC サンプル OTX 遺伝子の不在が有意 (n = 23、 p < 0.01)。
リアルタイム PCR 解析コントロールのサンプル (図 2 a-B); OTX1、OTX2 遺伝子の発現を確認しました。OTX1 がない OTX2 NITAC サンプルで表現された、両方の遺伝子が完全に (図 2 a-B) ITACs のダウンレギュ レート。サンプルを発見した OTX2 遺伝子の発現のみ OTX1 でした、ダウンレギュ レートが、PDNEC サンプル間の両方の遺伝子の発現変化 (図 2 a-B)。
リアルタイム PCR で実行される学生のtテスト ITACs 対コントロールでOTX1の統計的に有意なデータを確認した (n = 9、 p < 0.05)、アドオンが対コントロール (n = 6、 p < 0.05)、PDNECs 対コントロール (n = 8, p < 0.05)、NITACs 対コントロールにOTX2 (n = 5、 p < 0.05)、ITACs 対コントロール (n = 9、 p < 0.05)、アドオンが対コントロール (n = 6、 p < 0.05)、および PDNECs 対コントロール (n = 8, p < 0.05)。
図 1: コントロールと腫瘍組織OTX免疫組織化学的表現の代表的なイメージです。ペルオキシダーゼ標識二次抗体によって開発された反応を明らかにした信号 (ダークブラウン) は通常副鼻腔粘膜 (A) 非腸型腺癌 (NITACs) (B)、7 の 7 例の 5 つのコントロール FFPE セクションで表示されていた。嗅神経芽細胞腫 (ONs) の (D) の場合、11 例で低分化神経内分泌癌 (PDNECs) (E)、陽性が検出されない間、23 例腸型腺癌 (ITACs) の分析 (C)。軽打-ヘマトキシリン;元の倍率: 200 x、スケールバー = 100 μ m。
図 2: OTX1 (A) と正常および腫瘍性鼻の組織におけるOTX2 (B) mRNA 発現のリアルタイム定量 PCR 解析します。リアルタイム PCR 解析では、以下のサンプルは使用された: 5 つの FFPE セクション コントロール正常粘膜、腸型腺癌 (NITACs) の 5 例、腸型腺癌 (ITACs) 9 例、嗅神経芽腫 (ONs)、8 の 6 例の不十分の場合に、神経内分泌癌 (PDNEC) が区別されます。X 軸、Y 軸を表します 2- ΔCt値、サンプルの種類が報告されます。スチューデントのtによって得られた制御と腫瘍間で統計的に有意なデータ (p < 0.05)-テストし、アスタリスクで強調表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
本研究は、はじめてであり、mRNA レベルに基づいて HB 遺伝子 OTX1 OTX2 通常副鼻腔粘膜と粘膜下腺、炎症性ポリープ、副鼻腔 Schneiderian 乳頭腫と別の表現と神経外胚葉性上皮腫瘍、扁平上皮癌、非腸型副鼻腔腺癌、唾液腺型腫瘍、神経内分泌腫瘍、およびアドオンを含みます。
変更とトラブルシューティング:
RNA の劣化を避けるためには、病理研究室で deparaffinization プロトコルを実行します。我々 はスライド傷後、すべてのサンプルが急速に冷却し、さらに使用までドライアイスに保管されます。無菌実験条件を維持するために、RNA の汚染を避けるために、滅菌のヒントと専用ピペットのセットを使用して層流安全フードの以降のすべての解析を行った。
技術の制限:
技術の主要な制限は、副鼻腔の空洞の腫瘍は、まれなので、サンプルの可用性に依存します。抽出した RNA の量は別の重要な問題、FFPE サンプルからの RNA の抽出で断片化された RNA を分析することは困難であります。
既存のメソッドの意義:
鼻腔内の腫瘍の診断は通常、x 線解析、鼻腔、ct、磁気共鳴 (RMN)、生検の内視鏡検査で構成されます。近年、手術機器の進歩とイメージング技術の進歩は、副鼻腔腫瘍の最寄りの戦略として内視鏡手術をリードしていた。特に、副鼻腔腫瘍15の良性または悪性の種類ごとに可能な限りこの手法が報告されています。QRT PCR に基づく本手法により、異なる腫瘍のサンプルを識別できる特異的分子バイオ マーカーの同定: 実際には、我々 はこの分子マーカーとして ITACs の両方の HB 遺伝子の不在が使える証拠を提供します。NITACs に OTX2 の不在と同様、腫瘍の種類です。また、この手法は生検後すぐに適用することができます、数日または数週間の病院からレポートの必要に関して 6 時間以内に決定的な結果を与えることができます。
将来のアプリケーション:
今後の研究課題は、遺伝子と OTX1 だけでなく、OTX2 を検出特異抗体を蛍光抗体法、ウエスタンブロット、リアルタイム PCR 解析を用いた OTX1、OTX2 HB の遺伝子のタンパク質発現量も p53 ファミリーの発現レベルの分析を含みます。我々 は以前 OTX1 式乳房癌7における p53 によって調節されていることを示した、興味深いような規制が鼻腔内腫瘍にも存在するかを理解すること。蛍光抗体法とクロマチン免疫沈降 (チップ) アッセイは、それぞれ蛋白質蛋白質 p53 と OTXs の DNA 蛋白質の相互作用。このような接続が見つかった場合 p53 (と、家族、p63 や p73)、ターゲットを絞ったサイレンシングを明らかにするかどうか過剰発現または OTX 遺伝子の発現低下は p53 に依存。
p53 の損失自体や p53 にシグナル伝達経路における摂動の p53 突然変異によって機能、ひとがん16の大半で共通の機能です。P53 突然変異のほとんどは DNA 結合ドメイン内クラスターします。したがって、DNA 結合活性は変更されると転写遺伝子の変化が変異 p53 活動16へキーであることを示唆している重要な関数です。77% の全体的な周波数を持つ副鼻腔癌の共通の特徴として p53 遺伝子変異が報告されている、彼らは腺癌と木材粉じん暴露17への関連を示します。したがって、我々 のサンプルの興味深い (qR PCR および西部のしみの分析) によって mRNA および蛋白質レベルを評価し、識別または活性化/不活性化突然変異の存在を除外するために、この遺伝子のシーケンスを実行するででしょう。最後に、腫瘍型特定再発突然変異がある場合、設計の細胞とハーバーのこの突然変異 (1 つの突然変異体の対立遺伝子) でマウスを生成する注目に値する、突然変異は、病気を要約することができる場合は、検討します。
重要なステップ:
本研究の重要なステップにはとして生検、少なくとも 200 の抽出や、少なくとも 8 μ m 厚の FFPE サンプル RNA 保護バッファーに格納されているいずれかのよく保存されているサンプルは、入手が含まれて qRT PCR 解析を実行する RNA の ng。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この仕事に支えられセントロ グランディ楽器そして dell'Insubria、財団 Comunitaria ・ デル ・ Varesotto 財団・ デル ・ モンテ ・ ディ ・ ロンバルディアとスタンパーリアラヴェッロ アンナ ヴィラ e フェリーチェ Rusconi。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation | Applied Biosystem | AM1975 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystem | 4368814 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG | Applied Biosystem | 4326614 | |
| ABI Prism 7000 | Applied Biosystem | 270001857 | |
| ACTB probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| OTX1 probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| OTX2 probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| Acqueous Hydrogen Peroxide | Merk | 1072090250 | |
| Citrate Buffer | Sigma-Aldrich | 20276292 | |
| Triton | Sigma-Aldrich | 101473728 | |
| Tris | Merk | 108382 | |
| NaCl | Merk | 106404 | |
| Goat Anti-OTX2 Antibody | Vector Laboratories | Out of production. Catalog number not available | |
| Rabbit Anti-Goat Antibody | Vector Laboratories | BA5000 | |
| ABC-Peroxidase Complex | Vector Laboratories | PK6100 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB) | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Harris Hematoxylin | Bioptica | 0506004/L | |
| Pertek | Kaltek SRL | 1560 | |
| BioClear | Bioptica | W01030799 |
References
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